TALLER DE ENZIMAS

1. Explique cada uno de los siguientes trminos: a) Oxidorreductasas

Hidrolsas f) Ligasas

b) Liasas

c)Transferasas d) Isomerasas e)

2. En qu consiste la cintica enzimtica?

3. Que es el control alostrico?
4. En qu consiste la amplificacin de seales reguladoras (cascada de la fosforilasa, coagulacin de la sangre)
5. Al estudiar las propiedades de una enzima recin descubierta se obtuvieron los siguientes datos en presencia de dos
inhibidores diferentes A y B. Uno es un anlogo del sustrato y otro es un agente alquilante:
[S] (mol/L)

v (mol/min)

v (mol/min) con A

v (mol/min) con B

5 x 10-4
2.5 x 10-4
1.7 x 10-4
1.2 x 10-4
1.0 x 10-4

1.25
0.87
0.67
0.54
0.45

0.74
0.45
0.32
0.25
0.21

0.48
0.33
0.25
0.20
0.17

Si la concentracin del inhibidor A es 5 x 10-4 M y la de B es 3.2 x 10-6 M.

Determinar KM y vmax para esta enzima
Qu clase de inhibidor es cada uno?
6. En una reaccin enzimtica la velocidad mxima es igual a 3.0 mol de sustrato transformados por minuto en presencia
de 1.5 g de enzima (M = 30.000). Cul es el nmero de recambio?
a)

b)

7. Cul es la actividad especfica de 1.5 mg de enzima que catalizan la transformacin de 3 moles de sustrato por minuto
bajo condiciones de mxima actividad?
8. Un bioqumico describi y purific una nueva enzima, y gener la siguiente tabla de purificacin:
Procedimiento

1. Extracto crudo
2. Precipitacin salina
3. Precipitacin por pH
4. Cromatografa de intercambio inico
5. Cromatografa de afinidad
6. Cromatografa de exclusin por tamao

Protena total
(mg)

Actividad
(unidades)

20.000
5.000
4.000
200
50
45

4.000.000
3.000.000
1.000.000
800.000
750.000
675.000

a) A partir de esta informacin, calcule la actividad especfica de la enzima despus de cada experimento de purificacin.
b) Cual de los procedimientos de purificacin utilizados para esta enzima es el mas efectivo (El que proporciona el mayor
incremento en la pureza)
c) Cual de los procedimientos de purificacin es el menos efectivo
d) Hay alguna indicacin en esta tabla de que la enzima ahora es pura? Que otra cosa se podra hacer para estimar la pureza
de una preparacin enzimtica?

9. La tripsina y la quimotripsina son enzimas especficas que catalizan la hidrlisis de polipptidos en sitios especficos (ver
tabla).

ESPECIFICIDAD DE RUPTURA DE ALGUNAS PROTEASAS

Enzima
Punto de ruptura (sitio)
Tripsina
Lis, Arg (C)
Quimotripsina
Fen, Trp, Tir (C)
Pepsina
Fen, trp, Tir (N)
Proteasa de Submaxillarus
Arg (C)
Proteasa V8 de S aureus
Asp, Glu (C)
Proteasas N-Asp
Asp, Glu (N)
Bromuro de ciangeno*
Met (C)
* Reactivo qumico no enzimtico
La secuencia de la cadena B de la insulina que se muestra a continuacin presenta un enlace cruzado de cistina entre las
cadenas A y B que han sido rotos mediante el uso de cido perfrmico.
Fen-Val-Asn-Gln-His-Leu-CisSO3--Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tir-Leu-Val-CisO3--Gli-Glu-Arg-Gli-Fen-Fen-Tir-Tre-Pro-LisAla.
Indique los puntos en la cadena B que sern rotos por a) tripsina y b) quimotripsina. Tenga en cuenta que esas proteasas no
removern aminocidos solos de cualquier extremo de la cadena polipeptdica.
10.Se ha aislado un grupo de pptidos que influyen la transmisin nerviosa en ciertas partes del cerebro a partir de tejido
cerebral normal. Esos pptidos se conocen como opiceos, porque ellos e unen a receptotes especficos a los que tambin se
unen las drogas opiceas como la morfina y naloxona. Los opiceos as mimetizan alguna de las propiedades de estas drogas.
Algunos investigadores consideran a estos pptidos como analgsicos naturales. Utilizando la informacin suministrada ,
determine la secuencia de aminocidos del opiceo leucina-encefalina. Explique como su estructura es consistente con cada
pedazo de informacin.
a) La hidrlisis completa con HCl 1M a 110C seguida por un anlisis de aminocidos indic la presencia de: G, L, F y Y, en una
relacin molar 2,1,1,1.
b) El tratamiento del pptido con 1-fluoro.2,4-dinitrobenceno (DNFB) seguido por hidrlisis completa y cromatografa indic la
presencia del derivado 2,4 dinitrofenilado de tirosina. No se encontr tirosina libre.
c) La digestin completa del pptido con pepsina seguida por cromatografa produjo un dipptido que contena F y L mas un
tripptido que contena tirosina y glicina en una relacin 1:2.
11. Los extractos de la bacteria Bacillus brevis contienen un pptido con propiedades antibiticas. Tales antibiticos peptidicos
forman complejos con iones metlicos y aparentemente perturban el transporte a travs de la membrana celular, matando
ciertas especies bacterianas. La estructura del pptido fue determinada por las siguientes observaciones experimentales.
a) la hidrlisis completa del pptido seguida por anlisis de aminocidos produjo cantidades equimolares de Leu, Orn, Fen, Pro
y Val. Orn es ornitina, un aminocido que no est presente en las protenas pero si en algunos pptidos y tiene la siguiente
estructura:
H

+H N CH CH CH C COO 3
2
2
2
+ NH3

b) se estim el peso molecular del pptido en 1200

c) Cuando se trat con la enzima carboxipeptidasa, el pptido no se pudo hidrolizar
d) El tratamiento del pptido intacto con 1-fluoro.2,4-dinitrobenceno (DNFB) seguido por hidrlisis completa y cromatografa,
produjo solo aminocidos y el siguiente derivado:
NO2
O2N

NH CH2 CH2 CH2 C COO + NH3

Nota. Tenga en cuenta que el 2,4 dinitrofenil derivado involucra el grupo amino de una cadena lateral, mas que el amino
terminal.

e) La hidrlisis parcial del pptido seguida por separacin cromatogrfica y anlisis de secuencia produjo los siguientes di y
tripptidos: Leu-Fen, Fen-Pro, Orn-Leu, Val-Orn, Val-Orn-Leu, Fen-Pro-Val y Pro-Val-Orn.
Con esta informacin, deduzca la secuencia aminoacdica del antibitico. Muestre su razonamiento. Cuando haya llegada a una
estructura definitiva, demuestre que es consistente con cada observacin experimental.
12. El sabor dulce del maz recin cosechado se debe al elevado nivel de azcar en los granos. Los granos almacenados por
vario das no son tan dulces, debido al que el 50% del azucare del maz es convertido en almidn al da siguiente de la
cosecha. Para preservar la dulzura y la frescura del maz. Los granos son inmersos en agua hirviendo durante unos cuantos
minutos (blanqueado) y luego enfriados en agua fra. El maz procesado de esta forma se almacena en congeladores
manteniendo su sabor dulce. Cual es la base bioqumica de este procedimiento?
13. Para calcular la concentracin real de enzimas en una clula bacteriana, asuma que la clula contiene 100 enzimas
diferentes en solucin en su citosol, que cada protena tiene un peso molecular de 100.000 y que todas las 1000 enzimas estn
presentes en concentraciones iguales. Si se supone que la clula bacteriana es un cilindro (dimetro 1m, altura 2 m). Si el
cistosol (gravedad especfica= 1.20) es 20% protena soluble por peso, y la protena soluble consiste completamente de
enzimas diferentes, calcule la concentracin molar promedio de cada enzima en esta clula hipottica.
14. La enzima ureasa incrementa la tasa de hidrlisis de urea a pH 8.0 y 20C por un factor de 10 14. Si una cantidad dada de
ureasa puede hidrolizar completamente una cantidad de urea en 5 minutos y 20C a pH 8.0, que tiempo tomar esta cantidad
de urea para ser hidrolizada bajo las mismas condiciones en ausencia de ureasa.
15. El sitio activo de un enzima usualmente consiste en un bolsillo sobre la superficie enzimtica alineado con las cadenas
laterales de aminocidos necesarias para unir el sustrato y catalizar su transformacin qumica. La carboxipeptidasa, que
remueve secuencialmente el aminocido carboxilo terminal consiste de una sola cadena de 307 aminocidos. Los dos grupos
esencialmente catalticos en el centro activo estn proporcionados por Arg145 y Glu270.
a) Si la carboxipetidasa fuera una a hlice perfecta que tan lejos deberan estar (en nanmetros) los residuos Arg145 y Glu270?
b) Explique como es que esos dos aminocidos ubicados tan separadamente en la secuencia, pueden catalizar una reaccin
que ocurre en un espacio de unas pocas dcimas de nanmetro?
c) Si solo esos dos grupos catalticos estn involucrados en el mecanismos e hidrlisis, porqu es necesario para la enzima
contener tan grande nmero de residuos de aminocidos?
16. La enzima muscular lactato deshidrogenasa cataliza la reaccin:
OH
|
+
CH3 C COO + NADH + H CH3 C COO- + NAD+
|
H
Piruvato
Lactato

NADH Y NAD+ son las formas reducida y oxidada de la coenzima NAD respectivamente. Las soluciones de NADH pero no
NAD+, absorben luz a 340 nm. Esta propiedad se usa para determinar la concentracin de NADH en solucin midiendo
espectrofotometricamente la cantidad de luz absorbida a 340 nm por la solucin. Explique como esas propiedades del ANADH
se pueden usar para disear un ensayo cuantitativo para la lactato deshidrogenasa.
1x10-2
[S] (M)
2.5x10-6
4x10-6
1x10-5
2x10-5
4x10-5
1x10-4
2x10-3

V (mo/min)
28
40
70
95
112
128
139

140

17. Aunque existe mtodos grficos para la determinacin

precisa de los valores de KM y Vmax para una reaccin
enzimtica, esos valores pueden estimarse rpidamente
inspeccionando valores de V y de S. Calcule el valor
aproximado de KM
y Vmax para los datos obtenidos en una reaccin
enzimtica.

18. Ecuacin de Michaelis-Menten

a) A que concentracin de sustrato una enzima que tiene una Kcat de 30s-1 y una K de 0.005M trabajar a un cuarto de su
velocidad mxima.

b) Determine la fraccin de Vmax que reencontrara en cada caso cuando S = 1/KM, 2KM y 10KM.
S (mM)
1.5
2.0
3.0
4.0
8.0
16.0

Producto formado
(mol/min)
0.21
0.24
0.28
0.33
0.40
0.45

19. Los siguientes datos experimentales se recogieron

durante un estudio de la actividad cataltica de una
peptidasa intestinal capaz de hidrolizar el pptido
glicilglicina:
glicilglicina + H2O 2 glicina
Con estos datos, determine grficamente los valores de K M
y Vmax para esta preparacin enzimtica y su sustrato.

20. La anhidrasa carbnica de los eritrocitos (M=30.000) se encuentra entre las enzimas mas activas conocidas. Ella cataliza la
reaccin reversible de hidratacin de CO2: H2O+ CO2 H2CO3, La cual es importante en el transporte de CO2 desde los
tejidos hacia los pulmones.
a) Si 10 g de anhidrasa carbnica pura catalizan la hidratacin de 0.30 g de CO 2 en 1 min a 37C bajo condiciones ptimas,
cual es el nmero de recambio (Kcat) de la anhidrasa carbnica (en unidades de min-1?)
b) A partir de la respuesta anterior calcule la energa de activacin de la rehacan cabalizada en kJ/mol?
c) Si la anhidrasa carbnica provee una tasa de realce de de la reaccin de 10 7, cual es la energa de activacin de la reaccin
no catalizada?
21. Muchas enzimas son inhibidas irreversiblemente por iones metlicos pesados Tales como Hg 2+, Cu2+, o Ag+, que pueden
reaccionar con grupos sulfhidrilo esenciales para formar mercptidos:
Enz-SH + Ag+ Enz-S-Ag + H+
La afinidad de la plata por los grupos sulfhidrilo es tan grande que ese metal puede ser utilizado para titular cuantitativamente
grupos SH. A 10 ml de una solucin que contiene 1 mg/ml de una enzima pura, se le aadi suficiente AgNO 3 para inactivar
completamente la enzima. Se requiri un total de 0.342 mol de AgNO3. Calcule el peso molecular mnimo de la enzima.
Porqu el valor obtenido mediante este clculo solo da el peso molecular mnimo?
22. Cuando soluciones enzimticas son calentadas, hay una perdida progresiva de la actividad cataltica con el tiempo. Esta
prdida es el resultado del desplegamiento de la molcula de enzima nativa hacia una conformacin aleatoriamente plegada,
debido al incremento en la energa trmica. Una solucin de l enzima hexocinasa incubada a 45C perdi el 50% de su
actividad en 12 min, pero cuando la hexocinasa se incub a 45C en presencia de una gran concentracin de uno de sus
sustratos, solo perdi en 3% de su actividad. Explique porqu la desnaturalizacin trmica de la hexocinasa se ve retardada en
presencia de uno de sus sustratos.
23. El suero sanguneo humano contiene una clase de enzimas conocidas como fosfatasas cidas, las cuales hidrolizan steres
de fosfatos biolgicos bajo condiciones cidas (pH 5.0):

OO|
|
R O P O - + H2O R OH + HO P O O

Las fosfatasas cidas son producidas por los eritrocitos, hgado, rin, bazo, y glndula prottica. La enzima de la glndula
prosttica es clnicamente importante porque un incremento en su actividad en la sangre es un indicador de cncer de prstata.
La fosfatasa de la glndula prosttica es inhibida fuertemente por el in tartrato, pero la fosfatasa de otros tejidos no lo son.
Como esta informacin puede ser utilizada para desarrollar un procedimiento especfico para medir la actividad de la fosfatasa
cida prosttica en le suero sanguneo humano?
24. La anhidrasa carbnica es fuertemente inhibida por el medicamento acetazolamida, que se usa como diurtico (incrementa
la produccin de orina) y para tratar el glaucoma (reduce la presin intraocular excesivamente alta). La anhidrasa carbnica
juega un papel importante en esos y otros procesos secretorios, porque participa regulando el pH y el contenido de bicarbonato
de varios fluidos biolgicos. La curva experimental de velocidad de reaccin (dada aqu como porcentaje de Vmax) contra [S]
para la reaccin de la anhidrasa carbnica se ilustra en la curva superior de la siguiente grfica:

100

Cuando el experimento se repite en presencia de

acetazolamida, se obtiene la curva inferior. Inspeccionando
las dos curvas y nuestro conocimiento de las propiedades
cinticas de los inhibidores enzimticos competitivos y no
competitivos, determine la naturaleza de la inhibicin por
acetazolamida. Explique.

V(% de Vmax)

Sin inhibidor

50

Acetazolamida

10

100

[S]

El sitio centro activo de la lisozima contiene do residuos de

aminocidos esenciales para la catlisis: Glu35 y Asp52. Los
valores de pK para las cadenas laterales de esos residuos
son 5.9 y 4.5 respectivamente. Cual es el estado de
ionizacin (protonado o desprotonado) para cada residuo
al pH ptimo para la lisozima?. Como pueden explicar
estos estados de ionizacin el perfil de actividad mostrado
en la grfica para esta enzima?

100

A c tiv id a(%
d d e la
mx im )a

25. La actividad enzimtica de la lisozima es ptima a pH

5.2

50

0
2

6
pH

10