Materiales y mtodos

Preparacin del inculo y medio de cultivo

Se preparan en matraces de vidrio el inoculo inicial, 4L en volumen total para
una produccin piloto. Se pasan a recipientes y luego a bolsas dispensadoras
para el biorreactor en su manejo previo para la alimentacin de los tanques de
1200 L y 5000 L aproximadamente para el primer y segundo cultivo. Se
prepara HyQ SFM4Mab Serum-Free Medium (*), especializado para la
produccin de anticuerpos monoclonales, el cual tiene una formulacin baja en
protena, optimizado para purificaciones con protena A, lpidos y fosfolpidos
para la estabilidad, colesterol sinttico, L-glutamina, Plurionico F-68 y el uso de
agua grado inyectable para tu preparacin. Se esterilizan, se retiran
contaminantes mediante una filtracin con un tamao de poro de 0.2m y se
pasan a los respectivos biorreactoes de tanque agitados para el crecimiento
celular.
Cultivo celular
El modo de produccin es mediante cultivos de lote alimentado a flujos
cercanos a 17 g/L esto debido a que una alta concentracin de nutrientes o
elementos son inhibitorios para los hibridomas. El cultivo debe durar alrededor
de 12 das. El cultivo final tiene un volumen 15000L con aproximadamente
30Kg de producto, una media de 2 g/L.
Purificacin
Al completarse el cultivo celular se pasa el medio por filtros de 0.2 m para
garantizar la esterilidad. Se eliminan tanto la biomasa y los componentes en
suspensin mediante una centrifugan de disco con un rendimiento aproximado
del 96% de anticuerpos monoclonales perdindose el resto en la corriente de
residuos slidos. Se pasa entonces por una etapa de cromatografa de afinidad
usando una columna de protena-A eliminando la mayora de las protenas
contaminantes. Se lava y recuperan los anticuerpos en aproximadamente 26
horas usando 484L de diluyentes (0.6% p/p de buffer cido actico). Se
concentra y se diafiltra usando agua grado inyectable como diluyente en 5
horas con una membrana de 20 m2 requeridos, se obtiene un rendimiento del
97%. La solucin de protena concentrada es entonces tratada qumicamente
durante 1.5 horas con Polisorbato 80 para inactivar los virus. Una posterior
cromatografa de intercambio inico (IEX) dura aproximadamente 22 horas y
requiere un sulfato de amonio 211 L. Se aade sulfato de amonio a una
concentracin de 0,75 M para aumentar la fuerza inica en la preparacin para
cromatografa de interaccin hidrofbica (HIC) posterior. La etapa dura
aproximadamente 22 horas y requiere un volumen de diluyente de 190 L con
un rendimiento del 90%.Se agrega una exclusin viral por filtracin. Se
prosigue a una filtracin mediante una membrana con un tamao de poro de

0.02 m y 2.8 horas. Finalmente se diluye en buffer de fosfato salino (PBS)

intercambiando el buffer del HIC y se concentr 1.5 veces durante 8 horas
usando aproximadamente 10 m2 de membrana en una diafiltracin.
La protena final de almacena en bolsas especiales. Son producidos alrededor
de 19. 5 kg de anticuerpos monoclonales por lote y un rendimiento total de
64.4%.