UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS-ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURA

CARRERA DE INGENIERIA AGROPECUARIA

SANTO DOMINGO

PERIODO

Abril Agosto 2016

ASIGNATURA :

Mdulo de Biotecnologa Animal

NOMBRES

Kristley Celi, Pal Aazco,

Edwin Correa, Luis Vlez, Daniel Viteri

NIVEL

Octavo

DOCENTE

Dr. Flix Valdiviezo

FECHA

15 de agosto de 2016

TEMA:
Evaluacin de motilidad, morfologa y supervivencia de
espermatozoides bajo crio conservacin

SANTO DOMINGO-ECUADOR
2016

I.

Introduccin

La inseminacin artificial es un proceso biotecnolgico reproductivo: sin embargo uno

de los factores que influyen en esta tcnica es la calidad del semen, relacionado con la
capacidad reproductiva del macho, manejo del semen y mtodos de crio-preservacin
(Lozano, 2009).
Los espermatozoides sometidos a criopreservacin estn sujetos a una serie de
alteraciones morfolgicas como dilatacin y ruptura de la membrana plasmtica.
Degeneracin acrosomal y lesiones en las mitocondrias. El xito en la criopreservacin
depende del mantenimiento del potencial fertilizante de los espermatozoides, que deben
ofrecer la integridad y funcionalidad de las diferentes estructuras celulares durante y
despus de la congelacin (Hummersted, Graham, & Nolan, 1990)
La congelacin y descongelacin de semen de toro conduce al dao o la muerte de
aproximadamente el 30% de los espermatozoides, reduciendo el porcentaje de
espermatozoides mviles aproximadamente en un 50% (Chaveiro et al 2006).
Con el fin de evitar el dao durante el proceso de congelamiento, se han desarrollado
numerosos diluyentes en base a amortiguadores de pH (tris, cido ctrico), azcares de
bajo peso molecular (fructuosa, glucosa) que pasan a travs de la membrana celular
sirviendo como fuente de energa para el espermatozoide, agentes protectores de
membrana (yema de huevo, leche descremada) que contienen macromolculas que
protegen contra el shock por fro, y agentes crioprotectores permeables glicerol,
polialcoholes y no permeables trehalosa y sacarosa; los primeros son sustancias de bajo
peso molecular que atraviesan la membrana plasmtica, evitando la formacin
intracelular de cristales de hielo y la excesiva deshidratacin causada por la congelacin
lenta (Medeiros et al., 2002) (Medina et al., 2007).
Este trabajo se lleva a cabo en el laboratorio de Biotecnologa animal de la Universidad
de la Fuerzas Armadas ESPE en la facultad de ingeniera agropecuaria Santo Domingo.

II.

Objetivos
II.1.

Objetivo General
Evaluar dos diluyentes (Andromed y Steridyl) para la crio
preservacin del semen bovino.

II.2.

Objetivos Especficos
Evaluar eficiencia en la criopreservacion de semen bovino
Determinar la mortalidad y motilidad progresiva espermtica de las
pajuelas.

III.

Revisin de Literatura.
III.1. Crio preservacin del semen bovino.
La conservacin del semen en nitrgeno lquido tiene como objetivo
fundamental prolongar la viabilidad de los gametos masculinos de forma
indefinida, ya que a temperatura ambiente o de refrigeracin los
espermatozoides degeneran con cierta rapidez, debido principalmente al
agotamiento de las reservas energticas. La inseminacin artificial con semen
congelado ha demostrado ser la tecnologa reproductiva que ms ha contribuido
a acelerar el progreso gentico de las diferentes especies ganaderas,
especialmente del ganado vacuno de aptitud lctea; sin embargo, el xito de esta
tecnologa depende de que el semen utilizado mantenga su poder fecundante tras
su descongelacin. Para conseguir dicho objetivo, en todo protocolo de
congelacin seminal han de controlarse rigurosamente los sucesivos pasos que
constituyen el proceso de criopreservacin, y de forma especial aquellos que
influyen ms directamente sobre la estructura y funcin de las membranas
espermticas, y sobre el metabolismo celular (Muio, 2010).

III.2. Diluyentes Utilizados para la Congelacin del Semen Bovino

Un diluyente seminal debe reunir una serie de propiedades bsicas relacionadas
con su pH, capacidad tampn, osmolaridad, y fuerza inica. Adems debe
aportar una fuente de energa, no debe deteriorarse durante el almacenamiento
previo a su uso, debe proteger a los espermatozoides durante el enfriamiento,
congelacin y descongelacin, y finalmente, debe ser resistente al crecimiento
bacteriano (Ramnez, 2013).

Los diluyentes deben ser libres de elementos de origen animal que contienen
lecitina de soya, se han desarrollado y el 10% de los lpidos de soya es lecitina
que tambin es encontrada en la yema de huevo que pueden sustituir a la yema
de huevo. Tiene un efecto crioprotector por su baja viscosidad, menos residuos y
alto contenido de fosfolpidos al igual que la yema de huevo (Ramnez, 2013).
III.3. Composicin de los diluyentes
Los criopreservantes generan estrs osmtico sobre las clulas aumentando la
osmolaridad del medio. Las clulas inicialmente se deshidratan para compensar
la fuerza osmtica inducida por la presencia de los agentes crioprotectores y
despus se hidrata (Avila-Portillo et al, 2006).
El cido ctrico en los diluyentes neutraliza los productos de desecho del
metabolismo de los espermatozoides, en especial del cido lctico, es decir,
desempea una accin buffer efectiva neutralizando la acidez del medio causado
por los catabolitos. El cido ctrico fija tiene accin fijadora de calcio, que junto
con los iones de sodio y potasio mantienen el equilibrio osmtico, favoreciendo
la motilidad de los espermatozoides por participar en la activacin de la
fosfatasa cida presente en el plasma seminal (Borque & Saguez, 2012).
La fructuosa es necesaria para la supervivencia de los espermatozoides en
condiciones anaerbicas y estn estrechamente relacionada con la motilidad
inicial de los espermatozoides. El semen y la yema de huevo estn propensos a
contaminacin bacteriana, los diluyentes tienen antibiticos (penicilina
procanica, ampicilina, sulfato de gentamicina y lincomicina hidrocloridratado)
para prevenir ms crecimiento bacteriano (Borque & Saguez, 2012).
III.4. Pruebas de viabilidad espermtica.
III.4.1. Motilidad.
La motilidad individual se estima visualizando el movimiento progresivo de
cada uno de los espermatozoides, considerndose un 60% como recomendable
para lograr buenas tasas de fertilidad, siendo esta observacin subjetiva (Hafez
& Hafez, 2000). Recomiendan para la inseminacin en vacunos, un mnimo de
50% de espermatozoides con motilidad individual progresiva despus de
congelar y descongelar (Medeiros, Forell, Oliveira, & Rodrigues, 2002), con un
mnimo en la dosis de 16 x 106 espermatozoides por ml (Pesch & Hoffmann,
2007). En el congelado y descongelado de la pajuela se pierde alrededor de 20%
(Silva & Gadella, 2006).

III.4.2.Anormalidades espermticas
Si la proporcin de anormalidades es ms del 20%, entonces nos encontramos
ante un semen de baja fertilidad y entre las anormalidades ms frecuentes se
encuentran espermatozoides sin cola, cabeza grande, cabeza pequea, cola
reducida, cabeza adelgazada, rotura de cuello y acrosoma anormal (Hafez &
Hafez, 2000).

III.4.3.Porcentaje de vivos

Determinado por tincin supra vital con una mezcla de colorantes, como eosina
al 5% y nigrosina al 10%, donde las clulas que estn vivas excluyen el
colorante, mientras las que estn muertas se tien de rojo con la eosina (Hafez &
Hafez, 2000)

Metodologa
Evaluacin de la motilidad con el sistema CASA
El semen recin extrado fue colocado en bao Mara a 30C; de la muestra se tom
20l y se agreg en cada tubo de ensayo que contenan 1 ml de cada diluyente, se dej
entre 3 a 5 minutos, se tom 10 ul de cada muestra y se puso en cmara Leja a 37C y
se observ con el microscopio del sistema CASA.
Evaluacin de la viabilidad
Se coloc 20 l de la muestra en el porta objetos, se realiz un frotis en la placa
previamente calentada a 37C, se agreg 10 l de eosina y 16 l de nigrosina, se
homogeniz la muestra, se realiz un extendido en la placa, se dej secar por 5 min
sobre la placa trmica y se observ con lente de inmersin; se contabiliz 200
espermatozoides, para obtener el porcentaje de espermatozoides vivos.
Evaluacin de morfologa
Se puso 20 l de la muestra en la placa pre calentada a 37C, se aadi 10 l de eosina
y 16 l de nigrosina, se homogeniz y se realiz un extendido, se dej secar en la placa
trmica durante 5 min y se observ con lente de inmersin, se cont 200
espermatozoides.

IV.

Resultados
% de Vivos o Muertos

Porcentaje

19%

Vivos
Muertos

81%

Determinado por tincin supra vital con una mezcla de colorantes, como eosina
al 5% y nigrosina al 10%, donde las clulas que estn vivas excluyen el
colorante, mientras las que estn muertas se tien de rojo con la eosina

% de Anormalidades

73

15
10

0
Normal

C. Piriforme

2
Macrocefalia

C. Suelta

Sin Cabeza

Si la proporcin de anormalidades es ms del 20%, entonces nos encontramos

ante un semen de baja fertilidad y entre las anormalidades ms frecuentes se
encuentran espermatozoides sin cola, cabeza grande, cabeza pequea, cola
reducida, cabeza adelgazada, rotura de cuello y acrosoma anormal
TEST HOTS.
Evaluacin del test HOST
Se coloc en un tubo de ensayo 1 ml de solucin hipo osmtica a 37C y 25 l
de semen y se agreg 200 l de solucin HOST formol, se tom 12 l de la
muestra y se observ con un lente de 40X. Se cont 100 espermatozoides, se
consider positivos aquellos que muestran una torsin helicoidal de la cola.

TEST HOTS
70.0

62.5

60.0
50.0
40.0

37.5

Porcentaje % 30.0
20.0
10.0

2.0

1.0

0.0
1

2
Positivos

V.

Conclusiones y recomendaciones
Se encontr un porcentaje del 81% de espermatozoides vivos y un 19% de
muertos lo que nos indica que el semen es de buena calidad y el proceso de crio
gnesis fue realizado de una correcta forma.
Asimismo se encontr un 73% de espermatozoides normales, lo que da como
resultado que el semen recolectado fue de buena calidad y es recomendable su
uso en el campo.
El funcionamiento de la membrana plasmtica es un parmetro indicador de la
capacidad fecundante de los espermatozoides, as como la torsin helicoidal de
la cola que esta entre un 45 y 55 % a los mismos que se los considera
espermatozoides positivos, se observ un 37,5 % de espermatozoides positivos y
un 62,5 % de espermatozoides negativos.
Llevar un control de la temperatura para evitar la muerte de los espermatozoides
y que eso infiera en los datos recolectados.

VI.

Bibliografa
Chaveiro A, Machado L, Frijters A, Engel B, Woelders H. (2006). Mejora de los
parmetros de medio de congelacin y congelacin protocolo para esperma de
toro utilizando dos soportes osmticos.
Lozano, H. (2009). Factores que afectan la calidad seminal en toros.
Medeiros, C., Forell, F., Oliveira, A., & Rodrigues, J. (2002). Estado actual de la
crio preservacin.
Minitube. (2016). Diluyente de semen (Minitub, Productor) Obtenido de:
http://www.minitube.de/DE_esl/Productos-y-Servicios/Bovino/Diluyentes-deSemen
Hafez, B., & Hafez, E. (2000). Reproduccin e Inseminacin Artificial en
Animales (Sptima ed.). Mxico, Mxico: Interamericana Mc Graw Hill
Avila-Portillo, L. M., Madero, J. I., Lpez, C., Len, M. F., Acosta, L., Gmez,
C., y otros. (2006). Fundamentos de crio preservacin.
Pesch, S., & Hoffmann, B. (2007). Crio preservacin de espermatozoides.
Medicina Veterinaria.
Silva, P., & Gadella, B. (2006). Deteccin de anormalidades en clulas
espermticas.
Muio Rodrigo (2010). Evaluacin de la motilidad y viabilidad del semen
bovino mediante el uso de sistema casa y citometra de flujo: Identificacin de
subpoblaciones espermticas.
Ramnez Juan (2013). Evaluacin de dos agentes crioprotectores no permeables
y un diluyente comercial (triladyl) en la congelacin de semen bovino.
Borque, M., & Saguez, A. (1992). Variaciones estacionales de los niveles de
fructosa, cido ctrico y protenas totales en eyaculados de Moruecos de la Raza
Manchega.