RECUENTO BACTERIANO

PRACTICA N3

GRUPO: MAYUJAKE
MARIA CAMILA ASSIA ORTIZ
YUCELYS CONTRERAS SINCELEJO
JAVIER RUIZ CONTRERAS
KEVIN ALMANZA HERNANDEZ
DAVID GUEVARA BENITEZ

CARLOS GARCIA MOGOLLON

INGENIERO DE ALIMENTOS

UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE INGENIERIA
PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
SINCELEJO-SUCRE
2015
Laboratorio de Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre

RESUMEN
La prctica de laboratorio consiste en aplicar la tcnica de recuento bacteriano,
empleando el mtodo de conteo directo al microscopio en cmara de Neubauer o
hemocitometro. Para ello se tom como cultivo madre la levadura comercial
diluida en agua destilada estril. Luego se realiz el conteo de dos diluciones
seriadas en cmara de Neubauer observadas en microscopio. El conteo se realiza
teniendo en cuenta el cuadro central dentro del cual se encuentra 5 cuadros
indicados para realizar el recuento.
Palabras claves: levadura, recuento, cultivo, Neubauer, disoluciones.

1. INTRODUCCIN
El crecimiento microbiano se define como el aumento ordenado de todos los
constituyentes qumicos de un organismo, lo cual, para los organismos
unicelulares, conduce a un aumento del nmero de individuos en la poblacin. El
conteo bacteriano seala la magnitud de la poblacin total bacteriana. En ese
sentido se puede determinar por diversas tcnicas que se basan en algunos de los
siguientes tipos de medida: cuenta celular (directamente al microscopio o
mediante un contador electrnico de partculas o indirectamente con la cuenta de
colonias), masa celular (en forma directa pesando el contenido celular del
nitrgeno o indirectamente por turbidimetra, proporcional al nmero de clulas) y
actividad celular (indirectamente relacionando el grado de actividad bioqumica al
tamao de la poblacin bacteriana).
Para determinar el nmero total de clulas, el mtodo utilizado es el recuento
microscpico directo. Se utilizaron las clulas de levadura, se contabilizaron
mediante el empleo de la cmara de Neubauer o hematocitometro sin pinzas,
para la cual es necesaria una ampliacin de 100X o 400X. Las cmaras de
recuento se utilizan para determinar el nmero de partculas por unidad de
volumen de un lquido. Las partculas leucocitos, eritrocitos, trombocitos, bacterias,
esporas, polen etc. se cuentan visualmente con un microscopio. Las cmaras de
recuento BLAUBRAND son instrumentos de precisin para medicin. La placa
base en vidrio ptico especial tiene el tamao de un portaobjetos. Las ranuras
fresadas en la superficie de la placa base la dividen en dos zonas anchas
exteriores y 3 campos pequeos interiores. A diferencia de las zonas exteriores,
que se utilizan para rotulacin, los campos interiores estn esmerilados y pulidos.
En el campo central (fondo cmara) estn grabadas dos cuadrculas de recuento
separadas una de otra por una ranura. El fondo de la cmara del campo central es
usualmente 0,1 mm ms bajo (profundidad cmara) que ambos campos
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adyacentes. Entre campo central y cubreobjetos ya colocado existe por tanto una
ranura de 0,1 mm. La limitacin lateral del volumen a contar se forma mediante las
superficies imaginadas por la proyeccin vertical sobre las lneas exteriores de la
cuadrcula de recuento. Es muy tedioso, no es prctico para un gran nmero de
muestras. No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que
sean observadas al microscopio; y no distingue clulas vivas de muertas.

2. OBJETIVO
General

Desarrollar la destreza en el conteo de clulas en cmara de Neubauer o

hemocitmetro.

Especficos

Reconocer la tcnica de conteo en Cmara Neubauer.

Aplicar y desarrollar el recuento bacteriano con la tcnica de la cmara de
Neubauer.

3. PROCEDIMIENTO

Diagrama de flujo

Laboratorio de Microbiologa Industrial, Universidad de Sucre

RECUENTO
BACTERIANO

Se prepar un
cultivo madre a
partir de 0.5 gr
de levadura seca
y 10 mL agua
destilada

Se prepar dos
soluciones
problemas

Se tom 0.1 mL de
disolucion 10-2 y
se deposit una
alicuota en la
superficie de la
cmara de
Neubauer

Se coloc en la
platina de un
microscopio y se
enfoc con
objetivos (4x y
40x)

Se midi la
biomasa
microbiana por
conteo directo en
cmara de
Neubauer

Se realiz el
conteo teniendo en
cuenta el cuadro
central de la
cmara

En 2 tubos se
realizaron las
diluciones 10-1 (1 mL
cultivo madre + 9 mL
de H 2O destilada) y 10-2

Se anotaron los
resultados

(1 mL solucion 10-1 + 9
mL de H2O destilada)

4. RESULTADOS
En la preparacin del cultivo madre se obtuvo una mezcla homognea blancuzca,
lo que representa la concentracin de levadura en el agua destilada (fig1). Se
indicaron los cuadros para el recuento (fig.2) y se anotaron los resultados del
conteo para las diluciones 10-1 y10-2 (tabla 1).

Figura 1: cultivo madre

figura 2: cultivo enfocado en 4x. Se

observa el cuadro central para el recuento

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FACTOR
[ ] g/ml
Cuadro Cuadro Cuadro Cuadro Cuadro
Total
DILUCI
1
2
3
4
5
N
10-1
0.05
52
56
58
71
60
297
10-2
0.005
28
25
18
11
15
97
Tabla 1: recuento de las clulas en cmara de Neubauer en los 5 cuadros
indicados, para cada dilucin.

Luego se calcul el nmero de clulas por mililitro de muestra para cada tubo y se
anotaron los resultados (tabla 2).
Volumen de la cmara de Neubauer con respecto a las dimensiones de los
cuadros de conteo.
1 mm3 x 0.1 mm = 0.1 mm3
1.1 mm3 x 25 = 2.5 mm3

Se emple la frmula: [1]

1
dilucin
Nmero de cuadros x Volumen

Celulas contadas por dilucin x

N celulas /ml=

Con factor de dilucin 10-1

1
1
10
N celulas /ml=
5 x 2.5 mm3
297 x

= 237.6

Con factor de dilucin 10-2

1
2
10
N celulas /ml=
5 x 2.5 mm3
97 x

= 776

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FACTOR DILUCIN
[ ] g/ml
N Clulas/ml
-1
10
0.05
237.6
10-2
0.005
776
Tabla 2: nmero de levaduras por mililitro de muestra en cada tubo

5. ANALISIS DE RESULTADOS
El recuento de las levaduras se realiz con las diluciones, ya que el cultivo madre
tiene mayor concentracin haciendo ms difcil el conteo. Se puede apreciar en la
tabla 1 los resultados del conteo bacteriano, pero cabe destacar que es un mtodo
poco preciso, puesto que la distribucin de las clulas en cada cuadro vara, por lo
que se saca un promedio de los datos, aun as no es muy exacto el resultado.
De la tabla 2 se puede hacer un anlisis de la concentracin en las diluciones: en
el tubo 1 hay mayor concentracin y mayor nmero de clulas que en el tubo 2,
esto debido a que son diluciones seriadas y a medida que se aade agua
destilada disminuye la concentracin de levaduras y por efecto disminuye el
nmero de microorganismos.

6. CONCLUSIONES

Se hizo un previo anlisis de la cmara de Neubauer para despus hacer

una correcta manipulacin de esta con las muestras.
Se hizo el recuento de las clulas en cada una de las diluciones por conteo
directo en cmara de Neubauer tomando como base el cuadro central.
Se realizaron los respectivos clculos para hallar la concentracin y el
nmero de levaduras para cada dilucin.

7. CONSULTAS
a) Consulte y explique otros mtodos utilizados para la medicin de la biomasa
microbiana.
1. Mtodos directos de determinacin de biomasa: Se basan en el nmero de
clulas o en el peso celular, dentro de estos mtodos podemos distinguir a los
siguientes:

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Mtodos gravimtricos (Peso Seco): La cantidad total de biomasa presente en

una muestra puede medirse en trminos de peso seco por unidad de volumen, ya
sea como slidos en suspensin totales (SST) o slidos en suspensin voltiles
(SSV). Las clulas se separan del lquido bien por centrifugacin bien por
filtracin. Se expresan en g.m.s/mL. La principal desventaja de estas tcnicas es
que su determinacin incluye no slo microorganismos activos sino
microorganismos muertos, material inerte, polmeros extracelulares y materia
orgnica.

Mtodos espectrofotomtricos: Se basan en la existencia de una relacin

directa entre el nmero total de microorganismos presentes en una muestra y su
valor de turbidez. Tras la determinacin de la turbidez de la suspensin celular
mediante espectrofotometra, el resultado se expresa en unidades de absorbancia.
Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como mtodo de recuento, hay que
realizar una recta de calibrado que relacione medidas directas (microscpicas, por
recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez. Esta recta
contiene datos sobre el nmero de clulas, permitiendo la estimacin de tal
parmetro a partir de una sola medida de la turbidez
Mtodos microscpicos
mediante epifluorescencia: La microscopa de
epifluorescencia comenz a emplearse a Principios de los 70 Y hoy en da se
considera como uno de los mejores mtodos para la estimacin de la biomasa. La
epifluorescencia es debida a un agente fluorocromo, a la adicin de algn
anticuerpo marcado con fluorescencia (inmunofluorescencia) o a una
autofluorescencia natural debida a la existencia de algn componente celular
autofluorescente. El procedimiento consiste en la tincin de las bacterias con
dicho agente y posterior recuento mediante microscopa ptica con iluminacin de
epifluorescencia.
Mtodos de siembra: El recuento de microorganismos viables se fundamenta en
la capacidad de dichas clulas viables de desarrollar una colonia visible en un
medio de cultivo apropiado. En los recuentos de placa por vertido, un volumen de
0,1- I ml de la suspensin microbiolgica se mezcla con el medio de cultivo
fundido y parcialmente enfriado en una placa de Petri. En los recuentos en placa
por siembra en superficie, se extiende un volumen de aproximadamente 0,1 ml de
la suspensin sobre la superficie del medio de cultivo.

2. Mtodos indirectos de determinacin de lo biomasa: Estos mtodos se

basan fundamentalmente en la determinacin de algn componente celular
especfico, en la cuantificacin de alguna actividad enzimtica (mtodos
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bioqumicos) o en la medida de consumo de sustrato o de la formacin de algn

producto (mtodos cinticos):

Mtodos cinticos: La base de estos mtodos es la medida del consumo de

sustrato o de la formacin de producto en ensayos en discontinuo. El ejemplo ms
tpico en microorganismos aerobios es la determinacin de la DBO, que indica la
biodegradabilidad de un sustrato en disolucin a travs del consumo de oxigeno dl
medio
Mtodos bioqumicos: Las medidas de alguna actividad enzimtica pueden
considerarse como una alternativa a los mtodos tradicionales. Los ensayos
enzimticos son simples de realizar y sus resultados se obtienen rpidamente.
Adems el equipamiento necesario no es ni costoso ni complejo. La mayora de
las medidas de actividad enzimtica se realiza mediante la conversin de
sustratos especficos a productos coloreados que son cuantificados
fotomtricamente. La principal desventaja de los mtodos bioqumicos es la
variacin de las actividades enzimticas celulares con los cambios fisiolgicos y
que una vez que los microrganismo mueren l las enzimas liberadas pueden seguir
activas.
[2]
3. ATP: La medida de ATP puede usarse para calcular la biomasa microbiana, sin
embargo existen dificultades para el clculo exacto pues en algunos casos la
concentracin de ATP cambia segn sus condiciones alteradas como las
nutricionales y fisiolgicas. La mejor medida sera la cantidad total de compuestos
adenilados:
A: ATP+ ADP + AMP
Esto se calcula con el fin de calcular la carga energtica.
EC:

(ATP+ ADP)
( ATP+ ADP + AMP)

Esta carga energtica es una medida

microorganismos presentes en la muestra. [3]

del

estado

fisiolgico

de

los

b) Consulte las ventajas y desventajas de cada uno de las tcnicas utilizadas en el

experimento

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Ventajas: Es rpido, las exigencias del equipo son mnimas y se pueden observar
las diferencias morfolgicas de los microorganismos
Desventaja: El recuento de microorganismos en cmaras no es un mtodo muy
exacto debido a las irregularidades en la distribucin de la muestra. Adems no se
distinguen clulas vivas de muertas, analiza poca cantidad de muestra, provoca
cansancio del operador y solo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000
por mL, hace ms difcil distinguir los m.o de las partculas de la muestra. [4]

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
[1] Oscar Bastidas. Conteo Celular con Hematocitmetro. Technical Note Neubauer Chamber Cell Counting (consultado:5 octubre 2015). Disponible en:
http://www.celeromics.com/es/resources/docs/Articles/Conteo-CamaraNeubauer.pdf
[2]. Carmen Arniz, Laura Isac y Julin Lebrato. Determinacin de la biomasa en
procesos biolgicos. Artculos Tcnicos. N 205 (200), p. 45 - 50. Disponible en:
http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/tvolke/00_Determin-BM.pdf
[3] Microbilogos Industriales UDES [blog]. Mtodos de Medicin de Biomasa
Microbiana. Viernes, 24 de agosto de 2007 [Consulta 21 septiembre 2015].
Disponible
en:
http://microbiologos.blogspot.com.co/2007/08/metodos-demedicion-de-biomasa.html
[4] Evaluacin del crecimiento microbiano. Curso Microbiologa 2010. Facultad de
Agronoma. Practico 6. [Consulta 21 septiembre 2015]. Disponible en:
http://www.fagro.edu.uy/~microbiologia/docencia/materiales
%20teoricos/evaluacion%20del%20crecimiento.pdf
Tortora, Gerard J (2004). Microbiology An Introduction (8va edicin). Pearson
Prentice Hal

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