CUANTIFICACIN DE PROTENAS MEDIANTE EL MTODO DE BRADFORD

(1976):
La reaccin descrita por Bradford (1976), es una reaccin basada en la fijacin del
colorante Coomassie G-250 a las cadenas alifticas y aromticas de las protenas.
El complejo colorante-protena tiene una coloracin azul, que posee un punto de
absorbancia mxima a 595nm de longitud de onda. Por ende, es posible cuantificar
protenas en solucin basado en este principio.
Objetivo: cuantificar protenas en solucin basado en la formacin del complejo
Coomassie G-250/protena, mediante espectrofotometra visible (595nm).
Protocolo de preparacin del reactivo de Bradford (metodologa descrita
en Ausubel et al. (2001), Cap: 10.1.6 y Bonifacino et al. (2001), Cap:
A.3H.17):
Materiales y reactivos:

100 mg de Coomassie Brilliant Blue G-250

50 mL de etanol al 95%
100 mL de cido fosfrico al 85%
Agua destilada

Protocolo:

En un vaso de precipitado de 50 mL, pesar 100 mg de Coomassie Brilliant

Blue G-250. Disolver cuidadosamente en <25 mL de etanol al 95%.

Agregar la solucin de colorante-etanol a 800 mL de agua destilada.

Utilizar el etanol restante para enjuagar el resto del colorante (2 veces) y
agregarlo al agua.
Mientras la mezcla se agita, agregar lentamente el cido fosfrico al 85%.

CON MUCHO CUIDADO

Aforar hasta 1 L con agua destilada.

Usando papel filtro, filtrar la mezcla con ayuda de vaco.

OJO!: NO CONFUNDIR CON COOMASSIE BRILLIANT BLUE R-250

TENER CUIDADO CON NO SATURAR EL PAPEL, CUANDO EL PAPEL SE

SATURA SE PUEDE ROMPER.
PROBABLEMENTE SEA NECESARIO FILTRAR MS DE UNA VEZ. SE DEBE
FILTRAR HASTA QUE EL REACTIVO TENGA UNA COLORACIN PARDA,
SIN PARTICULAS AZULES. UNA BUENA ESTRATEGIA ES DEJAR
DECANTAR EL COLORANTE POR 24H PARA LUEGO FILTRAR MS
FACILMENTE.

El reactivo se puede almacenar hasta un mes a temperatura ambiente o

bien, puede ser almacenado a 4C por periodos ms prolongados.

Curva de calibracin para cuantificacin de protenas mediante el mtodo de

Bradford (segn metodologa descrita en Cooper (1977)):

BIBLIOGRAFA.
Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K.
eds. (2001) Current Protocols in Molecular Biology. Hoboken, NJ, USA: John
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[Accessed May 24, 2016].
Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J., Yamada K.M. eds.
(2001) Current Protocols in Cell Biology. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons,
Inc. Available at: http://doi.wiley.com/10.1002/0471143030 [Accessed May 24,
2016].
Bradford M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Analytical biochemistry, 72, 248254.
Cooper T.G. (1977) The Tools of Biochemistry. Wiley. Available at:
https://books.google.com/books?id=k33tHfsx9CEC&pgis=1 [Accessed May 24,
2016].