LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

MATERIA: MICROBIOLOGA GENERAL

Prcticas N 3

PRCTICA No. 3
Traer las siguientes muestras : las muestras deben ser tradas en un recipiente con
control de temperatura - coolers a temperatura de refrigeracin en frascos estriles
(frascos gatorade limpios y sometidos a un proceso de desinfeccin por ebullicin que
se lo puede hacer en la casa)

MUESTRA (100g)

GRUPOS
ING.
ALIMENTOS

MUESTRA

Carne molida

1, 5

Agua de ro contaminado

GRUPOS
ING.
AMBIENTAL
(100g)
16, 20, 24, 28

Chochos

2, 6

Suelo agrcola

17, 21, 25, 29

Ensalada de frutas con

crema

3, 7

Agua de acequia

18, 22, 26, 30

Queso fresco

4,

Arena de mar

19, 23, 27, 31

CHIC@S LOS ALIMENTOS NO DEBEN SER COMPRADOS EN SUPERMERCADOS O

RESTAURANTES QUE ASEGURAN BUENA CALIDAD SINO DEBEN CONSEGUIRSE EN
MERCADOS O CENTROS DE EXPENDIO DE ALIMENTOS EN FORMA ARTESANAL

HABRA UNA EVALUACION ESCRITA DE LA PRACTICA

ESTUDIAR EL MATERIAL ENVIADO.
LAS PERSONAS QUE NO TENGAS MANDIL, GORRO Y MASCARILLA NO PUEDEN
INGRESAR A LA PRACTICA.

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Prcticas N 3

TCNICAS DE INOCULACIN - Parte 2

1. OBJETIVOS:

Comparar los mtodos de homogenizacin y tcnicas de siembra

Aplicar las reglas generales de recuento de placas
Familiarizarse con la morfologa de los microorganismos generalmente aislados

2. BASES CONCEPTUALES
TCNICA DE RECUENTO EN PLACA
La calidad de un alimento depende de sus propiedades microbiolgicas, fsicas, qumicas y
sensoriales.
El anlisis microbiolgico de recuento total en placa (RTP) permite determinar la calidad
microbiolgica de los alimentos. Este nmero no guarda relacin con el de microorganismos
patgenos por lo que no puede usarse como ndice de su presencia y slo debe considerarse
un indicador de las caractersticas higinicas generales de la muestra. Los alimentos pueden
tener una apariencia normal pero su RTP puede ser elevado, lo que indica que la alteracin
del producto est muy cercana.
Todos los mtodos basados en el recuento en placa tienen las siguientes limitaciones:
- Se asume que cada clula forma una colonia y que cada colonia se origina por una
sola clula, sin embargo la habilidad de una clula para crecer hasta llegar al tamao
de una colonia macroscpica depende de muchos factores como: estado fisiolgico, el
medio de crecimiento, la temperatura de incubacin, etc.
- Esta tcnica son usadas para cuantificar poblaciones bacterianas > 250 UFC/ml (para
lquidos) o 2500 UFC/ml (para slidos con mayor carga microbiana). Para poblaciones
menores debe usarse otros mtodos.
- Los alimentos fermentados (Ej: quesos Cheddar) contienen naturalmente una elevada
carga microbiana y, por tanto, el RTP no puede utilizarse como medio de evaluar su
calidad microbiolgica general
- No se debe infravalorar el recuento de microorganismos que requieren tiempos de
incubacin, medios de cultivo, temperaturas de incubacin o condiciones de cultivo
diferentes
Dependiendo de las caractersticas del medio utilizado y de las condiciones de incubacin los
microorganismos analizados sern miembros de poblaciones diferentes. En general se
investiga la presencia de microorganismos aerobios o aerotolerantes (anaerobios facultativos);
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Prcticas N 3

aunque, en ciertas situaciones (por ejemplo, alimentos envasados al vaco), puede ser de
inters, hacer recuentos de anaerobios totales. Muchas veces para determinar el nmero de
microorganismos presentes en una muestra es indispensable diluir la muestra 10, 100, 1000 o
as sucesivamente hasta obtener un nmero de UFC que pueda ser contado (rango 30 300
en placas Petri)

El anlisis de un alimento para estimar su RTP implica:

-

Preparacin de diluciones seriadas de la muestra homogeneizada

La siembra en agar para el recuento
Incubacin de las placas sembradas a temperaturas adecuadas
Enumeracin de colonias desarrolladas
Clculo de las UFC/ml o UFC/g

Los recuentos en placa pueden ser determinados a diferentes temperaturas o bajo diferentes
atmsferas para incrementar su especificidad para ciertos tipos de bacteria. El resultado es
funcin de una serie de factores como son el mtodo de muestreo, el tipo de microorganismo,
el tipo de alimento y las caractersticas del medio de cultivo. Los cultivos pueden hacerse
tanto en masa (vertido) como en superficie (extensin).
-

Siembra en superficie o por extensin: Se deja solidificar el medio y sobre este se

extiende la muestra o su dilucin por superficie

Cada bacteria viable formar una colonia, el plaqueo puede hacerse en una placa
normal o por medio de un plaqueador en espiral que va depositando concentraciones
progresivamente ms diluidas de la muestra.

Siembra en profundidad o por vertido: La muestra o su dilucin se dispensa primero

en una placa Petri vaca y luego se aade el agar tibio. Se debe mezclar bien y
despacio el contenido de la placa

Diluciones sucesivas: Consiste en disminuir la carga bacteriana para facilitar el recuento de

los microorganismos presentes en la muestra. Las diluciones decimales de una muestra se
preparan mezclando una parte de la muestra con nueve partes del diluyente que
generalmente es disolucin salina fisiolgica o agua de peptona.

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El factor de dilucin para una muestra para la primera dilucin es 1/10 o 10 -1 y se calcula de la
siguiente forma:

Factor de dilucin=

volumen de muestra
volumen de muestra+ volumen de diluyente

[1]

Se pueden preparar diluciones adicionales segn se necesite

Los resultados se reportan como:
Recuento de bacterias: #UFC/ g o mL de muestra
Recuento de mohos y levaduras: #UPM/g o mL de muestra
UFC: unidades formadoras de colonia
UPM: unidades propagadoras de mohos y levaduras

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LECTURA DE RESULTADOS
Para calcular el nmero de microorganismos de una muestra se debe conocer el factor de
dilucin detallado en la Ecuacin [1], el volumen del inculo y el nmero de colonias de la
placa. Se usa la siguiente expresin

Recuento

UFC
Nmero de colonias en la placa
o
=
( UFC
)
ml
g
factor de dilucin x volumen inoculado en la placa

[2]

Reglas para conteo en placa:

Se deben seguir normas consistentes para el recuento en placa que permitan lograr
resultados que sean comparables entre diferentes laboratorios. Las reglas ms importantes
son las siguientes:
-

Placas con un nmero de colonias en el intervalo de 30 - 300 (la mejor situacin).Seleccionar aquellas placas donde aparezcan recuentos en este rango, pues hay
menor error en el conteo. Calcular el UFC/ml mediante las ecuaciones [1] y [2]

Placas con un nmero de colonias entre 1 20: Registre el nmero real de colonias de
las placas que procedan de la dilucin ms baja (inculo ms concentrado). Indique en
el resultado que el recuento es <<estimado>>
Placas sin colonias: Si no hay ninguna colonia en ninguna dilucin el resultado se
reporta como el ms pequeo del lmite de deteccin del procedimiento utilizado
(nmero que resultara de la presencia de una colonia en la placa en la que se
deposit la dilucin ms baja)
Placas con colonias esparcidas: Cuente una cadena de colonias que no estn muy
separadas como si fuese una sola colonia. Si las colonias pueden distinguirse, no
considere entonces que estn esparcidas para fines de recuento. Si las cadenas de
colonias se forman a partir de puntos distintos, cuente cada colonia como si fuese una
sola. Si la zona esparcida es superior al 25% de la placa, anote el resultado como
<<colonias esparcidas>>
Placas con ms de 300 colonias: Cuente porciones representativas de la placa en la
que se deposit la dilucin ms elevada
o Se puede dividir en dos partes y el nmero de colonias contadas se multiplica
por el nmero de divisiones realizadas.
o Si hay ms de 300 en todas las diluciones se cuentan todas las UFC y se
realiza un promedio de las tres diluciones.
o Si no se puede contar en ninguna placa por el alto nmero de UFC, se reporta
como MNPC (muy numeroso para contar) en este momento, sin embargo, de
tratarse de un anlisis microbiolgico real deber repetirse y hacer ms
diluciones para poder conocer el nmero de UFC presentes en la muestra.

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Ejemplo:
DILUCIN

# UFC

FACTOR DE
DILUCIN

RESULTADO

10-1

298

10

2980

10-2

48

100

4800

10-3

1000

No se usa

PROMEDIO

3890

REPORTE DE RESULTADOS (UFC/g o ml)

3,89 x 10 UFC /g o ml

Ejemplo:

Recuento

UFC
298
o
=
( UFC
)
ml
g
10 .1

= 2980

Recuento

UFC
48
o
=
( UFC
)
ml
g
10 .1

= 4800

3. MATERIALES
Medios de cultivo y reactivos:
-

Medios de cultivo:
Agar nutritivo
PCA

Materiales
- Tubos de ensayo con tapa rosca
- Autoclave
- Incubadora
- pipetas
- Asa de Digralsky
- Placas Petri desechables
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Cultivos:
- Muestra designada por grupo

4. MTODO
DILUCIONES SUCESIVAS
1. Rotule el material (frasco y tubos)
2. Pesar aspticamente 10 gramos de la muestra designada y colocar en 90 ml de agua
de peptona (dilucin 10-1)
3. Homogenizar.
4. Tomar 1 ml de la solucin y llevar a un tubo que contenga 9 ml de agua de peptona.
Homogenizar utilizando un vortex (dilucin 10-2).
5. De ste, tomar 1 ml y llevar a un tubo que contenga 9 ml de agua de peptona.
Homogenizar utilizando un vortex (dilucin 10-3).
6. Realizar las diluciones que sean necesarias dependiendo el tipo de muestra.

SIEMBRA POR VERTIDO

1. Rotule las placas (escriba el nmero d grupo, fecha, medio, microorganismo y
temperatura de incubacin; seale tambin el factor de dilucin y el volumen
inoculado)
2. Preparar el medio de cultivo y mantenerlo a temperatura de distribucin (45-50C)
3. Colocar una alcuota (1 ml) de muestra en las placas petri vacas y estriles.
4. Aadir el medio de cultivo, sobre la muestra.
5. Realizar movimientos giratorios para homogeneizar la muestra con el agar (an
lquido) que imite al de un 8 con el fin de mezclar el cultivo y el medio y, a la vez,
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difundir el agar; usar un agitador de placas.

6. Dejar solidificar el medio de cultivo antes de mover
7. Invertir las placas e incubar a 37C x 24 horas
8. Reportar los resultados referentes a las caractersticas ms sobresalientes de las
colonias encontradas.

SIEMBRA POR EXTENSION

1. Rotule las placas (escriba el nmero d grupo, fecha, medio, microorganismo y
temperatura de incubacin; seale tambin el factor de dilucin y el volumen
inoculado)
2. Depositar sobre el medio de cultivo una alcuota (0.1 mL) de muestra en el
centro de la placa petri con medio de cultivo slido (agar).
3. Luego con el asa de Digralsky, se dispersa o extiende la muestra sobre toda la
superficie de la Placa Petri por lo menos dos veces para asegurar una
distribucin uniforme.
4. Incubar a 37C x 24 horas
5. Reportar los resultados referentes a las caractersticas ms sobresalientes de
las colonias encontradas, en especial contar las colonias aisladas sobre el
medio de cultivo.

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5. CUESTIONARIO DE INVESTIGACIN
1. Se tiene 250 g de muestra. Qu cantidad de diluyente se debe emplear para conseguir
una primera dilucin al 1/10?
2. En qu casos esta tcnica no se usa?
3. Reporte los resultados de los siguientes recuentos (indique los clculos realizados)
Dilucin

Chochos

Chaulafn

Agua de ro
contaminado

10-3
10-4
10-5

295
120
35

115
33
2

655
231
44

Suelo
contaminado con
desechos
orgnicos
MNPC
866
396

6. BIBLIOGRAFA
- Aquiahuatl-Ramos, M.A. Y Prez Chabela, M.L. (2008) Manual de Prcticas.
Laboratorio Microbiologa General. Departamento de Biotecnologa. Universidad
Autnoma Metropolitana.
- Annimo. (sin fecha). Manual de Microbiologa. Departamento de Microbiologa y
Gentica. Universidad de Salamanca.
- Yousef A. & Carlstrom C.(2006). Microbiologa de los Alimentos: Manual de laboratorio.
Editorial Acribia. Zaragoza Espaa.
- Montville T., Matthews K., Kniel K. (2012) Food Microbiology. ASM PRESS.
Washington DC

6. REGISTRO DE DATOS

RECUENTO EN PLACAS
DESCRIPCIN DE LA MUESTRA (para ING.DE ALIMENTOS)
DATOS GENERALES
Muestra
Condiciones de conservacin
Nombre y lugar del expendedor
Fecha y hora de toma de la
muestra.
Fecha de recepcin de la muestra
CARACTERSTICAS ORGANOLPTICAS
Consistencia
Olor
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Color
TRANSPORTE DE LA MUESTRA
Congelada _______
Refrigerada ________
CARACTERSTICAS DE LA MUESTRA
Proceso tecnolgico al que fue
sometido
Observaciones y datos adicionales

T ambiente ______

DESCRIPCIN DE LA MUESTRA (para ING. AMBIENTAL)

DATOS GENERALES
Muestra
Llugar de toma de muestra
Fecha y hora de toma de la
muestra.
Temperatura:
Humedad relativa:
CARACTERSTICAS
Consistencia
Olor
Color
TRANSPORTE DE LA MUESTRA
Congelada _______

Refrigerada ________

T ambiente ______

Observaciones y datos adicionales

TCNICA DE VERTIDO
DILUCIN

# UFC

FACTOR DE
DILUCIN

RESULTADO

10-1
10-2
10-3
PROMEDIO
REPORTE DE RESULTADOS (UFC/g o ml)

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TECNICA DE EXTENSIN

DILUCI
N

# UFC

FACTOR
DILUCIN

DE RESULTAD
O

10-1
10-2
10-3
PROMEDIO
REPORTE DE RESULTADOS (UFC/g o ml)

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