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INDICE
Pg.
RESUMEN
SUMMARY
a) Generalidades
b) Estructura molecular de artemisinina y sus principales propiedades fisicoqumicas
c) Principales metabolitos presentes en Artemisia annua L.
CAPITULO III. PARTE EXPERIMENTAL
17
17
18
18
18
20
28
presentes en A.
a.3) con etanol de 95 tambien, con mezclas de etanol 70%-agua
E.) Extraccin de A de AA con solventes a sus temperaturas de ebullicin 32
a.1) con solventes hidrocarbonados
a.2) con solventes hidrocarbonados incluyendo el agregado de sustancias
atrapadoras de radicales libres (e.g. BHT)
a.3) con etanol de 96 (el mtodo de Roth y Acton) modificado
a.4) con mezclas de etanol 70%-agua
a.5) el mtodo de Elsohly et al.
F.) Separacin de A en los extractos que se obtuvieron a temperatura
ambiente y su posterior aislamiento a temperaturas inferiores a 0 C
43
49
50
53
60
72
71
M.) Mtodo propuesto en este trabajo para la extraccin de A en escala semipreparativa utilizando AA silvestre (Flow-sheet)
N.) Etapas sugeridas para la extraccin en mayor escala de A utilizando
77
81
86
CAPITULO V. Agradecimientos
91
92
a)
_________________________________________
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Fotografa de plantas silvestres de Artemisia Annua L.
observadas al aire libre (mes de Febrero de 2004) en terrenos no
muy frtiles del Departamento Gualeguaych (Provincia de Entre
Ros).
12
13
14
15
16
17
19
23
26
27
28
33
35
40
41
47
48
50
51
65
66
67
76
77
82
_____________________________________
INDICE DE TABLAS
Tabla I. Valores (promedios) de parmetros de retencin
cromatogrfica de analitos presentes en extractos de
Artemisia annua L. silvestre, obtenidos en solventes
hidrocarbonados.
p. 68
Tabla II. Cuadro comparativo de resultados analticos
cuantitativos obtenidos aplicando diferentes mtodos de
extraccin de A de AA utilizados en este trabajo.
p. 69
Tabla III. Solubilidad de artemisinina en solventes y algunas
p. 71
mezclas hidroalcohlicas.
a) Generalidades
La calidad de los extractos vegetales biolgicamente activos depende
principalmente del mtodo de extraccin empleado en su obtencin. Resulta
evidente tambin que el procedimiento seguido en estos casos se ve reflejado
tanto en el rendimiento del compuesto orgnico de inters como en el de otros
metabolitos que pueden en un principio no interesar y que sin embargo,
encontrndose presentes en el vegetal, poseen otras potenciales y diversas
aplicaciones.
Artemisinina (en lo sucesivo denominada simblicamente A en el
presente documento) viene siendo estudiada en este Laboratorio desde el
punto de vista fisicoqumico considerando fundamentalmente su grado de
estabilidad trmica en diversos solventes [1, 2]. Esa droga est presente en
cantidades variables (comprendidas entre 0,1 % y 2 % (p/p), en ejemplares de
Artemisia annua L convenientemente secados para su evaluacin, que crecen
abundantemente en algunas zonas de clima y temperatura moderada del
mundo [3] como as tambin de nuestro pas [4]. (Figuras 1, 2, y 3).
10
11
H 3C
CH 3
o
H
CH 3
12
13
endoperoxdica cclica.
La estabilidad trmica de A depende tanto de su naturaleza peroxdica
como de las condiciones fisicoqumicas del medio en que se encuentre en
solucin [1, 2]. Esto resulta tambin comn para otras novedosas sustancias
preparadas sintticamente y con verificada accin antipaldica [11], como lo
constituyen algunos representantes de los 1,2,4-trioxanos sustituidos (Figura
9).
14
OH
H
O
O
15
O
O
O
OCH 3
artemeter
OC2 H 5
arteeter
C O.O
+ Na
artesunato sdico
16
17
18
Solventes
60
Unidades area
artemisinina
50
1 hora
2 horas
40
30
20
10
0
OH
Et
%
96
na
eto
ac
N
O4
+S
P
E
C
-9 0
(6 0
P
E
no
ile
o -x
19
20
hidrocarbonado
21
22
23
1200
E-25
resduo, mg
1000
A, ppm
800
600
400
200
0
0
(a)
frasco
10
(b)
24
15
bien,
mezclas
de
n-hexano:diclorometano
bien
evaluadas
cuantitativamente
(TLC)
por
sus
reapectivas
25
Fig. 14. Cromatogramas (TLC) tpicos de eludos (10 mL, C.C.) de extractos
de AA en n-hexano obtenidos a reflujo (Soxhlet),). El solvente de elucin es
acetato de etilo (10 % (v/v) : n-hexano. (a) corresponde a analitos con valores
de Rf > 0,2 (probablemente terpenos); (b) fracciones conteniendo artemisinina
(Rf = 0,2); (c) 10 L de patrn de artemisinina (200 ppm en n-hexano).
160
p.133-B
slidos, mg
140
A, ppm
120
100
80
60
40
20
Frasco
0
0
(b) (c)
10
12
14
16
18
26
1000
resduo, mg
450
P 132
A, ppm
800
resduo, mg
p 134
400
A, ppm
350
300
600
250
200
400
150
100
200
f ra s c o
50
0
0
0
4 frasco 6
10
12
27
10
12
14
28
activado (en horno elctrico a 120 C), y colocados en un frasco de vidrio (de
seccin transversal cuadrada) de 1 L de capacidad total (el cual puede ser
hermticamente cerrado con una tapa roscada protegida de su contenido con
una lmina de aluminio y cartn de celulosa), el cual es insertado en un
agitador mecnico horizontal, funcionando a temperatura ambiente (ca 25 C)
durante ca. 8-12 horas. El lquido sobrenadante en el frasco (de color amarillo
claro) al cabo de este tratamiento se filtra por papel de celulosa de grano fino
(porosidad 42) plegado (o bien, en un embudo Bchner, procedimiento ste
apoyado con succin de una bomba mecnica de vaco). A fin de recuperar la
mayor parte de algunos extractivos remanentes provenientes de AA se vierten
sobre el resduo del embudo (percolacin), porciones del solvente utilizado y
finalmente porciones de agua destilada, continuando con presin ejercida
mecnicamente sobre la torta y simultnea filtracin a un Kitasato con ayuda
de presin reducida.
Finalmente, y luego de la decantacin, secado y filtracin por papel de
celulosa, de la fase orgnica, se realiza su concentracin en Rotavapor para el
aislamiento de A y de otros metabolitos de AA, lo cual, en este caso por su
complejidad analtica, resulta apropiado realizarla por cromatografa lquida
en columna de Silicagel (Seccin C. a.3).
a.2) con mezclas-de metanol (3% v/v/n-hexano (incluyendo la centrifugacin
a temperaturas ca. 0C y eliminacin por sublimacin de las impurezas
presentes en A).
Procedimiento. ca. 150 g de partes areas de AA, finamente molidas se
colocan en un frasco (e.g. de 1 L. de capacidad), con tapa de material plstico
roscada, protegida interiormente con un disco de aluminio, conteniendo una
mezcla de 500 mL de n-hexano con el agregado de 3 % (15 mL) de metanol,
el cual es mantenido a temperatura ambiente (ca. 25C) con ocasional
29
30
31
32
C6
RV + (ACN / C6 ; 1/3)
ACN
A + ACN
(a)
(b)
33
34
Pure Solvents
Wasted Solvents
Reflux extraction
Destilation
Filtration
Residue
Recuperate
Evaporation
Impurities separation
Residues
Residue
Evaporation
Chromatographic Column
Eluted Solvents
Evaporation
Crystalizatipn
Purificatin by recrystalizatin
Quality Control of A
HPLC, NMR
35
36
37
38
Procedimiento. ca. 160 g de hojas secas de AA, sin haber sido molidas
previamente, son extradas a reflujo con 300 mL de n-hexano (calidad de
anlisis de pesticidas) en un Soxhlet durante 48 horas (Figura 17). Este
lquido (de color verde amarillento) se evapora en Rotavapor a temperaturas
ca. 40C hasta lograr una consistencia viscosa (12 g; Rto.7,8 %).
El resduo proveniente de la extraccin realizada en el Soxhlet,
mayormente librado de su solvente por evaporacin en Rotavapor, se
particiona tres veces en una ampolla de decantacin, con 60 mL de n-hexano
presaturado (i.g. en la proporcin de 12 mL/g de resduo o extracto) y 20 mL
del acetonitrilo presaturado adicionado de agua (i.g. 4 mL/g de resduo o
extracto). Los extractos en acetonitrilo as obtenidos (i.g. que contienen ca. 20
% de agua) son lavados utilizando 10 % de su volumen de n-hexano
presaturado (a fin de eliminar mayormente los componentes que
simultneamente se extraen de AA (i.e. terpenos, principalmente ceras,
cido arteanuico y probablemente pequeas cantidades de artemisinina). La
remocin del agua que contiene la fase acetonitrilo se realiza en el mtodo
original [16] por la adicin de cloruro de sodio slido, o como se efectu en
este trabajo, con sulfato de sodio anhidro (en la proporcin de 7 g en 100 mL
del acetonitrilo acuoso). La evaporacin total del acetonitrilo, realizada con
presin reducida en Rotavapor, permite obtener un residuo aceitoso de color
marrn amarillento (4,31 g). La mayor parte del cido arteanuico (o
artemisinnico) fue as separada parcialmente por cristalizacin (420 mg) de la
fase acetonitrilo mediante su enfriamiento previo (ca. 0 C). (Figuras 19 y 20).
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res iduo, mg
p. 114
A , ppm
500
400
300
200
fr as co
100
0
0
12
40
16
20
24
28
32
36
(a) (b) c)
(a) (d)
41
42
43
44
45
46
bomba peristltica (Figura 21) y una trampa de lquidos de Pyrex a ca. 10C
(bao de hielo y sal).
Figura 21. Esquema del dispositivo de flujo contino utilizando una bomba
BP
n - hexano
-10 C
47
48
49
9
4
6
5
XXXX
XXXX
XXXX
XXXX
XXXX
XXXX
50
Figura 24. Equipo de HPLC preparativo (con vista de la columna rellena con
Silicagel,(d.i 30 cm y long. 60 cm) utilizado para la aplicacin de la tcnica
Dynamic Axial Compression en la extraccin de A de AA silvestre, con
acetato de etilo (10% v/v):n-hexano como mezcla eluyente.
51
52
53
54
Proceso 2
Aqu se reduce el volumen de etanol utilizado a menos de la mitad, lo que
representa un factor importante para el costo final del producto.
Purificacin
Las soluciones alcohlicas fueron tratadas con Carbn Activado a temperatura
ambiente y enseguida filtradas sobre Celite. Se obtiene as una solucin de
color amarillo oscuro la cual fue adicionada de Silica Precipitada (ZEOZIL).
El solvente se destil y el slido obtenido (FAROFA) fue colocado en un
extractor con agitacin mecnica.
Luego se extrajo con hexano y enseguida con una mezcla de hexano y
15% de acetato de etilo. Los solventes fueron sometidos a una filtracin en
columna de silice precipitada. La relacin dimetro de columna con la altura
de la masa de silice utilizada fue de 1:1,5 y la velocidad de elucin 15 mL
/min. En estas condiciones se obtiene un producto con un rendimiento de 75%
de la cantidad de artemisinina presente en las hojas del material vegetal.
Conclusiones obtenidas en la aplicacin de la Patente de Invencin
El etanol (96) es el solvente ms eficiente, aparte de ser menos txico y
ms barato. El rendimiento sobre la planta secada a 40o C por dos das fue
del orden del 1,2 % (p/p) siendo ca.9 % la humedad contenida en el vegetal
procesado.
El uso de hexano como solvente favorece la extraccin del material graso,
mientras que la mezcla de hexano-acetato de etilo (15% v/v) separa
satisfactoriamente artemisinina de los dems compuestos. Esta solucin fue
tratada con Carbn Activado por aproximadamente 1,5 horas a temperatura
ambiente y enseguida filtrada sobre Celite. La solucin levemente amarilla
fue concentrada por enfriamiento (0 - 5o C) en aproximadamente 2 horas y
55
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reserva el extracto (A-1). Las hojas se retornan al recipiente para ser extradas
nuevamente con etanol 96 por dos veces ms en un periodo de 1 hora 30
minutos, cada una. Se obtienen as los extractos (B-1) y (C-1). Las hojas
agotadas son lavadas con etanol 96 obteniendose el extracto (D-1). Los
extractos (A-1) + (B-1) + (C-1) + (D-1) se mezclan para la inmediata
separacin de artemisinina.
Cantidades de solventes a ser utilizados para la extraccin de 300 g de
hojas de AA molidas.
Etanol
(Primera
extraccin)
590
mL
Etanol
(Segunda
extraccin)
590
mL
Etanol
(Tercera
590
mL
Etanol
(para
300
mL
Extracto
etanlico
extraccin)
Lavado)
obtenido
finalmente
2070
mL
57
para
estos
factores
fueron
1:1,5
15
mL/min.,
respectivamente.
2 Con estas condiciones experimentales es posible obtener un producto con
un tenor de 91 % y un rendimiento de 75 % en relacin a la artemisinina
presente en las hojas de Artemisia annua L. silvestre.
a.1) Conclusiones adicionales de una reciente publicacin [6] que describe
modificaciones al mtodo descripto en la Patente brasilea original (Seccin
I.a) para la obtencin de A a partir de AA.
Los autores del trabajo [6] concluyen que las pricipales modificaciones
a ser introducidas en la aplicacin del mtodo ya descripto en la Patente
deberan ser las siguientes:
58
59
tipos de solventes
60
(I)
donde:
c, es la concentracin de A (expresada en ppm) en la solucin utilizada como
patrn (e.g. 2 g de A /10 mL de n-hexano, 200 ppm).
f, es el factor de coincidencia visual de las intensidades de la mancha de la
muestra desconocida, comparadas con la producida por 10 L de la solucin
patrn de A.
V, es el volumen total de solvente utilizado en la preparacin del extracto de
AA.
61
62
63
64
65
800
Calibracin A (GC-FID)
700
ppm
(p/v ) A
600
CATEDRAL
Sigma 1
Sigma 2
Sigma 3
500
400
300
200
SIGM A
100
Concepcin
Vivot
0
0
40
60
66
80
100
67
_______________________________________________________
Tabla I. Valores (promedios) de parmetros de retencin cromatogrfica de
analitos presentes en extractos de Artemisia annua L. silvestre obtenidos en
solventes hidrocarbonados.
_______________________________________________________
ANALITO RT (HPLC)a Rf (TLC) Vainillin/colorh F254nmi RT (GC)a
Arteanuina B
1,7
0,07
+/marrn
Artemisininac
0,2
+/rosado
-- 30,6 y 32,2
Artemisininad
0,2
+/rosado
- 24,6 y 34,4
Artemisitene
5,3e,f
0, 1
+/rosado
+/marrn
+/marrn
n.d.
________________________________________________________
68
_______________________________________________________
Rendimientob
Calidad del productoc
Mtodo
AAa
de extraccin
g
A% (p/p)
A% (p/p)
_______________________________________________________
n-hexanod
50
50
98
e
150
70
98
n-hexano
f
CO2
200
50
99
.EtOH 70%-agua 150
50
98
_______________________________________________________
a
con ca. 10% de humedad residual; b calculado con AA secada que
contiene 0,12 % (p/p) de A; c RP-HPLC; d a reflujo en Soxhlet; e a
ca. 25C con vigorosa agitacin mecnica; f como fludo supercrtico
(SF) con el agregado de metanol como polarizante.
_______________________________________________________
69
70
__________________________________________________________________________________
12
0,063
Hexano (40C)
460
33000
100000
___________________________________________________________
b) Utilizando mtodos cromatogrficos [19-28]
a.1) Cromatografa planar en capa delgada (CCD, TLC).(ver Seccin J a)
a.2) Cromatografa de alta eficiencia en fase invertida (CLAE, RP-HPLC) )
(ver Seccin J b).
a.3) Cromatografa capilar en fase gaseosa (CG).(ver Seccin J c)
c) Utilizando mtodos espectroscpicos [32]
a.1) Especroscopa infraroja (IR)
a.2) Espectroscopa RMN, NMR de 1H y 13C
Se utiliz equipamiento analtico perteneciente al Laboratorio LADECOR
(UNLP), emplendose patrones autnticos para el control de los resultados o
bien, su comparacin con informacin bibliogrfica disponible.
71
72
73
74
n-hexano),
conjuntamente
con
los
metabolitos
anteriormente
75
C (mg/l)
Ajuste polinomial de la curva
120
Concentracin (mg/l)
100
80
-6
40
20
0
0
2000
4000
Tiempo ( seg.)
76
6000
8000
M.) Mtodo propuesto en este trabajo para la extraccin de A en escala semipreparativa utilizando AA silvestre (Flow-sheet, Figura 29).
Figura 29. Flow sheet del mtodo en escala preparativa propuesto como
resultado de este trabajo, que emplea etanol (96) 70% (v/v) / agua, para la
extraccin de A y otros metabolitos de AA.
2 5 oC
2 hs .
+ + ++ + + + + + ++ + +
A A 1 5 0 g , c a rb n 1 0 g (x 3 )
E tO H 7 0 % a g ua 3 0 % 2 5 0 m L
E tO H 7 0 % a g ua 3 0 % 3 0 0 m L
xxxxxxxxx
R e s d uo A A
(x 3 )
P re si n re d ucid a
1 5 0 m L n-he xa no
2 5 oC
++ + + + + ++ + + + + +
4 oC
c o nc e ntra r R v
A rte m is inina
A c id o A rte a nuic o
O tro s M e ta b o lito s
77
78
79
80
81
Figura 30. Flow Sheet del mtodo propuesto para la extraccin (en 2
operaciones sucesivas) de cido arteanuico y de artemisinina a partir
de 5 Kg de Artemisia annua L. con una mezcla hidroalcohlica a
temperatura ambiente (donde se incluye la etapa opcional de
purificacin por cromatografa en columna)
20 oC
2 hs.
+++++++++++++
xxxxxxxxx
AA 5 kg , carbn 20g
EtOH 70% 1200 mL
(I) y (II)
Acido Arteanuico
Resduo AA
vaco
Na2 SO4
n - C6
EtOH aq
n - C6
4 oC
Acido Arteanuico
o
Artemisinina
82
83
extraccin empleados inicialmente, con ca. 10% de su volumen (ca. 120 mL)
de n-hexano.
8. Las fases superior (orgnica) separadas previamente por decantacin, se
recogern en un Erlenmeyer (provisto de tapa), el que contiene sulfato de
sodio anhidro, colocndolo a temperatura ambiente.
9. Con ayuda de un Bchner se eliminar por filtracin el agente deshidratante
recogiendo el lquido filtrado, con ayuda de presin reducida, en un Kitasato
de 1 L de capacidad.
Nota. El filtro Bchner puede reeemplazarce por un filtro prensa o bien, una
centrfuga de canasto, equipos apropiados provistos con membranas de
celulosa o de algodn.
10. Se realizar el monitoreo de A y de la presencia de sus impurezas (ver
Seccin J,b) a fin de conocer la composicin de la solucin orgnica (i.g. la
cual contiene otros metabolitos de AA como as tambin una cierta cantidad
de A).
11. El lquido orgnico, una vez concentrado en el Rotavapor, se enfriar
convenientemente a ca. 4o C para separar de esta manera A en forma
cristalizada.
Nota. En el caso que sus cristales se encuentrem impurificados con otros
metabolitos de AA (e.g. clorofilas degradadas, restos de lpidos), los mismos
poran ser eliminados de su superficie con n-hexano enfriado (ca. 0C).
12. Opcionalmente, se podra efectuar la evaporacin del lquido anhidro (fase
orgnica) en un Rotavapor hasta reducirlo a un volumen de ca. 20 mL a fin de
la separacin de A y de otros metabolitos a ca. 4C. Eventualmente, se
procedera a su elucin en columnas preparativas empacadas con Silicagel
(ver Seccin C.).
84
85
86
87
88
iniciales
preparados
(principalmente
con
mezclas
89
90
CAPITULO V. Agradecimientos
Los autores agradecen a la Profesora Dra. Etile Spegazzini de la Ctedra
de Farmacobotnica de la Facultad de Ciencias Exactas (UNLP) por la
certificacin de la identidad de los ejemplares de Artemisia annua L. silvestre
utilizados en este trabajo. As tambin a los Ingenieros Qumicos (UNLP)
Edgard Willis y Juan Soto, por las largas y estimulantes conversaciones
mantenidas sobre la marcha de este Proyeco, como tambin a las Contadoras
Pblicas Nacionales (UNLP) Silvia Arrieta y Miriam Cardozo por un Estudio
del Mercado Mundial de artemisinina, realizado con informacin disponible
en Internet y al Licenciado en Qumica Walter Gatti, por su valiosa
colaboracin (ad-honorem) en algunos anlisis cromatogrficos y parte de la
bsqueda bibliogrfica que se realiz. La Farmacutica Ester Michel y el
Ingeniero Qumico Leonardo Schadt llevaron a cabo con mucho entusiasmo y
profesionalismo, de manera ad-honorem, la resiembra en almcigos, cultivo al
aire libre, recoleccin, secado y molienda de las plantas utilizadas de
Artemisia annua L. silvestre. Los Tcnicos Asistente (CONICET) Carlos N.
Odoguardi y Jos Manzione colaboraron en el mecanografiado y anlisis TLC,
respectivamente, del presente trabajo. Esteban Fernndez realiz eficazmente
la edicin electrnica.
91
a)
92
93
18. Equipo HPLC-RP para obtener en escala preparativa productos naturales (origen
Holanda)
19. Dosage de artemisinine par chromatographie su couche mince (CCM).
(Validation de protocole, p. 205-208), Myrriam Gaudin, X. Simonnet, Centre
dhorticulture de researcher en production vegetale des Changins, Centre
darboriculture des Fougeres, CH-1964, Conthey.
20. Thin-Layer Chromatography, Reagents and Detection Methods, Volume 1b. H.
Jork, W. Furik, W. Fischer, H. Wimmer, V. C. H. Weinheim. Translated by F., J. A.
Hampson, 446-452 (1994).
21. HPLC Analysis of Artemisia annua metabolites. Zhou, Z.M., Anders, J.C.,
Chung, H., Theoharides, A.D. J. of Chromatography, 77, 114 (1987).
22. Artemisinin Analysis. DHulst, A., Augustijns, P., Arens, S., Van Parijs,
L.,Colson, S., Verbeke, N., Kinget, R. J. of Chromatographic Sci., 34, 276 (1996).
23. Chromatographic Methods of Analysis of Artemisinin. Ortelli, D., Rudaz, S.,
Cognard, E., Veuthey, Chromatographia, 52, 445 (2000).
24. Visualization Reagents for Sesquiterpene Lactones and Polyacetylenes on ThinLayer Chromatograms. Anna K. Picman, R. L. Ranieri, G.H.N. Towers, Jorgen Lam,
J. of Chromatography, 189, 187-198 (1980).
25. Determination of the Antimalarial Arteether and its Deethylated Metabolite
Dihydroartemisinin in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography with
Reductive Electrochemical Detection, Victor Melendez, James O. Peggins, Thomas
G. Brewer, Anthony D. Theoharides, J. of Pharmaceutical Sciences, 80 (2), 132-138
(1991).
26. Analysis of Artemisinin and Related Sesquiterpenoids from Artemisia annua L.
by Combined Gas Chromatography/Mass Spectrometry, Herman J. Woerdenbag,
Niesko Pras, Rein Bos, Jan F. Visser, Henk Hendriks, Theo M. Malingr.
Phytochemical Analysis, 2, 215-219 (1991).
27. Rapid method for the detection and determination of artemisinin by gas
chromatography. A.T. Sipahimalani, D. P. Fulzele, M. R. Heble , J. of
Chromatography, 538, 452-455 (1991).
94
95
96