Carotenos

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
CENTRO DE INVESTIGACIN EN CIENCIA APLICADA

Y TECNOLOGA AVANZADA
REA DE ALIMENTOS
EVALUACIN DE
DEL CRECIMIENTO CELULAR Y DE LOS
PIGMENTOS
GMENTOS OBTENIDOS DE LA MICROAL
MICROALGA Haematococcus
pluvialis (CHLOROPHYTA:VOLVOC
(CHLOROPHYTA:VOLVOCALES)
ALES) CULTIVADA EN
DIFERENT
DIFERENTES MEDIOS
T ESI S
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR
DOCTORA EN TECNOLOGA AVANZADA
PRESENTA:
Alumna: M. en C
C. Alicia Soledad Martnez Silva
Director de tesis: Dr. Eduardo San Martn Martnez
MEXICO, D. F.
enero, 2010
Alicia Soledad Martnez Silva
ii
El presente trabajo se desarroll en el Laboratorio de Biotecnologa de

Microalgas, en el Laboratorio de Investigacin de Qumica y Biologa de la
Universidad del Mar Campus Puerto ngel y en el Laboratorio de Apoyo
Analtico del Centro de Investigacin en Ciencia Aplicada y Tecnologa
Avanzada (CICATA) del Instituto Politcnico Nacional, Unidad Legaria, bajo la
direccin de Doctor Eduardo San Martn Martnez.
iii
Agradezco
al
Consejo
Nacional
de
Ciencia
Tecnologa
(CONACYT), el apoyo econmico otorgado durante el desarrollo de

la tesis; mediante la beca otorgada.
iv
NDICE
INTRODUCCIN
Pgina
1
CAPTULO 2 JUSTIFICACIN
3
3
3
3
3
4
7
8
10
11
12
14
17
18
22
24
25
25
26
28
29
32
34
37
CAPTULO 3 OBJETIVOS
39
CAPTULO 4 MATERIALES Y MTODOS
40
40
40
40
CAPTULO. 1 ANTECEDENTES
1.1 Pigmentos
1.1.1. Definicin
1.1.2. Clasificacin
1.1.3. Pigmentos Naturales
1.2 Carotenoides
1.2.1. Estructura qumica de los carotenoides
1.2.2. Propiedades fsicas y qumicas de los carotenides
1.2.3. Biosntesis de carotenides
1.2.4. Funciones de los carotenides
1.2.5. Fuentes de carotenoides
1.3 Generalidades de la Asraxantina
1.4 Microalgas
1.4.1. Algunas caractersticas de las microalgas
1.4.2. Aspectos de crecimiento de las mmicroalgas
1.4.3. Produccin de compuestos de inters
1.5 Haematococcus pluvialis
1.5.1. Descripcin de la especie H. pluvialis
1.5.2. Morfologa, estructura y fisiologia
1.5.3. Presencia y distribucin
1.5.4. Composicin qumica
1.5.5. Aplicaciones
1.5.6. Medios de cultivo
4.1 Organismo
4.2 Pruebas preliminares
4.3 Condiciones de cultivo
4.4 Recuento celular
4.4.1 Densidad celular
4.4.2 Parmetros Poblacionales
4.5 Cosecha y secado de la biomasa
4.6 Anlisis Qumico Proximal
4.7 Extraccin
4.7.1 Biomasa Humeda
4.7.2 Biomasa Seca
4.7.2.1.
Mtodo HCl 4N-Acetona
4.7.2.2.
Mtodo Acetona 100%
4.7.2.3.
Mtodo DMSO
4.8 Determinacin de Pigmentos
4.9 Evaluacin del almacenamiento y estabilidad de la biomasa seca
y extractos totales.
46
4.10 Separacin e identificacin de los pigmentos

4.10.1 Cromatografa em capa fina
4.10.2 Cromatografa em columna
4.10.3 Cromatografa de alta resolucin
4.11 Bioensayo Antimicrobiano
4.11.1 Prueba de Susceptibilidad
4.11.2 Categorias de Susceptibilidad
4.11.3 Medios de cultivo
4.11.4 Microorganismos de referencia
4.11.5 Reactivacin, mantenimiento y conservacin de las cepas
4.11.6 Viabilidad de las cepas
4.11.7 Preparacin de los inculos
4.11.7.1. Bacterias
4.11.7.2. Hongo levaduriforme
4.11.8 Seleccin del Antibitico (Control Positivo)
4.11.9 Control negativo
4.11.10 Preparacin de las concentraciones de los extractos
4.11.11 Determinacin de la Actividad Antimicrobiana
4.11.12 Concentracin mnima Bactericida (MBC)
CAPTULO 5 RESULTADOS Y DISCUSIN

5.1 Caractersticas morfolgicas de Haematococcus pluvialis
5.2 Anlisis Qumico Proximal
5.3 Condiciones de cultivo y parmetros poblacionales de
Haematococcus pluvialis.
5.3.1. Densidad celular
5.3.2. Comportamiento del pH y de la conductividad elctrica con
relacin al crecimiento de H. pluvialis.
5.3.3. Divisiones por dia
5.3.4. Tasa de crecimiento especfico
5.3.5. Tiempo de generacin
5.3.6. Produccin diaria
5.4 Extraccin y Determinacin de pigmentos
5.5 Separacin e identificacin de los pigmentos
5.6 Bioensayo de Actividad Antimicrobiana
5.5.1. Controles positivos
5.5.2. Actividad Antimicrobiana de los extractos crudos
47
47
48
48
48
48
49
50
50
51
51
52
52
52
53
53
53
53
54
30
30
31
34
34
36
38
45
CONCLUSIONES
49
RECOMENDACIONES
50
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
51
vi
NDICE DE FIGURAS
FIGURA
Pgina
Estructura
Carotenos.
Carotenoides:
Estructura qumica de algunos Carotenoides: Xantofilas.
Ruta resumida de la biosntesis de los Carotenoides.
10
Ismeros configuracionales de la astaxantina (3S,3S),

astaxantina (3R,3S) y de la (3R,3R) astaxantina.
15
Algunos ejemplos de microalgas de agua dulce y

marinas.
19
Diferentes sistemas de cultivo de microalgas. (a) Cielo

abierto. (b) Bolsas. (c) Garrafones. (d) Estanques. (e)
Fotobioreatores. (f) Carboy.
21
Ciclo de vida de Haematococcus pluvialis. a. Clula

vegetativa falgelada. b. Clula vegetativa sin flagelos.
c. Palmella. d. y f. Aplanspora.
28
Haematococcus pluvialis. (a) Depsito de agua

estancada en los Montes Pirineos, Espaa. (b) Pileta
con agua estancada.
29
Conservacin de H. pluvialis. (a) en agar y (b) en medio

lquido.
40
10
Determinacin de la actividad antimicrobiana por el

mtodo de difusin en placa (Kirby-Bauer). El perfil de
accin se mide por la formacin de halos de inhibicin.
49
11
Diagrama de flujo de la curva de crecimiento

microbiano de los microrganismos de referencia.
52
12
Micrografa H. pluvialis (40X) en forma de quiste

tomada con un microscopio ptico.
27
13
Densidad celular de H. pluvalis en los medios de cultivo

f/2 y QF (fertilizante foliar).
33
14
Variacin del pH de los medios de cultivo f/2 y QF

(fertilizante foliar) de la microalga H. pluvalis en 30 das.
34
qumica
de
algunos
vii
15
Conductividad elctrica de los medios de cultivo f/2 y

QF (fertilizante foliar) de la microalga H. pluvalis en 30
das.
35
16
Divisiones por da de H. pluvialis en los medios f/2 y QF

(fertilizante foliar) en 30 das de cultivo.
36
17
Tasa de crecimiento especfico (m) de los medios de

cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar) de la microalga H.
pluvalis en 30 das.
46
18
Tiempo de generacin de H. pluvialis en 30 das de

cultivo en los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante
foliar).
47
19
Produccin diaria de la microalga H. pluvialis en los

diferentes medios de cultivo.
48
viii
NDICE DE TABLAS
No. Tabla
Pgina
1.
Fuentes naturales de Carotenoides.
2.
Principales organismos productores de Astaxantina.
3.
Clasificacin Taxonmica de Haematococcus pluvialis.
25
4.
Compuestos comnmente presentes en H. pluvialis.
29
5.
Perfil de aminocidos en H. pluvialis.
29
6.
cidos grasos encontrados en la microalga H.

pluvialis.
31
7.
Parmetros
para
las
diferentes
condiciones
preliminares de los cultivos de la microalga.
8.
Condiciones iniciales de los medios de cultivo de H.

pluvialis.
9.
Composicin qumica de diferentes medios de cultivo

utilizados en el crecimiento de H. pluvialis.
41
10.
Microorganismos
antimicrobiano.
11.
Antibiticos
positivos.
12.
Halos de inibicin de los controles positivos.
utilizados
probados
para
en
definir
13
el
ensayo
51
los
controles
63
64
ix
Resumen
La obtencin de carotenoides de microalgas es un tema de gran importancia

cientfica
en
la
industria
alimenticia
acuicultura.
La
microalga
Haematococcusp pluvialis representa una fuente natural de carotenoides como

la astaxantina. Este pigmento tiene una funcin de un poderoso antioxidante
biolgico. Debido a su particular color, puede ser usado para pigmentar los
salmnidos y la trucha arco iris. El objetivo de este trabajo fue estudio
comparativo entre dos medios de cultivo para evaluar los cambios en el
crecimiento celular y el contenido de pigmento en esta microalga. Se utilizaron
clulas de H. pluvialis en forma de quiste y el f/2 (Guillard y Ryther, 1962) y un
fertilizante foliar (QF) como medios de cultivo. La irradiancia fluctu entre
4541,03 y 3766,26 lux. La agitacin fue manual y la temperatura fue de 28oC.
La densidad celular se estim por clulas directo. El pH estuvo entre 8,37 a
8,42 y la conductividad elctrica de 135,3 a 142,1 mV. Para la extraccin de los
pigmentos hmedos en la biomasa hmeda se utiliz acetona 100% y para la
biomasa seca se utiliz DMSO, HCl 4N y acetona 100%. La clorofila a, b, la
astaxantina y los carotenoides totales se midieron mediante espectrofotmetro
UV-visible. Los experimentos se llevaron a cabo 5replicas. H. pluvialis se
adapto en menos tiempo en el medio QF que en el f/2. El contenido de clorofila
a y b en el f/2 fue inferior a la QF. Sin embargo, el contenido de astaxantina
obtenido fue mayor en el medio f/2 que en el medio QF. Los resultados que se
obtuvieron no estn reportados en la literatura, pero algunos autores informan
que se puede obtener hasta el 7% de astaxantina en otros medios.
Abstract
Obtaining carotenoids from microalgae is a subject of great scientific

importance and within the food industry and aquaculture. The microalgae
Haematococcus pluvialis represents a natural source of carotenoids such as
astaxanthin. This pigment acts as functions as a powerful biological antioxidant.
Due to its particular color, it can be used to pigment salmonids and the rainbow
trout. The objective of this work was a comparative study between two growth
mediums to assess changes in cell growth and the pigment content in this
microalgae. We used cells from H. pluvialis in cyst form for cultivation in the f/2
(Guillard and Ryther, 1962) medium and in Foliar Fertilizer (QF) medium. The
irradiance fluctuated between 4541.03 and 3766.26 lux. The agitation was
manual and the temperature was 28oC. The cell density was estimated by cell
counts direct. The pH was between 8.37 to 8.42 and the conductivity of 135.3 to
142.1 mV. For the extraction of wet pigments we used 100% acetone and for
dry biomass we used DMSO, HCl 4N and 100% acetone. Chlorophyll a, b,
astaxanthin
and
total
carotenoids
were
measured
using
UV-Visible
spectrophotometer. Experiments were carried repeated replicated five times. H.

pluvialis adapted in less time in the QF medium than in the f/2. The content of
chlorophyll a and b in the f/2 was lower than QF. However, the content of
astaxanthin obtained was greater for the f/2 media than for the QF medium. The
results using these culture media are not reported in the literature but some
authors reported up to 7% of astaxanthin in other mediums.
xi
CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA
INTRODUCCIN
INTRODUCCIN
En la actualidad, uno de los principales intereses en Ciencia y
Tecnologa de Alimentos es la extraccin y caracterizacin de nuevos
ingredientes funcionales de origen natural. Estos ingredientes biolgicamente
activos pueden ser utilizados no slo como conservadores naturales contra la
degradacin de los alimentos, sino tambin se pueden aadir a los alimentos
como ingredientes capaces de promover nuestra salud (Guarner y Azpiroz,
2005)
Entre los compuestos activos se encuentran algunos pigmentos
naturales como los carotenoides que son los responsables de los colores
naturales de color amarillo, naranja y rojo, utilizado en la industria alimentaria,
farmacutica, cosmtica y diettica. Ms all de su uso extensivo como
colorante y el enriquecimiento de los alimentos, tambin se utilizan debido a su
actividad pro- vitamnica A, y sus propiedades que se traducen en posibles
funciones biolgicas benficas para la salud, tales como el fortalecimiento del
sistema inmunolgico y disminucin del riesgo de enfermedades degenerativas
(ciertos tipos de cncer, las enfermedades cardiovasculares, degeneracin
macular y las cataratas) (Niizu, 2003).
Una de las fuentes naturales de pigmentos carotenoides ms apreciadas
en las ltimas dcadas por su diversidad y propiedades teraputicas son las
microalgas. Estos organismos son una fuente natural muy interesante de
nuevos compuestos (Plaza et al., 2008).
Varias especies de microalgas se cultivan comercialmente en algunos
pases y la biomasa producida ha sido utilizada como una fuente de productos
para su aplicacin en la industria alimentaria. Segn Pulz y Gross (2004), el
mercado de alimentos funcionales, utiliza microalgas en pastas, pan, yogur,
bebidas y muestra un rpido desarrollo en los pases como Francia, Estados
Unidos, China y Tailandia. Las principales microalgas que se cultivan
comercialmente son de los gneros Chlorella Beyerinck (Chlorophyceae) y
Arthrospira Stizenberger, (Cyanophyceae); para alimentos naturales ("Health
food"); Dunaliella salina Teodoresco, (Chlorophyceae) para la obtencin de
INTRODUCCIN
betacaroteno y Haematococcus pluvialis Flotow (Chlorophyceae) para la

obtencin del pigmento astaxantina (Becker, 2004).
Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae) es una microalga verde
unicelular de agua dulce que ya ha sido estudiado por su capacidad para
acumular el pigmento astaxantina bajo condiciones de estrs. La astaxantina
es un carotenoide rojo-naranja con fuertes propiedades antioxidantes (Yuan y
Chen, 1998). Adems, como ya ha sido demostrado en otros organismos y en
algunas microalgas (Borowitzka, 1999; Mendes et al., 2003; Cohen, 1999;
Molina Grima et al., 2003), que junto con la astaxantina, existen diferentes
compuestos
con
propiedades
antibacterianas,
antivirales
y/o
actividad
antifngica que se pueden esperar que se encuentren tambin en esta

microalga. Por lo tanto, H. pluvialis puede ser considerada como una fuente
natural potencial de pigmentos naturales que podran utilizarse como
ingredientes para la preparacin de alimentos funcionales.
Sin embargo esta microalga no es de fcil cultivo y presenta ciertas
dificultades al obtener los pigmentos en unas cantidades apreciables lo que
debilita sus posibilidades de uso como fuente natural dichos compuestos.
Actualmente se estn desarrollando medios de cultivo ptimos para su
crecimiento as como una adecuada tecnologa de cultivo que incrementara la
produccin de biomasa hasta niveles relevantes para la produccin de estos
compuestos.
No obstante, el uso de los medios de cultivo sintticos ha incrementado
sustancialmente el valor econmico para la produccin de la biomasa de este
microorganismo (Gonzlez et al., 1999). Por lo que recientemente se ha
ensayado el uso de sustratos alternativos y no convencionales (Gonzlez et al.,
1999, Romero et al., 2001, Vigna et al., 2002 y Vera et al., 2002). Se destaca
que a partir de estos medios innovadores se han obtenido resultados
comparables y superiores a los correspondientes a los medios sintticos.
En este trabajo se presenta un estudio comparativo entre dos medios de
cultivo para evaluar los cambios en el crecimiento, el contenido pigmentos
fotosintticos y la actividad antimicrobiana de Haematococcus pluviales
cultivada en medio f/2 (Guillard y Ryther, 1962) y un Fertilizante foliar.
ANTECEDENTES
CAPTULO 1
ANTECEDENTES
1.1. Pigmentos
Los pigmentos son generalmente colores que se pueden observar

durante toda la vida. Estn presentes en todos los organismos del mundo,
siendo las plantas los principales productores. Los pigmentos naturales o
sintticos son utilizados en medicamentos, alimentos, ropa, cosmticos,
decoracin y en varios otros sectores.
1.1.1. Definicin
Los pigmentos son compuestos qumicos que absorben luz en el
intervalo de longitud de onda de la regin visible. La produccin del color se
debe a la estructura especfica del compuesto (cromforo), esta estructura
capta la energa y la excitacin que es producida por un electrn de una rbita
exterior a una rbita mayor, la energa no absorbida es refleja y/o refractada
para ser capturada por el ojo, y los impulsos neuronales generados sern
transmitidos al cerebro, donde puede ser interpretados como color (DelgadoVargas, et al, 2000).
1.1.2. Clasificacin
Los pigmentos pueden ser clasificados tomando en cuenta algunas de
las caractersticas como origen (naturales, sintticos o inorgnicos), estructura
del cromforo (pueden tener sistemas conjugados como los carotenoides, las
antocianidas y las betalanas), estructura de los pigmentos naturales (como los
derivados del tetrapirrol, derivados de los isoprenoides, etc.) y como aditivos
alimentarios (pueden ser certificados y no certificados, segn la FDA).
1.1.3. Pigmentos Naturales

Hoy en da, las ventajas de los pigmentos naturales sobre los sintticos
han aumentado debido a las propiedades biolgicas de los pigmentos naturales
que se han ido descubierto. Adems, algunos productos tienen un gran valor
en el mercado slo la utilizacin de tintes naturales. Sin embargo, es necesario
ANTECEDENTES
sealar que las ventajas de los colorantes sintticos son muy conocidas como
el alto poder de pigmentacin, la estabilidad, el almacenamiento, la facilidad del
proceso de obtencin y, adems, son ms baratos y estn disponibles en
cantidades ilimitadas (Wissgot y Bortlik, 1996).
Los pigmentos naturales presentan otra funcin adems de embellecer
el medio ambiente. Es a travs de ellos, que produce el proceso de
fotosntesis, lo cual sera imposible sin la presencia de la clorofila y de los
carotenoides. Asimismo, se ha reportado en la literatura, la accin antioxidante,
la fotoproteccin (Teramura y Middleton, 1993), los mecanismos de defensa de
plantas (Snyder y Nicholson, 1990), y la participacin en los procesos sexuales
de las plantas y los animales. Actualmente se sabe que adems de pigmento,
el color y tienen diferentes funciones en el cuerpo donde estos compuestos se
encuentran,
estos
compuestos
pueden
tener
efectos
farmacolgicos
beneficiosos para el consumo.

Cuatro grupos principales de pigmentos son responsables de la
coloracin en mamferos, aves, peces e invertebrados de importancia
econmica. Estos son las porfirinas, piridinas, melaninas y carotenoides
(Hudon, 1994). Las porfirinas son de importancia primordial en la coloracin de
la cscara de huevos de especies aviares (Lang et al., 1987). Las piridinas son
responsables por muchos de los amarillos y rojos brillantes en peces, anfibios y
reptiles (Nixon, 1985); estos pigmentos son solubles en agua y son de
produccin endgena (Hudon, 1994). Las melaninas dan lugar a los negros,
grises y marrones de vertebrados y muchos invertebrados, as como tambin
de sus rojos y amarillos. Las melaninas son polmeros heterogneos
compuestos de metabolitos de tirosina (Hudon, 1994). Los pigmentos
carotenoides, obtenidos por los animales de sus dietas, confieren la mayora de
los brillantes colores rojo, amarillo y naranja, muy apreciados no slo en
acuicultura, sino tambin en la industria avcola (Toyomizu et al., 2001).
1.2. Carotenoides
Los carotenoides son pigmentos naturales responsables de los colores

amarillo, naranja y rojo en muchos alimentos tales como frutas, verduras, yema
de huevo, algunos pescados como el salmn, la trucha y los mariscos
ANTECEDENTES
(Maldonade et al., 2007).

En
las
industrias
de
alimentos,
los
carotenoides
se
utilizan
principalmente como colorantes, con el objetivo de restablecer el color perdido

durante el procesamiento y almacenamiento as como estandarizar el color de
algunos productos alimenticios. Recientemente, con el creciente inters en la
salud, los carotenoides tambin se han aadido a los alimentos por presentar
actividades biolgicas que enriquecen los productos alimenticios. Tambin son
importantes precursores de muchos compuestos qumicos responsables del
aroma de algunos alimentos, de algunos olores florales (Snchez-Contreras et
al., 2000), de color especfico y fotoproteccin (Marasco y Schmidt-Dannert,
2003).
Adems de color, los carotenoides tienen importantes actividades
biolgicas como la inhibicin de las enfermedades que ocasionan los radicales
libres presentes, tales como la arteriosclerosis, cataratas, degeneracin
muscular, la esclerosis mltiple, el cncer, las enfermedades degenerativas y
cardiovasculares (Maldonade et al.,2007; Bhosale, 2004; Aksu y Eren, 2007).
Industrialmente los carotenoides como el b-caroteno y la astaxantina son
utilizados como colorantes naturales para alimentos o adicionados en las dietas
en acuicultura (Aksu y Eren, 2007). La astaxantina es un pigmento encontrado
en los animales acuticos, tales como la langosta, el cangrejo y el camarn.
Este pigmento protege contra los radicales libres, la peroxidacin lipdica, el
dao oxidativo del colesterol LDL, la oxidacin de cidos grasos esenciales
poliinsaturados y la proteccin contra los efectos de la luz ultravioleta, las
membranas celulares, las clulas y los tejidos (Hu et al., 2006).
Debido a la alta tasa de insaturacin, factores tales como el calor, la luz
y los cidos ocasionan isomerizacin de los carotenoides trans, que es la forma
ms estable en la naturaleza, a forma cis, promoviendo una ligera prdida del
color y de la actividad pro-vitaminca. Los carotenoides son tambin
susceptibles a las oxidaciones enzimticas o no enzimticas, que dependen de
la estructura de los carotenoides, la disponibilidad de oxgeno, la presencia de
enzimas, metales, pro-oxidantes y antioxidantes, la alta temperatura y la
exposicin a la luz (Schroeder y Johnson, 1995).
Los pigmentos pueden absorber la luz sobre todo en la regin
ultravioleta (UV) y del espectro visible, el resto es transmitido o reflejado, y
ANTECEDENTES
representa el color. La estructura responsable de la absorcin de la luz es el

grupo cromforo, por la que los carotenoides se caracterizan por dobles
enlaces conjugados. Cada carotenoide es caracterizado por un espectro de
absorcin electrnica. Por lo tanto, la espectroscopia de absorcin es una
tcnica importante en el anlisis de los carotenoides (Gross, 1991).
La produccin comercial de los carotenoides a partir de microorganismos
compite principalmente con la produccin sinttica por procedimientos
qumicos. Actualmente, los carotenoides utilizados industrialmente se obtienen
por va qumica o por extraccin de plantas y/o las microalgas. Sin embargo,
debido a la preocupacin por el uso de aditivos qumicos en los alimento, existe
un creciente inters por los carotenoides obtenidos naturalmente por procesos
biotecnolgicos.
Comercialmente, los carotenoides son utilizados como colorantes
alimentarios y como suplementos nutricionales, con un mercado mundial
estimado en US$ 935 millones/ao, siendo que solamente la astaxantina
representa cerca de unos US$ 150 millones en el ao 2000 y, con un valor de
US$ 2000/kg (Fraser y Bramley, 2004).
Segn Silva (2004), la produccin biotecnolgica de carotenoides ha
aumentado debido a factores tales como la posibilidad de utilizar sustratos de
bajo costo para la bioproduccin; la denominacin de sustancias naturales;
pequeo espacio de produccin, no est sujeta a las condiciones ambientales
como el clima, la temporada o la composicin de los suelos, y el control de las
condiciones de cultivo.
1.2.1. Estructura qumica de los carotenoides

Los carotenoides son en su mayora compuestos tetraterpenoides
formados por ocho unidades isoprenoides, siendo el esqueleto de la molcula
un largo sistema central de enlaces dobles alternados (Britton, 1995). Los
hidrocarburos correspondientes a la frmula emprica C40H56 son conocidos
como carotenos (Figura 1) y los derivados conteniendo una o ms funciones
oxigenadas (aldehido, cido caboxlico, epoxi, hidroxi, ceto, metoxi) se conocen
como xantofilas, como se muestra en la Figura 2 (Schmidt et al., 1994).
Los carotenoides pueden tambin ser acclicos o poseer un anillo de seis
miembros (ocasionalmente de cinco miembros), a uno o ambos extremos del
ANTECEDENTES
esqueleto molecular (Schmidt et al., 1994). Pueden tambin estar presentes en

forma libre, as como en forma de steres, glicsidos, sulfatos y carotenoprotenas (Matsuno y Hirao, 1989).
Figura 1. Estructura qumica de algunos Carotenoides: Carotenos.
1.2.3. Propiedades fsicas y qumicas de los carotenoides

Las
propiedades
fsicas
qumicas
de
los
carotenoides
son
consecuencia de su estructura qumica. El sistema de dobles enlaces

conjugados, su ms notable caracterstica, es el cromforo absorbente de luz
que confiere a estos pigmentos su atractivo color. La mayora de los
carotenoides absorbe luz en el intervalo de 400-500 nm, exhibiendo su mximo
a tres longitudes de onda que resultan en un espectro de tres bandas. A mayor
nmero de dobles enlaces conjugados, mayor el valor de l mxima. Sin
embargo, la ciclacin de la molcula resulta en cambio hipsocrmico
(desplazamiento del l mxima hacia una ms baja longitud de onda), efecto
ANTECEDENTES
hipocrmico (descenso en absorbancia) y prdida de estructura fina (espectro

con picos menos definidos).
Figura 2. Estructura qumica de algunos Carotenoides: Xantofilas.
El licopeno (Fig. 1), un carotenoide acclico insaturado, es rojo y

presenta l mxima a 444, 470 y 502 nm; el b-caroteno bicclico, si bien
contiene el mismo nmero de dobles enlaces conjugados como el licopeno, es
amarillo-naranja y tiene un l mxima a 450 y 477 nm y una mera inflexin a
425 nm. El g-caroteno monocclico es rojo anaranjado y exhibe un l mxima y
espectro intermedio entre los del licopeno y b-caroteno. Otros carotenoides, en
ANTECEDENTES
lugar de exhibir un espectro de tres picos, presentan un espectro que consiste

en una banda nica, ancha y simtrica. Este es el caso de los cetocarotenoides, tales como la astaxantina, cantaxantina y equinona. Tanto, la
longitud de onda de mxima absorcin (l max) y la forma del espectro
(estructura espectral fina) son caractersticas del cromforo de la molcula que
proveen valiosa informacin para identificar carotenoides (Britton, 1995) Aparte
de sus propiedades de absorcin de luz, la cadena polieno tambin confiere a
los carotenoides su distintiva reactividad qumica, de ser muy susceptible a la
oxidacin e isomerizacin. Un gran nmero de ismeros geomtricos pueden
existir; sin embargo, los carotenoides son naturalmente de la forma trans (E), si
bien la presencia de ismeros cis (Z), usualmente en pequeas cantidades,
deber ser siempre considerada (Schmidt et al., 1994). La inestabilidad de los
carotenoides respecto a la oxidacin, es una caracterstica importante de la
molcula en relacin a la qumica de los radicales libres (Britton, 1995)
En lo que respecta a su solubilidad, los carotenoides son como otros
compuestos
isopropenoides
superiores,
siendo
los
carotenos
tpicos
hidrocarburos no polares y las xantofilas ms polares, pero insolubles en agua

(Schmidt et al., 1994). Su comportamiento lipoflico hace de ellos propensos a
acumularse
en
compartimientos
lipoflicos
como
las
membranas
lipoprotenas. La tendencia lipoflica de estos compuestos influencia tambin en

su absorcin, transporte y excrecin en el organismo (Stahl et al., 1993). Slo
combinados con protenas (caroteno-protenas), los carotenoides son solubles
en una fase acuosa. La presencia de caroteno-protenas se observa en
crustceos tales como langosta, cangrejo y langostino (Shahidi et al., 1998).
Es de gran importancia entender las propiedades fsicas y qumicas de
los carotenoides, tales como su tamao, forma, polaridad, siendo estas
determinantes
para
su
habilidad
de
encajar
correctamente
en
su
medioambiente molecular y permitirles su ptimo funcionamiento (Britton,

1995).
1.2.4. Biosntesis de carotenoides

La biosnteis de carotenoides se produce a travs de la ruta de los
isoprenoides o terpenoides. El primer paso importante en la biosntesis de
carotenoides (Figura 3) es un acoplamiento cabeza con cabeza de dos
ANTECEDENTES
molculas del C20 geranil-geranil difosfato (GGPP) que da lugar al incoloro

fitoeno. En los siguientes pasos, la introduccin de dobles enlaces crea las
propiedades absorbentes de luz, que determinan el color de los carotenoides.
Finalmente, ocurren diversas variaciones estructurales, que segn Britton,
(1998) resultan en los cientos de carotenoides.
Figura 3. Ruta resumida de la biosntesis de los carotenoides.
1.2.5. Funciones de los carotenoides

Las funciones de los carotenoides pueden ser divididas en dos grupos:
(1) fenolgicas y (2) fisiolgicas (Latscha, 1991). En la naturaleza, el rol ms
evidente de los carotenoides es el de conferir la diversidad de colores
observados en plantas, frutos, flores y en el reino animal.
En plantas superiores, los carotenoides no slo confieren coloracin,
sino tambin caractersticas de sabor y fragancia (tabaco, flores y frutas), a
travs de metabolitos de carotenoides (Enzell, 1985). Las funciones fisiolgicas
10
ANTECEDENTES
de los carotenoides en plantas se relacionan con su rol en el proceso

fotosinttico.
En la fotoproteccin, los carotenoides disipan la energa lumnica usada
en la fotosntesis e inhiben la formacin de especies de oxgeno reactivo
(ROS), siendo ambos mecanismos de defensa contra la excesiva energa solar.
Adems los carotenoides participan en la coleccin de luz y la transferencia de
energa a la clorofila, para la funcin de fotosntesis (Deming-Adams et al.,
1996).
En animales, una de las ms importantes funciones de los carotenoides
es como precursores de vitamina A (Krinsky et al., 1993). Este campo ha sido
extensamente estudiado debido a la importancia fisiolgica de la vitamina A en
el crecimiento, la visin y la reproduccin. No todos los carotenoides son
precursores de vitamina A; slo 60 han sido mencionados como precursores de
retinoides (Pfander, 1987). Los ms importantes precursores son: a-caroteno,
g-caroteno, b-criptoxantina, equinona, b-apo-12-carotenal y por supuesto bcaroteno. Desde el punto de vista estructural, los precursores de retinoides
debern tener por lo menos un anillo b no sustitudo Sin embargo, se ha
encontrado que ciertas xantofilas, tales como cantaxantina, astaxantina,
zeaxantina, lutena y tunaxantina, son tambin precursores de retinoides en
peces y ratas (Matsuno, 1991).
Los carotenoides participan en los mecanismos de proteccin contra la
oxidacin, atrapando dos de las molculas ROS (Sies, 1986; Halliwell, 1996):
(1O2) un estado excitado de una forma parcialmente reducida de oxgeno,
inestable y altamente reactiva, y radicales peroxil, generados en el proceso de
oxidacin de lpidos (Stahl y Sie, 2003). En general, los carotenoides son
considerados antioxidantes, previniendo enfermedades causadas por estrs
oxidativo (Chew y Park, 2004).
Los carotenoides tambin participan en la mejora del crecimiento (Inborr
y Lignell, 1997), en la funcin inmune y resistencia a enfermedades en
animales superiores y el hombre (Jyounchi et al., 1993; Chew y Park, 2004), en
la funcin reproductiva, adems de participar en seales sexuales, se ha
observado la mejora del desempeo reproductivo de vacunos alimentados con
dietas suplementadas con b-caroteno.
11
ANTECEDENTES
1.2.6. Fuentes de carotenoides

Entre el grupo de carotenoides sintticos, la astaxantina es el principal
pigmento usado en acuicultura a nivel mundial (Higuera-Ciapara et al., 2006),
siendo la cantaxantina la fuente predominante en salmnidos (Torrissen, 1986;
Choubert et al., 1994; Metusalach et al., 1996). Sin embargo, ya que la
astaxantina es el carotenoide presente naturalmente en el msculo de los
salmnidos, la astaxantina sinttica es el pigmento preferido ya que produce el
verdadero color observado en estas especies. En cuanto a la cantaxantina,
esta le confiere al filete una coloracin ms amarillo-anaranjada (Johnson,
1992).
El alto costo de los carotenoides sintticos y la creciente demanda por
una pigmentacin natural, ha estimulado el uso de fuentes naturales de
carotenoides (Tabla 1) con potencial de industrializacin. Sin embargo, estos
productos participan a la fecha de slo una pequea fraccin del mercado,
debido a su limitada produccin (McCoy, 1999). Es este el caso de algunos
microorganismos tales como microalgas, bacterias y levaduras que se ha
informado sintetizan astaxantina (Johnson y Schroeder, 1995; Amstrong, 1997)
y otros carotenoides de inters.
La microalga de agua dulce Hematococcus pluvialis tiene la habilidad de
acumular grandes cantidades de astaxantina, a nivel de 1.5 a 5.0% w/w en
base seca (Johnson y Schroeder, 1995; Krishna y Mohanty, 1998). Otra
microalga que tambin ha dado resultados positivos en pigmentacin de peces
es Chlorella vulgaris (Gouveia et al., 1996; 2002); mientras que la microalga
Chlorococcum sp parece ser una fuente promisoria de astaxantina,
cantaxantina y adonixantina (Higuera-Ciapara et al., 2006). Es preciso sealar
que adems de conferir coloracin apropiada, las microalgas tendran un efecto
positivo en el crecimiento, como fue mostrado en un estudio con larvas de
Penaeus monodon (Darachai et al., 1999).
En el campo de las levaduras, Phaffia rhodozyma es probablemente la
ms importante, ya que contiene astaxantina como su principal carotenoide
(Andrewes y Starr, 1976), constituyendo aproximadamente 83 a 87% del total
de pigmentos (Shahidi et al., 1998). El ismero ptico (3R,3R) de astaxantina
predomina en las levaduras rojas, opuesta a la configuracin normal (3S,3S)
presente en otras fuentes (Andrewes y Starr, 1976). Los ismeros pticos
12
ANTECEDENTES
tienen el mismo grado de utilizacin y su configuracin ptica es mantenida

despus de su deposicin en el msculo de la trucha arco iris (Foss et al.,
1984). Johnson et al., (1980) han informado que Phaffia rhodozyma tambin es
una buena fuente de protenas y lpidos. La inclusin de esta fuente de
carotenoides, aparte de su efecto positivo en la pigmentacin de peces, mejora
la funcin heptica y el potencial defensivo contra el estrs oxidativo (Nakano
et al., 1995; 1999)
Tabla 1. Fuentes naturales de Carotenoides.

Fuente
(mg/Kg)
Harina de flor de cempaschil (Tagetes erecta)
6000 10000
Harina de chile (Capsicum annuum)
500 10000
Microalga Chlorella sp.

Harina de alfalfa (Medicago sativa)
4000
400 500
Harina de glten de maz (Zea mais)
330
Pprika espaola
274
Achiote (Bixa Orellana)
265
Maz amarillo (Zea mais)
10 25
Fuente: Cuca et al., 1990
Los desechos del procesamiento de crustceos (camarn, krill, cangrejo

y langostino) tienen tambin potencial como fuentes de carotenoides. En vista
del hecho que cerca de 70% del peso bruto de la captura constituyen desechos
de procesamiento (Simpson y Haard, 1985), la necesidad de reducir los
problemas medioambientales causados por el gran volumen de estos desechos
(Torrissen y Naevdal, 1984; Sahidi, 1995) y su contenido de carotenoides,
hacen de los desechos de crustceos un material atractivo para su
industrializacin, siendo la astaxantina el carotenoide predominante (Shahidi et
al., 1994; Higuera-Ciapara et al., 2006). Por lo general, este material est
compuesto de sales minerales (15-35%), protenas (25-50%), quitina (25-35%),
de acuerdo con Lee y Peniston, (1982).
Los subproductos de crustceos han sido utilizados en la coloracin de
tegumentos y msculos de especies de importancia econmica, con buenos
13
ANTECEDENTES
resultados (Torrissen et al., 1989; Coral, 1997). Desventajas de esta fuente de

carotenoides son la variabilidad en la concentracin de pigmento y los elevados
contenidos de ceniza y quitina, que reduce significativamente su digestibilidad
por los peces y limita grandemente el nivel de inclusin en la formulacin de
dietas.
Las plantas tambin muestran potencial como fuentes de carotenoides,
como los ensayos con pimentn rojo han dado buenos resultados, si bien se
observ una ms baja eficacia en comparacin con astaxantina disponible
comercialmente (Carter et al., 1994; Yanar et al., 1997). Adems, los pigmentos
de la leo resina de pprika confieren una coloracin menos deseable a la
trucha arco iris, en comparacin con la cantaxantina (Katar et al., 1999).
En un estudio llevado a cabo con Sparus aurata (la dorada) alimentada
con una dieta conteniendo harina de gluten (rica en zeaxantina) la coloracin
de la frente y el oprculo alcanzaron el amarillo caracterstico de sus
contrapartes silvestres (Robaina et al., 1997). Es de inters continuar
investigando otras probables fuentes vegetales de carotenoides para peces. El
calendula (marigold), rico en lutena, puede ser una alternativa interesante,
dado su eficaz uso en la avicultura para la coloracin de la yema del huevo y
de la piel.
1.3. Generalidades de la astaxantina.
La
astaxantina
(3,3-dihidroxi-b,b-caroteno-4,4-diona)
es
un
oxicarotenoide como se observa en la Figura 4 y pertenece al grupo de las

xantofilas.
La astaxantina producida industrialmente presenta una molcula idntica
a aquella presente en organismos vivos, siendo una mezcla de los ismeros
(3S, 3S), (3R, 3S) y (3R, 3R) en proporciones 1:2:1, respectivamente (Fig. 4).
Al igual que otros carotenoides, este pigmento est formado por ocho unidades
de isopreno que por condensacin dan estructuras carbonadas de cuarenta
tomos, llamados tetraterpenos.
La frmula molecular de este carotenoide es C40H52O4 y posee un peso
molecular aproximado de 596.86. Este pigmento fue identificado qumicamente
por Khn y Sorenson, (1983) y presenta formas de cristales de color violeta
14
ANTECEDENTES
oscuro, su punto de fusin es de aproximadamente 224oC. Es insoluble en

soluciones acuosas, pero soluble en diclorometano (30 g/L), en cloroformo (10
g/L), acetona (0.2 g/L), dimetilsulfxido (0.5 g/L) y otros disolventes polares. Es
sensible a la luz, a la temperatura, a los cidos, al oxgeno y a la presencia de
lcalis. En condiciones de saponificacin sufre una conversin a astaceno.
La astaxantina presenta dos carbonos asimtricos en la posicin 3 y 3
(Fig. 4) y puede existir en cuatro configuraciones, incluyendo los enantimeros
idnticos (3S,3S; 3R,3R) y formas meso (3R,3S; 3R,3S) (Mller et al., 1980).
Figura. 4. Ismeros configuracionales de la astaxantina (3S,3S) astaxantina,

(3R,3S) astaxantina; (3R,3R) astaxantina.
El ismero configuracional 3S,3S, se encuentra presente en los huevos

de la langosta (Homarus gamarus), al igual que en la microalga H. pluvialis,
hecho que caus controversia y fren el desarrollo comercial de la produccin
de astaxantina, utilizando como fuente natural a P. rhodozyma, por las
restricciones que pudiera imponer la FDA al considerar que el ismero 3R,3R
no se encontraba en la naturaleza por lo que fue prohibido el uso de
astaxantina como aditivo para alimento de peces. Estudios posteriores
demostraron que los ismeros meso y sus enantimeros se encuentran en
huevos de langosta, camarn, salmn en el zooplancton y el krill del Atlntico.
15
ANTECEDENTES
Por lo tanto, el ismero de astaxantina que ingiere el salmn carece de

relevancia biolgica (Johnson et al., 1980).
Tabla 2. Principales organismos productores de Astaxantina.

Especie
Contenido total de
Astaxantina (mg/100g)
Salmn Sockeye
26 a 37
Salmn Coho
9 a 21
Salmn Chun
3a8
Salmn Chinook
8a9
Salmn rosa
4a6
Salmn Atlntico
3 a 11
Trucha arcoiris
1a3
Huevos de salmn
0 a 14
Besugo rojo
2 a 14
Huevos de besugo
3a8
Langosta
Coppodos
39-80
Langostilla
46-130
Aceite de langosta
72.7
Harina de cangrejo
13.7
Camarn del rtico
116.0
Phaffia f. (levadura)
30-800
Astaxantina sinttica
800
H. pluvialis
1000-3000
Astaxantina
esterificada
Libre y
esterificada**
Libre y
esterificada**
Libre y
esterificada**
Libre y
esterificada**
Libre y
esterificada**
Libre y
esterificada**
Libre y
esterificada**
Esterificada**
*
Esterificada**
*
N. D.
Libre y
esterificada**
Esterificada**
*
Esterificada**
*
Esterificada**
*
Esterificada**
*
Esterificada**
*
Esterificada**
*
Libre
Esterificada**
*
Principal
ismero
3S-3S
3S-3S
3S-3S
3S-3S
3S-3S
3S-3S
3S-3S
N. D.
N. D.
N. D.
N. D.
3R-3R
3R-3R
N. D
3S-3S
3R-3R
3R-3R
3R-3S
3R-3S
*Los crustceos en donde se encontraron mayormente los ismeros 3S -3S.

**Dependiendo del tejido, la astaxantina se puede encontrar libre o esterificada.
***Tambin contienen pequeas cantidades de astaxantina libre.
N.D. No detectado.
Fuente: Christiansen y Torrissen, 1997.
16
ANTECEDENTES
La astaxantina es un pigmento carotenoide presente en animales

marinos tales como los salmones y los crustceos, ya que estos animales no
pueden sintetizar astaxantina por s solos la toman en sus alimentos naturales
la cual es adicionada a la alimentacin de los salmones, trucha y camarones
cultivados para intensificar su color. En la tabla 2 se describe el contenido total
de astaxantina en varios organismos. La astaxantina posee una actividad
antioxidante ms alta que el b-caroteno y el a-tocoferol (Yamane et al., 1997).
La funcin principal de este colorante es realizar una fotoproteccin
pasiva (como filtro), reduciendo la cantidad de luz disponible al complejo
colector de luz del fotosistema II, minimizando el riesgo de fotoinhibicin en
cloroplastos (Linden, 1999). La astaxantina es usada para la pigmentacin de
la piel y la carne de peces, sobre todo salmnidos, aunque tambin en cultivos
de crustceos, dorada, rodaballo y peces ornamentales (Johnson y An, 1991;
Lorenz y Cysewski, 2000).
En los ltimos aos el inters por este pigmento ha ido incrementndose
a medida que nuevos estudios le confieren nuevas propiedades y no slo la
capacidad de pigmentacin. La astaxantina tiene un elevado potencial como
antioxidante, inmunoregulador, anti-inflamatorio y agente anticarcinognico
(Guerin et al., 2003; Shahidi et al., 1998). Influye tambin en la reproduccin en
animales: en salmnidos es movilizada desde el msculo a los ovarios antes de
la puesta (Nakano et al., 1999; Bell et al., 2000). La carencia de este pigmento
en la dieta de las larvas de peces puede llevar a problemas en el desarrollo
larvario como sucede en larvas de halibut producindose una migracin
anormal del ojo y una mala pigmentacin (Rnnestad et al., 1998; Hamre et al.,
2002).
1.4. Microalgas
1.4.1. Algunas caractersticas de microalgas

Las algas son organismos pertenecientes al reino vegetal, que
comprenden un grupo muy diverso de organismos fotosintetizadores (Sur y
Whittick, 1987).
Se clasifican como talfitas, es decir, plantas inferiores, por presentar
una estructura simple no vascularizada con ausencia de raz, tallo y hojas. Sus
17
ANTECEDENTES
estructuras reproductivas estn desprotegidas (Critogamia), productoras de

esporas y desprovistas de semillas y flores (Lee, 1989).
Las microalgas tienen similitudes en muchos aspectos comunes con las
plantas superiores, como por ejemplo la composicin de sus carbohidratos de
reservas, protenas y pigmentos fotosintticos. Tienen la clorofila "a" como sus
pigmentos fotosintticos primario (Van Den Hoek et al., 1989). Otros tipos de
pigmentos, como los carotenoides (b-caroteno y fucoxantina), la ficocianina y
ficoeritrina presentan una distribucin ms limitada en las algas, que funcionan
como pigmentos accesorios (Sur y Whittick, 1987).
Las microalgas presentan una amplia distribucin geogrfica, se pueden
encontrar en prcticamente todas las condiciones ambientales de la Tierra,
desde los suelos frtiles hasta los desiertos fros y calientes. Sin embargo, son
en los ambientes acuticos, tanto marino y en aguas continentales, donde se
encuentra mayor prevalencia de microalgas (Lee, 1989).
El trmino microlaga no tiene ningn valor taxonmico, incluye
microorganismos algales con clorofila a y otros pigmentos fotosintticos, son
capaces de realizar fotosntesis oxgnica y, que para su caracterizacin
(sistemtica) implica la consideracin de una serie de criterios (Hoek et al.,
1995; Raven et al., 2001).
Como
lo
indica
Tomasello
(2004),
las
microalgas
han
sido
tradicionalmente clasificadas tomando en cuenta diversos criterios, tales como

los tipos de pigmentos, la naturaleza qumica de los productos de reserva y los
compuestos de la pared celular. Asimismo, otros aspectos han sido
considerados como criterios morfolgicos y citolgicos, como la aparicin de
las clulas flageladas, la estructura de los flagelos, los procesos de formacin
del ncleo en la divisin celular, la presencia y caracterizacin de envoltorio del
cloroplasto y la posible relacin entre el retculo endoplasmtico y la membrana
nuclear. Adems de los criterios anteriormente mencionados, las tcnicas de
biologa molecular actuales se han utilizado para la clasificacin de las
microalgas (Hu, 2004).
Bajo el nombre de microalgas se incluyen organismos con dos tipos de
estructura celular:
1. Microalgas que presentan una estructura celular procariota, representan
la divisin Cyanophyta (cianobacterias) y Prochlorophyta;
18
ANTECEDENTES
2. Microalgas que presentan una estructura celular eucariota, representan

la Divisin Chlorophyta Euglenophyta, Rhodophyta, Prymnesiophyta
(Haptophyta,
segn
Teixeira,
2002),
Heterokontophyta
(Bacillariophyceae, Chrysophyceae, Xanthophyceae, etc), Cryptophyta y

Dinophyta de acuerdo a la clasificacin de Hoek, Mann y Jahns (1995).
A pesar de las diferencias estructurales y morfolgicas (Figura 5) entre

los representantes de cada divisin, son similares fisiolgicamente y tienen un
metabolismo anlogo al de las plantas (Abalde et al., 1995)
Figura 5. Algunos ejemplos de microalgas de agua dulce y marinas.
Las microalgas se encuentran principalmente en el medio marino, en

agua dulce y el suelo. Estos organismos son responsables de al menos el 60%
de la produccin primaria de la Tierra (Chisti, 2004). De acuerdo con
Arredondo-Vega (1995), las microalgas (productores primarios) almacenan la
energa solar, convirtindola en energa biolgica, siendo la biomasa microalgal
la base de muchas cadenas trficas en los ambientes acuticos. Los
constituyentes de este nivel trfico sintetizan nuevos materiales orgnicos a
partir de sustratos inorgnicos, tales como sales (nutrientes), CO2 y agua, y
19
ANTECEDENTES
esta energa biolgica se utiliza en su parte como alimento para organismos

que constituyen el segundo nivel trfico (consumidores primarios), dando
continuidad a las cadenas trficas acuticas.
En los ambientes acuticos, las microalgas son, al menos en parte del
ciclo de vida, el alimento principal de los animales fitfagos como algunas
especies de peces, moluscos (filtradores) y de crustceos, por ejemplo.
Adems, todos los organismos vivos (acuticos y terrestres) dependen directa
o indirectamente, del oxgeno proveniente de la fotosntesis realizada por las
microalgas para su respiracin (Shelef y Soede, 1980).
Segn Borowitzka (1999), las microalgas pueden ser cultivadas en
diferentes sistemas de cultivo, con volmenes que van desde unos pocos litros
hasta miles de millones de litros. En general, los sistemas de produccin son
poco sofisticados (Figura 6), ya que muchas empresas desarrollan sus cultivos
en sistemas de tanques abiertos con fondo de tierra y con escaso o nulo control
de los parmetros ambientales.
(b)
(a)
(d)
(c)
(f)
(e)
Figura 6. Diferentes sistemas de cultivo de microalgas. (a) Cielo abierto. (b)

Bolsas. (c) Garrafones. (d) Estanques. (e) Fotobioreatores. (f) Carboy.
Recientemente, algunos cultivos se han desarrollado en los equipos

especficos,
llamados
fotobioreatores
donde
se
pueden
controlar
los
20
ANTECEDENTES
parmetros ambientales y esto implica un aumento de la productividad, que

permite la produccin de compuestos de alto valor comercial (Tredici, 2004).
Muchas de las sustancias sintetizadas y acumuladas por las microalgas
se encuentran tambin en las plantas, quienes evolucionaron a partir de las
microalgas verdes o Chlorophyceae (Raven et al., 2001). Sin embargo, segn
Cohen (1986) y Richmond (1990a), la produccin de microalgas puede ser
justificada por presentar diversas ventajas, dentro de las cuales pueden
destacarse las siguientes:
r Un cultivo de microalgas es un sistema biolgico eficiente en el
aprovechamiento de la energa solar para la produccin de materia
orgnica, donde muchas especies crecen ms rpido que la plantas
terrestres, lo que facilita mayores rendimientos biomasa (mayor
productividad).
r Su naturaleza unicelular asegura una biomasa con la misma
composicin bioqumica, como ocurre en las plantas terrestres, que
proporcionan compuestos localizados en partes especficas: en frutas,
hojas, semillas o races.
r Mediante la manipulacin de las condiciones ambientales de cultivo (por
ejemplo luz, temperatura, nutrientes) muchas especies pueden ser
inducidas a sintetizar y acumular grandes concentraciones de protenas,
carbohidratos, lpidos, etc. Estos compuestos tienen un alto valor
comercial, principalmente porque son productos naturales.
r Puede crecer bien en regiones con condiciones climticas extremas. Los
cultivos se pueden desarrollar con agua marina o de estuarios, los
cuales pueden ser no convencionales empleado cultivos de plantas con
poco valor a la agricultura, o con el agua proveniente de diversos
procesos de produccin (agrcola, industrial y de residuos domsticos,
por ejemplo).
r El ciclo de vida de la mayora de las microalgas se completa en pocas
horas, lo que favorece la seleccin de cepas y al mejoramiento gentico
de especies.
El nmero exacto de especies de microalgas an se desconoce,

actualmente se encuentra informacin que puede haber entre 200,000 y varios
21
ANTECEDENTES
millones de individuos de este grupo. Esta diversidad tambin se refleja en la

composicin bioqumica y, por tanto, las microalgas son una fuente de una
cantidad ilimitada de productos, como cidos grasos poliinsaturados,
colorantes, enzimas etc. (Norton et al., 1996; Pulz y Bruto, 2004).
1.4.2. Aspectos de crecimiento de las microalgas

Tanto en el medio ambiente natural como en los cultivos, el crecimiento
de una poblacin de microalgas es el resultado de la interaccin entre los
factores biolgicos, fsicos y qumicos (Raven, 1988). Los factores biolgicos
estn relacionados con su propio metabolismo de las especies cultivadas, as
como la posible influencia de otros organismos en el desarrollo microalgal. En
cuanto a los factores fsico-qumicos que afectan el crecimiento de las
microalgas, son principalmente reportados los estudios sobre la luz, la
temperatura, la salinidad y la disponibilidad de nutrientes (Loureno et al.,
2002).
Segn Gladue (1991), la mayora de las especies microalgales son
fotoautotrficas, es decir, a travs de la fotosntesis obtiene energa de la luz
para fijar el carbono, necesario para la construccin de la biomasa. As mismo,
la relacin entre la sntesis del material orgnico como reflejo de la produccin
fotosinttica puede ser expresada principalmente por el aumento de la
poblacin microalgal (Balech, 1977). La condicin de la luz, que debe ser
considerada en trminos de fotoperodo (tiempo de exposicin a la luz, o
fotoperodo), la intensidad y la calidad (longitud de onda), es de fundamental
importancia para las microalgas (Dubinsky, 1990; Snchez-Saavedra y
Voltolini, 1994). El hecho de que la luz vare tanto en el espacio (profundidad y
latitud) y en el tiempo (diario y estacional), implica ser un factor condicionante
para el crecimiento planctnico.
Los pigmentos fotosintetisantes microalgales pueden ser clasificados en
tres grupos: la clorofila, los carotenoides y las ficobilinas, siendo que, cada uno
difiere en su composicin qumica y presenta diferente capacidad de absorcin
de la luz en una determinada longitud de onda (Ronda, 1983).
En cultivos fotoautotrficos, la cantidad energa luminosa recibida por el
sistema fotosinttico afectar la cantidad de carbono que puede ser fijado,
22
ANTECEDENTES
determinando la produccin de biomasa y la tasa de crecimiento de los cultivos

microalgales (Tzovenis et al., 2003).
Del mismo modo, otros diversos aspectos del metabolismo de las
microalgas son tambin influenciados por las condiciones luminosas. Segn
Gunkel (1970), la cantidad, la calidad y la movilidad de los pigmentos
fotosintticos, la distribucin horizontal y vertical del fitoplancton en las masas
de agua y el tamao y la morfologa de las clulas, entre otros, estn
correlacionan con las condiciones de luz, tanto cuantitativamente como
cualitativamente.
En cuanto a la nutricin, para un crecimiento ptimo, las microalgas
tienen la necesidad de una serie de nutrientes. Entre las especies, ocurren
muchas variaciones relacionadas principalmente con la cantidad de nutrientes
en el medio. Sin embargo, estas necesidades nutricionales dependen de
distintas condiciones ambientales (Abalde et al., 1995).
En cuanto a los nutrientes, las microalgas requieren C, N, O, H y P,
adems de Ca, Mg, S y K. Como micronutrientes, por lo general requieren Fe,
Mn, Cu, Mo y Co, mientras que algunas microalgas tambin requieren bajas
concentraciones de vitaminas en el medio de cultivo (Guillard, 1975). Se sabe
que ciertas microalgas tienen necesidades especficas. Adems de los factores
descritos anteriormente, otros pueden influir en el desarrollo de los cultivos
como el tamao y la forma de los depsitos, el tamao de las clulas (volumen
celular), la aireacin de los cultivos, el pH, etc (Richmond, 1990).
1.4.3. Produccin de compuestos de inters

Varias microalgas han sido estudiadas y algunas especies han sido
ampliamente utilizados en la acuicultura, en la alimentacin humana y animal,
en la agricultura, en el tratamiento de aguas residuales, en la reduccin de
dixido de carbono de la atmsfera, en la sustitucin de los combustibles
fsiles y en la obtencin de muchos compuestos (Borowitzka, 1994; Molina
Grima et al., 1995, Shale, 2000, Richmond, 2004). Adems de la consolidada
produccin de microalgas para la obtencin de biomasa, las investigaciones
relacionadas con el cultivo de microalgas aumentaran las perspectivas para la
produccin de nuevos combustibles, biopolmeros, biofertilizantes, plaguicidas,
cidos grasos y pigmentos, as como muchos otros compuestos bioactivos que
23
ANTECEDENTES
pueder ser utilizados en alimentos funcionales (Skulberg, 2000; Skulberg,

2004).
Las protenas son los componentes esenciales de las microalgas y su
valor nutricional est determinado por el contenido y disponibilidad de los
aminocidos que la constituyen.
Los lpidos tpicos de las microalgas son los steres de glicerol y los
cidos grasos que contengan un intervalo de carbono entre C12 y C20 (Romero,
1999). Otro hecho que despierta el inters en estos microorganismos son las
altas tazas de crecimiento, que establecen ventajas tecnolgicas y comerciales
en comparacin con las tcnicas convencionales de produccin de nutrientes
(Dufoss et al., 2005). La fraccin lipdica de las microalgas puede contener
cantidades significativas de constituyentes de composicin semejante a la de
aceites vegetales. El potencial de aplicacin de los aceites extridos de estos
microorganismos es muy amplio, pudiendo ser utilizados en la extraccin de
cidos grasos esenciales para la alimentacin humana y para la industria en la
manufactura de surfactantes y cosmticos (Borowitzka y Borowitzka, 1988). Es
reconocido que las microalgas tienen la capacidad de sintetizar compuestos
nutracuticos, como los cidos grasos poli-insaturados (cido araquidnico ARA, cido eicosapentaenoico -EPA y cido docosahexaenoico -DHA, por
ejemplo) y pigmentos carotenoides (astaxantina, b-caroteno, lutena y
cantaxantina, etc.) que presentan propiedades teraputicas (Gill y Valivety,
1997; Ohshima, 1998; Tripathi et al., 1999).
Actualmente, las microalgas son comercializadas como alimentos
naturales ("health food") o como suplementos alimenticios y son encontradas
en polvo ("sun dried" o "spray-dried), en forma de tabletas, cpsulas o
extractos. Las microalgas, son incorporadas en pastas, bocadillos, dulces,
bebidas, etc., tanto como suplemento nutricional y como colorante natural
(Becker, 2004; Coll et al., 2004; Pulz y Bruto, 2004).
1.5. Haematococcus pluvialis
1.5.1 Descripcin de la especie H. pluvialis

Haematococcus pluvialis, tambin es conocido como Haematococcus
lacustris o Sphaerella lacustris. Es una microalga verde, unicelular, de agua
24
ANTECEDENTES
dulce, que en su clasificacin taxonmica pertenece al Phylum Chlorophyta,

como se muestra en la Tabla 3 (Bold y Wynne, 1985).
El Phylum Chlorophyta incluye todas las algas con plstidos rodeados
por dos membranas, que contienen los pigmentos fotosintticos clorofila a y b y
que forman estados flagelados de esporas o gametos. El principal producto de
almacenamiento de carbohidratos es el almidn (a-1,4-glucano) depositado
dentro del plstido.
Tabla 3. Clasificacin Taxonmica de Haematococcus pluvialis.

PHYLLUM
CHLOROPHYTA
CLASE
CHLOROPHYCEAE
ORDEN
VOLVOCALES
FAMILIA
Haematococcaceae
GENERO
ESPECIE
Haematococcus
pluvialis
Las clorofitas, o algas verdes forman un grupo muy extenso, que se

considera como el ms evolucionado entre las algas. Tienen caractersticas
que las distingue de las dems algas, y las acerca a los briofitos y las plantas
vasculares, como por ejemplo la composicin de los polisacridos que
producen, o la presencia de las clorofilas a y b. El Phylum engloba varias
clases, subdivididas en unos 500 gneros y 8000 especies. Sus caractersticas
principales son las siguientes:
1. Aunque algunas son macroscpicas, la mayora son microscpicas.
Muchas son planctnicas, y viven suspendidas en el medio como
organismos unicelulares aislados o agrupados en colonias, o en forma
unicelular. Otras son bentnicas, y pueden ser epilticas o perifticas.
2. Las
clulas
pueden realizar
movimientos fototcticos, mediante
secrecin de muclagos o por la presencia de flagelos (zoidios). Las

clulas flageladas son isocontas, esto es, tienen los flagelos con
estructuras iguales pero que difieren en su longitud. Normalmente hay
dos flagelos por cada clula.
3. En los cloroplastos coexisten varios pigmentos, adems de las clorofilas,
25
ANTECEDENTES
xantofilas, lutena y zeaxantina. Pero estos pigmentos no enmascaran a

la clorofila, por lo que el color predominante es el que les da el nombre
de algas verdes.
4. En algunos casos las clulas tiene pirenoides, que se encuentran dentro
del cloroplasto, y a menudo penetrados por los tilacoides.
5. Las reservas de polisacridos de las clulas estn en forma de grnulos
que pueden encontrarse alrededor del pirenoide, cuando lo hay, o
dispersos en el estroma del cloroplasto, pero no libres en el citoplasma
como ocurre en las dems algas.
6. Su pared celular est compuesta, principalmente, de celulosa.
7. La mayora son de agua dulce, pero las hay tambin terrestres y
marinas.
1.5.2. Morfologa, estructura y fisiologa de H. pluvialis

Como se muestra en la Figura 7 el ciclo de vida tpico de H. pluvialis. En
condiciones favorables, los cultivos de esta microalga se componen
generalmente de clulas vegetativas flageladas junto con clulas vegetativas
en reposo.
Las clulas flageladas son esfricas o elipsoidales con dos flagelos de
igual longitud que salen de un extremo anterior. Las clulas contienen un nico
cloroplasto en forma de copa con varios pirenoides.
En los cultivos lquidos, las clulas biflageladas (zooesporas) poseen un
pared delgada, separada de la plasmalema por un gran espacio, que es
atravesado por finas hebras citoplasmticas que puede verse seccionadas
longitudinalmente, transversalmente u oblicuamente (Santos y Mesquita, 1984).
En este estado, las clulas persisten y poseen clorofila a, b y los carotenoides
primarios que normalmente se encuentran en las Clorofitas y en los
cloroplastos de las plantas superiores, tales como b-caroteno, lutena,
violaxantina, neoxantina y zeaxantina (Harker et al., 1996).
Las clulas flageladas mviles dejan de dividirse despus de unas cinco
duplicaciones celulares. Poco despus las zooesporas dejan de dividirse,
ocurre la fusin celular, y dentro de las prximas 50 horas, el contenido de ADN
de la mayora de las clulas se duplica (Lee y Ding, 1994). A continuacin, las
clulas pierden sus flagelos y se convierten en una forma esfrica no mvil.
26
ANTECEDENTES
Las clulas no mviles muestran una pared celular gruesa, debajo de

esta pared, un espacio pequeo periplsmico, con una electro-densidad
variable y limitado internamente por una plasmalema bastante sinuosa.
Las otras caractersticas ultra-estructurales del protoplasma son
similares a las clulas mviles, pero no hay estigma ni vacuolas contrctiles
(Santos y Mesquita, 1984).
Cuando las condiciones ambientales llegan a ser adversas (privacin de
nutrientes, alta irradiancia de luz o alta salinidad) las clulas sufren cambios
morfolgicos, fisiolgicos y en las caractersticas fotosintticas, resultando as
la formacin de grandes aplansporas rojas resistentes a las condiciones
ambientales extremas (Boussia y Vonshak, 1991).
Durante la transformacin, las clulas microalgales (ligeramente
redondeadas), pierden sus flagelos, hacindose clulas enquistadas inmviles.
A continuacin, se forma una vaina trilaminar resistente a la acetlisis y se
genera una pared secundaria de este material base y engrosada, coincidiendo
con una expansin del volumen celular (Montsant et al., 2001; Hagen et al.,
2002). Entonces se comienza a producir carotenoides secundarios tales como
cantaxantina, echinenone y en particular, del pigmento rojo astaxantina seguido
de una disminucin de clorofilas y carotenoides primarios (Harker et al., 1996).
Los microscopios de luz y electrnicos han revelado que, en las clulas
mviles, aparecen las primeras esferas pequeas de inclusiones de
astaxantina (limitadas cada una de ellas con una biomembrana no verdadera)
en el citoplasma perinuclear, los grnulos del pigmento no se encuentran
dentro de ningn orgnelo o vescula (Santos y Mesquita, 1984). En los quistes
que estn madurando el nmero de depsitos de pigmento aumenta y toman
una variedad de formas. La unin de los grnulos globulares depende del
incremento de las cantidades de astaxantina formada y de las edades de las
clulas.
En las clulas maduras enquistadas el citoplasma estn casi
uniformemente rojas con reducidas cantidades de pigmentos en los
cloroplastos. La astaxantina se dispersa hacia la periferia de las clulas de
Haematococcus bajo la induccin de luz y se mueve hacia el centro despus
que se interrumpe la iluminacin (Yong y Lee, 1991).
Sin embargo, este proceso es reversible, es decir, cuando los quistes
27
ANTECEDENTES
maduros se transfieren a un medio fresco y se exponen a una baja de luz, las

clulas hijas intracelulares se liberan de las clulas enquistadas maduras
dentro del medio, y las clulas vegetativas se regeneran de las clulas hijas. La
germinacin coincide con la clorofila y sntesis de protenas, y la degradacin
de carotenoides (Fabregas et al., 2003).
Figura 7. Ciclo de vida de Haematococcus pluvialis. a. Clula vegetativa

flagelada. b. Clula vegetativa sin flagelos. c. Palmella. d y f. Aplanspora.
1.5.3. Presencia y distribucin de Haematococcus pluvialis

H. pluvialis se distribuye ampliamente y ha sido aislada en Europa, frica
y en Amrica del Norte, a partir de cortezas secas de piedra, en los depsitos
de agua en los acantilados, en los musgos de los estanques e incluso en una
fuente (Figura 8) de agua bendita en el patio de una iglesia de Zrich
(Pringsheim, 1966). Algunas especies fueron recolectadas dos veces por lo
menos en Minnesota (U. S), pero no han sido estudiados los cultivos
(Thompson y Wujek, 1989).
Este gnero tambin se encuentra muy extendido en Canad,
incluyendo British Columbia (Stein y Borden, 1979), Nunavut (Sheath y
Steinman, 1982), Ontario (Duthie y Socha, 1976), en Europa: Gran bretaa
(Pentecost 2002), Alemania (Toepel et al., 2005), Portugal (Sociedad Espaola
28
ANTECEDENTES
de Ficologa, 2008), Rumania (Caraus, 2002), Espaa (Alvarez y Cobelas,

1982, Aboal, 1988b, Sociedad Espaola de Ficologa, 2008); Suramrica:
Argentina (Damiani et al., 2006); Asia: China (Hu y Wei, 2006) y en las Islas del
Pacfico: Islas en Hawai (Sherwood, 2004). H. pluviales tambin ha sido
reportado en Mxico (Ortega, 1984).
(a)
(b)
Figura 8. Haematococcus pluvialis. (a) Depsito de agua estancada en los

Montes Pirineo, Espaa. (b) Pileta con agua estancada.
La extensa presencia de Haematococcus en cuerpos de agua

temporales y no en permanentes se debe, en parte, al hecho de que en esos
depsitos, estn comnmente libres de la competencia de otras microalgas, y
no
ninguna
caracterstica
inherente
de
los
depsitos
de
agua.
Haematococcus pluvialis se puede adaptar bastante bien para sobrevivir en

condiciones extremas y en las fluctuaciones luz, de temperatura, concentracin
de sales, que muchas otras microalgas, debido a su capacidad de enquistarse
de manera rpida (Proctor, 1957). Pringsheim (1966) sugiere que H. pluvialis
se distribuy como quistes secos por el viento, de lo contrario no podra
alcanzar la mayora de las localidades donde se ha encontrado.
1.5.4. Composicin qumica de Haematococcus pluvialis

La composicin general de esta microalga consiste comnmente en
carotenoides, cidos grasos, protenas, carbohidratos y minerales.
Tabla 4. Compuestos comnmente presentes en H. pluvialis.

Compuestos
Mnimo Mximo Media
29
ANTECEDENTES
Protenas (%)
17.30
27.16
23.62
Carbohidratos (%)
36.9
40.0
38.0
Grasas (%)
7.14
21.22
13.80
Fierro (%)
0.14
1.0
0.73
Humedad (%)
3.0
9.0
6.0
Magnesio (%)
0.85
1.4
1.14
Calcio (%)
0.93
3.3
1.58
Biotina (mg/lb)
0.108
0.665
0.337
12
7.5
cido flico (mg/100g)
0.936
1.48
1.30
Niacina (mg/lb)
20.2
35.2
29.8
cido pantotnico
2.80
10.57
6.14
Vitamina B1 (mg/lb)
<0.050
4.81
2.17
Vitamina B2 (mg/lb)
5.17
9.36
7.67
Vitamina B6 (mg/lb)
Vitamina B12 (mg/lb)
0.659
4.5
1.63
0.381
0.912
0.549
Vitamina BC (mg/lb)
6.42
82.7
38.86
Vitamina BE (IU/lb)
58.4
333
186.1
Cenizas (%)
11.07
24.47
17.71
L-carnitina (ug/g)
NatuRose Technical Bulletin # 060.
Tabla 5. Perfil de aminocidos en H. pluvialis.

Aminocidos
Valor mnimo Valor mximo Valor medio

(%)
(%)
(%)
Triptfano
0.05
0.56
0.31
cido aspartico
1.37
2.31
1.89
Treonina
0.78
1.24
1.04
Serina
0.73
1.06
0.94
cido glutamico
1.70
2.39
2.19
Prolina
0.69
1.00
0.89
Glicina
0.84
1.32
1.17
Alanina
1.30
1.92
1.73
Cistena
0.16
0.21
0.19
Valina
0.83
1.94
1.36
30
ANTECEDENTES
Metionina
0.32
0.43
0.40
Isoleucina
0.55
0.97
0.79
Leucina
1.21
1.84
1.67
Tirosina
0.40
0.63
0.52
Fenilalanina
Histidina
0.61
1.05
0.90
0.48
0.76
0.61
Lisina
0.75
1.32
1.13
Arginina
0.81
1.34
1.07
Tabla 6. cidos grasos encontrados en la microalga H. pluvialis.

cidos grasos
Media Mnimo Mximo

(%)
(%)
(%)
C12:0 Laurico
C14:0 Miristico
<0.01
<0.005
0.01
0.07
0.04
0.10
C16:0 Palmtico
3.82
2.078
6.15
C16:1 Palmitoleico
0.08
0.02
0.17
C17:0 Margarico
0.03
0.01
0.03
C17:1 Margaroleico
0.17
0.09
0.23
C18:0 Estearico
0.27
0.14
0.46
C18:1 Oleico
3.41
1.66
5.31
C18:2 Linoleico
2.74
1.44
4.40
C18:3 Linolenico
1.47
0.86
2.11
C18:3 gamma linolenico omega 6
0.21
0.09
0.29
C18:4 Octadecatetraenoico
0.19
0.09
0.25
C20:0 Arachidico
0.08
0.04
0.12
C20:1 Gadoleico
0.04
0.01
0.08
C20:2 Eicosatrienoico
0.16
0.06
0.21
C20:3 Gama Eicosatrienoico
0.06
0.02
0.09
C20:4 Arachidonico
0.18
0.082
0.31
C20:5 Eicosapentaenoico omega 3
0.08
0.031
0.180.
C22:0 Behenico
0.05
0.02
0.08
C24:0 Lignocerico
0.03
0.013
0.05

31
ANTECEDENTES
1.5.5. Aplicaciones de Haematococcus pluvialis

La microalga H. pluvialis representa la ms rica fuente natural de astaxantina,
y ahora es cultivado a gran escala (Olaizola 2000; Olaizola y Huntley, 2003). El
contenido de astaxantina en esta microalga puede superar el 4% de peso seco,
este valor es por ahora el ms alto reportado para cualquier microorganismos,
incluyendo bacterias, hongos y otras microalgas (Boussiba 2000). La
astaxantina es una xantofila de fuerte actividad antioxidante, diez veces
superior que el b-caroteno y ms de 500 veces ms efectivo que el a-tocoferol,
la astaxantina se ha propuesto como la supervitamina E (Jyonouchi et
al.,1994). La dosis diaria recomendada es de 4 mg (Odeberg et al., 2003).
Hematococcus contiene principalmente mono-steres de astaxantina ligados a
cidos grasos 16:0, 18:0, 18:2 y 18:1 (Restrm et al., 1981a), teniendo los no
esterificados, los mono y di-steres una configuracin pura (3S, 3S) (Grung et
al., 1992). Sin embargo, esta microalga exhibe ciertas caractersticas
desfavorables para su cultivo, tales como tasa lenta de crecimiento y ciclo de
vida complejo, en comparacin con otras microalgas exitosamente cultivadas a
escala comercial, como la Dunaliella spp. y la Spirulina spp. (Cifuentes et al.,
2003).
El inters en la produccin y comercializacin de astaxantina microalgal
para el consumo humano tambin ha aumentado, la inminente aprobacin de la
U. S. Food and Drug Administration (FDA) para su uso como ingrediente en
suplementos dietticos, y para su aprobacin en varios pases europeos
(Cysewski y Lorenz, 2004).
El mayor mercado para la astaxantina ha sido la acuicultura, donde es
especialmente utilizado para el color rojizo a la carne del salmn cultivado
(Tripathi et al., 1999). La astaxantina se vende a US$2500 por kg con un
mercado mundial anual estimado en US$200 millones (Lorenz y Cysewski,
2000). En el mercado, los productos se encuentran en forma de concentrados
en polvo, liofilizados o biomasa deshidratada, o bien como extracto de aceite
vegetal. Aunque el 95% de este mercado consume derivados de astaxantina
sinttica, la demanda de los consumidores por los productos naturales hacen
que los pigmentos sintticos sean mucho menos deseable y proporciona una
oportunidad para la produccin de astaxantina por H. pluvialis.
32
ANTECEDENTES

La microalga H. pluvialis tiene una tasa de crecimiento baja lo que
constituye uno de los principales problemas para su produccin a gran escala.
Los medios de cultivo usados de manera habitual para su cultivo han sido
adaptados de los empleados para otras microalgas, para bacterias o incluso
una mezcla de ambos y no han sido diseados para soportar altos
crecimientos. Este problema ha provocado que se haya realizado un esfuerzo
importante en el desarrollo de un medio de cultivo adecuado a los
requerimientos propios de esta microalga (Gong y Chen, 1997; Pringshe, 1966;
Sarada et al., 2002). La mayora de estos trabajos se realizaron en condiciones
de cultivo discontinuo o batch y se han optimizado slo algunos componentes
del medio.
cultivo para evaluar los pigmentos obtenidos de la microalga Haematococcus
pluvialis ya que en los ltimos aos, este organismo ha sido considerado como
una posible fuente natural para la produccin de astaxantina.
33
JUSTIFICACIN
CAPTULO 2
JUSTIFICACIN
En la centuria de 1900 el reino vegetal y animal provea todos los

materiales colorantes para la industria textil, cosmtica, pinturas y alimentos.
Este
patrn
comenz
cambiar
muy
rpidamente
seguido
por
el
descubrimiento de los colorantes sintticos. El impacto inicial fue sentido en la

industria textil para los colorantes naturales los cuales perdieron su mercado.
Progresivamente una amplia variedad de colorantes sintticos fueron
manufacturados y stos desplazaron a muchos de los colorantes para
alimentos y cosmticos que se venan utilizando ya que stos fueron
comparativamente ms baratos, mayor consistencia en la calidad, mejor
facilidad de obtencin, mejores atributos de calidad y estabilidad superior en
sistemas alimentarios.
Hoy en da el sector alimentario, est experimentando un regreso al
mercado de colorantes naturales, ste cambio no ha sido manejado
directamente por la industria alimentaria sino por los consumidores de pases
desarrollados, los cuales estn informados y preocupados sobre posibles
riesgos a su salud asociados con aditivos alimentarios sintticos.
El inters por los alimentos funcionales es cada vez mayor, dado que
stos, adems de satisfacer las necesidades energticas y nutricionales
bsicas, son capaces de aportar beneficios adicionales a nuestra salud.
Adems, existe una tendencia entre los consumidores dirigida hacia la ingesta
de productos procedentes de fuentes naturales en contraposicin a los
obtenidos de forma sinttica.
Actualmente, el nmero de ventajas de los pigmentos naturales sobre
los sintticos han aumentado debido a las propiedades farmacolgicas que se
han descubierto de los pigmentos naturales. Adems, algunos productos han
tenido un gran valor en el mercado porque en la fabricacin de stos se ocupan
solo pigmentos naturales. Sin embargo, es necesario sealar que los
colorantes sintticos han tenido ventajas bien conocidas como el alto poder
pigmentante, la estabilidad, el almacenamiento, la facilidad del procesamiento y
adems son ms baratos y estn disponibles en cantidades ilimitadas (Wissgot
y Bortlik, 1996).
34
JUSTIFICACIN
De acuerdo a datos registrados por el Banco Nacional de Comercio

Exterior (BANCOMEXT, 2006), el volumen de las importaciones a Mxico de
materiales colorantes de origen animal y vegetal aumentaron de 2000 a 2006
en un 61.96%, de 324.5 ton a 1382.190 ton. Por otro lado las exportaciones
bajaron en un 32% (4,481,786 ton en 2000 a 2008, 2,283.037 ton en 2008).
El aumento en las importaciones y la baja en las exportaciones de
materiales colorantes naturales, demuestra la necesidad de buscar nuevas
fuentes alternativas de colorantes de origen natural, as como mejorar y
optimizar los procesos existentes que reduzcan los costos actuales y ser ms
competitivos en el mercado internacional.
Las microalgas se consideran como alimentos funcionales, capaces no
slo de elevar el contenido nutricional de los alimentos tradicionales, sino
tambin de afectar positivamente la salud de animales y humanos. Poseen
cantidades apreciables de carbohidratos, lpidos, vitaminas, minerales, cidos
grasos poliinsaturados (omega3 y omega6) y antioxidantes (carotenos).
Algunas tienen, incluso, un contenido de aminocidos superior al presentado
por alimentos convencionales (Mndez, 2003; Abalde et al., 1996; Visentainer,
et al., 2005).
cultivo para evaluar los pigmentos obtenidos de la microalga Haematococcus
pluvialis considerando la hiptesis de que la fuente de nutrientes puede originar
cambios en el crecimiento, contenido de pigmentos y actividad antimicrobiana.
.
35
OBJETIVOS
CAPTULO 3
OBJETIVOS
Objetivo general:
Evaluar los pigmentos obtenidos de la microalaga Haematococcus pluvialis

(Chlorophyta:Volvocales) cultivada en diferentes medios.
Objetivos especficos:
1) Validar las tcnicas operativas de crecimiento de Haematococcus

pluvialis e induccin de pigmentos utilizando varios medios de cultivo.
2) Determinar la composicin de cenizas, lpidos, carbohidratos, humedad

y nitrgeno proteico de la microalga seca de Haematococcus pluvialis
mediante un anlisis qumico proximal.
3) Obtener extractos orgnicos totales utilizando disolventes de diferente

polaridad y variando el protocolo de extraccin.
4) Evaluar el almacenamiento y la estabilidad de la biomasa seca y de los

extractos orgnicos totales.
5) Determinar la actividad antimicrobiana de los extractos orgnicos totales

de H. pluvialis sobre bacterias gram positivas, gram negativas y un
hongo levaduriforme.
6) Aislar y caracterizar los pigmentos obtenidos mediante cromatografa y

espectroscopa UV-Vis
36
MATERIALES Y MTODOS
CAPTULO 4
MATERIALES Y MTODOS
4.1. Organismo
La cepa Haematococcus pluviales con clave Hamp-1r se obtuvo del

cepario del Laboratorio de Biotecnologa de Microalgas de la Universidad del
Mar, campus Puerto ngel. Esta cepa es conservada en el medio de cultivo f/2
(Guillard y Ryther, 1962) a 28oC como se observa en la figura 9.
(b)
(a)
Figura 9. Conservacin de H. pluvialis con clave Hamp-1r. (a) en agar y (b) en
medio lquido.
4.2. Pruebas preliminares
La microalga fue cultivada en 5 medios de cultivo diferentes y en 3

condiciones diferentes (figura 10).
1)
2)
3)
Figura 10. Pruebas preliminares de cultivo de H. pluvialis.
37
MATERIALES Y MTODOS
Los medios de cultivos utilizados fueron BBM, BG-11, f/2, f/2 sin fosfatos
y un fertilizante foliar (QF). Las condiciones de cultivo, fueron las siguientes las
que se describen en la tabla 7.
Tabla 7. Parmetros para las diferentes condiciones preliminarios de los

cultivos de la microalga.
T (oC)
Luz (ftcd)
pH
Agitacin
Condicin 1
28
110
7.5
Manual
Condicin 2
28
420
7.5
Manual
Condicin 3
28
230
7.5
Mecnica
Todos estos experimentos se hicieron por quintuplicado, utilizando

tubos, matraces erlenmeyer de 250 y 500 mL. Se ocuparon 2 inculos de
Haematococcus pluviales uno en su forma vegetativa con flagelos y otro en su
forma de quiste.
Cada dos das se tomaban muestras de la microalga para verlas al
microscopio y observar los cambios morfolgicos.
4. 3. Condiciones de cultivo
Se utilizaron cepas de H. pluviales en su forma de quiste. En la Tabla 9

se describe la composicin qumica de los medios de cultivo empleados.
La irradiancia flucto entre 4541.03 lux a 3766.26 lux. La agitacin fue
manual. Se utilizaron matraces erlenmeyer de 500 mL. Se le adicion 350 mL
de medio de cultivo y 17.5 mL de inculo. Todos los experimentos se realizaron
por quintuplicado. En la tabla 8 se detallan las condiciones iniciales de cultivo.
Tabla 8. Condiciones iniciales de los medios de cultivo para H. pluvialis.

Variables fisioqumicas
f/2*
Fertilizante foliar
pH
8.37
8.42
Conductividad elctrica (mV)
142.1
142.1
Concentracin de inculo (cel/mL)
8250
21000
*(Guillard y Ryther, 1962)

38
MATERIALES Y MTODOS
Tabla 9. Composicin qumica de los medios de cultivo f/2 (Guillard y Ryther,

1962) y del Fertilizante foliar (QF).
Constituyentes
BBM
[g/L]
1.0
BG-11
[g/L]
1.5
f/2*
[g/L]
-
f/2
[g/L]
0.075
Fertilizante**
[g/L]
-
Nitrgeno ntrico
6x10-3
Nitrgeno amoniacal
2.4x10-3
Nitrgeno orgnico
2.16x10-2
Fsforo Asimilable
1.2x10-2
NaH2PO44H2O
0.05
0.025
0.036
(K2O) 2.1x10-2
(MgO) 6x10-5
EDTA
0.075
0.075
9.36x10-5
9.36x10-5
FeCl36H2O
0.075
0.4
3.15x10-5
3.15x10-5
(Fe) 3x10-5
NaMoO4
0.0175
6.3x10-6
6.3x10-6
(Mo) 1.2x10-6
ZnSO47H2O
2.2x10-5
2.2x10-5
(Zn) 9x10-6
MnCl24H2O
0.025
1.8x10-4
1.8x10-4
(Mn) 3x10-6
CuSO45H2O
0.001
9.8x10-6
9.8x10-6
(Cu) 6x10-6
H3BO4
0.006
(B) 4.5x10-6
CoCl3
0.2
1x10-5
1x10-5
(Co) 6x10-6
0.005
1x10-5
1x10-5
NaNO3
KH2PO4
MgSO47H2O
Vitaminas***
*Sin Nitrgeno.
**Foliar.
***Solucin comercial.
4.4. Recuento celular
Despus de inocular los matraces, se lleva el registro de crecimiento

para identificar la etapa de mayor densidad de las microalgas (fase
exponencial) la cual indica el momento apropiado para cosecharlas. Esta etapa
tambin indica que el cultivo debe transferirse a un volumen mayor de medio
de cultivo o diluirse si el recipiente tiene volumen disponible. Para determinar la
densidad celular cada muestra fue fijada con lugol al 5%. Los conteos se
hicieron empleando una cmara Neubauer estndar de 0.1 mm de altura y 1
mm2 de rea. Se hicieron las lecturas en un microscopio ptico Olympus
39
MATERIALES Y MTODOS
BX51. Tambin se hizo una descripcin de la microalga Haematococcus
pluvialis mediante la aobservacin de sus clula a travs de varios

microscopios
como
el
Microscopio
Carl
Zeis
modelo
Estndar
25
(esteroescpico), LeicaZoom 2000 (contraste de fases) y Olympus BX51. Las

imgenes de las clulas fueron capturadas por un dispositivo acoplado a una
cmara fotogrfica.
4.4.1. Densidad celular

Con la cmara Neubauer estndar (Hematocmetro) de 0.1 mm de altura
y 1 mm2 de rea, la densidad de microalgas se calcularon de acuerdo a la
siguiente relacin:
2 = F + F. D. + M C 10 1000 Cel/mL
Donde:
D= densidad del cultivo.
F= fijador (mL).
F. D.= Factor de dilucin (mL).
. 2 =
Vf
vi
Vf= volumen final de la muestra diluida (mL).

vi= volumen inicial de la muestra r (mL).
M= Mililitros de muestra utilizados.
C= nmero de clulas promedio contadas.
10= factor de multiplicacin debido a la profundidad del hematocmetro.
1000= factor de conversin a mililitros.
4.4.2 Parmetros Poblacionales

Los principales parmetros poblacionales del crecimiento de un cultivo
de clulas se calcularon con las siguientes ecuaciones:
1.- Las divisiones por da (k) se calcularon de acuerdo a Guillard (1973):
Donde:
3.322
N2
log
T2 T1
N1
3.322= Factor de conversin del logaritmo base 2 a base 10.
40
MATERIALES Y MTODOS
N1= Concentracin celular al tiempo T1.

N2.= Concentracin celular al tiempo T2.
2.- La tasa de crecimiento especfico (m) estimada como lo recomienda E. P. A.

(1971) para ensayos con microalgas:
=
N2
log N1
T2 T1
da
3.- El tiempo de generacin (Tg) se determina como lo recomienda Eppley y

Strickland (1968):
r. =
log2 T2 T1
log2
=
logN2 logN1
k
4.- La produccin diaria de microalgas se valora segn De la Cruz y Alfonso,

1975:
. 2. =
N2 N1
T2 T1
4.5. Cosecha y secado de la biomasa
Las clulas microalgales fueron separadas del medio de cultivo por

centrifugacin (3500 rpm durante 5 min a 5oC) y se secaron en una estufa de
vacio LABLINE a 80C por 24 horas.
4.6. Anlisis Qumico proximal
Porciones de microalgas secas fueron molidas en un mortero para la

determinacin del anlisis qumico proximal, el cual se realiz por los mtodos
oficiales AOAC (1997), en donde se evalu el contenido de Humedad (925.10),
ceniza (923.03), lpidos totales y Nitrgeno proteico total (979.09).
El contenido de carbohidratos se estim por el mtodo de fenol-sulfrico
(Dubois et al., 1956). En todos los casos, las determinaciones se realizaron por
quintuplicado.
41
MATERIALES Y MTODOS
4.7. Extraccin
Para evitar foto-descomposicin de los pigmentos, este proceso se llev

a cabo en ambiente oscuro iluminado con luz roja (700 nm). Todas las
extracciones se repitieron hasta que el color de la biomasa se agotase por los
disolventes de extraccin. Todos los experimentos fueron realizados por
quintuplicado. Los extractos obtenidos se almacenaron en frascos mbar a 4C
hasta su posterior anlisis.
4.7.1. Biomasa hmeda

Se tomaron 5 mL de cultivo y se agreg a un tubo de centrfuga de 15
mL de capacidad. Luego se centrifug a 3500 rpm a 5oC durante 5 min
utilizando una centrifuga (Universal 32R Hettich Zentrifugen). Los pigmentos
se extrajeron del botn celular mediante la adicin de 10 mL de acetona 100%.
Se agit vigorosamente en un vortex durante 30 seg. Se procedi a congelar la
disolucin a -20oC durante 2 horas. Los extractos, por quintuplicado, se
clarificaron mediante centrifugacin y se procedi a medir la absorbancia de las
muestras en un Espectrofotmetro de UV-Vis (Marca VARIAN. Modelo cary 50,
USA).
4.7.2. Biomasa seca

Despus del secado de la microalga, se realizo una ruptura celular
mediante congelamiento de la biomasa a -40oC durante 20 minutos, seguido de
una molienda con un mortero. Se probaron tres diferentes mtodos de
extraccin.
4.7.2.1. Mtodo HCl 4N-Acetona

La extraccin y determinacin del contenido total de pigmentos en las
muestras en estudio se realiz por el mtodo descrito por Sarada et al., (2006),
quienes propusieron un mtodo mejorado para la extraccin de astaxantina de
H. pluvialis. Este mtodo se basa en la adicin de unas gotas de HCl 4N a
70oC para facilitar la extraccin, y se logra hasta un 90% de la extraccin del
pigmento sin homogeneizar. Se pesaron, 100 mg de microalga y se aadieron
10 gotas de HCl 4N (PerkinElmer) y 3 perlas de ebullicin (sigma, 425-600
42
MATERIALES Y MTODOS
micras) a un tubo falcn cnico de plstico. Se mezcl vigorosamente en un

agitador vortex durante 30 seg. A continuacin se incub en un bao mara a
70oC durante 2 minutos y se homogeneiz nuevamente en el vortex. Despus
se le adicion al material celular 5 mL de acetona (Merck) al 100%. La
suspensin fue homogeneizada en un agitador vortex y se someti a
centrifugacin (3500 rpm por 5 minutos). El sobrenadante se colect en un
matraz baln para despus concentrarlo en un rotavapor. Este procedimiento
se repiti hasta la extraccin exhaustiva de los pigmentos, lo cual fue
confirmada mediante una exploracin espectrofotomtrica UV-Vis.
4.7.2.2. Mtodo Acetona 100%

Se pesaron 100 mg de microalga, se aadieron 5 mL de acetona 100%
conjuntamente con 3 perlas de ebullicin de vidrio (sigma, 425-600 micras) a
un tubo de centrifuga cnico de 50 mL. La suspensin fue homogeneizada en
un agitador vortex y se sometieron a una centrifugacin de 3500 rpm por 5 min.
Los sobrenadantes fueron colectados, en un matraz baln para su posterior
concentracin en un rotavapor. Este procedimiento descrito se repiti con el fin
de extraer exhaustivamente los pigmentos de la biomasa seca. La confirmacin
de la ausencia de estos compuestos en las muestras fue realizado mediante
una la exploracin espectrofotomtrica UV-Vis, se consider finalizado el
procedimiento cuando los valores en la absorbancia fueran inferiores a 0.05
unidades.
4.7.2.3. Mtodo DMSO

A 100 mg de muestra se le aadieron 2 mL de dimetilsulfxido (DMSO)
(Merck) y 3 perlas de ebullicin de vidrio en un tubo falcn de plstico con
capacidad de 50 ml. Se incubo este material en un bao mara a una
temperatura de 50oC por 30 min., seguido de una rigurosa agitacin en el
vortex durante 15 segundos cada 10 min. Posteriormente, el material fue
centrifugado (3500 rpm por 5 min.), se recupero el sobrenadante y se repiti el
proceso de extraccin hasta agotamiento.
4.8. Determinacin de pigmentos
43
MATERIALES Y MTODOS
Para la cuantificacin del contenido total de pigmentos se utilizaron los

siguientes mtodos:
1. Frmulas. Las concentraciones de clorofila a, b, carotenoides totales y
astaxantina se determinaron mediante las frmulas propuestas por
Lichtentaler and Wellburn, (1985).
2.
e a
euu = 11.75 A>> 2.350 A>50
e a
eu = 18.61 A>50 3.960 A>>
ue 1'u
a =1 1000 A5
2.270C
81.4C
227
3. Patrones de referencia. El contenido de carotenoides totales se

estableci a partir de la concentracin de los extractos la cual se obtuvo
de la curva de calibracin (absorbancia, Y, en funcin de la
concentracin X expresada en mg/L), elaborada con soluciones
preparadas con b-caroteno (Y= , Astaxantina, Clorofila a y Xantofila. A
todas las soluciones estndares se les determin el espectro de
absorcin visible. Las determinaciones se realizaron por quintuplicado y
los contenidos de pigmentos se expresaron como valores promedios
para cada medio de cultivo.
4.9. Evaluacin del almacenamiento y estabilidad de la biomasa

seca y extractos totales
La biomasa seca de H. pluvialis se mantuvo durante 1.5 aos bajo las

siguientes condiciones: A temperatura ambiente bajo a la exposicin a la luz; a
temperatura ambiente en la oscuridad; congelado a -20oC en la oscuridad; con
antioxidante (0,01% de cido ascrbico) a temperatura ambiente en la
oscuridad; en una estufa de vacio (P0.04 atm).
Los extractos acetnicos de los pigmentos carotenoides, fueron
mantenidos en las mismas condiciones de almacenamiento antes mencionadas
durante 6 meses.
44
MATERIALES Y MTODOS
Tambin se hizo un estudio parcial de la estabilidad ante la luz,

ensayndose la estabilidad en exposicin a la luz solar, a la luz UV-vis y la
oscuridad.
4.10. Separacin e identificacin de los pigmentos
Para todos los anlisis cromatogrficos se utilizo el pigmento seco,

extrado de la microalga Haematococcus pluvialis.
4.10.1. Cromatografa en capa fina

La cromatrografa en placa fina se realiz en la oscuridad sobre una
placa de gel de slice de aluminio (Sigma-Aldrich Z19329-1) probando
diferentes disolventes de diversa polaridad como eluyentes. La mezcla que
logr mejores separaciones fue hexano:acetona (7:3). El revelado de las placas
se realiz utilizando una lmpara UV (Upland, USA) y vapores de yodo o cido
sulfrico al 10%. La identificacin de los carotenoides purificados se llev a
cabo utilizando los patrones de referencia ya antes mencionados y por un
anlisis espectrofotmetrico UV-vis.
4.10.2. Cromatografa en columna

Se emplearon columnas de vidrio de 2 cm de dimetro y 25 cm de altura,
empacadas con gel de slice 60 (malla 60 y 0.040-063 mm. Cromatografa en
columna Merck 1.09385.1000), y con 120 mL de hexano. El extracto se coloc
en un vaso de precipitado y se disolvi en hexano. El pigmento se agreg a la
columna formando una capa delgada uniforme, eluyendo inicialmente hexano
100%. Se obtuvieron fracciones de 6-10 mL en frascos trasparentes forrados
con papel aluminio de 30 mL, que fueron concentrados en el rotavapor a
sequedad, para su posterior estudio. Las fracciones obtenidas de la separacin
de los pigmentos por cromatografa en columna se analizaron por HPLC.
4.10.3. Cromatografa liquida de alta resolucin

El contenido de carotenoides y astaxantina de los extractos obtenidos
fueron analizados por cromatografa lquida de alta resolucin Un dispositivo
45
MATERIALES Y MTODOS
HPLC (bomba LC de Perkin Elmer, serie 200, Nor walk CT 06859, USA)
utilizando una columna C18 de fase inversa (Supelco, 25 cm de 4,6 mm). Los
disolventes empleados fueron (A) acetona y (B) una mezcla de metanol:agua
(9:1 v/v). La velocidad de flujo fue de 1.25 mL/min. La separacin de los
carotenoides se logr mediante un gradiente entre los disolventes A y B
durante 40 minutos de la siguiente manera: El disolvente B, se eluyo de 80 a un
20% durante 25 min, 20% para 10 minutos, y de 20 a 80% durante 5 min. La
separacin de los carotenoides y los steres de astaxantina fueron
identificados mediante un detector de matriz de fotodiodos (Brinda et al., 2004).
Los picos fueron integrados a 477 nm para cuantificacin de la astaxantina libre
y los steres de astaxantina. Fueron utilizados estndares de b caroteno, y la
astaxantina (Sigma) para la identificacin y cuantificacin de los pigmentos.
4.11. Bioensayo antimicrobiano
4.11.1. Prueba de Susceptibilidad

La tcnica de difusin en agar tambin conocida como de difusin en
disco, antbiograma o "Kirby-Bauer" es la ms utilizada en los laboratorios de
microbiologa clnica (Fig. 11). Esta tcnica es, en esencia, el resultado de la
interaccin de tres elementos: el antibitico depositado en un reservorio,
generalmente un disco de papel filtro (sensidiscos); un microorganismo que
ser inhibido o no por el antibitico, y un medio slido (agar) que servir como
apoyo al crecimiento del microorganismo y de difusin del antibitico. El
comportamiento de estos tres elementos a su vez estuvo determinado por las
condiciones de incubacin: temperatura, concentracin de bixido de carbono y
tiempo de incubacin.
Se deposit el disco con el antibitico sobre el agar ya uniformemente
inoculado; se estableci una competencia entre el antibitico que se difundi a
travs del medio y el microorganismo: que comienza a crecer. Si ste es
susceptible, habra un halo de inhibicin que se extender hasta un lmite dado
por la concentracin alcanzada por el antibitico en ese punto (concentracin
crtica).
Por lo que el dimetro de la zona de inhibicin indic el grado de
susceptibilidad del organismo al antibitico, cuando ste qued como nica
46
MATERIALES Y MTODOS
variable del sistema. A mayor zona de inhibicin mayor ser la susceptibilidad

del organismo. Todos los ensayos se hicieron por quintuplicado.
Figura 11. Determinacin de la actividad antimicrobiana por el mtodo de

difusin en placa (Kirby-Bauer). El perfil de accin se mide por la formacin de
halos de inhibicin.
4.10.2. Categoras de susceptibilidad

El International Collaborative Study Group on Antimicrobial Susceptibillity
Testing de la Organizacin Mundial de la Salud (Ericsson, 1971) recomienda
cuatro categoras de susceptibilidad:
Categora 1.- Incluye a las bacterias con un grado de susceptibilidad tal,
que la respuesta in vivo es probable en infecciones sistmicas, moderadas
a severas, cuando se tratan con la dosis habitual de un antimicrobiano.
Estos organismos se consideran como susceptibles.
Categora 2.- Incluye la susceptibilidad in vitro que hace probable la
respuesta in vivo en infecciones sistmicas, cuando el antibitico se usa en
dosis mayores o cercanas a la toxicidad.
Categora 3.- Comprende ciertos grados de susceptibilidad en los que la
Respuesta in vivo es probable cuando se tratan infecciones localizadas en
sitios donde el antibitico puede ser concentrado por procesos fisiolgicos
o por aplicacin local. Un ejemplo sera el tratamiento correcto de
infecciones urinarias por Proteus con penicilina G, que resultara
inadecuado para tratar al mismo organismo alojado en una vlvula
cardiaca.
47
MATERIALES Y MTODOS
Categora 4.- Incluye organismos cuya susceptibilidad hace la respuesta in

vivo improbable. Son organismos considerados como resistentes.
Las categoras 2 y 3 corresponden a la susceptibilidad intermedia, como
se informa tradicionalmente, que adems de las implicaciones clnicas antes
sealadas sirve para evitar discrepancias significativas que resulten de errores
tcnicos no controlables.

Los medios de cultivo que se emplearon fueron agar y caldo Dextrosa
Sabouraud (DIBICO) para Candida albicans agar y caldo Meller Hinton
(MERCK) para las bacterias.
4.11.4. Microorganismos de referencia

Los microorganismos fueron elegidos entre especies representativas de
distintas bacterias Gram (+) y Gram (-), y un hongo levaduriforme. En la Tabla
10 se describe el tipo de microorganismo y el nmero de cdigo de los
microorganismos de prueba. stos se adquirieron del Cepario de la Escuela
Nacional de Ciencias Biolgicas del Instituto Politcnico Nacional.
Tabla 10. Microorganismos utilizados en el ensayo antimicrobiano.

Microorganismo
Tipo de microorganismo
No. de cdigo
Bacilo Gram +
ATCC 6633
Levadura
ATCC 10231
Bacteria Gram +
ATCC 10741
Escherichia coli
Bacilo Gram +
ATCC 10536
Pseudomona aeruginosa
Bacilo Gram -
ATCC 27853
Staphylococcus aureus
Coco Gram +
ATCC 6538
Bacillus subtilis
Candida albicans
Enterococcus faecalis
Antes de realizar la determinacin del efecto antimicrobiano de los

diferentes extractos de la esponja, se verific la viabilidad de cada uno de los
microorganismos seleccionados para este trabajo. Todas las determinaciones
del bioensayo antimicrobiano se hicieron por quintuplicado.
48
MATERIALES Y MTODOS
4.11.5. Reactivacin, mantenimiento y conservacin de las cepas

Todos los microorganismos fueron activados en caldo Muller Hinton a
36oC por 24 horas, luego se resembro en agar Mueller Hinton y se incub en
las condiciones anteriores, para obtener colonias aisladas. Con las colonias
asiladas se hacieron resiembras masivas sobre cuas de agar Mueller Hinton
con 1% p/v de glicerol y sin glicerol. Los tubos en cua, luego de ser
incubados, se conservaron en refrigeracin para tener cultivos de trabajo. De
las cajas de agar se cosecharon los microorganismos con solucin
crioprotectora para conservar las cepas a -20oC. Tambin se determin
peridicamente la pureza de las cepas microbianas identificndolas por medio
de morfologa colonial, aislndolas por estra cruzada en el agar apropiado para
cada microorganismo, por morfologa microscpica y pruebas bioqumicas
especficas.
4.11.6. Viabilidad de las cepas

Con el fin de de verificar la viabilidad de cada uno de los
microorganismos, conocer la concentracin celular y la fase de desarrollo de
los microorganismos, se realiz una curva de crecimiento empleando caldo
Dextrosa Sabouraud la levadura y caldo Meller Hinton para las bacterias. En
la figura 12 se muestra el protocolo que se sigui para las cinticas de
crecimiento.
MTODO DE
DIFUSIN
EN AGAR
Figura 12. Diagrama de flujo de la curva de crecimiento microbiano de los

microrganismos de referencia.
4.11.7. Preparacin de los inculos
49
MATERIALES Y MTODOS
4.11.7.1. Bacterias
Para la preparacin de los inoclos bacterianos se utilizaron las
bacterias S. aureus, E. faecalis, E. coli, S. aureus, P. aeruginosa (Tabla 10).
Cada bacteria fue transferida al medio de mantenimiento Mueller Hinton e
incubada a 370C durante 24 horas, para la activacin respectiva del cultivo.
Para preparar el inculo fueron seleccionadas de 4 a 5 colonias de
bacterias activas en agar Mueller Hinton y transferidas a un tubo de ensaye
roscado con 5 mL de solucin estril de Caldo Mueller Hinton, seguido por una
homogenizacin en in vortex durante 15 segundos. La densidad del inculo fue
ajustada por espectrofotometra a 520 nm, al patrn de turbidez nmero 0.5 de
McFarland (NCCLS, 1993). El inculo final se obtuvo de la suspensin diluida
de los cultivos bacterianos respectivos, obtenindose una concentracin
aproximadamente de 1.5 x 106 clulas/mL (NCCLS, 1993). La suspensin
ajustada del inculo no debe permanecer ms de 15 a 20 minutos antes de
proceder a sembrarla en la caja petri.
4.11.7.2. Hongo levaduriforme

La levadura utilizada para la preparacin del inculo fue Candida
albicans. Se cultivo, por lo menos dos veces, en agar Dextrosa Saboraud, para
asegurarse de la pureza y viabilidad de los cultivos jvenes de 24 y 48 horas a
370C. El procedimiento para la obtencin del inculo fue el que se describi
para las bacterias.
4.11.8. Seleccin del Antibitico (Control Positivo)

Para la seleccin del control de sensibilidad o control positivo, con el fin
de obtener un marco de referencia acerca de la resistencia o sensibilidad de los
microorganismos objeto de estudio, se realizaron antibiogramas utilizando
algunos antibiticos que se encuentran en el mercado como Ampicilina,
Ketoconazol, Tienam/Imipenem, Cloranfenicol, Estreptomicina, Metronidazol y
Eritromicina. Se ensayaron concentraciones de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 mg/mL.
4.11.9. Control negativo

El control negativo consisti en discos impregnados con disolvente y
50
MATERIALES Y MTODOS
secados en iguales condiciones que las muestras; el ensayo es vlido si hay

ausencia de halo inhibitorio.
4.11.10. Preparacin de las concentraciones de extracto

Se aplicaron diferentes concentraciones (2, 3, 4, 5, 6 y 7 mg/mL) del
concentrado de cada uno de los extractos crudos microalgales obtenidos
anteriormente y disueltos con los diferentes disolventes. Mediante una
micropipeta con puntas estriles, se adicionaron a cada sensidisco estril
aproximadamente 5 mL de las diluciones de los extractos y se dejaron secar.
Esta
operacin
se
repiti
las
veces
necesarias
hasta
obtener
las
concentraciones antes mencionadas.
4.11.11. Determinacin de la actividad antimicrobiana

Se utilizaron cajas petri de vidrio, en las que se vertieron 15 mL de agar
Muller Hinton. Se dejaron solidificar y enfriar a temperatura ambiente. Con un
hisopo estril se sembr en cada caja petri los organismos de referencia.
Inmediatamente se depositaron los sensidiscos con el apoyo de una pinza
estril, presionndolos ligeramente para asegurar un contacto completo con la
superficie del agar. Se colocaron 6 sensidiscos en cada caja, los cuales
contenan diferentes concentraciones de extracto, adems de los controles
negativos y positivos. Para prevenir una sobreposicin de las zonas de
inhibicin, la distribucin de los sensidiscos se procur tener un lmite no menor
de 20 mm entre cada uno, y de 15 mm en relacin con el borde de la placa. Las
cajas se incubaron de forma invertida a 37oC durante 24 h, los dimetros de las
zonas de inhibicin se midieron por la parte posterior de la placa con una regla
graduada en milmetros, utilizando una fuente de luz brillante, cada hora hasta
completar las 24 horas. El ensayo se considera positivo (+) cuando hay
presencia de halo inhibitorio y negativo (-) cuando hay ausencia de halo
inhibitorio.
4.11.12. Concentracin Mnima Bactericida (MBC)

Para determinar la concentracin mnima bactericida, se seleccionaron
los cultivos que presentaron halo de inhibicin antimicrobiana. Se tom una
51
MATERIALES Y MTODOS
asada de estos cultivos y se sembraron en cajas petri con medio de cultivo de

agar Mueller Hinton y se incubaron a 37oC durante 24 horas. Despus de la
incubacin de los cultivos que han sido objeto de inspeccin se verific
visualmente el crecimiento microbiano.
Para la interpretacin de los resultados que se consideraron en la
inhibicin es la siguiente si se percibi el crecimiento microbiano los cultivos en
las cajas petri el extracto se considera que es de accin bacteriosttica y si no
existe crecimiento en los cultivos la accin se considera bactericida (Baron y
Finegold, 1990).
52
CAPTULO 5
RESULTADOS Y DISCUSIN
5.1. Caractersticas morfolgicas de Haematococcus pluvialis
Los cambios morfolgicos durante la etapa de formacin de glbulos

rojos incluyen un engrosamiento de la pared celular y un aumento significativo
en el volumen celular, a veces formando gigantes aplanoesporas rojas. Sin
embargo, la mayora de los quistes son ms pequeos de color rojo.
Figura 13. Fotomicrografa H. pluvialis (40X) en forma de quiste tomada con un

microscopio ptico.
En la Figura 13 se observa el espesor de la pared celular de la

aplanoespora de H. pluvialis. Esta pared se caracteriza por una extraordinaria
resistencia contra la agresin mecnica y qumica. Lorenz y Cysewski (2000)
recomiendan conocer los aspectos del ciclo de vida de H. pluvialis pues cada
vez se hace ms importante este aspecto, debido al creciente inters en este
microorganismo como una fuente biotecnologa de astaxantina. Al igual como
lo mencionan los autores Bubrick, (1991) y Olaizola, (2000) el engrosamiento
de la pared celular de la aplonoespora disminuye la biodisponibilidad de los
carotenoides acumulados ya que el rompimiento de las clulas para accesar a
los pigmentos se hace ms difcil y caro debido a las multiples tcnicas de
extraccin.
5.2. Condiciones de cultivo y parmetros poblacionales de H.

pluvialis en los medios f/2 y QF.
53
Las investigaciones sobre el cultivo de microalgas revisten gran

importancia dada su amplia aplicacin biotecnolgica y comercial. En tal
sentido, se han utilizado los cultivos discontinuos por su fcil manejo para
determinar la cintica de crecimiento y los parmetros que influyen en el
desarrollo poblacional de las microalgas (Abalde et al., 1995). Sin embargo, el
uso de los medios de cultivo sintticos ha incrementado sustancialmente el
valor econmico para la produccin de la biomasa de estos microorganismos
(Gonzlez et al., 1999).
Recientemente se ha ensayado el uso de sustratos alternativos y no
convencionales como medios de cultivo, destacando: fertilizantes agrcolas,
residuos pesqueros y exudados gomosos, entre otros, para el crecimiento y
desarrollo de algunas microalgas. Se destaca que a partir de estos medios
innovadores se han obtenido resultados comparables y superiores a los
correspondientes a los medios sintticos.
El objetivo general de este trabajo fue evaluar los cultivos por lotes de
Haematococcus pluvialis en los medios f/2 (Guillard y Ryther, 1962) y un
fertilizante foliar (QF).
Para que las microalgas crezcan adecuadamente en un medio de cultivo
artificial como el f/2 debe reunir una serie de condiciones. Un medio de cultivo
debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesario y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante.
5.2.1. Comportamiento del pH, de la conductividad elctrica y de la

temperatura con relacin al crecimiento de H. pluvialis.
Son numerosos los trabajos que se han realizado sobre los factores
fsico-qumicos que condicionan el crecimiento del fitoplancton en cultivo entre
los que se destacan la luz, temperatura, salinidad, pH y CO2 (Coutteau 1996,
Snchez et al., 2000, Leonardos y Lucas 2000, Tzovenis et al., 2003).
Como se mencion el pH es un parmetro fundamental para el
crecimiento de la microalga. Las microalgas de agua dulce, comnmente
crecen favorablemente en intervalos de ambientes neutros a bsicos (Ginzburg
y Ginzburg, 1981). Este parmetro afecta muchos procesos directamente
relacionados con el crecimiento microalgal y el metabolismo, incluyendo la
54
disponibilidad y asimilacin de iones (Borowitzka y Borowitzka, 1988).

El intervalo de pH requerido por el fitoplancton es de 7.7 a 8.2
aproximadamente (14)
pH
QF
F/2
10.3
10.0
9.7
9.4
9.1
8.8
8.5
8.2
7.9
7.6
7.3
7.0
0
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
Tiempo (das)
Figura 14. Variacin del pH de los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar)
de la microalga H. pluvalis en 30 das.
En la figura 14 se observa que el pH sigui la misma tendencia en los

dos medios de cultivo. En el medio f/2 se observa un aumento de
55
Conductividad Elctrica (mV)
QF
F/2
290
260
230
200
170
140
110
80
50
0
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Tiempo (das)
Figura 15. Conductividad elctrica de los medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante

foliar) de la microalga H. pluvalis en 30 das.
La temperatura ptima para el crecimiento de H. pluvialis es

relativamente bajo. Borowitzka et al. (1991) ha reportado que una variedad de
esta microalga (H. pluvialis MUR) creca mejor a 15oC de temperatura. A 25oC
fue inhibido el crecimiento y a 35oC de temperatura el cultivo decayo en su
totalidad. El mismo modo Harker el al., (1995) demostr que la temperatura
optima de crecimiento estaba entre los 14 y 15 oC.
5.2.1. Densidad Celular.
La curva de crecimiento de las microalgas, de forma general, posee

cinco fases en el tiempo. La duracin de cada fase puede acortarse, alargarse
o apenas reconocerde, dependiendo de diversos factores como temperatura,
fuente deluz, composicin qumica del medio de cultivo, tamao del inculo y
caractersticas propias de las microalgas.
Al inocular un nuevo medio, a menudo no se registra un crecimiento
inmediato en el nmero de clulas. Esta fase de induccin o de retraso del
56
crecimiento se puede dilatar entre 1 a 3 das, dependiendo del tamao y del

estado del inoculo. En general, este periodo se puede evitar utilizando como
inculos cultivos que todava estn en su fase de crecimiento exponencial.
Al adaptarse las clulas al medio, la densidad de las microalgas
aumenta en forma geomtrica (exponencial). La fase exponencial puede
presentarse del segundo al tercer da despus de inoculado el medio y
prolongarse hasta 4 das.
En la fase de declinamiento relativo del crecimiento, puede durar de 1 a
2 das, empieza a manifestarse un decremento de la velocidad de las clulas,
debido a condiciones desfavorables en el cultivo generadas en la fase
exponencial. Al final de esta fase la densidad del cultivo alcanza su valor
mximo.
f/2
QF
2.50E+06
No. de cel/mL
2.00E+06
1.50E+06
1.00E+06
5.00E+05
0.00E+00
0
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
Tiempo (das)
Figura 14. Densidad celular de H. pluvalis en los medios de cultivo f/2 y QF
(fertilizante foliar).
Como se observa en la figura 14, el crecimiento de la microalga present

una tendencia similar en los dos medios evaluados, con una fase de latencia
que culmin el da 12 para el medio f/2 y para el QF el da 6, seguida de una
fase exponencial que dur 18 das para el medio QF y para el medio f/2 10. La
microalga present una fase estacionaria despus de los das 24 y 26 en los
57
medios f/2 y QF respectivamente.

En el da 24 la microalga alcanza su densidad celular mxima (2098250
cel/mL) en el medio QF y en el f/2 el da 22 con 686000 cel/mL.
5.3.3. Divisiones por da (k) en los diferentes medios de cultivo.
f/2
QF
1.60
k (divisiones por da)
1.40
1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Tiempo (das)
Figura 16. Divisiones por da de H. pluvialis en los medios f/2 y QF (fertilizante
foliar) en 30 das de cultivo.
5.3.4. Tasa de crecimiento especfico (m) de los medios de cultivo f/2

y QF.
58
m (da-1)
f/2
QF
0.45
0.42
0.39
0.36
0.33
0.30
0.27
0.24
0.21
0.18
0.15
0.12
0.09
0.06
0.03
0.00
0
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Tiempo (das)
Figura 17. Tasa de crecimiento especfico (m) de los medios de cultivo f/2 y QF
(fertilizante foliar) de la microalga H. pluvalis en 30 das.
5.3.5. Tiempo de generacion (Tg) en los diferentes medios de

cultivo.
Tiempo de generacin (Tg)
f/2
QF
4.70
4.40
4.10
3.80
3.50
3.20
2.90
2.60
2.30
2.00
1.70
1.40
1.10
0.80
0.50
0
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Tiempo (das)
Figura 18. Tiempo de generacin de H. pluvialis en 30 das de cultivo en los
59
medios de cultivo f/2 y QF (fertilizante foliar).
5.3.6. Produccin diaria de los medios de cultivo f/2 y QF.
f/2
QF
Produccin diaria (cel/mL)
9.E+04
8.E+04
7.E+04
6.E+04
5.E+04
4.E+04
3.E+04
2.E+04
1.E+04
0.E+00
0
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Tiempo (das)
Figura 19. Produccin diaria de la microalga H. pluvialis en los
diferentes medios de cultivo.
5.3. Anlisis qumico proximal.
Otra de las herramientas para determinar la cantidad y calidad de la

biomasa celular en cultivos es la determinacin de su composicin bioqumica
(protenas, carbohidratos, cenizas, humedad y lpidos). Esta informacin es
sumamente til para analizar sobre todo aquellas especies de uso potencial en
acuicultura; adems puede ser utilizada como una medicin indirecta para
mostrar la fase de crecimiento en que se encuentra el cultivo.
Tabla 13. Composicin qumica proximal de H. pluvialis en base de los medios

f/2 y QF.
Anlisis
Protenas
f/2*(%)
Fertilizante foliar (%)
37.6 0.4
41.2 0.7
60
Carbohidratos
18.5 0.5
20.2 0.2
Lpidos
29.7 0.3
27 0.7
Humedad
3.3 0.4
3 0.3
Cenizas
10.9 0.1
8.6 0.6
*(Guillard y Ryther, 1962)
Las microalgas, en general, contienen del 25 hasta el 65% de su peso

seco como protenas, hasta el 53% de lpidos y hasta el 58% de carbohidratos,
dependiendo de su etapa de desarrollo (Castillo y Berger, 1983; Brow et al.,
1989).
La composicin bioqumica de la microalga Haematococcus pluvialis ha
recibido relativamente poca atencin, ya que la mayora de las investigaciones
han sido dirigidas a la evaluacin de otros compuestos de inters, tales como
carotenoides totales y particularmente la astaxantina, en determinadas
condiciones de cultivo. Sin embargo, es importante examinar la composicin
bioqumica de esta microalga (protenas, carbohidratos y lpidos), sobre todo
cuando van a ser incluidas como clulas en dietas peletizadas para la
alimentacin de peces y crustceos. Esta propuesta se debe a que adems de
la pigmentacin que dicha microalga proporciona a estos organismos, podra
funcionar como complemento alimenticio o como un alimento potencial para
otros organismos filtradores que forman parte de la cadena alimenticia. Estos
ltimos deben ser capaces de digerir la pared celular, caracterstica de esta
cepa cuando se encuentra enquistada (clulas en estado plameloide y
aplanosporas). Los resultados obtenidos en el cultivo de Haematococcus
pluvialis en los diferentes medios utilizados mostraron un porcentaje de
componentes bioqumicos adecuados. Estos porcentajes son similares a los
reportados para H. lacustris (Cern, 1996) y para otras especies de microalgas,
ampliamente utilizadas en acuicultura (Brown et al., 1989).
Durante el desarrollo de los cultivos, predomin la presencia de clulas
rojas sobre las dems morfologas. Se observaron clulas flageladas con el
centro pigmentado, esta expresin de la microalga se condiserara idnea si se
lograra mantener cultivos masivos. En estas condiciones pudiera ser utilizada
directamente en la alimentacin de organismos con bajo poder de digestibilidad
61
de paredes celulares duras, como algunos peces y crustceos de importancia

econmica (Sommer et al., 1991).
5.4. Extraccin y determinacin de pigmentos
Los pigmentos carotenoides son solubles en lpidos o en solventes no

polares, excepto cuando se forman complejos con las protenas y azcares.
Los disolventes polares ms utilizados para la extraccin de los carotenoides
son el ter de petrleo y el ter etlico. Hay otros, pero, tienen muchos
inconvenientes, como ser inflamables, txicos y degradan rpidamente los
carotenoides. Otros disolventes menos polares como la acetona, el metanol y
el etanol tambin se utilizan para la extraccin, pero slo son eficientes siempre
y cuando se trate de la extraccin de xantofilas (Rodriguez-Amaya, 1997).
En general, la extraccin de los carotenoides se debe hacer
rpidamente, a fin de evitar el contacto con la luz, el oxgeno y altas
temperaturas, ya que se tiene que minimizar la degradacin de estos
compuestos. Segn algunos autores (Rodrguez-Amaya 1989, RodrguezAmaya, 1990 y Amaya-Farfan, 1992), hay varios puntos que deben tenerse en
cuenta en la extraccin de los carotenoides, dentro de los cuales destacan:
r El origen de los carotenoides.
r La composicin de los carotenoides en los alimentos ya que stos varan
tanto cualitativa y cuantitativamente.
r La predisposicin a la isomerizacin y la oxidacin.
5.4.1 Determinacin de los pigmentos en la biomasa hmeda
62
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
(das)
0.38
0.35
0.32
Unidades de absorbancia
0.29
0.26
0.23
0.2
0.17
0.14
0.11
0.08
0.05
0.02
-0.01
340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740
Longitud de onda (nm)
Figura 15. Espectro de absorcin f/2.
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
(das)
0.18
Unidades de absorbancia
0.15
0.12
0.09
0.06
0.03
0
340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 740
-0.03
Longitud de onda (nm)
Figura 17. Espectro de absorcin QF.
63
Clorofila a
Clorofila b
Astaxantina
b-caroteno
Lutena
1.2
Concentracin (mg/mL)
1.0
0.9
0.7
0.6
0.4
0.3
0.1
-0.1
10
-0.2
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Tiempo (das)
Figura 11. Concentracin de pigmentos f/2
Clorofila a
Clorofila b
Astaxantina
b-caroteno
Lutena
1.2
Concentracin (mg/mL)
1.0
0.9
0.7
0.6
0.4
0.3
0.1
-0.1
-0.2
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Tiempo (das)
Figura 15. Concentracin de pigmentos biomasa humeda QF.
Lababpour y Lee (2005) probaron varios disolventes orgnicos (metanol,

hexano, cloroformo, n-propanol y acetonitrilo) y seleccionaron a la acetona
100% como el mejor disolvente extractivo de los pigmentos, debido a su
sensibilidad y baja toxicidad en comparacin con otras pruebas. No obstante en
64
este estudio se obtuvieron bajos rendimientos en la extraccin de Astaxantina

con la Acetona 100%.
Un rompimiento con DMSO es un mtodo rpido y reproducible en
comparacin con los mtodos de mecnicos, por lo que es un mtodo
alternativo que puede utilizarse eficazmente para de extraccin de astaxantina
a partir de clulas de H. pluvialis.
Tal como se presenta en la literatura, algunos autores han sealado que
en la extraccin de astaxantina se han utilizado distintos extractantes y
disolventes, entre ellos la acetona que ha sido uno de los disolventes orgnicos
para la extraccin de dicho pigmento.
Se evalu el potencial extractor de tres disolventes: Acetona 100%,
Acetona-HCl 4N y DMSO. Segn los resultados que se presentan en la Tabla
10.
Tabla 10. Resultados de las extracciones
F/2 (Guillard y Ryther, 1962)
[mg/mL]
QF (Fertilizante foliar)
[mg/mL]
Acetona 100%
3.5 (1.4% en 50 mg*)
2.0 (0.79% en 50 mg*)
Acetona-HCl 4N
2.1 (0.8% en 50 mg*)
3.8 (1.5% en 50 mg*)
3.2 (4% en 50 mg*)
2.8 (3.5% en 20 mg*)*
Disolvente
DMSO
En la figura 20 se observa las clulas antes y despus de las extracciones con

los diversos disolventes.
65
Figura 20. Fotomicrografa de clulas enquistadas de H. pluvialis (a1, b1) antes

de la extraccin y (a, b) despus de la extraccin. (a=F/2 and b=QF)..
5.5. Separacin e identificacin de los compuestos.
La separacin e identificacin de la separacin de estos compuestos

generalmente se produce por mtodos cromatogrficos, como Cromatografa
de Capa Fina (TLC) y la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).
Desde HPLC es la tcnica preferida de columna, ya que esto tiene dos
ventajas: el hecho de que es cualitativa y cuantitativamente el mismo tiempo.
Esta tcnica es ideal para los carotenoides, ya que estos compuestos pueden
ser fcilmente controlados por los rayos UV detectores visibles. Un factor que
ha contribuido an ms a los estudios de los carotenoides es que se dediquen
a los detectores de fotodiodo, que permiten la deteccin de ms de una
longitud de onda. En general, la tcnica de cromatografa lquida de alto
rendimiento tiene las siguientes ventajas sobre otras tcnicas: alta sensibilidad,
resolucin, reproducibilidad y rapidez en el anlisis (Taylor, 1988). La tcnica
ms utilizada para el anlisis de los carotenoides es la espectroscopia UVvisible, que proporciona informacin sobre la presencia de anillos, grupos
carbonilo y los efectos de ismeros. En este anlisis, el mximo de absorcin,
la forma y la estructura del espectro estn las caractersticas de las molculas
de los cromforos.
5.6. Actividad antimicrobiana

Casi siempre, la bsqueda de productos naturales activos esta
ntimamente ligada a ensayos antimicrobianos. Con estos bioensayos, se pudo
conocer la capacidad que tiene un compuesto o grupo de compuestos de una
eventual actividad contra algunos microorganismos. Se emplearon mtodos en
difusin en placa o discos con agar puesto que es una prueba eficiente,
sencilla, no costosa (Rinehart, 1990) y econmica en trminos de cantidad de
muestra
utilizada.
Sin
embargo,
es
importante
hacer
notar
algunos
inconvenientes de esta tcnica, puesto que los extractos poco polares tienden
a difundirse deficientemente sobre la placa de agar ya que los compuestos del
agar son altamente polares (Berghe y Vlietinck, 1991). No obstante fue posible
66
detectar actividad antimicrobiana en extractos poco polares.
Seleccin del antibitico (control positivo)

Entre los antibiticos que se encuentran en el mercado se eligieron los
controles positivos (Tabla 11). Todos los microorganismos de prueba
manifestaron resistencia a la Estreptomicina, al Metronidazol y la Eritromicina.
Las cepas bacterianas C. albicans, E. faecalis y P. aeuruginosa fueron las que
presentaron ms resistencia a los antibiticos de prueba. Torres-Ario (2001)
recomend el uso de Tienam/Imipenem como control positivo pues es uno de
los ms efectivos para la eliminacin de bacterias hetertrofas. El ketoconazol
solo se prob en Candida albicans, puesto que este medicamento es
antifngico y no tena caso probarlo en bacterias.
Tabla 11. Antibiticos probados para definir los controles positivos

Microorganismo
Ampicilina
Ketoconazol
Tienam/
Cloranfenicol
Estreptomicina
Metronidazol
Eritromicina
Imipenem
B. subtilis
C. albicans
E. faecalis
N. P.
N. P
E. coli
N. P
P. aeruginosa
N. P
S.aureus
N. P
R= Resistente, S= Sensible, N. P.= No se probo.
B. subtilis, y C. albicans mostraron sensibilidad a la Ampicilina y al

Ketoconazol, respectivamente. El Tienam/Imipenen inhibi el crecimiento de E.
faecalis, P. aeruginosa, y el Cloranfenicol el de E. coli y S. aureus.
En la tabla 12 se ilustran los controles positivos, la concentracin de
stos por disco, y el halo de inhibicin que se form. El halo de inhibicin
formado por la Ampicilina para B. subtilis fue el ms grande (22 mm). Este
bacilo result ser muy sensible a este medicamento, a pesar que el espectro de
accin de dicho antibitico es mayor que el de la bencilpenicilina; aunque
tambin es sensible a las penicilinasas. Es menos activa contra bacterias gram
positivas, pero es activa contra algunas gram negativas, como Escherichia coli,
Haemophilus influenzae y Salmonella sp., aunque se han reportado
incrementos en su resistencia (US Pharmacopeia, 1994; Anon, 1995; Barnas y
67
Nimphius,
1996;
Demonty,
1996)
La
Ampicilina
est
indicada,
fundamentalmente, en infecciones por algunas bacterias gram negativas y

enterococos, pero es ineficaz frente a Klebsiella, Enterobacter y Pseudomonas
spp. Es eficaz en las infecciones debidas a estreptococos y estafilococos
sensibles, as como en las infecciones urinarias causadas por E. coli, P.
mirabilis y Enterococcus sp., en las meningitis por H. influenzae, neumococos y
meningococos sensibles y en las infecciones por Listeria, incluyendo meningitis
(US Pharmacopeia, 1994; Anon, 1995; Barnas y Nimphius, 1996; Demonty,
1996).
Tabla 12. Halos de inibicin de los controles positivos.

Microorganismo
Bacillus subtilis
Candida albicans
Escherichia coli
Pseudomona aeruginosa
Control positivo
(Antibitico)
(mg/disco)
Halo de inhibicin
(mm)
Ampicilina
22
Ketoconalzol
19
Tienam/Imipenem
17.5
Cloranfenicol
3.5
19.5
Tienam/Imipenem
16.5
Cloranfenicol
3.5
21
Valores promedio producto de las cinco rplicas.
La concentracin ms alta que se manejo de Tienam/Imipenem fue de 4

mg por disco para P. aeruginosa y E. faecalis. El Tienam/Imipenem, derivado Nformimidoilo de la tienamicina, obtenido del Streptomyces cattleya, fue el primer
antibitico betalactmico del grupo de los carbapenmicos. Es tambin
bactericida y acta, igualmente, inhibiendo la sntesis de la pared celular. Su
espectro de accin es amplio e incluye a microorganismos gram positivos y
gram negativos, aerobios y anaerobios. Se utiliza en el tratamiento de
infecciones intra-abdominales de etiologa mixta y nosocomiales; incluyendo las
de microorganismos gram negativos resistentes, como son las de Enterobacter;
y las originadas por el uso previo de antibiticos de amplio espectro. Tiene
buena actividad contra P. aeruginosa y Bacillus fragilis, pero la mayora de las
cepas de estafilococos resistentes a la meticilina lo son tambin al imipenem y
la P. aeruginosa puede hacerse resistente cuando se usa solo. Es uno de los
antibiticos ms caros que existen en el mercado actual, el costo de un
68
tratamiento puede exceder los $100/da (Alv y Nord, 1995; Ennis y Cobbs,
1995; Norrby, 1995;).
Actividad antimicrobiana en los extractos crudos.

Todos los extractos crudos se ensayaron contra los microorganismos de
prueba como se ilustra en la tabla q.
Tabla 13. Actividad antimicrobiana en los extractos crudos de Haematococcus

pluvialis extraida con DMSO.
Microorganismo
Tipo de
microorganismo
Bacilo Gram +
Levadura
Bacteria Gram +
Escherichia coli
Bacteria Gram -
Bacilo Gram -
Coco Gram +
Bacillus subtilis
Candida albicans
Pseudomonas
aeruginosa
(+) inhibicin de crecimiento microbiano. ( - ) no inhibicin de crecimiento microbiano.

pluvialis extraida con Acetona 100%.
Microorganismo
Bacillus subtilis
Candida albicans
Tipo de
microorganismo
Bacilo Gram +
Levadura
Bacteria Gram +
Escherichia coli
Bacteria Gram -
Bacilo Gram -
Coco Gram +
Pseudomonas
aeruginosa

pluvialis extraida con Acetona-HCl 4N
Microorganismo
Tipo de
microorganismo
69
Bacillus subtilis
Bacilo Gram +
Levadura
Bacteria Gram +
Escherichia coli
Candida albicans
Pseudomonas
aeruginosa
Bacteria Gram -
Bacilo Gram -
Coco Gram +
70
CONCLUSIONES
1. La composicin qumica proximal de H. pluvialis presento porcentajes
adecuados y que coinciden con otras microalgas (protena 37.6-41.2%,
carbohidratos 18.5-20.2% y lpidos 29.7- 27%) por lo que puede ser una
alternativa como suplemento alimenticio para la acuicultura.
2. El DMSO resulto ser el disolvente adecuado para la extraccin de

astaxantina, sin embargo no es muy verstil ni adecuado para la
concentracin de este extracto.
3. Los extractos crudos extraidos con DMSO resultaron tener ms actividad
antimicrobiana que los extractos de Acetona 100% y Acetona-HCl 4N.
4. Todos los extractos crudos tuvieron un efecto bactericida frente a los

microorganismos de prueba.
71
RECOMENDACIONES.
Los futuros trabajos que deberan realizarse:
Ensayar la actividad antioxidante de estos extractos crudos.
Optimizaar las condiciones de produccin de H. pluvialis para su

escalamiento a 10 L.
Realizar pruebas de toxicidad de los extractos.
72
Abraham, J. 1991. Les vitamines: sensibilit des vitamines aux agressions
physico-chimiques. Extrait des Cahiers de Nutrition et de dittique, 1.
Aksu, Z and Eren, A. T. 2005. Carotenoids production by the yeast Rhodotorula
mucilaginosa: Use of agricultural wastes as a carbon source. Process
Biochemistry, v. 40, p. 29852991.
Aksu, Z and Eren, A. T. 2007. Production of carotenoids by isolated yeast of
Rhodotorula glutinis. Biochemical Engineering Journal, v. 35, p. 107
113.
Andrewes, A. G and Starr, M. P. 1976. (3R, 3R)-astaxanthin from the yeast
Phaffia rhodozyma. Phytochemistry, v. 15, p. 1009-1011.
Armstrong, G. A and Hearst, J. E. 1996. Carotenoids 2. Genetics and molecular
biology of carotenoid pigment biosynthesis. Faseb Journal, v. 10(2), p.
228-237.
Association of Official Analytical Chemists. 1997. Official Methods of Analysis of
the Association of Official Analytical Chemists, 16th ed.; Cunniff, P.,
Ed.; AOAC International Suite, Maryland, Volume I.
Badyaev, A. V and Hill, G. E. 2000. Evolution of sexual dichromatism:
Contribution of carotenoid versus melanin based coloration. Biol. J.
Linn. Soc., v. 69, p. 153-172.
Basurco, B. and Abelln, E. 1999. Finfish species diversification in the context
of the Mediterranean marine fish farming development. Cahiers Options
Mditerranennes, Ser. B: Etudes et Recherches, v. 24, p. 9-25.
Bendich, A and Shapiro, S. S. 1986. Effect of -carotene and canthaxanthin on
the immune responses of the rat. J. Nutr., v. 116 (11), p. 2254-2262.
Bhosale, P. 2004. Environmental and cultural stimulants in the production of
carotenoids
from
microorganisms.
Applied
Microbiology
and
Biotechnology, v. 63, p. 351361.

Bidigare, R. B., Ondrusek, M. E., Kennicutt II, M. C., Iturriaga, R., Harvey, H. R.,
Hohan, R. W and Macko, S. A. 1993. Evidence for photoprotective
function for secondary carotenoids of snow algae. J Phycol., v. 29, p.
427-434.
73
Boonyaratpalin, M., Thongrod, S., Supamattaya, K., Britton, G and Schlipalius,

L. E. 2001. Effect of -carotene source, Dunaliella salina, and
astaxanthin on pigmentation, growth, survival and health of Penaeus
monodon. Aquaculture Research, v. 32 (1), p. 182-190.
Booth, M., Warner-Smith, R., Allan, G and Glencross, B. 2004. Effects of dietary
astaxanthin source and light manipulation on the skin colour of
Australian snapper Pagrus auratus (Bloch & Schneider, 1801).
Aquaculture Research, v. 35, p. 458-464.
Borowitzka, M. A.; Huisman, J. M and Osborn, A. 1991. Culture of the
astaxanthinproducing green alga Haematococcus pluvialis. 1. Effects of
nutrients on growth and cell type. J Appl Phycol., v. 3, p. 295-304.
Botella-Pava, P and Rodrguez-Concepcin, M. 2006 Carotenoid biotechnology
in plants for nutritionally improved foods. Physiologia Plantarum, v.
126, p. 369381.
Boussiba, S and Vonshak, A. 1991. Astaxanthin accumulation in the green alga
Haematococcus pluvialis. Plant and Cell Physiology, v. 32(7), p.
1077-1082.
Boussiba, S and Vonshak, A. 1991. Astaxanthin accumulation in the green alga
Haematococcus pluvialis. Plant Cell Physiol., v. 7, p. 1077-1082.
Boussiba, S. 2000. Carotenogenesis in the green alga Haematococcus
pluvialis: cellular physiology and stress response. Physiologia
Plantarum, v. 108(2), p. 111-117.
Boussiba, S. 2000. Carotenogenesis in the green alga Haematococcus
pluvialis: cellular physiology and stress response. Physiologia
Plantarum, v. 108(2), p. 111-117.
Boussiba, S., Bing W., Jian-Ping, Y., Zarka, A and Chen, F. 1999. Changes in
pigments profile in the green alga Haematococcus pluvialis exposed to
environmental stresses. Bitech Lett., v. 21, p. 601-604.
Boussiba, S., Fan, L and Vonshak, A. 1992. Enhancement and determination of
astaxanthin accumulation in the green alga Haematococcus pluvialis.
Meth Enzymol., v. 213, p. 386-391.
Britton, G. 1995. Carotenoids. Vol. 1B: Spectroscopy. Edited by Britton G.,
Liaaen-Jensen S., and Pfander, H. Birkhuser Verlag Basel.
Britton, G. 1995a. Structure and properties of carotenoids in relation to function.
74
FASEB J., v. 9, p. 1551-1558.

Britton, G. 1995b. UV/Visible spectroscopy. In Carotenoids: Spectroscopy
(Britton, G., Liaaen-Jensen, S., Pfander, H., Eds). Vol. 1B. Birkusen,
Basel. 1998.
Britton, G. 1998. Overview of carotenoid biosynthesis. In: Britton, G., LiaaenJensen, S., Pfander, H., (Eds). Carotenoids, vol. 3. Birkusen, Basel.,
14-15.
Britton, G., Liaaen-Jensen, S and Pfander, H. 2004. Carotenoids Handbook.
Boston: Birkhauser Verlag.
Buchheim, M. A and Chapman, R. L. 1991. Phylogeny of the colonial green
flagellates: a study of 18S and 26S rRNA sequence data. Biosystems,
v. 25, p. 85-100.
Buchheim, M. A., Mauley, M. A., Zimmer, E. A., Theriot, E. C and Chapman, R.
L. 1995. Multiple origins of colonial green flagellates from unicells.
Evidence from molecular and organism characters. Mol Phylogen
Evol, v. 4, p. 322-343.
Burczyk, J. 1987. Cell wall carotenoids in green algae which from
sporopollenins. Phytochemistry, v. 26, p. 121-128.
Burns, J., Frase, P. D and Bramley, P. M. 2003. Identification and quantification
of carotenoids, tocopherols and chlorophylls in commonly consumed
fruits and vegetables. Phytochemistry, v. 62, p. 939-947.
Carter, J. V., Palafox, J. T. P and Islas, R.P. 1994. Bioensayo de pigmentacin
de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) con extractos de chili ancho
(Capsicum annuum). Arch. Latinoam. Nutr., v. 44, p. 252-255.
Casas, A and Mallent, D. 1988. El color de los frutos ctricos. I. Generalidades.
II. Factores que influyen en el color. Influencia de la especie, de la
variedad y de la temperatura. Revista de Agroqumica y Tecnologa
de Alimentos, v. 28 (2), p. 184-201.
Chen, B. H and Chen, Y. Y. 1993. Stability of chlorophylls and carotenoids in
sweet
potato
leaves
during
microwave
cooking.
Journal
of
Agricultural and Food Chemistry, v. 41 (8), p. 1315- 1320.

Chew, B. P and Park, J. S. 2004. Functions and actions of retinoids and
carotenoids: building on the vision of James Allen Olson. American
Society of Nutritional Sciences, p. 257S-261S.
75
Chew, B. P. 1992. Role of carotenoids in the immune response. J. Dairy Sci.,

v. 75, p. 265.
Choi, Y. E., Yun, Y. S and Park, J. M. 2002. Evaluation of factors promoting
astaxanthin production by a unicellular green alga, Haematococcus
pluvialis, with fractional factorial design. Biotechnology Progress, v.
18(6), p. 1170-1175.
Choubert, G., Gomez, R and Milicua, J. C. G. 1994b. Response of serum
carotenoid level to dietary astaxanthin and canthaxanthin in immature
rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Comp. Biochem. Physiol., v.
109 A, p. 1001-1006.
Choubert, G., Milicua, J. C and Gomez, R. 1994a. The transport of astaxanthin
in immature rainbow trout Oncorhynchus mykiss serum. Comp.
Biochem. Physiol., v. 108 A, p. 245-248.
Cifuentes, A. S., Gonzlez, M. A., Vargas, S., Hoeneisen, M and Gonzlez, N.
2003. Optimization of biomass, total carotenoids and astaxanthin
production in Haematococcus pluvialis Flotow strain Steptoe (Nevada,
USA) under laboratory conditions. Bio. Res., v. 36, p. 343-357.
Clydesdale, F. M. 1993. Colour as a factor in food choice. Crit. Rev. Fd. Sci.
Nut., v. 33, p. 83-101.
Coral, H. G., Hubermann, A., De la Lanza, G and Monroy-Ruiz, J. 1997.
Pigmentation of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) with oil
extracted astaxanthin from the langostilla (Pleurocondes planipes).
Archivos Latino-americanos de Nutricin, v. 47, p. 237-241.
Darachai, J., Pitatiratitivorakul, S and Menasveta, P. 1999. Effect of astaxanthin
on growth and survival of Penaeus monodon larvae. In: Proceedings of
the 37th Kasetsart University Annual Conference, 36-41. Oates, C.G.,
Eds.
Delgado-Vargas, F., Jmenez, A. R and Paredes-Lpez, O. 2000. Natural
pigments: Carotenoids, anthocianins, and Betalains Characteristics,
Biosynthesis, Processing and Stability. Critical Reviews in Food
Science and Nutrition, v. 40 (3), p. 173-289.
Deming-Adams, B., Gilmore, A. M and Adams III, W. W. 1996. In vivo functions
of carotenoids in higher plants. FASEB J., v. 10, p. 403-412.
Demmig-Adams, B., Gilmore, A. M and Adams, W. W. 1996. In vivo functions of
76
carotenoids in higher plants. Faseb Journal, v. 10(4), p. 403-412.

Doolan, B. J., Allan, G. L., Booth, M. A and Jones, P. L. 2004. Improving skin
colour in farmed snapper (red sea bream, Pagrus auratus).School of
Ecology and Environment, Deakin University, Warrnambool, Victoria
3280, Australia. www.was.org/documents.
Droop, M. R. 1954. Conditions governing haematochrome formation and loss in
the alga Haematococcus pluvialis. Arch Mikrobiol., v. 20, p. 391-397.
Droop, M. R. 1955. Carotenogenesis in Haematococcus. Nature., v. 175, p. 42.
Fabregas, J., Dominguez, A., Maseda, A and Otero, A. 2003. Interactions
between
irradiance
and
nutrient
availability
during
astaxanthin
accumulation and degradation in Haematococcus pluvialis. Applied

Microbiology and Biotechnology, v. 61(5-6), p. 545-551.
Foss, P., Storebakken, T., Schiedt, K., Liaaen-Jensen, S., Austreng, E and
Streiff, K. 1984. Carotenoids in diets for salmonids. I. Pigmentation of
rainbow trout with the individual optical isomers of astaxanthin in
comparison with canthaxanthin. Aquaculture, v. 41, p. 213-226.
Fraser, P. D and Bramley, P. M. 2004. The biosynthesis and nutritional uses of
carotenoids. Progress in Lipid Research, v. 43, p. 228-265.
Fraser, P. D., Romer, S., Shipton, C. A., Mills, P. B., Kiano, J. W., Misawa, N.,
Drake, R. G., Schuch, W and Bramley, P. M. 2002. Evaluation of
transgenic tomato plants expressing an additional phytoene synthase in
a fruit-specific manner. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, v. 99(2), p. 1092-1097.
Fray, R. G., Wallace, A., Fraser, P. D., Valero, D., Hedden, P., Bramley, P. M
and Grierson, D. 1995. Constitutive expression of a fruit phytoene
synthase gene in transgenic tomatoes causes dwarfism by redirecting
metabolites from the gibberellin pathway. Plant Journal, v. 8(5), p. 693701.
Freund, P. R and Washan, C. J. 1988. Maggion, M. Natural color for use in
foods. Cereal Foods World, v. 33(7), p.553-559.
Furr, H. C., Barua, A. B and Olson, J. A. 1992. Modern chromatographic
analysis of vitamins. 2nd edition: 1.- Retinoids and carotenoids.
Chromatographic science series, vol. 60, 2nd edition. Marcel Dekker,
Inc.
77
Giovannucci, E. 1999. Tomatoes, tomato-based products, lycopene and cancer:

a review of the epidemiological literature. Journal of the National
Cancer Institute, v. 91, p. 317-331.
Gong, X. 1997. Optimisation and modelling of the growth and astaxanthin
formation of Haematococcus pluvialis. PhD thesis. The University of
Hong Kong, Hong Kong.
Goodwin, T. W. 1981 The Biochemistry of the carotenoids: Biosynthesis.
Chapman and Hall London. v. 1, p. 578602.
Gouveia, L and Rema, P. 2005. Effect of microalgal biomass concentration and
temperature
on
ornamental
goldfish
(Carassius
auratus)
skin
pigmentation. Aquaculture Nutrition, v. 11, p. 19-23.

Gouveia, L., Choubert, G., Gomes, E., Pereira, N., Santinha, J and Empis, J.
2002. Pigmentation of gilthead sea bream, Sparus aurata (L. 1875),
using
Chlorella
vulgaris
(Chlorophyta,
Volvocales)
microalga.
Aquaculture Research, v. 33 (12), p. 987-993.

Gouveia, L., Gomes, E and Empis, J. 1996. Potential use of microalga
(Chlorella vulgaris) in the pigmentation of rainbow trout (Oncorhynchus
mykiss) muscle. Zertschrift fur Lebensmittel Untersuchung undForschung, v. 202, p. 75-79.
Granado, F., Olmedilla, B., Blanco, I and Rojas-Hidalgo, E. 1992. Carotenoid
composition in raw and cooked spanish vegetables. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v. 40 (1), p. 2135-2140.
Grassmann ,J., Hippeli, S and Elstre, E. F. 2002. Plants defence mechanism
and its benefits for animal and medicine: role of phenolics and
terpenoids
in avoiding oxygen
stress.
Plant Physiology and
Biochemistry, v. 40, p. 471-478.

Gross, J. 1991. Pigments in vegetables: chlorophylls and carotenoids. New
York, Published by Van Nostrand Reinhold.
Grossman, A. R., Lohr, M and Im, C. S. 2004. Chlamydomonas reinhardtii in the
landscape of pigments. Annual Review of Genetics, v. 38, p. 119-173.
Grunewald, K and Hagen, C. 2001. b-carotene is the intermediate exported
from the chloroplast during accumulation of secondary carotenoids in
Haematococcus pluvialis. Journal of Applied Phycology, v. 13(1), p.
89-93.
78
Grunewald, K., Eckert, M., Hirschberg, J and
Hagen, C. 2000. Phytoene
desaturase is localized exclusively in the chloroplast and up-regulated

at the mRNA level during accumulation of secondary carotenoids in
Haematococcus
pluvialis
(Volvocales,
Chlorophyceae).
Plant
Physiology, v. 122(4), p. 1261-1268.

Grunewald, K., Hirschberg, J and Hagen, C. 2001. Ketocarotenoid biosynthesis
outside of plastids in the unicellular green alga Haematococcus
pluvialis. Journal of Biological Chemistry, v. 276(8), p. 6023-6029.
Grung, M and Liaan-Jensen, S. 1993. Algal carotenoids; secondary carotenoids
of algae 3; carotenoids in a natural bloom of Euglena sanguinea.
Biochem Syst Ecol., v. 21, p. 757-763.
Grung, M., DSouza, M. L., Borowitzka, M and Liaaen-Jensen, S. 1992. Algal
carotenoids 51. Secondary carotenoids 2. Haematococcus pluvialis
aplanospores as a source of (3S, 3S)-astaxanthin esters. J. Appl.
Phycol., v. 4, p. 165-171.
Guerin, M., Huntley, M. E and Olaizola, M. 2003. Haematococcus astaxanthin:
applications for human health and nutrition. Trends in Biotechnology,
v. 21(5), p. 210-216.
Guschina, I. A and Harwood, J. L. 2006. Lipids and lipid metabolism in
eukaryotic algae. Progress in Lipid Research, v. 45(2), p. 160-186.
Halliwell, B. 1996. Antioxidants in human health and disease. Annu. Rev. Nutr.,
v. 16, p. 33-50.
Harker, M., Tsavalos, A. J and Young, A. J. 1996a. Autotrophic growth and
carotenoid production of Haematococcus pluvialis in a 30 liter air-lift
photobioreactor. Journal of Fermentation and Bioengineering, v.
82(2), p. 113-118.
Harker, M., Tsavalos, A. J and Young, A. J. 1996b. Factors responsible for
astaxanthin formation in the chlorophyte Haematococcus pluvialis.
Bioresource Technology, v. 55(3), p. 207-214.
Harker, M., Tsavalos, A. J and Young, A. J. 1996b. Factors responsible for
astaxanthin formation in the chlorophyte Haematococcus pluvialis.
Biores Technol., v. 55, p. 207-214.
Higuera-Ciapara, I., Felix-Valenzuela, L and Goycoolea, F. M. 2006.
Astaxanthin: A review of its chemistry and applications. Critical
79
Reviews in Food Science and Nutrition, v. 46, p. 186-196.

Hill, G. E. 1991. Plumage coloration is a sexually selected indicator of male
quality. Nature, v. 350, p. 337-339.
Hirschberg, J. 2001. Carotenoid biosynthesis in flowering plants. Current
Opinion in Plant Biology, v. 4(3), p. 210-218.
Hu, Z. C., Zheng, Y. G., Wang, Z and Shen, Y. C. 2006. pH control strategy in
astaxanthin
fermentation
bioprocess
by
Xanthophyllomyces
dendrorhous. Enzyme and Microbial Technology, v. 39, p. 586590.

Huang, J.C., Chen, F and Sandmann, G. 2006a. Stress-related differential
expression of multiple -carotene ketolase genes in the unicellular
green alga Haematococcus pluvialis. Journal of Biotechnology, v.
122(2), p. 176-185.
Huang, J.C., Wang, Y., Sandmann, G and Chen, F. 2006b. Isolation and
characterization of a carotenoid oxygenase gene from Chlorella
zofingiensis (Chlorophyta). Applied Microbiology and Biotechnology,
p. 1-7.
Hudon, J. 1994. Showiness, carotenoids and captivity: a comment on Hill
(1992). Auk., v. III, p. 218-221.
Inborr, J and Lignell, . 1997. Effect of feeding astaxanthin-rich algae meal
(Haematococcus
pluvialis)
on
performance
and
carotenoid
concentration of different tissues of broiler chickens. In: Proceedings of

the XIII WPSA Conference on Poultry Meat Quality in Poznan, Poland,
September 2225, Session M1, 39-43.
James, E. S and Cronan, J. E. 2004. Expression of two Escherichia coli acetylCoA carboxylase subunits is autoregulated. Journal of Biological
Chemistry, v. 279(4), p. 2520-2527.
Johnson, E. A and An, G. H. 1991. Astaxanthin from microbial sources. Crit
Rev Biotechnol. 11: 297-326.
Johnson, E. A and Schroeder, W. A. 1995. Microbial carotenoids. In: Fiechter
(Eds). Advances in Biochemical Engineering. Berlin: Springer, p. 119178.
Johnson, E. A., Villa, T. G and Lewis, M. 1980. Phaffia rhodozyna as an
astaxanthin source in salmonids diets. Aquaculture, v. 20, p. 123-134.
Johnson, E. A., Villa, T. G and Lewis, M. J. 1980. Phaffia rhodozyma as an
80
astaxanthin source in salmonid diets. Aquaculture., v. 20, p. 123.

Johnson, L. 1992. Recovery of pigments an chitin from pink shrimp peeling
wastes. In Advances in seafood biochemistry: Composition and quality,
Flick, G. J. and Martin, R. E., Eds., Technomic Publishing Co. Inc.,
Lancaster and Basel, 123.
Jyounchi, H., Zhang, L., Gross, M and Tomita, Y. 1993. Studies of
immunomodulating actions of carotenoids. II. Astaxanthin enhances in
vivo antibody production to T-dependant antigens without facilitating
polyclonal B-cell activation. Nutr. Cancer, v. 19, p. 269-280.
Kajiwara, S., Kakizono, T., Saito, T., Kondo, K., Ohtani, T., Nishio, N., Nagai, S
and Misawa, N. 1995. Isolation and functional identification of a novel
cDNA for astaxanthin biosynthesis from Haematococcus pluvialis, and
astaxanthin synthesis in Escherichia coli. Plant Molecular Biology, v.
29(2), p. 343-352.
Kennedy, G. Y and Vevers, H. G. 1976. A survey of avian eggshell pigments.
Comp. Biochem. Physiol., v. 55 B, p. 117-123.
Klaui, H. and Bauernfeind, J. C. 1981. Carotenoids as colorants and vitamin A
precursors. Bauernfeind J. C. Ed.; Academic Press: New York.
Knutzon, D. S., Thompson, G. A., Radke, S. E., Johnson, W. B., Knauf, V. C
and Kridl, J. C. 1992. Modification of Brassica seed oil by antisense
expression of a stearoyl-acyl carrier protein desaturase gene.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, v. 89(7), p. 2624-2628.
Kobayashi, M. 2003. Astaxanthin biosynthesis enhanced by reactive oxygen
species in the green alga Haematococcus pluvialis. Biotechnology
and Bioprocess Engineering, v. 8(6), p. 322-330.
Kobayashi, M., Kakizono, T and Nagai, S. 1991. Astaxanthin production by a
green alga, Haematococcus pluvialis accompanied with morphological
changes
in
acetate
media.
Journal
of
Fermentation
and
Bioengineering, v. 71(5), p. 335-339.

Kobayashi, M., Kakizono, T and Nagai, S. 1992b. Effects of light intensity, light
quality and illumination cycle on astaxanthin formation in a green alga,
Haematococcus pluvialis. J Ferment. Bioeng., v. 74, p. 61-63.
Kobayashi, M., Kakizono, T., Yamaguchi, K., Nishio, N and Nagai, S. 1992a.
81
Growth and astaxanthin formation of Haematococcus pluvialis in

heterotrophic and mixotrophic conditions. J Ferment Bioeng., v. 1, p.
17-20.
Kodric-Brown, A. 1985. Female preference and sexual selection for male
coloration in the guppy (Poecilia reticulata). Behavioral Ecology and
Sociobiology, v. 17, p. 199-206.
Kodric-Brown, A. 1989. Dietary carotenoids and male mating sucess in the
guppy: an environmental component to female choice. Am. Nat., v.
124, p. 309-323.
Koteng, D. F. 1992. Markedsunderskelse Norsk Laks. FNL Bergen, Norway.
Basurco, B. & Abelln, E. 1999. Finfish species diversification in the
context of the Mediterranean marine fish farming development. Cahiers
Options Mditerranennes, Ser. B: Etudes et Recherches, v. 24, p. 925.
Krinsky, N., Wang, X. D., Tang, G and Russell, R. M. 1993. Mechanisms of
carotenoids cleavage to retinoids. Ann. N.Y. Acad. Sci., v. 691, p. 167176.
Krishna, K. B and Mohanty, P. 1998. Secondary carotenoid production in green
algae. J. Sci. Industr. Res., v. 57, p. 51-63.
Kritchevsky, S. B. 1999. -carotene, carotenoids and the prevention of
coronary heart disease. Journal of Nutrition, v. 129, p. 5-8.
Khn, R and Sorenson, N. A. 1983. ber astaxanthin and ovoerdin. Ber. Dtsch.
Chem. Ges., v. 71, p. 1879.
Landrum, J. T. and Bone, R. A. 2001. Lutein, Zeaxanthin and the Macular
Pigment. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 385, p. 2840.
Lang, M. R and Wells, J. W. 1987. A review of eggshell pigmentation. Worlds
Poultry Sci. J., v. 43, p. 238-246.
Latscha, T. 1991. Carotenoids in aquatic animal nutrition. In D.M. Akiyama and
R. K. H. Tan, Eds. Proceeding of the Aquaculture Feed Processing, p.
68-79.
Lee, J. E and Peniston, Q. 1982. Utilization of shellfish waste for chitin and
chitosan production. In: Chemistry and Biochemistry of Marine Food
Products: 415. Martin, R., Flick, G and Hebard, C., (Eds.). Avi Wesport.,
82
CT. USA.
Lee, Y. K and Ding, S. Y. 1994. Cell cycle and accumulation of astaxanthin in
Haematococcus lacustris (Chlorophyta). J Phyco., v. 30, p. 445-449.
Lee, Y. K and Soh, C. W. 1991. Accumulation of astaxanthin in Haematococcus
lacustris (Chlorophyta). J Phycol., v. 27, p. 575-577.
Li, Y. T. 2007. The role of carotenogenesis in the response of the green alga
Haematococcus pluvialis to oxidative stress. PhD thesis. The University
of Hong Kong, Hong Kong.
Liang, C. W., Zhao, F. Q., Meng, C. X., Tan, C. P.and Qin, S. 2006. Molecular
cloning, characterization and evolutionary analysis of phytoene
desaturase (PDS) gene from Haematococcus pluvialis. World Journal
of Microbiology & Biotechnology, v. 22(1), p. 59-64.
Lin, M. Q., Ushio, H., Ohshima, T., Yamanaka, H and Koizumi, C. 1998. Skin
color control of the red sea bream (Pagrus major). Lebensm.-Wiss.u.Technol., v. 31, p. 27-32.
Linden, H. 1999. Carotenoid hydroxylase from Haematococcus pluvialis: cDNA
sequence, regulation and functional complementation. Biochimica et
Biophysica Acta, v. 1446(3), p. 203-212.
Linden, H. 1999. Carotenoid hydroxylase from Haematococcus pluvialis: cDNA
sequence,
regulation
and
functional
complementation.
Biochim
Biophys Acta, v. 1446, p. 203-212.

Lindgren, L. O., Stalberg, K. G and Hoglund, A. S. 2003. Seed-specific
overexpression of an endogenous Arabidopsis phytoene synthase gene
results in delayed germination and increased levels of carotenoids,
chlorophyll, and abscisic acid. Plant Physiology, v. 132(2), p. 779-785.
Lotan, T and Hirschberg, J. 1995. Cloning and expression in Escherichia coli of
the gene encoding -C-4-oxygenase, that converts -carotene to the
ketocarotenoid
canthaxanthin
in Haematococcus pluvialis.
Febs
Letters, v. 364(2), p. 125-128.

Lotthammer, K. H. 1978. Original researches. In: Importance of Beta-carotene
for Bovine Fertility. Proc. Roche Symposium London. Hoffmann-La
Roche, Basel Switzerland.
Maldonade, I .R., Scamparini, A. R. P., Rodrguez-Amaya, D. R. 2007.
Selection and characterization of carotenoid-producing yeasts from
83
Campinas region, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, v. 38, p.

6570.
Marasco, E and Schimdt-Dannert, C. 2003.Towards the biotechnological
production
of
aroma
and
flavour
compounds
in
engineered
microorganisms. Applied Biotechnology, Food Science and Policy,

v. 1, n. 3, p. 145157.
Marusich, W. L.; Bauernfeind, J. C and Abraham, J. 1991. Les vitamines:
sensibilit des vitamines aux agressions Oxycarotenoids in poultry
feeds. In: Bauernfeind, J. C. (Ed.). Carotenoids as colorants and vitamin
A precursors: technological and nutritional applications. New York:
Academic Press, p. 319-462.
Matsuno, T and Hirao, S. 1989. Marine carotenoids. In: Marine Biogenic Lipids,
Fats and Oils. Vol. 1, R. G. Ackman (Eds), CRC press, Boca Raton,
Florida, 251-388.
Matsuno, T. 1991. Xanthophylls as precursors of retinoids. Pure & Appl.
Chem., v. 63 (1), p. 81-88.
McCoy, M. 1999. Astaxanthin market a hard one to crack. Chemical
Engineering News, April, v. 5, p. 15-17.
Melndez-Martnez, A. J., Vicario, I. M and Heredia, F. J. 2003. A routine highperformance
liquid
chromatography
method
for
carotenoid
determination in ultrafrozen orange juices. Journal of Agricultural and

Food Chemistry, 51, 4219-4224.
Mendoza, H., Martel, A., del Rio, M. J and Reina, G. G. 1999. Oleic acid is the
main fatty acid related with carotenogenesis in Dunaliella salina.
Journal of Applied Phycology, v. 11(1), p. 15-19.
Mercadante, A. Z., Britton, G., Rodrguez-Amaya, D. B. 1998. Carotenoids from
yellow passion fruit (Passiflora edulis). Journal of Agricultural and
Food Chemistry, v. 46 (10), p. 4102-4106.
Metusalach, Synowiecki, J., Brown, J and Shahidi, F. 1996. Deposition and
metabolism of dietary canthaxanthin in different organs of Arctic charr
(Salvelinus alpinus L.). Aquaculture, v. 142, p. 99-106.
Meyers, S. P. 1977. Using crustacean meals and carotenoid fortified diets.
Feedstuffs, v. 43, p. 26-28.
Middleton, E. M and Teramura, A. H. 1993. The role of flavonol glycosides and
84
carotenoids in protecting soybean from ultraviolet-B damage. Plant

Physiol., v. 103, p. 741752.
Miki, W., Yamaguchi, K., Konosu, S., Takane, T., Satake, M., Fujita, T.,
Kuwabara, H., Shimeno, S and Takeda, M. 1985. Origino of tunaxanthin
in the integument of yellowtail (Seriola quinqueradiata). Biochemistry
and Molecular Biology, v. 80 (2), p. 195-201.
Mnguez-Mosquera, M. I. 1997. Clorofilas y carotenoides en tecnologa de
alimentos. Sevilla: Universidad de Sevilla. Serie: Ciencias, 47.
Misawa, N., Masamoto, K., Hori, T., Ohtani, T., Boger, P and Sandmann G.
1994. Expression of an Erwinia phytoene desaturase gene not only
confers multiple resistance to herbicides interfering with carotenoid
biosynthesis but also alters xanthophyll metabolism in transgenic
plants. The Plant Journal, v. 6, p. 481-489.
Muller, R. K., Bernhard, K., Mayer, H., Ruttimann, A and Vecchi, M. 1980.
Beitrag zur analytic und synthese von 3-hydroxy-4-oxocarotinoiden.
Helv Chim Acta, v. 63, p. 1654.
Nakano, T., Kanmuri, T., Sato, M and Takeuchi, M. 1999. Effect of astaxanthin
rich red yeast (Phaffia rhodozyma) on oxidative stress in rainbow trout.
Biochimica et Biophysica Acta, v. 1426, p. 119-125.
Nakano, T., Tosa, M and Takeuchi, M. 1995. Improvement of biochemical
features in fish health by red yeast and synthetic astaxanthin. J. Agric.
Food Chem., v. 43, p. 1570-1573.
NCCLS. 1997. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility
Tests.6th edition; Approved standards. U.S.A. M-2, vol. 17 No. 1.
Nixon, J. C. 1985. Naturally occuring pterins. In: Folates and pterins, Blaxley
and Benkovic (Eds.), John Wiley & Sons, 2: 1.
ONeil, C. A. and Schwartz, S. J. 1992. Review: chromatographic analysis of
cis/trans carotenoid isomers. Journal of Chromatography, v. 624, p.
235-252.
Ohlrogge, J. B and Jaworski, J. G. 1997. Regulation of fatty acid synthesis.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v.
48, p. 109-136.
Ohlrogge, J. B and Jaworski, J. G. 1997. Regulation of fatty acid synthesis.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, v.
85
48, p. 109-136.
Olaizola, M. 2000. Commercial production of astaxanthin from Haematococcus
pluvialis using 25,000-liter outdoor photobioreactors. J Appl Phycol., v.
12, p. 499- 506.
Olivier, J and Palou, A. 2000. Chromatographic determination of carotenoids in
foods. Journal of Chromatography A., v. 881, p. 543555.
Olmedilla, B., Granado, F., Blanco, I., Rojas-Hidalgo, E. 1992. Determination of
nine carotenoids, retinol, retinyl palmitate and alpha-tocopherol in
control human serum using two internal standards. Food Chemistry, v.
45, p. 205-213.
Pfander, H. 1987. Key to Carotenoids, 2nd ed. Birkhauser, Basel.
Rabbani, S., Beyer, P., Von Lintig, J., Hugueney, P and Kleinig, H. 1998.
Induced -carotene synthesis driven by triacylglycerol deposition in the
unicellular alga Dunaliella bardawil. Plant Physiology, v. 116(4), p.
1239-1248.
Restrm, B., Borch, G and Liaaen-Jensen, S. 1981b. Fatty acid composition of
some esterified carotenols. Comp. Biochem. Physiol., 69 B: 625-627.
Grung, M., DSouza, M.L., Borowitzka, M. & Liaaen-Jensen, S., 1992.
Algal carotenoids 51. Secondary carotenoids 2. Haematococcus
pluvialis aplanospores as a source of (3S, 3S)-astaxanthin esters. J.
Appl. Phycol., v. 4, p. 165-171.
Restrm, B., Borch, G., Skulberg, O. M and Liaaen-Jensen, S. 1981a. Optical
purity
of
(3S,
3S)-astaxanthin
from
Haematococcus
pluvialis.
Phytochemistry, v. 20 (11), p. 2561-2564.

Robaina, L., Moyano, F.J., Izquierdo, M. S., Socorro, J., Vergara, J.M and
Montero, D. 1997. Corn gluten, meat and bone meals as protein
sources in diets for gilthead sea bream (Sparus aurata): nutritional and
histological implications. Aquaculture, v. 157, p. 347-359.
Rohmer, M. 2003. Mevalonate-independent methylerythritol phosphate pathway
for isoprenoid biosynthesis. elucidation and distribution. Pure and
Applied Chemistry, v. 75(2-3), p. 375-387.
Snchez-Contreras, A., Jimnez, M., Snchez, S. 2000. Bioconversion of lutein
to products with aroma. Appl Microbiol Biotechnol., v. 54(4), p. 528
534.
86
Sandmann, G. 2002. Molecular evolution of carotenoid biosynthesis from

bacteria to plants. Physiologia Plantarum, v. 116(4), p. 431-440.
Santos, M. F and Mesquita, J. F. 1984. Ultrastructural study of Haematococcus
lacustris 1. Some aspects of carotenogenesis. Cytologia, v. 49(1), p.
215-228.
Satio, A and Regier, L. W. 1971. Pigmentation on brook trout (Salvelinus
fontalis) by feeding dry crustacean waste. J. Fish. Res. Board Can., v.
26, p. 357-360.
Schiedt, K. 1998. Absorption and metabolism of carotenoids in birds, fish and
crustacean. In: Britton, G., Liaaen-Jensen, S., Pfander, H., (Eds).
Carotenoids, v. 3. Birkusen, Basel, p. 285.
Schmidt, K., Connor, A and Britton, G. 1994. Analysis of pigments: carotenoids
and related polyenes. In: Goodfellow, M., ODonell, A. G., (Eds).
Chemical methods in procaryotic systematics, p. 403.
Schoefs, B., Rmiki, N. E., Rachadi, J and Lemoine, Y. 2001. Astaxanthin
accumulation
in
Haematococcus
requires
cytochrome
P450
hydroxylase and an active synthesis of fatty acids. Febs Letters, v.

500(3), p. 125-128.
Schoefs, B., Rmiki, N. E., Rachadi, J and Lemoine, Y. 2001. Astaxanthin
accumulation
in
Haematococcus
requires
cytochrome
P450
hydroxylase and an active synthesis of fatty acids. Febs Letters, v.

500(3), p. 125-128.
Schroeder, W. A and Johnson, E. A. 1995. Carotenoids protect Phaffia
rhodozyma against singlet oxygen damage. J Ind Microbiol., v. 14, p.
502-507
Schroeder, W. A and Johnson, E. A. 1995. Singlet oxygen and peroxyl radicals
regulate astaxanthin biosynthesis in the yeast Phaffia rhodozyma. J.
Biol. Chem. V. 270, p. 1837418379.
Shahidi, F and Synowiecki, J. 1991. Isolation and characterization of nutrients
and value-added produces from snow crab (Chinoecetes opilio) and
shrimp (Pandalus borealis) processing discards. J. Agric. Food Chem.,
v. 39: p. 1527-1532.
Shahidi, F. 1995. Role of chemistry and biotechnology in value-added utilization
of shellfish processing discards. Can. Chem. News, Sept., p. 25-29.
87
Shahidi, F., Metusalach, A and Brown, J. A. 1998. Carotenoid pigments in

seafood and aquaculture. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., v. 38, p. 1-67.
Shahidi, F., Synowiecki, J and Penney, R.W. 1994. Chemical nature of
xanthophylls in flesh and skin of cultured arctic char (Salvelinus alpinus
L.). Food Chemistry, v. 51, p. 1-4.
Shi, X. 1998. High yield production of lutein by Chlorella protothecoides under
heterotrophic conditions of growth. PhD thesis. The University of Hong
Kong, Hong Kong.
Shpigel, M., McBride, S. C., Marciano, S and Lipatch, I. 2004. The effect of
photoperiod and temperature on the reproduction of European sea
urchin, Paracentrotus lividus. Aquaculture, v. 232, p. 1-4.
Sies, H. 1986. Biochemistry of oxidative stress. Angew. Chem. Int. Eds. Engl.,
25: 1058-1071.
Silva, M. C. 2004. Alteraes na biossntese de carotenides em leveduras
induzidas por agentes qumicos. Campinas, Tese de Doutorado em
Cincia de Alimentos Faculdade de Engenharia de Alimentos,
Universidade Estadual de Campinas (Unicamp).
Simpson, B. K and Haard, N. F. 1985. The use of proteolyc enzymes to extract
carotenoproteins from shrimp processing wastes. J. Appl. Biochem., v.
7, p. 212-222.
Slabas, A. R., Simon, J. W and Brown, A. P. 2001. Biosynthesis and regulation
of fatty acids and triglycerides in oil seed rape. Current status and
future trends. European Journal of Lipid Science and Technology,
v. 103(7), p. 455-466.
Slattery, M. L., Benson, J., Curtin, K., Ma, K. N., Schaeffer, D., Potter, J. D.
2000. Carotenoids and colon cancer. American Journal of Clinical
Nutrition, v. 71, p. 575-582.
Snyder, B. A., Nicholson, R. L. 1990. Synthesis of phytoalexins in Sorghum as a
site-specific response to fungal ingress. Science, v. 248, p. 16371639.
Spinelli, J., Lehman, L and Wieg, D. 1974. Composition, processing and
utilization of red crab (Pleurocondes planipes) as an aquacultural feed
ingredients. J. Fish Res. Bd. Can., v. 31, p. 1025-1029.
Stahl, W. and Sies, H. 2003. Antioxidant activity of carotenoids. Institut fr
Biochemie
und
Molekularbiologie
I,
Heinrich-Heine
Universitt
88
Dsseldorf, P.O. Box 101007, D-40001 Dusserldorf, Germany.

Molecular Aspect of Medicine, v. 24, p. 345-351.
Stahl, W., Schwarz, W and Sies, H. 1993. Human serum concentrations of alltrans-beta- carotene and alpha-carotene but not 9-cis-beta-carotene
increase upon ingestion of a natural isomer mixture obtained from
Dunaliella salina (Betatene). J. Nutr., v. 123, p. 847-851.
Steinbrenner, J and Linden, H. 2001. Regulation of two carotenoid biosynthesis
genes coding for phytoene synthase and carotenoid hydroxylase during
stress-induced astaxanthin formation in the green alga Haematococcus
pluvialis. Plant Physiology, v. 125(2), p. 810-817.
Steinbrenner, J and Linden, H. 2003. Light induction of carotenoid biosynthesis
genes in the green alga Haematococcus pluvialis: regulation by
photosynthetic redox control. Plant Molecular Biology, v. 52(2), p.
343-356.
Steinbrenner, J and Sandmann, G. 2006. Transformation of the green alga
Haematococcus pluvialis with a phytoene desaturase for accelerated
astaxanthin biosynthesis. Applied and Environmental Microbiology,
v. 72(12), p. 7477-7484.
Straub, O. 1987. Key to carotenoids. 2nd Edition. Edited by: Pfander H.,
Gerspacher M., Rychener M. & Schwabe R., Birkhuser Verlag, Basel,
Boston.
Sylvia, G., Morrisey, M. T., Graham, T and Garca, S. 1995. Organoleptic
qualities of farmed and wild salmon. J. Aquat. Food Prod. Technol., v.
4, p 51-64.
Sylvia, G., Morrisey, M. T., Graham, T and Garca, S. 1996. Changing trends in
seafood markets: the case of farmed and wild salmon. J. Food Prod.
Market, v. 3, p. 49-63.
Tian, L., Musetti, V., Kim, J., Magallanes-Lundback, M and DellaPenna, D.
2004. The Arabidopsis LUT1 locus encodes a member of the
cytochrome P450 family that is required for carotenoid epsilon-ring
hydroxylation activity. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, v. 101(1), p 402-407.
Torrissen, O. J and Naevdal, G. 1984. Pigmentation of salmonids-genetical
variation in carotenoid deposition in rainbow trout. Aquaculture, v. 38,
89
p. 59-66.
Torrissen, O. J. 1986. Pigmentation of salmonids a comparison of astaxanthin
and canthaxanthin as pigment sources for rainbow trout. Aquaculture,
v. 53, p. 271-278.
Torrissen, O. J., Hardy, R. W and Shearer, K. D. 1989. Pigmentation of
salmonids carotenoids deposition and metabolism, CRC Crit. Rev.
Aquat. Sci., v. 1, p. 209-225.
Toyomizu, M., Sato, K., Taroda, H., Kato, T and Akiba, Y. 2001. Effects of
dietary Spirulina on meat colour in muscle of broiler chickens. British
Poultry Science, v. 42, p. 197-202.
Tripathi, U., Sarada, R and Ravishankar, G. A. 2002. Effect of culture conditions
on growth of green alga Haematococcus pluvialis and astaxanthin
production. Acta Physiologiae Plantarum, v. 24(3), p. 323-329.
Van Breemen, R. B., Schmitz, H. H., Schwartz, S. J. 1993. Continuous-flow fast
atom bombardment liquid chromatography/mass spectrometry of
carotenoids. Analytical Chemistry, v. 65 (8), p. 965-969.
Van Poppel, G. and Goldbohm, R. A. 1995. Epidemiological evidence for carotene and cancer prevention. American Journal of Clinical
Nutrition, v. 62, p. 1493-1503.
Wang, S. B. 2003. A proteomic study of the green microalga Haematococcus
pluvialis. PhD thesis. The University of Hong Kong, Hong Kong.
Wang, S. B., Chen, F., Sommerfeld, M and Hu, Q. 2004a. Proteomic analysis of
molecular
response
to
oxidative
stress
by
the
green
alga
Haematococcus pluvialis (Chlorophyceae). Planta, v. 220(1), p. 17-29.

Wang, S. B., Hu, Q., Sommerfeld, M and Chen, F. 2004b. Cell wall proteomics
of
the
green
alga
Haematococcus
pluvialis
(Chlorophyceae).
Proteomics, v. 4(3), p. 692-708.

Wilkie, D. 1972. The carotenoid pigmentation of Pleuroncodes planipes
Stimpson (Crustacea, Decapoda, Galatheidae). Comm. Biochem.
Physiol., v. 423, p. 731-734.
Wissgot, U and Bortlik, K. 1996. Prospects for new natural food colorants.
Trends in Food Science & Technology. v 7, p. 298-302.
Yamane, Y., Higashida, K and Nishio, N. 1997. Influence of oxygen and glucose
on primary metabolism and astaxanthin production by Phaffia
90
rhodozyma in batch and fed-bath cultures. Kinetic and stoichiometric

analysis. Appl Environ Microbiol., v. 63, p. 4471-4478.
Yanar, M., Kumlu, M., Celik, M., Yanar, Y and Tekelioglu, N. 1997.
Pigmentation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) with carotenoid
from red pepper. Israeli J. Aquacult. Badmidgeh, v. 49, p. 193-198.
Young, A. J. and Britton, G. 1993. Carotenoids in photosynthesis. London, UK:
Chapman & Hall.
Zhekisheva, M., Boussiba, S., Khozin-Goldberg, I., Zarka, A and Cohen, Z.
2002.
Accumulation
of
oleic
acid
in
Haematococcus
pluvialis
(Chlorophyceae) under nitrogen starvation or high light is correlated

with that of astaxanthin esters. Journal of Phycology, v. 38(2), p. 325331.
Zhekisheva, M., Zarka, A., Khozin-Goldberg, I., Cohen, Z and Boussiba, S.
2005. Inhibition of astaxanthin synthesis under high irradiance does not
abolish triacylglycerol accumulation in the green alga Haematococcus
pluvialis (Chlorophyceae). Journal of Phycology, v. 41(4), p. 819-826.
91

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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

CENTRO DE INVESTIGACIN EN CIENCIA APLICADA

Director de tesis: Dr. Eduardo San Martn Martnez

Alicia Soledad Martnez Silva

Alicia Soledad Martnez Silva

El presente trabajo se desarroll en el Laboratorio de Biotecnologa de

Alicia Soledad Martnez Silva

(CONACYT), el apoyo econmico otorgado durante el desarrollo de

Alicia Soledad Martnez Silva

CAPTULO 4 MATERIALES Y MTODOS

4.10 Separacin e identificacin de los pigmentos

CAPTULO 5 RESULTADOS Y DISCUSIN

Alicia Soledad Martnez Silva

Estructura qumica de algunos Carotenoides: Xantofilas.

Ruta resumida de la biosntesis de los Carotenoides.

Ismeros configuracionales de la astaxantina (3S,3S),

Algunos ejemplos de microalgas de agua dulce y

Diferentes sistemas de cultivo de microalgas. (a) Cielo

Ciclo de vida de Haematococcus pluvialis. a. Clula

Haematococcus pluvialis. (a) Depsito de agua

Conservacin de H. pluvialis. (a) en agar y (b) en medio

Determinacin de la actividad antimicrobiana por el

Diagrama de flujo de la curva de crecimiento

Micrografa H. pluvialis (40X) en forma de quiste

Densidad celular de H. pluvalis en los medios de cultivo

Variacin del pH de los medios de cultivo f/2 y QF

Alicia Soledad Martnez Silva

Conductividad elctrica de los medios de cultivo f/2 y

Divisiones por da de H. pluvialis en los medios f/2 y QF

Tasa de crecimiento especfico (m) de los medios de

Tiempo de generacin de H. pluvialis en 30 das de

Produccin diaria de la microalga H. pluvialis en los

Alicia Soledad Martnez Silva

Fuentes naturales de Carotenoides.

Principales organismos productores de Astaxantina.

Clasificacin Taxonmica de Haematococcus pluvialis.

Compuestos comnmente presentes en H. pluvialis.

Perfil de aminocidos en H. pluvialis.

cidos grasos encontrados en la microalga H.

Condiciones iniciales de los medios de cultivo de H.

Composicin qumica de diferentes medios de cultivo

Halos de inibicin de los controles positivos.

Alicia Soledad Martnez Silva

La obtencin de carotenoides de microalgas es un tema de gran importancia

Haematococcusp pluvialis representa una fuente natural de carotenoides como

Alicia Soledad Martnez Silva

Obtaining carotenoids from microalgae is a subject of great scientific

spectrophotometer. Experiments were carried repeated replicated five times. H.

Alicia Soledad Martnez Silva

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA

Alicia Soledad Martnez Silva

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA

betacaroteno y Haematococcus pluvialis Flotow (Chlorophyceae) para la

antifngica que se pueden esperar que se encuentren tambin en esta

Alicia Soledad Martnez Silva

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA

Los pigmentos son generalmente colores que se pueden observar

1.1.3. Pigmentos Naturales

Alicia Soledad Martnez Silva

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA

beneficiosos para el consumo.

Los carotenoides son pigmentos naturales responsables de los colores

CICATA-IPN. UNIDAD LEGARIA