RECOPILADO POR:

EL PROGRAMA UNIVERSITARIO DE ALIMENTOS

NMX-F-358-S-1981 ALIMENTOS PARA HUMANOS. ALIMENTOS ENVASADOS.

ANLISIS MICROBIOLGICO. FOODS FOR HUMANS. CANNED FOODS.
MICROBIOLOGICAL ANALYSIS. NORMAS MEXICANAS. DIRECCIN GENERAL
DE NORMAS.
PREFACIO
En la elaboracin de esta Norma, participaron los siguientes Organismos:
Bioxon de Mxico, S.A.
Instituto Politcnico Nacional.
Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas.
Departamento de Microbiologa.
Centro de Control Total de Calidades, S.A.
Asociacin Nacional de Empacadores de Productos Alimenticios, A.C.
Departamento de Pesca.
Nueva Modelo, S.A.
Elas Pando, S.A. de C.V.
Productos del Monte, S.A. de C.V.
Clemente Jacques y Cia, S.A. de C.V.
Productos Pesqueros Mexicanos, S.A. de C.V.
Secretaria de Salubridad y Asistencia.
Direccin General de Control de Alimentos, Bebidas y Medicamentos.
Subsecretaria de Salubridad.
Direccin General de Laboratorios Salud Publica.
1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACIN
Esta Norma Mexicana establece el mtodo para el anlisis de los microorganismos
mesoflicos y termoflicos, aerobios y anaerobios en alimentos envasados.
Esta Norma se complementa con las siguientes Normas Mexicanas vigentes:
2. REFERENCIAS
NMX-F-253. Cuenta de bacterias mesoflicas aerobias.
NMX-F-285. Muestreo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis
microbiolgico.
NMX-Z-001. Sistema general de medidas - Sistema (SI) de unidades.
3. DEFINICIONES
Para los efectos de esta Norma se establece la siguiente definicin:

3.1 Enlatado: Es una forma de conservacin de los alimentos que consiste en envasarlos en
recipientes, con cerraduras hermticas y sometidos a tratamientos especiales que
aseguran su calidad sanitaria por un tiempo ms o menos largo segn el procesado y tipo
de producto (vase A. 1).
4. FUNDAMENTO
El anlisis microbiolgico de productos alimenticios enlatados tiene por objeto determinar la
presencia de organismos que pudieran haber resistido al tratamiento trmico y que por
determinadas circunstancias pudieran desarrollarse produciendo alteraciones en el alimento o
peligro para el consumidor.
El mtodo se basa en la deteccin de los microorganismos capaces de desarrollarse en los
alimentos enlatados, de acuerdo al pH que presenten.
Siendo la tcnica especfica a aplicar, diferente para los alimentos de baja acidez (pH
superior a 4.6) que la de los alimentos cidos (pH inferior a 4.6).
5. REACTIVOS MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO
5.1 Reactivos
Los reactivos que a continuacin se mencionan, deben ser grado analtico a menos que se
indique otra cosa, cuando se especifique agua debe ser agua destilada.
5.1.1
5.1.2
5.1.3
5.1.4

Yodo al 2% en alcohol de 70%

Alcohol etlico de 95%
Xilol
Colorante azul de metileno.- Azul de metileno 0.3 g; alcohol etlico al 95% 50 cm3;
disolver y aadir agua destilada a completar 100 cm3.
5.1.5 Verde de malaquita.- (Para tincin de esporas mtodo de Wertz - Conklin). Solucin
acuosa de verde de malaquita al 5%.
5.1.6 Reactivos y colorantes para tincin de Gram (Modificacin de Hucker).
5.1.6.1 Solucin concentrada de Cristal Violeta: Cristal violeta (85% de colorante) 20 g,
Etanol (95%) 100 cm3
5.1.6.2 Solucin concentrada de oxalato de amonio: Oxalato de amonio 1 g, Agua destilada
100 cm3. Solucin de trabajo: Preparar una solucin de cristal violeta diluyendo la
solucin concentrada 1:10 en agua destilada. Mezclar con 4 volmenes de solucin
concentrada de oxalato de sodio.
5.1.6.3 Lugol (Para coloracin de Gram): Cristales de yodo 1 g, Yoduro de potasio 2 g
Disolver en 5 cm3 de agua destilada y agregar agua destilada - 240 cm3.

Solucin acuosa de Bicarbonato de Sodio - 60 cm3 Mezclar bien y guardar en un frasco

mbar.

5.1.6.4 Solucin decolorante:

Etanol (95 %) 250 cm3
Acetona 250 cm3
Mezclar bien y guardar en un frasco con tapa de cristal esmerilado.
5.1.6.5 Solucin concentrada de Safranina
Safranina 0 - 2.5 g 3
Etanol (95 %) 100 cm
Solucin de trabajo:
Diluir la solucin concentrada 1:5 o 1:10 con agua destilada.
5.1.6.6 Solucin de contraste
Solucin acuosa de Safranina al 0.5%.
5.2 Materiales
Todo el material para utilizarse debe ser esterilizado.

Abrelatas del tipo microbiolgico (edfor)

Pinzas, esptulas, cucharas y tijeras
Pipetas serolgicas con tapn de algodn
Pipetas o tubos de 8 mm de dimetro con tapn de algodn.
Tubos de cultivo de 18 mm o de 20 mm x 150 mm, o cualquier tamao adaptable a la
tcnica.
Cajas de Petri
Porta objetos
Punzn para latas
Asa de platino o nicromel en porta-asa
Cepillo para lavar las latas
Toallas, gasa y algodn
Mecheros de gas
Marcador de tinta indeleble
Frascos de vidrio y matraces Erlenmeyer
Vacumetro tipo Bourdon
Medidor de espacio libre
Embudo de tallo corto y 8 cm de dimetro aproximado

5.3 Medios de cultivo

5.3.1 Caldo Dextrosa Bromocresol Prpura (triptona glucosa)

Es un medio para el cultivo y cuenta de microorganismos aerobios y facultativos anaerobios,

cuando se emplea con agar est indicando para cuenta normal de esporas de Flat Sour y
esporas de termoflicos. Es de gran aplicacin en materia prima como almidones y azcar.
Dextrosa 10 g
Extracto de carne 3 g
Peptona 5 g
Bromocresol Prpura (al 0.6% en alcohol) 2 cm3
Agua destilada 1000 cm3
Disolver los ingredientes con ayuda de calor, envasar en tubos en cantidades de 12 a 15 cm3.
Esterilizar en autoclave a 394 K (121 C) durante 15 minutos. El pH final de este medio se
debe ajustar a 7.0 0.1
5.3.2 Caldo de hgado picado
Es un medio para propsitos generales con valor particular en la siembra y cuenta de
microorganismos anaerobios as como de esporas de anaerobios termoflicos.
Hgado de res fresco 500 g
Agua destilada 800 cm3
Peptona 10 g
Fosfato dipotsico (K2HPO4) 1 g
Almidn soluble (opcional) 1 g
Limaduras de Fe (opcional) 1 g
Poner el hgado picado en agua, calentar a ebullicin, y dejarlo hervir lentamente durante
una hora, recuperar volumen. (Ajustar pH a 8.5 con NaOH). Enfriar para eliminar el exceso
de grasa, ajustar el pH a 7.0 y hervir otros 10 minutos. Filtrar a travs de una tela
presionando para quitar el exceso de lquido.
Agregar al caldo la peptona, el fosfato y el almidn soluble ajustar el pH a 7.0 y llevar el
volumen del caldo a 1000 cm3 con agua destilada .
Filtrar a travs de papel filtro grueso. Envasar en tubos de 18 mm o 20 mm x 150 mm.
Agregarles pedazos pequeos de hgado, limaduras de Fe y de 10 a 12 cm3 de caldo.
Esterilizar en autoclave a 394 K (121C) durante 20 minutos.
5.3.3 Extracto de malta
Extracto de malta 15 g
Agua destilada 1000 cm3
Ajustar el pH final a 4.7 + 0.2, envasar en tubos y esterilizar a 394 K (121C) durante 15
minutos. Este medio no deber ser sobre-calentado.

5.3.4 Caldo cido

Proteasa peptona 5 g
Extracto de levadura 5 g
Dextrosa 5 g
Fosfato dipotsico (K2HPO4)4 g
Agua destilada 1000 cm3
Disolver. Vaciar en tubos, porciones de 12 a 15 cm3, esterilizar a 394 K (121C) durante 15
minutos y ajustar el pH a 5.
6. APARATOS

Autoclave con termmetro o manmetro probado con termmetro de mximas.

Incubadoras con termmetro de mercurio y termostato que evite variaciones mayores de
1 K (1C).
Medidor de pH
Microscopio compuesto

7. CLASIFICACIN DE LA MUESTRA
7.1 Examen de las latas
Apuntar en la libreta de registro el nmero de lote y tamao de la lata, as como todos los
datos que aparezcan en la etiqueta y que sirvan para identificar el producto. Quitar las
etiquetas, identificando previamente cada lata. Anotar los defectos fsicos de las latas como:
defectos en los cierres y costura lateral, abolladuras, golpes, derrames, abombamientos, etc.
Clasificndolas como sigue:
7.1.1 Latas planas o normales.
Las que presentan ambos extremos cncavos, y que permanecen en esta condicin an
cuando el envase se somete a compresin manual en uno de sus extremos.
7.1.2 Latas con abombamiento ligero, grado I.
Unicamente uno de los extremos de la lata se encuentra ligeramente abombado, pero puede
comprimirse fcilmente.
7.1.3 Latas con abombamiento elstico, grado II.
Uno de los extremos se encuentra abombado, al presionarlo el extremo opuesto se abulta.
7.1.4 Latas con hinchazn, grado III.

Ambos extremos se encuentran abombados, pero pueden comprimirse o ceden ligeramente a

la presin.
7.1.5 Latas con hinchazn, grado IV.
Ambos extremos se encuentran abombados, pero tan fuertemente que no puede comprimirse
el envase.
Una vez clasificadas las latas con base al tipo de defecto que presenten, separarlas en dos
grupos: un grupo de reserva que contendr un envase representativo de cada defecto
encontrado y un grupo para el anlisis que contendr as mismo tambin un envase
representativo de cada defecto. Por ejemplo: si se encuentran 2 latas con defecto del grado
I, analice una y guarde la otra en el grupo de reserva (mantenindola en refrigeracin). Las
latas que presentan defectos II, III y IV analcelas de inmediato no las incube.
7.2 Incubacin de las latas
Colocar todas las latas (cidas y no cidas) normales y las que presenten defectos del grado
I, en una incubadora a 310 K (37C) y examinarlas diariamente durante 21 das para separar
las que se hayan inflado, examinar su contenido al microscopio tiendo con cristal violeta
diluido. Si es necesario se efectuarn las siembras microbiolgicas. Despus de los 21 das
sacar los envases restantes y analizar una porcin representativa de stos (vase 7.2.1).
Los productos con pH superior a 4.6 se incubarn a 328K (55C) durante 10 das,
revisndose diariamente y separndose las latas anormales. Hay que tener en cuenta que en
este caso no todas las latas anormales se inflan (vase 7.2.1).
7.2.1 Al finalizar el tiempo de incubacin sacar las latas de la incubadora y dejar enfriar.
Una vez fras determinar el vaco, si se observa prdida de vaco puede ser debido a
varias especies de Bacillus esporulados que producen un tipo de descomposicin que
generalmente no altera las latas y se conocen como bacilos productores de agriado
plano (Flat Sour) as como los productores de cido sulfhdrico que pueden
reconocerse por la coloracin negra del producto y el olor que despide.
Tomar el pH- del producto comparndolo con el pH que tenan las latas antes de incubar,
hay variaciones abajo de 0.15 o 0.20, sto puede ser un indicio de descomposicin.
7.3 Preparacin de las latas
Lavar los envases con un cepillo, usando agua y jabn, enjuagarlos y secarlos. Si las latas
estn hinchadas (Tipo IV) guardarlas en el refrigerador para que se enfren antes de abrirlas.
Flamear el extremo de la lata que no est marcado con el lote y mediante el abrelatas
(previamente esterilizado a la flama casi hasta el rojo) hacer una abertura lo suficientemente

grande para permitir la extraccin de la muestra. (Esto debe hacerse entre 2 mecheros o bajo
flujo laminar).
Si la lata esta fuertemente inflada, no flamear, esterilizar con yodo al 2% en alcohol de 70%,
limpiando con una gasa estril. Una vez hecho sto, colocar sobre la tapa un embudo de
tallo corto estril y perforar con un pica hielo o un clavo largo estriles hasta desalojar el gas
antes de abrir la lata.
Si es necesario, hacer una prueba para hidrgeno haciendo una pequea puncin sobre la
superficie esterilizada, recibir el gas dentro de un tubo de ensayo invertido e inmediatamente
poner la boca del tubo sobre la flama. Una pequea explosin indica la presencia de
hidrgeno. No se debe flamear directamente el orificio de la lata.
8. PROCEDIMIENTO
Abrir las latas entre 2 mecheros Bunsen o bajo flujo laminar y tomar porciones del contenido
slido y lquido (si es posible homogeneice) utilizando los utensilios adecuados a la
naturaleza del producto, esptulas, pinzas, tubos de vidrio, pipetas, etc.
Tomar de 1 a 2 gramos o cm3 del producto y adicionar directamente a cada uno de los tubos
del medio que se va a utilizar, dependiendo del pH del alimento. Dejar una muestra en un
frasco estril, para cualquier aclaracin o para efectuar pruebas biolgicas. Hacer un frotis
del contenido para dar una idea de los organismos involucrados en la descomposicin.
Preparar los frotis en portaobjetos mediante una asa de platino, fijarlos con calor y teirlos
con azul de metileno, o cristal violeta diluido. Si el alimento es slido o muy espeso, agregar
una pequea cantidad de agua; si es muy grasoso, poner un poco de xilol, una vez fijado el
frotis agregar el azul de metileno o cristal violeta diluido.
Una vez tomada la muestra, anotar el estado del alimento, como: Olor, cambios en calor,
consistencia, etc. No debe probarse.
Medir el pH, vaciar el contenido de la lata y observar el interior, anotando, el estado del
barniz, la presencia de manchas. etc.
8.1 .Alimentos de baja acidez, pH mayor de 4.6: Calentar 4 tubos con caldo de hgado
durante 20 minutos a 373 K (100C) para expulsar el oxgeno disuelto y enfriar a 325 K
(52C); pasteurizar 2 tubos durante 13 minutos a 360 K (87C). Inocular los 4 tubos con
2g a 4g de muestra. Estratificar con vaspar (vaselina, parafina al 50% o con agar al 2% a
318 K (45C).
Inocular con 2 a 4 g de muestra 4 tubos con caldo bromocresol prpura e incubar segn se
indica en la tabla 1.
Tabla 1. Sistema de incubacin para los alimentos de baja acidez
Medio de Cultivo

Numero de Tubos

Temperatura

Tiempos de

Investigacin

Caldo de Hgado

1 pasteurizado*
1 sin pasteurizar
Caldo de Hgado
1 pasteurizado*
1 sin pasteurizar
Caldo Bromocresol
2
Prpura
Caldo Bromocresol
2
Prpura
* Para la investigacin de esporas.

K (C)

Incubacin en
Horas

308 2 (35 2)

96 120

328 (55)

24 72

308 2 (35 2)

96 120

328 (55)

24 - 48

Mesoflicos
Anaerobios
Termoflicos
Anaerobios
Mesoflicos
Aerobios
Termoflicos
Aerobios

8.2 Alimentos cidos. pH menor de 4.6

De cada envase de los que constituyen la muestra, inocular 4 tubos de caldo cido
previamente calentado a 373 K (100C) para expulsar el oxgeno disuelto y enfriado a
temperatura ambiente. Estratificar como en el caso anterior. Asimismo, inocular tambin 2
tubos de caldo extracto de malta e incube segn se indica en la Tabla 2
Tabla 2. Sistema de incubacin para los alimentos cidos
Medio de Cultivo
Nmero de
Temperatura
Tiempo de
Investigacin
Tubos
K (C)
Incubacin
en Horas
Caldo cido
2
303 (30)
96
Mesoflicos
(aerobiosis)
aerobios
Caldo cido
2
328 (55)
48
Termoflicos
(aerobiosis)
aerobios
Caldo cido
2
303 (30)
96
Mesoflicos
(anaerobiosis)
anaerobios
Caldo cido
2
328 (55)
48
Termoflicos
(anaerobiosis)
anaerobios
Caldo extracto de
2
303 (30)
96
Mesoflicos
malta (aerobiosis)
aerobios
Caldo extracto de
2
303 (30)
96
Mesoflicos
malta (anaerobiosis)
aerobios
9. INTERPRETACIN DE RESULTADOS
9.1 Alimentos de baja acidez
9.1.1 Aerobios
Observar los tubos sembrados en caldo dextrosa bromocresol prpura despus del tiempo
indicado en la Tabla 1. Un resultado positivo est dado por el vire del indicador del medio
de violeta a amarillo y enturbiamiento del medio.

Hay que tener cuidado en la interpretacin de esta lectura, ya que la naturaleza del alimento,
puede influir en el color o enturbiamiento del medio. Comprobar el crecimiento,
transfiriendo con una asa, una pequea porcin del cultivo a otro tubo con dextrosa
bromocresol prpura e incubarlos por 48 horas. Observar vire y enturbiamiento del medio y
efectuar frotis de los tubos positivos, as como otras tcnicas de comprobacin, anotar los
resultados de la siguiente manera:
Mesoflicos aerobios a 308 K (35C): Positivos o Negativos
Termoflicos aerobios a 328 K (55C): Positivos o Negativos
9.1.2 Anaerobios
Observar los tubos de caldo de hgado despus del tiempo indicado en la tabla 1. Los tubos
que presentan gas, lo que se observa por el desplazamiento de la capa de agar o vaspar as
como enturbiamiento se consideran positivos. Haga un frotis de los tubos positivos y
consrvelos para pruebas en animales.
Anote los resultados como:
Mesoflicos anaerobios a 308 K (35C): Positivos o Negativos
Termoflicos anaerobios a 328 K (55C): Positivos o Negativos
9.2 Alimentos cidos
9.2.1 Aerobios
Observar los tubos de caldo cido y extracto de malta despus del tiempo indicado en la
tabla 2. Los tubos positivos sern aquellos que presenten una turbiedad del medio, as como
en algunos casos la presencia de un precipitado blanco. Como en los casos anteriores es
necesario volver a resembrar tomando una azada de los tubos que se sospechan con
crecimiento, as como hacer frotis y otras tcnicas analticas que nos permitan comprobar la
presencia de los microorganismos que estamos investigando. Anote los resultados como se
indic para los alimentos de baja acidez.
9.2.2 Anaerobios
Observar los tubos de caldo cido y extracto de malta despus del tiempo indicado en la
tabla 2. Igual que en el caso de los alimentos de baja acidez, resultado positivo en los tubos
estar dado por la presencia de gas y el desplazamiento de la capa de agar o vaspar. Igual
que en los casos anteriores efecte pruebas de comprobacin y anote los resultados en
forma similar.
9.3

Conclusin

Cuando el examen de una lata arroje la presencia de organismos no resistentes al calor se

tiene una indicacin de que el producto se contamin posteriormente al proceso trmico, en
cambio si el examen microbiolgico indica la presencia de organismos resistentes al calor,
esto indica que muy probablemente la causa de la descomposicin fue un insuficiente
proceso trmico.
APNDICE A
A. 1 Cuando se mencione enlatado comprende tambin envases de vidrio y otros tipos.
10

BIBLIOGRAFA

a) Alimentos enlatados. Principios para el control del procesamiento trmico y evaluacin

de cierres de envases. National Canners Association y Western Research Laboratory,
Barkeley, Calif. Primera Edicin en Espaol 1975.
b) Bacteriological Analytical Manual for Foods and Drug Administration. Washington.
D.C. 1972.
c) Herson, A.C. and Hulland, E.D. Canned Foods J.A. Churchill LTD, London 5a. Edition
1963.
d) Recommended Methods for the Microbiological examination of Foods. American Public
Health Association, Inc. New York. 1966.
e) S.S.A. Tcnicas de Microbiologa de la Direccin General de Laboratorios de Salud
Pblica. En prensa.