BIOPROCESOS:

Bioprocesos industriales se basan comnmente en el empirismo en lugar de la comprensin

cientfica proceso de fi co. En esta revisin, se resumen las estrategias actuales para el diseo
de bioprocesos sciencebased y el control de los hongos fi filamentosas el objetivo de reducir
los tiempos de desarrollo y el aumento de la economa del proceso. Se discute la evolucin y
las tendencias recientes en relacin con tres aspectos cruciales a lo largo del ciclo de vida de
bioprocesos de hongos fi filamentosas, a saber, (i) la tensin y la caracterizacin del inculo,
(ii) la morfologa, y (iii) la reologa, as como sus efectos sobre el rendimiento del proceso.
interconexiones complejas entre la tensin, el inculo, la morfologa, la reologa y el diseo
del proceso se describen y discuten. Slo la combinacin de diferentes sensores de tipo duro
con tecnologa de sensores suave y el desarrollo de modelos mecanicistas simpli fi cados
puede permitir el diseo de bioprocesos basados en la ciencia de los hongos fi filamentosas.
aplicacin industrial de fi hongos filamentosas Econmico, y bioprocesos controlables fiables
para fi organismos filamentosas, en particular, fi hongos filamentosas, son de suma
importancia para la produccin a gran escala de una amplia gama de productos con valor
agregado que incluyen cidos orgnicos, enzimas y antibiticos. Debido a las interacciones
complejas entre la tecnologa de proceso, fi morfologa filamentosas (Figura 1), y el
rendimiento global del proceso, el diseo tradicional de bioprocesos est siendo llevada a
cabo por etapas comnmente por mucho tiempo, estrategias empricas (Figura 2). En
contraste con los productos biofarmacuticos, la mayora de los productos de fi hongos
filamentosas son (blanco) productos industriales biotecnolgicos a granel y por lo tanto no
estn sujetos a las exigencias normativas estrechos. En consecuencia, los fabricantes pueden
optimizar continuamente sus cepas de produccin y procesos industriales para asegurar la
competitividad. enfoques empricos comunes, sin embargo, una visin cientfica falta en
ingeniera de procesos y parmetros de proceso clave (KPPS) (seeGlossary) bioprocesos
inevitablyleadingtosub-optimallydesigned y altas tasas de fracaso del proceso. Por lo tanto,
los ingenieros de bioprocesos persiguen dos objetivos generales resumidos as'two-times50%
', whichmeanstwicetheproductivityand reducir el tiempo de desarrollo de bioprocesos a 50%.
Con el fin de cumplir estos requisitos econmicos, es necesario entender y controlar el
sistema biolgico utilizado. En esta revisin, se dar una visin general de las estrategias de
medicin y control se han desarrollado recientemente para los principales
obstculos a lo largo del ciclo de vida de bioprocesos de fi hongos filamentosas que afecta de
forma significativa el rendimiento global del proceso. Puntos que impactan en el rendimiento
del proceso son: (i) la cepa y el inculo, (ii) la morfologa, y (iii) la reologa. Adems,
proporcionamos perspectivas futuras dirigidas a una comprensin holstica de las
interdependencias complejas en el diseo del proceso basado en la ciencia ficcin de los
hongos filamentosas.
Colar y inculo La deteccin de caractersticas de las cepas El primer paso en el diseo de
bioprocesos es la identificacin de cepas promisorias candidatos (Figura 2). Para lograr la
automatizacin y de alto rendimiento, las cepas estn comnmente identificados en los
sistemas de placa de microvaloracin (MTP). Adems de identificacin de cepas altamente
productivos, el cribado inicial tambin debe tener en cuenta las caractersticas morfolgicas,
como la morfologa de crecimiento complejo o crecimiento de la pared adherente, lo que signi
fi cativamente afectan la reproducibilidad de los resultados y el procedimiento posterior
ampliacin. Faltan estos factores importantes, los clones seleccionados pueden fallar en la
entrega de las productividades observadas a pequea escala. La reduccin del espacio de
cabeza fue demostrado ser una estrategia til para prevenir el crecimiento de la pared y las
consiguientes heterogeneidades [1-3]. Otro estudio compar el rendimiento fisiolgico y
morfolgico proceso en el MTP y reactores de sobremesa de 1 litro. La adicin de perlas de
vidrio promovi el crecimiento del micelio
revisin
Glosario

tasa de desprendimiento de dixido de carbono y la tasa de absorcin de oxgeno (CER /

OUR): la frecuencia respiratoria que reflejan la actividad fisiolgica de cultivo. atributo
fundamental de la calidad (CQA): un examen fsico, qumico, biolgico, microbiolgico o
caracterstica que debe estar dentro de un lmite apropiado, gama o distribucin para
garantizar la calidad del producto deseado. de parmetros de procesos crticos (CPP): un
parmetro de proceso cuya variabilidad tiene un impacto en un atributo fundamental de la
calidad y por lo tanto debe ser supervisado o controlado para asegurar que el proceso
produce la calidad deseada. Diseo de Experimentos (DOE): un mtodo estructurado,
organizado para determinar la relacin entre los factores que afectan a un proceso y la salida
de ese proceso. parmetro de proceso clave (KPP): un parmetro ajustable (variable) del
proceso que, cuando se mantiene dentro de un rango estrecho, asegura un rendimiento
ptimo proceso. Un parmetro clave proceso no afecta de manera significativa atributos
crticos de calidad del producto. Rangos para KPPS se establecen durante el desarrollo del
proceso, y los cambios en los rangos de funcionamiento sern gestionados dentro del sistema
de calidad. tecnologa de proceso analtico (PAT): un sistema para disear, analizar y controlar
la fabricacin a travs de mediciones puntuales de calidad y de rendimiento atributos crticos
de las materias primas y en proceso y procesos con el objetivo de garantizar la calidad del
producto final. Calidad ByDesign (QbD): un todevelopment systematicapproach
thatbeginswith objetivos predefinidos y hace hincapi en los productos y procesos
comprensin y control de procesos, basado en conocimientos cientficos slidos y la gestin
de riesgos de calidad.
y concomitantemente disminucin del crecimiento de la pared [4]. Con este enfoque, los
parmetros de rendimiento fisiolgicas identi fi cado durante el cribado MTP para mesas de
trabajo fueron similares a los reactores. Los autores tambin estudiaron la influencia de
diferentes regmenes de cultivo sobre el comportamiento del proceso morfolgico mediante la
medicin
de
las
distribuciones
de
tamao
de
partcula.
Aunque
physiologicalscreeningresultsweresimilaratminiaturizedand a escala de laboratorio, la
morfologa de crecimiento era diferente, probablemente debido a las diferentes fuerzas de
cizallamiento. Un sistema microbioreactor desechable para cribado de alto rendimiento de la
germinacin e fi ciencia se ha introducido recientemente [5]. cmaras del reactor de 100 ml
de volumen habilitada paralelizados caracterizacin de la morfologa de crecimiento durante
la germinacin de esporas, as como la cuantificacin de la calidad del inculo. Aunque tales
reactores miniaturizados no permiten la caracterizacin completa de la morfologa de
crecimiento, se ha demostrado que los parmetros morfolgicos, como la unidad de
crecimiento de las hifas de longitud, pueden ser correlacionados para sedimentar cintica de
formacin y el tamao de pellet [6]. Otro factor crucial que tiene que ser considerado en el
anlisis de caractersticas de las cepas es el medio de crecimiento (Cuadro 1).
Caracterizacin de la concentracin de inculo de esporas de inculo, la calidad, y la
viabilidad afectan gravemente la morfologa de hongos, la fisiologa, y la productividad [7]
.Todatehowever, theamountofinoculumandthe ajuste de parmetros de proceso estn todava
empricamente optimizado con cada lote de inculo. En consecuencia, los procesos iniciales
llevados a cabo con un lote de inculo fresco slo llegan poco a poco una ptima emprica
despus de varias pruebas de funcionamiento. Este procedimiento no est de acuerdo
completamente con el objetivo global 'y dos veces el 50%' en (blanco) biotecnologa
industrial. A este respecto, los dispositivos microbioreactor paralelas y sistemas de cultivo
MTP [1,4,5] representan herramientas tiles forthecharacterizationofgerminationef viabilidad
ciencyandspore fi. Por otra parte, la microscopa de fluorescencia [8] y transformada de
Fourier (FTIR) spectromicroscopy infrarrojos [9,10] proporcionan una resolucin espacial de la
composicin bioqumica intracelular de fi hongos filamentosas. A pesar de estas metodologas
se encuentran todava en su infancia, los resultados son prometedores para un medio de
cuantificar la calidad del inculo de esporas en el futuro. El punto de tiempo de transferencia
correcta de la semilla reactor al reactor despus de la produccin exitosa germinacin de las
esporas es tan crucial como la calidad inculo de esporas ptima.
[(Figure_1) TD $ FIG]

Las esporas
El desarrollo de hifas
dispersar la morfologa
la morfologa de pellets
Tendencias en Biotecnologa
El desarrollo de hifas
dispersar la morfologa
la morfologa de pellets
Figura 1. Ciclo de vida morfolgica de los hongos filamentosos. Independiente de la
capitalizacin de Aspergillus spp. para la produccin de enzimas o cidos orgnicos,
Trichoderma spp. para celulasas, o Penicillium spp. para los antibiticos, estos caballos de
batalla industriales filamentosos todos comparten una morfologa nica de crecimiento y
complejo. bioprocesos de hongos se inocularon comnmente a partir de esporas. Despus de
la germinacin exitosa: ramificacin, que se extiende, y el entrelazamiento de las hifas sola
introducir dispersar a las redes de hifas. Ms de duracin del proceso, los pellets pueden
desarrollar a travs de crecimiento a partir de esporas individuales o por aglomeracin.
fuerzas de cizallamiento de alta y de nutrientes limitacin causa la desintegracin de pellets.
[(Figure_2) TD $ FIG]
Tendencias en Biotecnologa
El control del proceso a escala de fabricacin basado en KPP oscila iden? fi cado en el paso 2.
Integra sin problemas? en de nuevos clones en la produccin? en es O? es obstaculizada por
la falta de mechanis? c comprensin de aumento de escala ECTS e ff.
La seleccin de alto rendimiento para las cepas altamente productoras.
Proyeccin de la morfologa y la reologa proceso en esta etapa exige Veri fi cada, mechanis?
C modelos de escalado.
Medicin y control de KPP vacas? Cs en un caudal limitado en escala de litros.
Ini? Inves Al? Ga? Sobre la morfologa del proceso y la reologa basado en la escala
descendente hidrulica.
1. La cepa de cribado
2. Proceso de desarrollo
3. Implementa? En al produc? A escala
Figura 2. Diseo de bioprocesos tradicional para los hongos filamentosos. La estrategia de
desarrollo comienza con la deteccin cualitativa de clones adecuados, seguido por el
desarrollo de bioprocesos cuantitativa en biorreactores a escala de laboratorio. De esta
manera, se identifican los parmetros de proceso clave (KPPS) para asegurar que el sistema
biolgico se guiados a sus blancos cantidad del producto. pilotaje subsiguiente apunta a la
escalabilidad del proceso, el anlisis de la adaptacin de los parmetros del proceso, y los
efectos de escala-up [53].
Revisin Trends in Biotechnology 2013 abril, vol. 31, N 1
38
La medicin de la tasa de evolucin de dixido de carbono (CER), la espectroscopia de
fluorescencia mltiples longitudes de onda, la medicin de la turbidez y la espectroscopia de

infrarrojo cercano (NIR) se utilizan para determinar este punto temporal en lnea [11,12].
enfoques espectroscpicos no requieren el anlisis de gases de escape y por lo tanto se
aplican
tambin
a
los
MTP
y
agitar
matraces.
Miniaturizedandparallelscreeningapproachesprovide rpida cuanti fi cacin de las
caractersticas de la cepa y de inculo. La deteccin de las caractersticas fisiolgicas y
morfolgicas relevantes en esta etapa inicial de diseo de bioprocesos facilitar la prediccin
del comportamiento del proceso a escala grande.
Morfologa coagulante frente a no coagulante especies El mecanismo de la formacin de
grnulos depende de la cepa fngica. Una cepa fngica puede ser coagulante o no
coagulante, una descripcin de los fenmenos de agregacin de conidios. Varios estudios han
analizado el caso de la agregacin de conidios, que est ms influenciada por los medios de
comunicacin, las fuerzas mecnicas, as como la concentracin de inculo y la viabilidad
[7,13]. La agregacin se produce en dos etapas: (i) inmediatamente despus de la
inoculacin, nicamente afectadas por el valor de pH y la osmolalidad del medio de [14]; (Ii)
en la germinacin, afectada por el pH, la osmolalidad, agitacin y aireacin [13]. la
agregacin de los conidios puede ser muy bien controlada por 2D espectroscopia de
fluorescencia [11] y se ha descrito en un modelo de proceso fiable [7]. Para las cepas de
hongos, pellets o bien thatgerminatesorfromentanglements no coagulante forma
fromasinglespore
de
hifas
ramificadas
y
dispersar
grupos
de
micelio.
El
sporeinoculumconcentrationisaKPPforpelletformation. De hecho, la formacin de grnulos se
acelera a la reduccin de las concentraciones de inculo de esporas [15]. Con el fin de
describir de forma fiable el comportamiento de los hongos fi filamentosas sobre el proceso de
produccin, el conocimiento de inculo y sus caractersticas de coagulacin debe integrarse
en un balance global de la poblacin morfolgica, as como los modelos multivariados de
prediccin [13].
Diferentes morfologas durante los procesos de produccin La mayora de los procesos de
hongos fi filamentosas son cultivos de varias etapas durante las cuales los hongos fi
filamentosas exhiben diferentes morfologas. La morfologa predominante durante
cultivationsdependsonseveralfactorslikethestrain, thespore concentracin de inculo y la
calidad, y la agitacin [15]. limitacin de nutrientes y la difusin de oxgeno que afectan a los
gradientes de pellets micromorfologa [16], as como efectos de las concentraciones DO2 y
DCO2 en el biorreactor en macromorfologa fngica tener toda cuanti fi cado sido
recientemente [17- 19]. Esto es especialmente importante para la escalabilidad proceso
porque contrapresin hidrosttica en el fondo de los vasos grandes que pueden crear altas
concentraciones residuales DCO2 [17,18,20]. Otros estudios han investigado los cambios
morfolgicos durante perodos prolongados de cultivo [21], en el que los gradientes de
concentracin de sustrato a travs de grnulos de hongos afectan micromorfologa pellet y
actividad de la biomasa [16]. Morfologa significativamente influye en varios otros KPPS
incluyendo la viscosidad, la mezcla de caldo de la demanda de energa y la productividad,
substratediffusion cparameterslike butalsostrain-especfica y los rendimientos [22]. Morfologa
y reologa interdependencias pueden ser investigados por anlisis de imagen digital de
anlisis de tamao de partculas [24] [23] o. Ciertas morfologas de crecimiento estn
directamente relacionadas con la produccin de compuestos de inters industrial, por
ejemplo, se prefieren los grnulos para la produccin de cido ctrico [15], mientras que el
crecimiento del micelio aumenta la formacin de fructofuranosidasa [14]. Por lo tanto, el
anlisis de la morfologa y control fiables son cruciales para bioprocesos optimizados.
anlisis de la morfologa y la morfologa de Control del crecimiento se dirige cada vez ms
como un proceso de KPP durante el desarrollo debido a la relacin indiscutible entre la
morfologa
de
hongos
y
el
rendimiento
del
proceso
[15,22,25]
.Aprerequisiteformorphologicalprocesscontrol es el conocimiento detallado de un hongo
'responsetoprocessparameters.Suchknowledge morfolgica, sin embargo, slo puede ser
recogida si las herramientas precisos para el anlisis morfolgico estn disponibles. Una

excelente revisin, recientemente publicado describe mtodos para analizar la morfologa de

hongos incluyendo la microscopa de fuerza atmica, citometra de fl ujo, y las tcnicas
aplicables en tiempo real [25]. Aunque para algunas de estas tcnicas de aplicabilidad en el
entorno de produccin todava tiene que ser probada, la revisin vitrinas enfoques existentes
para dilucidar la informacin morfolgica relevante, mecanicista para el desarrollo de
bioprocesos optimizado. tcnicas analticas fiables deben permitir la investigacin detallada
de los efectos de los cambios en los parmetros del proceso, incluyendo inculo de esporas,
la composicin del medio, y la cintica de mezcla, en la morfologa de hongos
[14,15,22,26,27]. Asi que
Caja de desarrollo 1. Medios
Hasta la fecha, la mayora de los procesos de produccin establecidos con hongos
filamentosos se llevan a cabo en medios qumicamente definidos. Las principales ventajas de
los medios complejos son que contienen una rica variedad de compuestos que permiten el
crecimiento de microorganismos intactos y que estn hechos a partir de fuentes de bajo
costo. Sin embargo, la variabilidad significativa de lote a gran cantidad de diferentes
componentes en los resultados de los medios de comunicacin complejas en grandes
variaciones en la eficiencia de la produccin. Actualmente, hay dos estrategias para abordar
este problema: (i) la caracterizacin de las materias primas complejas y tomando las acciones
correspondientes en funcin de las variaciones, y (ii) de conmutacin de los procesos de
produccin de complejos de medios definidos. Para la caracterizacin de componentes de
medios complejos, tcnicas espectroscpicas, incluyendo infrarrojo cercano (NIR), mediados
infrarrojo (MIR), y de reflectancia total atenuada mediados espectroscopia de infrarrojo (ATRMIR) son comnmente empleada [54]. Una visin global de la mayora de estos mtodos, que
contiene valiosas sugerencias para posibles aplicaciones de la tcnica respectiva, se le dio en
2004 [55]. Los principales inconvenientes de herramientas espectroscpicas son sensor
ensuciamiento durante la aplicacin en lnea, extensos procedimientos de calibracin para los
modelos quimiomtricas cuantitativos fiables, as como la demanda de anlisis de datos
multivariable complejo [54,56]. Por lo tanto, en aras de la simplicidad y capacidad de control,
evitando la variabilidad materia prima por el cambio a medios de cultivo definido es
preferible. la caracterizacin de cepas de hongos filamentosos rpido en lote cultivos en un
medio complejo / combinado definido permite la identificacin de la cepa candidato ms
prometedor para la conmutacin de la bioprocesos de complejos a los medios de
comunicacin totalmente definidos [3]. Esta metodologa se basa en las necesidades
analticas mnimas y la determinacin indirecta de las tasas de absorcin especficas de los
componentes de los medios complejos mediante la aplicacin de tcnicas de balanceo de
masas redundante estadsticamente verificadas. Este enfoque no slo ha permitido el cambio
de complejos de medios definidos, sino tambin un aumento del doble del rendimiento global
del espacio de la penicilina tiempo y un triple aumento en la tasa de formacin de penicilina
especfica mxima [3].
Revisin Trends in Biotechnology 2013 abril, vol. 31, N 1
39
ahora, sin embargo, estos anlisis han sido en su mayora sobre la base de un nmero
limitado de imgenes microscpicas grabadas manualmente utilizando tcnicas de anlisis de
imgenes digitales introducidas hace ms de una dcada [27]. Debido a que la grabacin
manual de imagen impide la aplicabilidad de alto rendimiento, automatizable caracterizacin
morfolgica de bajo nivel enfoques basados en distribuciones de tamao de partcula debe
utilizarse para aplicaciones de rutina industriales [4,24]. Para las penetraciones ms
estrechos, los enfoques de caracterizacin morfolgica de nivel intermedio, que da acceso a
la informacin morfolgica mecanicista, se puede utilizar. dimensiones fractales se pueden
emplear como descriptores morfolgicos [28] y tambin describen el comportamiento de
ramificacin y el pellet morfologa [29]. dimensiones fractales miden el grado de complejidad
as como las propiedades de llenado de masas, y un gran nmero de parmetros morfolgicos

se pueden reemplazar eficazmente por estos ndices [28]. Por otra parte, otro descriptor
morfolgica, el nmero morfologa, est estrechamente correlacionada con la productividad
de Aspergillus niger [14]. La estrategia ptima, sin embargo, es un alto rendimiento, alto nivel
de enfoque de caracterizacin morfolgica describir la morfologa de hongos sobre la base de
fi cacin y frecuencia distribuciones caciones morfolgicas para varios parmetros
morfolgicos [6]. Estos planteamientos permiten el modelado y la comprensin de las
heterogeneidades que afectan al rendimiento global del proceso sobre la base de los balances
de poblacin [30]. , estrategias de modelado morfolgica estructurados prometedores para
predecir el comportamiento del proceso morfolgico y el enlace a la productividad ya fueron
introducidos en los aos 90, pero an no se han aplicado para el desarrollo de procesos
industriales [31,32]. Hasta la fecha, la falta de herramientas fiables para el anlisis
automatizada de alto rendimiento de la morfologa de hongos ha impedido el uso de anlisis
morfolgico como un procedimiento de anlisis de rutina. Dispositivos para la lnea, en lnea y
en tiempo real las mediciones microscpicas se han desarrollado en los ltimos aos, pero su
aplicabilidad como herramientas automatizadas de medicin en lnea an no se ha
demostrado [33]. A pesar de la disponibilidad de trabajo computacional flujos de reducir al
mnimo la intervencin manual durante los anlisis morfolgicos [34,35], todava hay una
necesidad de sistemas de anlisis de imagen con la adquisicin de imgenes y anlisis
totalmente automatizado [14,36]. Un reciente mtodo de alto rendimiento para una rpida
caracterizacin morfolgica de los hongos fi filamentosas articula la grabacin totalmente
automatizada de miles de imgenes microscpicas con concomitante estadstica veri fi cacin
para la completa y precisa cuanti fi cacin de la morfologa de hongos [6].
Pelletmicromorphologyandsubstratediffusionlimitationsaffectingpelletgrowth,
erosin,
andbreakagecanbe cuantificada mediante microscopa lser confocal [16]. Recientes, nuevas
herramientas para el anlisis de micromorfolgico incluyen (i) FTIR imgenes
spectromicroscopic, que permite la resolucin espacial en 3D de la micromorfologa pellet
mediante la investigacin de la composicin bioqumica de las secciones de pellets de
micrtomo, y (ii) MALDI-TOF clula intacta espectrometra de masas (ICMS), que proporciona
El anlisis micromorfolgico thatfacilitatesidenti fi cationandquanti fi cationofprotein patrones
en diferentes estados de los procesos fisiolgicos o morfolgicos (AE Posch et al., sin
publicar). Tales tcnicas de alto nivel representan un paso importante hacia la modelizacin
mecnica de las interdependencias entre las
los parmetros del proceso, fisiologa, transferencia de masa, y micromorfologa. Hasta la
fecha, las estrategias de control morfolgicas para la produccin industrial incluyen la
seleccin de una cepa candidata que exhibe la morfologa deseada durante el desarrollo del
proceso [6], as como el ajuste de la concentracin de inculo de esporas, la composicin del
medio, y el rgimen de agitacin [15]. Por otra parte, las micropartculas se pueden utilizar
para personalizar la morfologa de hongos [37]. Del mismo modo, el control de la osmolalidad
facilita el control de la morfologa micelial dispersa [14]. Creemos que la caracterizacin
morfolgica de alto rendimiento enfoques que van desde la microscopa ptica para
citometra de flujo [6,24] facilitar morphology- y, por tanto, el control de bioprocesos en el
futuro. La actualizacin de los modelos mecanicistas morfolgicas, estructuradas con los
datos morfolgicos cuantitativos avanzar enfoques para el modelado predictivo morfolgica
3D de pellets y dispersar la morfologa [38]. combinacin de sensores de sonido para el
volumen de biomasa [39], por ejemplo, material dielctrico (DE) espectroscopia, y el
equilibrio de la masa elemental redundante para la estimacin de la produccin de biomasa
[3] puede ser un camino prometedor para facilitar el seguimiento en tiempo real de las
caractersticas de la biomasa mediante sensores suaves.
Reologa de la reologa y la morfologa Hay interconexiones complejas entre la morfologa,
concentracin de biomasa, y la reologa [23,40]. A continuacin, destacamos la dependencia
de la reologa de la morfologa de hongos. el crecimiento de hongos libremente dispersado
causa alta viscosidad caldo y deteriora la transferencia de oxgeno. A menos que haya un
directlinkagebetweenmorphologyandproductivity, la morfologa de pellets es el preferido en
los procesos de produccin debido a la menor viscosidad. Sin embargo, los lmites de

crecimiento pellet sustrato de difusin para el ncleo del grnulo en dimetros de pellets
crticos, lo que provoca la lisis de las clulas de ncleo de grnulo [6]. Este evento ha sido
resuelta
en
el
espacio
por
microscopa
confocal
de
barrido
lser
[16].
Hydrodynamicconditionsinthebioreactorin fl uencethe desarrollo morfolgico del hongo y por
lo tanto la reologa. velocidades de agitacin altas, que son necesarios para la transferencia
de masa ptima, conducir a la tensin de alta cizalla. En consecuencia, las redes de micelio
estn fragmentados, aumentando la cantidad de filamentos libres y por lo tanto la viscosidad.
La alta viscosidad provoca insu fi ciente de transferencia de masa y la limitacin de oxgeno
[41]. Modelado de la fragmentacin de hongos requiere el clculo de la fuerza de las hifas y
las fuerzas mecnicas ejercidas sobre el hongo por el de flujo turbulento. A este respecto, es
crucial saber la disipacin de energa por impulsores y aireacin. Mayor disipacin de energa
provoca una fuerte erosin y cambios en la morfologa de pellets como se muestra forA.niger
[41] .Ingeneral, la formacin de grnulos hydrodynamicconditionsaffect en tres niveles: (i) la
interaccin de los pellets y remolinos; (Ii) el impacto entre los pellets y agitadores / BAF es fl;
y (iii) de colisin entre los grnulos de [42]. Estas interacciones pueden quitarse hifas o
romperse por completo grnulos enteros. Para describir de forma fiable un bioproceso hongos,
la influencia de la tensin de cizallamiento hidrodinmico en la morfologa, la reologa y la
productividad tiene que ser integrado en los modelos. La entrada de energa media, un
parmetro de fcil acceso, se puede utilizar para caracterizar la dinmica fluidas y reologa.
Este parmetro, sin embargo, depende de la disposicin experimental y por lo tanto
Revisin Trends in Biotechnology 2013 abril, vol. 31, N 1
40
no puede ser transferida a travs de modelos. Un modelo holstico tiene que utilizar
parmetros transferibles y describir todos los procesos independientes de las condiciones de
funcionamiento. Por lo tanto, la interaccin entre los remolinos y las superficies de pellets
necesita estar relacionada con las fuerzas de corte. Las fuerzas de corte estn distribuidos de
manera desigual dentro del reactor, por lo que la velocidad de cizallamiento mximo en lugar
de parmetros medios deben ser utilizados para describir la reologa en un biorreactor [41].
herramientas de medicin de la reologa, an se necesitan enfoques automatizables fiables
para la determinacin oportuna de las caractersticas reolgicas de caldo. Las tcnicas
tradicionales se pueden agrupar en tres categoras: (i) tcnicas capilares, (ii) las tcnicas de
rotacin, y (iii) la cada de las tcnicas de bolas [43]. Sin embargo, estas tcnicas
cannotbeusedforfungalfermentationbrothsbecausethey se considera que son lquidos no
newtonianos. fermentationbrothsareacomplexsystem Fungal: atthebeginningof un proceso el
caldo bsicamente describe un lquido newtoniano, pero debido a crecimiento de la biomasa y
el cambio de la morfologa de hongos, el caldo se vuelve heterogneo que presenta la
tecnologa developmentsininstrument no Newtoniancharacteristics.Recent para reometra,
especialmente con respecto a nonNewtonianliquids, havebeenachieved [43,44 ] .Despitethe
disponibilidad de viscosmetros en lnea de la industria qumica, la reologa es comnmente
no se mide en tiempo real para bioprocesos fi filamentosas. Novela, dispositivos
miniaturizados, incluyendo herramientas espectroscpicas de ultrasonido, resonadores
acsticos electromagnticos, y que vibran los dispositivos de puente estn todava en su
infancia, pero describen una herramienta en lnea prometedora para
Cuadro 2. Prediccin de reologa
requisitos de energa proyectados de laboratorio a gran escala a menudo disminuyen la
economa del proceso o incluso exceden la disponibilidad de energa. Por lo tanto, bioprocesos
con hongos filamentosos necesitan ser adaptados durante el pilotaje para satisfacer potencia
disponible en escala de fabricacin, por ejemplo, mediante la adaptacin de medios y la
introduccin de etapas de dilucin [20]. Hasta la fecha, la ampliacin de bioprocesos
filamentosos se dirige habitualmente usando la regla emprica de los pulgares para arriba
hidrulica escala, incluida la velocidad tangencial mxima o la velocidad punta del impulsor,

el valor de kla, saturacin de oxgeno, la entrada de energa volumtrica, y el tiempo de

mezclado [57-59] . diseo del proceso basado en la ciencia la aplicacin de modelado
predictivo para reolgico morfolgica morfolgica ampliacin representara un paso
importante hacia el aumento de la tasa de xito del proceso y contribuir as a reducir los
tiempos de desarrollo de procesos y el aumento de la economa del proceso (Figura I).
Desafortunadamente, todava es muy complejo y difcil de predecir la reologa de un caldo de
fermentacin. frmulas importantes que describen diferentes aspectos que influyen en la
reologa son las frmulas conocidas para la viscosidad aparente, la ley de potencia mtodo
Metzner y Otto, y el modelo de Herschel-Bulkley. Sin embargo, una sola frmula no puede
describir los complejos procesos que contribuyen a la viscosidad en un biorreactor.
Complementando el anlisis de imgenes de bajo rendimiento para el modelado convencional
reolgico [23],
mtodos multivariantes, y los datos de distribucin del tamao accesible de alto rendimiento
pueden utilizarse para predecir las propiedades reolgicas en un biorreactor [24]. Los
parmetros ms importantes para describir la reologa caldo se pueden predecir con xito de
la distribucin del tamao, concentracin de biomasa, y el modo de alimentacin. Los
enfoques actuales se combinan los datos de distribucin de tamao de partculas y
concentracin de biomasa y analizar estos datos utilizando diferentes herramientas
quimiomtricas, como mnimos cuadrados parciales (PLS) modelos. Estas propiedades
reolgicas enfoques multivariado modelo de caldos de fermentacin filamentosos con igual o
mayor precisin que las relaciones tradicionales de tipo ley de potencia basados en los datos
promedio de anlisis de imgenes [24]. Sin embargo, el modelo calibrado es especfico para
una determinada cepa de hongo, la escala y las condiciones de funcionamiento y por lo tanto
slo es vlida en un rango limitado. Creemos que los mtodos de caracterizacin de partculas
superiores (highthroughput, anlisis de imgenes estadsticamente verificado) aumentarn
significativamente el poder predictivo de los modelos de la reologa en el futuro,
proporcionando mtodos de modelizacin mecanicistas [23,38] con los datos de poblacin
morfolgicos cuantitativos highdimensional [6]. Por lo tanto, sugerimos predictivo morfolgica
ampliacin, junto con las estrategias de control escalables y no lineales para la extrapolacin
fiable del rendimiento del proceso de produccin de los resultados del examen. [(Box_2) TD $
FIG]
Miniaturiza? En y paralleliza? En
El anlisis de alto rendimiento y datos verificables ca? a
monitoreo y modelacin en lnea
diseo del proceso basado en la ciencia
Colar y inculo
Morfologa
reologa
Tendencias en Biotecnologa
Figura I. estrategias para el diseo de procesos basados en la ciencia de orientacin tiempos
de desarrollo de procesos ms bajos y mayor economa del proceso recomendado. Durante
los prximos aos, veremos la aplicacin de sensores avanzados recientemente introducidas
para la tensin y la caracterizacin del inculo, la morfologa, la reologa y el rendimiento del
proceso, as como su mejora concomitante. Esto permitir un registro ms preciso de KPPS y
dar acceso a un nmero mucho mayor de datos de proceso (en lnea). La extraccin de la
informacin pertinente de dichos datos multidimensionales accesibles mediante anlisis
multivariante, y la integracin en los modelos de procesos mecnicos simplificados ser
necesario aumentar la tasa de xito del proceso de muestreo miniaturizado a escala de
fabricacin. La combinacin de las tcnicas de medicin, como complemento ortogonal de
sensores de sonido suaves ya permite la resolucin de la interaccin de KPPS altamente

entrecruzados y por lo tanto describe un enfoque prometedor hacia el diseo de bioprocesos

basados en la ciencia para los hongos filamentosos.
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la medicin de la viscosidad fi filamentosas caldo. Por lo tanto, los esfuerzos actuales
centran en modelos fiables que predicen la reologa caldo basado en mediciones de
parmetros ms fcilmente accesibles que incluyen la concentracin de biomasa,
distribucin del tamao de partcula [24], andenergyinput [45] .Accuratemeasurement
reologa caldo as como su prediccin durante escala-up es crucial para el diseo
bioprocesos xito (Recuadro 2).

se
los
la
de
de

Efectos sobre el rendimiento del proceso Cuantificar el rendimiento del proceso de fi hongos
filamentosas, la concentracin de biomasa, viabilityas as como su estado fisiolgico deben
ser monitoreados.
concentracin de biomasa y la productividad volumtrica viabilidad, el parmetro objetivo en
el diseo del proceso industrial, depende en gran medida de la concentracin de biomasa y la
cantidad de viable, produciendo activamente clulas. Tambin KPPS, tales como la reologa
[23], son influenciados por la concentracin de biomasa. determinacin en lnea fiable de la
concentracin de biomasa y la cantidad de biomasa activa representaran un gran paso hacia
el control de bioprocesos eficaz. Para monitorear las caractersticas de la biomasa, diferentes
estrategias, como las mediciones de turbidez, espectroscopia IR, espectroscopia 2D,
espectroscopa dielctrica (DE), y diferentes sensores suaves se han desarrollado [46,47].
viscosidad caldo se puede utilizar como un indicador de la concentracin de biomasa de la fi
filamentosas organismo modelo Streptomyces spp .. La viscosidad es proporcional a la
concentracin de biomasa hasta el final de la fase exponencial de crecimiento [48]. Sin
embargo, durante las etapas posteriores del proceso, la viscosidad no indica la concentracin
de biomasa debido a cambios en las propiedades reolgicas del caldo de fermentacin
resultante de cambios en la morfologa [48]. Biocalorimetry se utiliza para controlar la
produccin de calor durante bioprocesos en lnea. La produccin de calor metablico se
correlaciona con el crecimiento, la morfologa y la fisiologa
[49,50]. La investigacin de la evolucin de calor sobre duracin del proceso por las llamadas
curvas
de
potencia
en
tiempo
proporciona
informacin
sobre
biomassgrowthandphysiology.Furthermore, patrones heatrelease tambin re fl ejan cambios
en la morfologa de hongos, por lo que esta estrategia en lnea podra ser una herramienta til
para la monitorizacin no invasiva morfologa [49,50] . sensores blandos se pueden utilizar
para estimar con precisin la biomasa mediante la combinacin de datos de fcil seguimiento,
al igual que la tasa de dixido de carbono evolucin (CER), la tasa de consumo de oxgeno
(OUR), o el consumo de base, con sensores de tipo duro, que estn estrechamente
relacionados a la biomasa de crecimiento [51]. Por lo tanto, los sensores suaves son un
enfoque poderoso para KPPS de seguimiento, que slo seran accesibles para la medicin
directa de costosos equipos y mano de obra. Siempre que los componentes relevantes han
sido identificados y puedan ser medidos en lnea, fi el balance de masas estequiomtrica
principio de primera lnea permite la estimacin de la concentracin de biomasa, incluso para
cultivos en medios complejos, slidos [3]. Una comparacin de sensores comunes de biomasa
en lnea ha demostrado que el DE espectroscopia, medicin de la turbidez, y CER dieron las
estimaciones ms exactas. Una combinacin de sensores tambin revela informacin sobre la
morfologa de los hongos, los rendimientos de los cambios, y la biomasa viabilidad [39].
Actualmente, una gran variedad de diferentes herramientas de medicin para determinar la
concentracin de biomasa fngica est disponible. Tabla 1 da una visin general de estas
tecnologas, muestra sensibilidades cruzadas, y describe las etapas del ciclo de vida de
bioprocesos de hongos, en donde la tecnologa respectiva se puede utilizar. En resumen, a lo
largo
de
todas
las
etapas
de
bioprocessdesign,
principios
thecombinationofcomplementarymeasurement con primer principio de equilibrio de masa

estequiomtrica de sensores soft es muy recomendable. viabilidad de la biomasa, la

concentracin, morfologa, y la actividad se puede estimar para facilitar en ltima instancia, el
modelado de procesos de prediccin y control. Adems de estas mediciones representativas
de biomasa, el estado fisiolgico proceso debe controlarse de forma fiable (Cuadro 3).
Tabla 1. Mtodos para la determinacin en tiempo real de fi filamentosas biomassa Mtodo
sensibilidad cruzada Aplicabilidad Refs burbujas de gas Morfologa sensor de componentes de
medios Contenido de sal de alta densidad celular slido ensuciamiento Screening Fomento de
la Produccin de Microscopa - + - - + RAAR [33,47] Turbidimetra RR - RRRAAR [46,47] La
citometra de flujo - R - R + - NA AA [24,47] vibracional espectroscopa RR - - R / + RAAR
[12,46, 54] dielctrica RRR espectroscopa - + - NA AA [39,46, 47 ] espectroscopia de
fluorescencia RR - - R / + RAAR [11,39, 46,47] Calorimetra - - - - + - NA AA [49,50] Balance de
masa de la adicin de pH / base - - - - - RAAA [51] masa equilibrio de pO2 / NUESTRO de pO2 - - - - RAAA [51] El gas de escape de medicin - - - - - - NA AA [3,11, 12,39] sensores soft - - - - - AAA [3,46 , 51] aAbbreviations: +, cuanti fi cables sensibilidad cruzada; -, Sin sensibilidad
cruzada; R, la evaluacin de riesgos fi co caso espec necesaria debido a la no cuanti fi cables
sensibilidad cruzada; A, aplicable; NA, no aplicable.
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Observaciones finales y tendencias futuras retos en el diseo de bioprocesos para fi hongos
filamentosas son fuertemente interdependientes (vase la Figura I en el recuadro 2).
Sistemtica Diseo de Experimentos investigationofinterdependenciesbetweenKPPsrequiresa
enfoque (DoE). procesar la informacin relevante debe ser extrado de los datos
experimentales primas por estadsticamente Veri fi cado equilibrio macroscpica y anlisis
morfolgico [3,6]. Por otra parte, la informacin fisiolgica subyacente debe ser examinado
con el modelado mecanicista [45,52]. Aunque todava no es una amenaza reguladora,
creemos que despus de Calidad por Diseo (QbD) directrices [ICH (2009) Q8, Desarrollo
Farmacutico (R2); ver http://www.ich.org] sera tambin beneficioso en fi thecaseofindustrial
(blanco) biotechnologicalbulkproducts. desarrollo de procesos basados en la ciencia basada
en la evaluacin del riesgo inicial y la identi fi cacin de los atributos crticos de calidad (CQA),
los
parmetros
crticos
del
proceso
(CPP),
y
KPPS
followedbysystematicresolutionoftheirinterdependencies
hasbeendemonstratedfortheproductionofbiopharmaceuticals [CMC-Biotech-Trabajo de Grupo
(2009) A-Mab: un estudio de caso en Desarrollo de bioprocesos; http: //www.casss. org /
asociaciones / 9165 / archivos / A-Mab_Case_Study_Version_ 2-1.pdf, 1-278]. Implementacin
de una obra tan automatizado de flujo tambin permitir una rpida integracin de la novela,
cepas mejoradas en la produccin, disminuir el desarrollo
tiempos, y la economa incremento de procesos para la produccin de productos de valor
aadido de los hongos fi filamentosas.
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Cuadro 3. Monitoreo de rendimiento de los procesos fisiolgicos
Diferentes estrategias se pueden aplicar y se combinaron para el seguimiento in situ del
estado del proceso fisiolgico. espectroscopia de fluorescencia 2D se puede emplear para
controlar la productividad y la actividad metablica de una cepa de A. niger recombinante
durante cultivos fed-batch [11]. La glucosa en Streptomyces coelicolor cultivos ha sido objeto
de seguimiento con precisin mediante espectroscopia NIR [60]. El rendimiento de un proceso
de produccin en medios complejos para una lnea de clula animal recombinante ha sido
muy bien predicho mediante la combinacin de NIR y 2D espectroscopia de fluorescencia
[61]. Creemos que esta estrategia tambin describe una herramienta potencial para
bioprocesos con hongos filamentosos. Desafortunadamente, es difcil desarrollar modelos
fiables para los mtodos espectroscpicos. La biomasa y el caldo de absorbancia puede
ocultar absorbancia de otros analitos, y los picos en los espectros pueden superponerse;
muestras de filtrado tienen que ser analizados por separado con el fin de formular un modelo
para un determinado analito tecla [54,60]. Las relaciones entre la tensin, el inculo, la
morfologa, la reologa y el diseo de procesos con la fisiologa y la productividad son
complejas. Hasta la fecha, la tecnologa analtica de procesos fiable y verificada (PAT)
herramientas para el seguimiento in situ de bioprocesos de hongos filamentosos son todava
escasos. estrategias de muestreo en lnea que permite automatizar en tiempo real en lnea se
han sugerido medicin de parmetros para otros sistemas microbianos en los ltimos aos e
ilustrar la investigacin en curso en este campo (por ejemplo, [62]). Sin embargo, las tcnicas

de muestreo deben ser validados para cada aplicacin especfica [63]. Por otra parte, las
herramientas PAT que se han desarrollado para sistemas unicelulares no pueden ser
transferidos fcilmente a los hongos filamentosos debido a varias caractersticas especficas
de hongos, tales como la morfologa de crecimiento complejo o crecimiento de la pared
adherente que afecta el ensuciamiento de la sonda. Simplificado de modelado, mecanicista
presenta una estrategia alternativa para predecir y controlar la productividad, reologa, y la
morfologa [52]. En este contexto, un enfoque mecanicista de modelo de produccin de la
enzima en A. oryzae se ha basado en los parmetros hidrulicos comunes, incluyendo la
agitacin y regmenes de aireacin sino tambin 1st relaciones principales para la
estequiometra de reaccin, la transferencia de masa, y el caldo de la viscosidad [45]. El
modelo infiere precisin KPPS incluyendo la productividad, la viscosidad de caldo, y la
transferencia de oxgeno, as como la tasa de crecimiento especfica a diferentes regmenes
de cultivo.