1

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS

PROGRAMA DE QUMICA.

MANUAL DE LABORATORIO DE BIOQUMICA I

ABRIL DEL 2011

ACTUALIZACIN DE

MC LENY JUDITH LVAREZ ARAUJO

DR JORGE ALBERTO PREZ LEN

INTRODUCCIN
El curso de Bioqumica I tiene como propsito explicar las caractersticas
generales de las macromolculas y las reacciones que tienen lugar para su
metabolismo. En ese sentido, en el curso paralelo y complementario de laboratorio
se sientan las bases para el anlisis experimental que cubra con el propsito
general del curso.
En este Manual se describen prcticas cuya realizacin asegura que el Estudiante
aprenda los fundamentos de algunas de las tcnicas bioqumicas clsicas:
Especrofotometra y su uso en la cuantificacin de molculas de inters;
determinacin del pH de las soluciones y su efecto en el estado de las
macromolculas, anlisis por cromatografa y electroforesis y diseos
experimentales para evaluar cintica enzimtica y manipulacin de cidos
nucleicos.
Se enfatiza de manera especial en la comprensin de la correlacin entre
variables y cmo estas correlaciones representan procesos bioqumicos
susceptibles de cuantificarse y manipularse.
Las prcticas que se describen en este Manual son el resultado de la adaptacin
del Manual de Prcticas del Programa de Qumica, previamente elaborado por el
Qumico Hctor Reyes Leal, el Dr Gilberto Reyes Leal, la MC Katya Carrasco
Urrutia y el EQ David Reyes; as como de la adaptacin de diversos textos, que se
acreditan en la bibliografa general y en cada una de las prcticas.

BIBLIOGRAFA GENERAL
Chang, R. 2005. Physical Chemistry for the Biosciences. University Science Books.
Harris, DC. 2001. Anlisis Qumico Cuantitativo. 2da Edicin Editorial Revert.
Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. y Randall, R. J. (1951). Protein
meassurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.

Nelson DL, Cox MM 2006. Lehninger: Principios de Bioqumica. Cuarta Edicin.

Editorial Omega.
Manual de prcticas de laboratorio, Bioqumica y Biologa Molecular Departamento
de Bioqumica Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autnoma de Mxico.
2006.
Russell, David W.; Sambrook, Joseph 2001. Molecular cloning: a laboratory
manual. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory.

CONTENIDO
OBJETIVO GENERAL

INDICACIONES DE SEGURIDAD

ESPECTROFOTOMETRA

CROMATOGRAFA DE AMINOACIDOS EN CAPA FINA

DISOCIACIN DE AMINOCIDOS

10

DETERMINACION DEL PUNTO ISOELCTRICO DE LA ALBMINA

12

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE PROTENAS

13

ELECTROFORESIS EN GEL

15

CINTICA ENZIMTICA

17

ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURAS

19

AISLAMIENTO DE ADN PLASMIDICO POR LISIS ALCALINA

21

OBJETIVO GENERAL
El curso de Laboratorio de Bioqumica tiene como objetivo introducir al estudiante
al anlisis experimental que se aplica para explicar las caractersticas generales
de las macromolculas y las reacciones que tienen lugar para su metabolismo.
As, en este curso el alumno debe aprender los fundamentos de las tcnicas
bioqumicas clsicas y el diseo experimental para la deteccin, cuantificacin y
modificacin de las macromolculas.
INDICACIONES DE SEGURIDAD
Las medidas de Seguridad durante el curso de Laboratorio de Bioqumica son las
mismas que se indican para todos los cursos de Laboratorio del Programa de
Qumica, por lo que se recomienda al estudiante que aprenda stas al inicio de
cada curso.
De manera particular, se requiere que durante este curso el estudiante utilice
siempre propipetas y guantes, ya que las sustancias a usar durante algunos de los
experimentos son inhibidores metablicos (venenos). Se enfatiza asimismo, la
disposicin de estos materiales en contenedores especiales y no en las tarjas, y
siempre bajo la supervisin del Maestro de Laboratorio.

ESPECTROFOTOMETRA
Objetivo.- Aprender los fundamentos de la interaccin entre la radiacin
electromagntica y la Materia, y su aplicacin en el anlisis de molculas
FUNDAMENTO
La radiacin electromagntica comprende la oscilacin de la energa en campos
elctricos y magnticos en forma de ondas perpendiculares en el espacio. Con base
en la mecnica cuntica, sabemos que la materia y la energa son interconvertibles
y, as, cada tipo de radiacin tiene una naturaleza dual como onda y como partcula,
lo que le permite interactuar con el resto de la materia y as modificar su estructura y
propiedades. Dentro del espectro de radiacin electromagntica, un intervalo
pequeo corresponde a lo que conocemos como luz visible, mientras que la mayora
de las radiaciones electromagnticas son imperceptibles para nuestro sistema
sensorial.
La relacin de la luz visible con la materia, es decir, la absorcin de la luz por una
molcula, se describe mediante la ecuacin conocida como Ley de Lambert y Beer,
en la cual se correlacionan la concentracin de la molcula absorbente y la distancia
que recorre la luz dentro de este material:
Intensidad final de la luz =
Intensidad inicial[coeficiente de absorcin de la molcula*concentracin de la sustancia*distancia que recorre a luz]

Cada molcula tiene un coeficiente de absorcin especfico, expresado en unidades

de absortividad por concentracin de la molcula y, por convencin, se considera
que la distancia que recorre la luz en una muestra de absorbente es igual a 1
centmetro. La ecuacin descrita es til para calcular concentraciones de molculas
a partir de la intensidad o transmitancia de la luz que pasa a travs de ella.
MATERIAL.Solucin azul de Metileno 0.26 micromolar y naranja de Metilo 2.6 micromolar.
Tubos de ensaye de 15x160 mm
Pipetas de 10 ml.
Pipetas de 5 ml.
Celdillas para espectrofotmetro.
1 Gradilla.
Espectrofotmetro
DETERMINACION DE LOS ESPECTROS DE ABSORCION.
1.- Determinar los espectros de absorcin de cada una de las soluciones, leyendo
las absorbancia (A) correspondiente a cada una de las longitudes de onda del
espectrofotmetro, desde 400 hasta 700 nm; calibrando a cero con agua destilada.
2.- Seleccionar las longitudes de onda de mxima absorbancia para cada una de las
soluciones tipo.
PREPARACION DE CURVAS DE CALIBRACION PARA CADA SOLUCION TIPO.
1.- Preparar 4 diluciones para cada una de las soluciones tipo, utilizando agua
destilada como diluyente, y ordenar estas diluciones por concentracin .

2.- Leer la absorbancia de cada dilucin a la longitud de onda seleccionada en el

inciso anterior.
ANLISIS DE DATOS
Elaborar tablas para las lecturas a cada longitud de onda y su absorbancia, y para
cada concentracin y la absorbancia registrada.
Elaborar grficas de ejes cartesianos de la siguiente manera
a)
Para cada solucin inicial, la absorbancia en funcin de la longitud de onda,
detectar los valores correspondientes al pico de absorcin.
b)
Para cada dilucin de cada colorante, la absorbanci a en funcin de la
concentracin final; analizar la recta obtenida mediante la ecuacin general
de la recta (regresin lineal) y calcular el coeficiente de extincin molar para
cada colorante.
REFERENCIAS
http://www.chemkeys.com/bra/index.htm
http://www.micronal.com.br/artigostecnicos/glossario.pdf
Harris, DC (2001) Anlisis Qumico Cuantitativo. Ed Revert, 2da Edicin.

CROMATOGRAFA DE AMINOACIDOS EN CAPA FINA

Objetivo.- Aprender los fudamentos de la separacin por cramatografa con base
en las propiedades fisicoqumicas de los grupos radicales de los aminocidos.
FUNDAMENTO
La cromatografa es una de las tcnicas que pueden aplicarse para identificar y
caracterizar aminocidos. En las separaciones cromatogrficas, las molculas son
separadas dentro de una fase estacionaria y una fase mvil. La separacin
depende de la tendencia relativa de las molculas en la mezcla, de asociarse con
ms fuerza a una u otra fase.
Bsicamente en las cromatografas las muestras se aplican en una tira de
papel o placa fina (fase estacionaria) y se suspenden en un recipiente que
contiene al disolvente cromatogrfico (fase mvil); ste avanza sobre la fase
estacionaria, arrastrando los diferentes componentes de la muestra, a diferentes
velocidades que dependen de las caractersticas de polaridad, tamao, carga y
afinidad.
MATERIAL:
- Equipo para cromatografia de capa fina
- capilares
- soluciones de aminocidos
Cromatografa en capa fina.
Se proporcionaran alcuotas de estndares de distintos aminocidos.
1.- Trazar una lnea con lpiz sobre la placa a un centmetro de la base de
la placa (utilizar regla y guantes para manipular la capa fina).
2.- A esta altura, colocar una gota de cada uno de los estndares de
aminocido, manteniendo una separacin suficiente entre cada gota (ver figura);
se agregar adems, una alcuota de una solucin de aminocidos incgnita
(muestra problema).
3.- Dejar secar al aire (no soplar).
4.- Mientras tanto aadir el disolvente (fase mvil) de butanol:cido
actico;agua en proporciones de 40:10:50 respectivamente a la cmara
cromatogrfica y sellar sta con vaselina.
5.- Colocar las placas de cromatografa en la cmara, cuidando de no
empalmar una con otra. Las placas deben quedar con la muestra de aminocidos
en la parte inferior para hacer una cromatografa ascendente.
6.- Cerrar la cmara y dejar que ascienda el disolvente por la placa hasta
un poco antes que salga.
7.- Sacar las placas y marcar con lpiz hasta donde avanz el disolvente.
8.- Dejar secar la placa al aire durante unos minutos.
9.- Rociar toda la placa con la solucin de ninhidrina y calentar ligeramente
en la estufa hasta que se revele el color, indicando la presencia de los
aminocidos.
10.- Medir los frentes del disolvente y del soluto para cada mancha y
calcular sus respectivos Rf (relacin de frentes).

Rf= frente del soluto/frente del solvente.

11.- Comparar el Rf de los aminocidos estndares.
disolvente (fase mvil)

Frente de soluto

Esquema de una cromatografa ascendente en capa fina.

ANLISIS DE DATOS
a) Realizar una tabla en la que se anotar cada aminocido y su Rf.
b) Calcular el Rf de cada aminocido en la muestra problema, para deducir la
identidad de stos con base en su comparacin con las soluciones
conocidas.
c) Discutir el valor de Rf y con esto la movilidad de cada aminocido
correlacionando las caractersticas de su grupo R con la interaccin con la
fase mvil (disolvente).
Bibliografa
Nelson DL, Cox MM 2006. Lehninger: Principios de Bioqumica. Cuarta Edicin.
Editorial Omega.

10

DISOCIACIN DE AMINOCIDOS
Objetivo.- Comprender el comportamiento de los aminocidos como molculas
anfotricas y correlacionar esta propiedad con las caractersticas de los grupo
radicales.
FUNDAMENTO:
Los aminocidos son molculas que presentan la siguiente estructura qumica
genrica:
H
|
R
C - COO|
+
NH3
Los aminocidos contienen un carbn asmetrico (con excepcin de la glicina)
llamado carbono alfa, al cual se le unen cuatro radicales que son:
- un grupo carboxilo (COO-)
- un grupo amino (+NH3)
- un tomo de hidrgeno (H) y
- un radical de composicin variable que permite diferenciar a los aminocidos
(R), llamado cadena lateral.
Debido a las caracteristicas fisicoqumicas de la cadena lateral, es posible
relacionar su posicin, dentro de la estructura proteca ya que si es de
caracteristicas no polares (hidrofbico), al contacto con el agua tender a plegarse
dentro de la cadena polipeptdica; o si es de caractersticas polares (hidroflico),
tender a interactuar con el agua. Desde luego, para saber cual es la estructura de
la cadena lateral debemos de conocer cual es el pH de la solucin ya que
dependiendo del pH la cadena lateral estar protonada (H+) o desprotonada, este
parmetro se puede conocer utilizando los pKa de cada aminocido y la ecuacin
de Henderson-Hasselbach lo cual permite determinar cual es la estructura
predominante a un pH dado; por ejemplo:

H
H
H
|
pk1
|
pK2
|
R - C - COOH -----> R - C - COO- ------> R - C - COO|
|
l
+
+
NH3
NH3
NH2
pH = cido

pH = alcalino

Los cambios de carga observados en el aminocido mostrado, dependen del pH

en que se encuentre, como se observa en la figura anterior, bajo condiciones cidas
el aminocido est totalmente protonado y en condiciones alcalinas est totalmente
desprotonado, esto se debe a que los aminocidos son cidos dbiles y por lo tanto
tienen una constante de disociacin por cada grupo o radical capaz de comportarse
11

como cido o base dbil. Esto permite conocer el punto isoeltrico de un

aminocido, el cual se define como el pH en el cual la carga neta es cero (cmo se
le llama a este estado del aminocido?).
Los aminocidos que son utilizados para la sntesis de protenas son 20, los
cuales se les ha identificado como aminocidos naturales y los no naturales son los
que an cuando siendo aminocidos, no forman parte estructural de las protenas
(no estn representados en el cdigo gentico).
En esta prctica se revisar el comportamiento inico de los aminocidos en
solucin por medio de su disociacin en funcin del pH.

MTODO
Material:
2 vasos de precipitados de 100 ml
1 bureta, soporte y pinzas
2 pipetas de 5 ml de 10 ml
piseta .
Equipo: pHmetro, agitador magntico con imanes de agitacin.
Soluciones: glicina 0.1 M, cido asprtico 0.1 M, NaOH 0.1 N, HCl 0.1 N.
Procedimiento:
Cargar cada bureta con las soluciones de NaOH 0.1 N y HCl 0.1 N
Colocar 30 ml de la solucin de glicina 0.1M en vaso con un imn de agitacin,
llevar al agitador y medir el pH; en agitacin constante, agregar gota a gota la
solucin de NaOH 0.1N y registrar el pH, continuar el procedimiento hasta titular
completamente (pH bsico).
Repetir el procedimiento con un nuevo volumen de glicina 0.1 M y titular con la
solucin de HCl 0.1N.
Repetir todo el procedimiento con un volumen de 30 ml de cido asprtico.
ANLISIS DE DATOS
a) Elaborar una grfica en ejes cartesianos con el valor de pH del aminocido
bajo titulacin en funcin del volumen equivalente del cido y de la base
utilizado para la titulacin.
b) Determinar en la grfica de titulacin los valores de punto isoelctrico del
aminocido titulado, y las zonas de amortiguamiento.
BIBILIOGRAFA
Chang, R. Physical Chemistry for the Biosciences. University Science Books. CA,
USA, 2005.pp 676.

12

DETERMINACION DEL PUNTO ISOELCTRICO DE LA ALBMINA

Objetivo.- Analizar el comportamiento de las protenas como molculas anfotricas
y correlacionar sus propiedades fisicoqumicas con su comportamiento en solucin.
FUNDAMENTO:
Los factores que pueden afectar la solubilidad de una protena son: La fuerza
inica del medio, el pH. la temperatura y la constante dielctrica del disolvente. En
particular, los cambios de pH modifican la solubilidad de una protena de la misma
forma en que afectan el equilibrio cido base de los grupos radicales de los
aminocidos; de tal manera que puede determinarse el punto isoelctrico de una
protena con base en la solubilidad que presente.
MATERIAL.1.- 13 tubos de ensaye de 10 X 150 mm
2.- 1 pipeta de 10 ml
3.- 5 pipetas de 5 ml
4.- 1 pipeta de 5 ml
5.- 1 gradilla
METODO.Determinacin del punto Isoelctrico de la albmina por adicin de un cido.
Preparar una serie de tubos como se indica a continuacin:
pH

Agua destilada (ml)

8.8
8.5
8.0
7.0
5.0
1.0

Ac. Acetico 0.1 N

(ml)
0.2
0.5
1.0
2.0
4.0
8.0

Albuminato de Sodio 0.1N

(ml)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0

Mezclar bien y observar los cambios que presente la solubilidad de la albmina en

cada tubo, adems de medir el pH mediante el potencimetro.
Experimento No. 2
Determinacin del punto Isoelctrico de la albmina por titulacin.
1.- Colocar 30 ml de la solucin de albuminato en un vaso de precipitados
2.- Titular con bureta con una solucin de HCl 0.1N, anotar el pH en que la protena
es insoluble.
ANLISIS DE DATOS
a) Elaborar una grfica en ejes cartesianos del valor de pH de la solucin de
albuminato en funcin del volumen agregado de HCl.
b) Deducir de esta grfica el punto isoelctrico de la albmina por deteccin de
su insolubilidad.
Bibliografa
Nelson DL, Cox MM 2006. Lehninger: Principios de Bioqumica. Cuarta Edicin.
Editorial Omega.

13

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE PROTENAS

Objetivo.- Aprender los fundamentos fisicoqumicos para la cuantificacin de
protenas y comparar diferentes mtodos
INTRODUCCIN
Existen diversas tcnicas de deteccin y cuantificacin de protenas que varan en
cuanto a su sensibilidad (concentracin mnima que pueden detectar). Dos de las
reacciones ms utilizadas son la de Biuret y su modificacin conocida como el
mtodo de Lowry. En ambas reacciones, el sulfato de cobre alcalino reacciona con
compuestos que contienen dos o ms enlaces peptdicos, ya que el radical
carbamilo que se forma en el enlace peptdico es muy afn a los iones de cobre. En
esta prctica se comparar la sensibilidad de ambos mtodos en la cuantificacin
de la concentracin de protenas.
MATERIAL
30 tubos de ensaye
Gradilla
2 vasos de precipitados de 100 ml
Pipetas de 1 ml
Pipetas de 10 ml
Las soluciones se proporcionarn en el laboratorio
Preparar una serie de tubos de acuerdo a las siguiente tablas, siguiendo la
secuencia:
Agua
Albmina muestra problema
Reactivo de biuret
Incubar 10 minutos
Reactivo de Folin y agitar vigorosamente
Incubar 20 minutos

14

#T

dH2O

1
2
3
4
5
6
7
8

1.000
0.975
0.950
0.925
0.900
0.980
0.980
0.980

BSA 10
mg/ml
(ml)

Protena
problema
(ml)

0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
-------------

--------------------0.020
0.020
0.020

Biuret
(ml)

5
5
5
5
5
5
5
5

Folin
(ml)

0
0
0
0
0
0
0
0

#T

1
2
3
4
5
6
7
8

#T

1
2
3
4
5
6
7
8
9
#T

1
2
3
4
5
6
7
8
9

dH2O

BSA 10
mg/ml
(ml)

Protena
problema
(ml)

Biuret
(ml)

Folin
(ml)

1.000
0.975
0.950
0.925
0.900
0.980
0.980
0.980

0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
-------------

--------------------0.020
0.020
0.020

5
5
5
5
5
5
5
5

dH2O

BSA 1
mg/ml
(ml)

Protena
problema
(ml)

Biuret
(ml)

Folin
(ml)

1.000
0.975
0.950
0.925
0.900
0.875
0.980
0.980
0.980

0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
-------------

------------------------0.020
0.020
0.020

5
5
5
5
5
5
5
5
5

0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5

dH2O

BSA 1
mg/ml
(ml)

Protena
problema
(ml)

Biuret
(ml)

Folin
(ml)

1.000
0.975
0.950
0.925
0.900
0.875
0.980
0.980
0.980

0.000
0.025
0.050
0.075
0.100
0.125
-------------

------------------------0.020
0.020
0.020

5
5
5
5
5
5
5
5
5

0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5

0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5

Al finalizar las incubaciones, se leer la absorbancia de los tubos a 500 nm,

utilizando el tubo #1 como blanco.
ANLISIS DE DATOS
a) Con los datos de absorbancia de cada tabla, realizar una grfica de la
absorbancia en funcin de la concentracin final de protena utilizando los
valores de los tubos 1 al 6; ajustar la recta resultante con la ecuacin
general de la recta.
b) Deducir la concentracin de protena presente en las muestras problema a
partir del ajuste lineal.
c) Comparar la concentracin mnima de protena detectada por cada mtodo.
BIBLIOGRAFA
1) Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. y Randall, R. J. (1951). Protein
meassurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, p265-275.

15

ELECTROFORESIS EN GEL
Objetivo.- Aprender el fundamento del anlisis de la composicin proteca por
medio de la determinacin de la masa molecular.
FUNDAMENTO
La electroforesis en gel es uno de los mtodos usados con mayor frecuencia para
separar a las protenas dentro de una muestra. El principio del mtodo consiste en
aprovechar la movilidad de las protenas en un campo elctrico homogneo (el
gel), dentro del cual la separacin ocurre por un desplazamiento diferencial
determinado por la masa molecular de cada protena. En esta prctica se
realizar la separacin de una muestra patrn de protenas mediante
electroforesis en un gel de poliacrilamida.
Material
Pipetas de 1, 5 y 10 ml (2 de cada una)
2 vasos de precipitados de 50 100 ml
Soluciones (se proporcionarn en el laboratorio)
Buffer Tris 1.5 M pH 8
Buffer Tris 0.5 M pH 6.8
Acrilamida/bis acrilamida 30 % en agua
Lauril sulfato de sodio (SDS) 10% en agua
Persulfato de amonio 1% en agua
TEMED
Equipo (se proporcionar en el laboratorio)
Cmaras de electroforesis, vidrios corto y largo, separadores, peines y fuente de
poder
Mtodo
NOTA: LA ACRILAMIDA/BIS ACRILAMIDA ES TXICA Y LETAL, DEBE
MANEJARSE SIEMPRE CON GUANTES
1.-Preparacin de los geles (mezclas a realizar en los vasos de precipitados)
Gel separador
3.35 ml de H2O
2.5 ml de Tris 1.5 M pH 8
0.1 ml de SDS 1%
4 ml acrilamida/bis acrilamida 30%
0.05 ml de persulfato de amonio
0.005 ml de TEMED
La mezcla debe vertirse al molde (vidrios) inmediatamente despus de prepararse,
hasta llegar a un centmetro de la parte superior del vidrio corto.
Los vidrios forman el modelo en donde se polimeriza el gel para separar a las
protenas. El montaje de los vidrios consiste en colocarlos uno encima del otro. A
continuacin se monta a las dos placas en el marco de hule y as se vaca la
mezcla del gel. El gel concentrador se prepara despus de que ha polimerizado el
gel separador.
Gel concentrador
3 ml H2O
1.25 ml Tris 0,5 M pH6.8
0.05 ml SDS 1%
0.7 ml de acrilamida/bisacrilamida 30%
16

0.025 ml persulfato de amonio 1%

0.005 ml TEMED
Se vierte la mezcla del gel concentrador sobre el gel concentrador polimerizado,
inmediatamente despus se coloca el peine entre la parte superior de los vidrios, y
ste se retirar hasta que polimerice el gel concentrador.
Mientras se preparan las muestras a colocarse en el gel, diluyendo en una
proporcin 1:1 con buffer de carga. Al quitar el peine se forman los pozos en
donde se colocar a la muestra preparada; esto se har con una micropipeta
automtica, agregando 20 microlitros de cada muestra en cada carril. En cada gel
debe haber una muestra de una solucin que contiene una serie de protenas bien
caracaterizadas en cuanto a su masa molecular (patrn de pesos moleculares). Al
finalizar de colocar las muestras , los vidrios se introducen en la cmara de
electroforesis.
La cmara se llena con buffer de corrida y se conecta a la fuente de poder.
Se enciende la fuente de poder a un voltaje de 120 Voltios, se finaliza la corrida
hasta que el frente de migracin salga del gel.
Se desmonta al gel separando los vidrios dentro de un recipiente o refractario
lleno de agua; despus, con ayuda de un papel filtro se traslada al gel a la
solucin de tincin, en la que permanece por 15 minutos. Al trmino de la tincin,
se saca al gel, se enjuaga en agua y se destie en una mezcla de cido acticoalcohol-agua. La destincin continuar hasta que sea evidente la presencia de las
protenas, en forma de bandas. Posteriormente, se traslada al gel a un recipiente
con agua y se coloca sobre un papel filtro, para manipularse. Se debe medir la
distancia de desplazamiento de cada banda en cada carril, y se calcula el
coeficiente de migracin (Rf), al dividir la distancia de desplazamiento de cada
banda entre la longitud total del gel.
ANLISIS DE DATOS
a) Anotar en una tabla el Rf de cada protena del marcador de peso molecular
y su masa.
b) Realizar una grfica en ejes cartesianos del Rf de cada protena en funcin
del logaritmo de su peso molecular, ajustar la lnea resultante con la
ecuacin de la recta.
c) Deducir el peso molecular de cada protena detectada en la muestra
problema a partir de su Rf.
Bibliografa
Nelson DL, Cox MM 2006. Lehninger: Principios de Bioqumica. Cuarta Edicin.
Editorial Omega.

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CINTICA ENZIMTICA

Objetivo.- Analizar la actividad enzimtica en trminos de cintica molecular

FUNDAMENTO:
La cintica qumica es el estudio de la velocidad de cambio que existe entre el
estado inicial de los reactantes y los productos y el estado final. La velocidad es
expresada en trminos de cambios de concentracin de sustrato o producto por unidad de
tiempo, esto se puede seguir, determinando la desaparicin de reactantes, o la aparicin
de productos en funcin del tiempo. Es particularmente importante hacer notar que
constantemente hay cambios en la velocidad de reaccin conforme procede la reaccin
hasta llegar al equilibrio, una vez alcanzado ste, los cambios de velocidad son iguales a
cero.
El determinar la velocidad de una reaccin no revela nada acerca de la
Estequiometria de los reactantes y productos ni del mecanismo de la reaccin.
En la mayora de las reacciones enzimticas al seguir su comportamiento cintico
se pueden obtener generalmente varios rdenes de reaccin; al examinar la curva de
velocidad responde en forma caracterstica a los aumentos de concentracin de sustrato:
1).- A muy bajas concentraciones de sustrato el comportamiento de velocidad con
respecto a la concentracin de sustrato es esencialmente lineal, esto es, la velocidad es
directamente proporcional a la concentracin de sustrato y en esta regin se presenta la
cintica de primer orden.
2).- -En la etapa final de la curva observamos que la velocidad es esencialmente
independiente de la concentracin de sustrato, aqu la cintica es de orden cero.
3).- En la parte intermedia de la curva se presenta una mezcla de rdenes de reaccin, ya
que se observan cambios en la velocidad de reaccin pero no siguen una constante de
proporcionalidad.
Este tipo de estudio cintico fue desarrollado por primera vez por MichaelisMenten y formularon la siguiente ecuacin:
v = Vmax (S)
Km+(S)
donde las constantes Vmx y Km son caractersticas para cada enzima bajo ciertas
condiciones.
En forma prctica es difcil determinar el valor de Km de una curva de saturacin
de sustrato, pero se puede recurrir a la grfica de Lineweaver-Burk que utiliza los
recprocos de velocidad y sustrato, sta tiene la ventaja de dar valores de Km y Vmax.
estadsticamente ms significativos con tan slo 6 a 8 datos experimentales.
En los experimentos a realizar se van a observar los efectos de la concentracin de
sustrato y concentracin de enzima sobre la actividad enzimtica en una reaccin. Se
medir la actividad de la invertasa, una enzima hidroltica que acta sobre la sacarosa (un
disacrido) liberando glucosa y fructosa. La actividad de la enzima se mide al cuantificar
los productos, hacindolos reaccionar con el reactivo de 3,5-dinitrosalicilato.y midiendo
por espectrofotometra.
MATERIAL:
15 tubos de ensaye, una gradilla
3 pipetas de 1.0 ml., 2 pipetas 5.0 ml.
un bao de agua a 37 C, un bao de agua a ebullicin.
Solucin de glucosa 2.5 mM-fructosa 2.5 mM

18

Solucin de sacarosa 0.025 M en amortiguador acetato de Na+ 25 mM pH 4.5.

amortiguador acetato de Na+ 25 mM pH 4.5
solucin de 2,3 dinitro-salicilato.

METODO:
Curva patrn de monosacridos
Tubo
1
2
3
4
5
6
7

solucin glucosa-fructosa ml

0
0.1
0.2
0.4
0.6
0.8
1

Agua ml
2
0.9
0.8
0.6
0.4
0.2
0

3,5-dinitrosalicilato ml

2
2
2
2
2
2
2

Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin durante 5 minutos, agregar 8 ml de agua

y leer a 540 nm., ajustando a cero con el tubo 1
Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica.
Preparar los siguientes tubos
tubo
1
2
3
4
5
6
7

sacarosa 0.025 M / amortiguador

acetato ml
0
0.5
1
2
4
8
10

amortiguador acetato ml

enzima ml

10
9.5
9
8
6
2
0

1
1
1
1
1
1
1

Mezclar e incubar a 35C durante 20 minutos.

Detener la incubacin y agregar 2 ml de 3,5-dinitrosalicilato y leer a 540 nm, ajustando a
0 con el tubo 1.
ANLISIS DE DATOS
Calcular la concentracin de monosacridos en cada tubo, esa es la cantidad de producto
de reaccin enzimtica; referirla al tiempo de incubacin para calcular la velocidad inicial
de la actividad enzimtica a cada concentracin de sustrato (cada tubo).
Hacer la grfica velocidad de reaccin contra velocidad de sustrato y la grfica de los
recprocos (LineWeaver-Burk) para calcular los parmetros cinticos.
Bibliografa

Nelson DL, Cox MM 2006. Lehninger: Principios de Bioqumica. Cuarta Edicin.

Editorial Omega.
Manual de prcticas de laboratorio, Bioqumica y Biologa Molecular Departamento
de Bioqumica Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autnoma de Mxico.
2006.

19

ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURAS

(Prctica adaptada del Manual de prcticas de laboratorio, Bioqumica y Biologa Molecular
Departamento de Bioqumica Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autnoma de Mxico.)

Objetivo.- Analizar el metabolismo celular por medio de la variacin en los

parmetros fisicoqumicos del medio
FUNDAMENTO
Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que
en la membrana plasmtica tienen una ATPasa de H+ que acopla la hidrlisis del
ATP con el bombeo de protones hacia afuera de la clula. Esta enzima es
semejante desde un punto de vista estructural y funcional a la ATPasa de Na+/K+
de las clulas animales y, al igual que sta, se inhibe con concentraciones
micromolares de vanadato. Como resultado de la actividad de la ATPasa de H + en
la levadura, se genera un gradiente electroqumico de protones que se utiliza para
impulsar el transporte de nutrientes al interior de la clula por sistemas de
transporte simportadores o uniportadores. La ATPasa de H + consume hasta un 25
% del ATP que se sintetiza en la clula.
Adems de esta ATPasa de H+ de la membrana plasmtica, las levaduras
tienen otra bomba de protones en la membrana interna de las mitocondrias, la
ATP sintasa, que se encarga de la sntesis del ATP. En contraste con la enzima de
membrana plasmtica, el flujo de protones a travs de la ATP sintasa induce la
sntesis de ATP. Uno de los inhibidores ms efectivos de esta enzima es la
oligomicina.
El ciclo de ATP en la levadura se completa cuando el ATP que se sintetiza
en la mitocondria por medio de la ATP sintasa, se consume a nivel de la
membrana plasmtica, cuando la ATPasa de H+ lo hidroliza para bombear
protones al exterior de la clula.
El objetivo de esta prctica es correlacionar el consumo de glucosa por las
levaduras, con la variacin en pH extracelular, como una medida del bombeo de
protones que ocurre durante el proceso.
Material
Tres vasos de precipitados de 100 ml.
Pipetas de 5 y 10 ml.
Potencimetro.
Levadura (Saccharomyces cerevisiae)
200 mg/ml.
Solucin de glucosa (10%).
Solucin de dinitrofenol 40 mM en
etanol.
Solucin de azida de sodio 400 mM.
Experimento 1 (control)
1 .Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Determinar el pH de la solucin y repetir la medicin dos veces ms con
intervalos de 3 minutos para obtener la lnea basal.
20

3. Adicionar 5 ml de glucosa a 10 %, agitar y medir el pH.

4. Determinar el pH de la solucin cada 5 minutos, 4 veces, y luego cada 10
minutos 2 veces ms.
EXPERIMENTO 2 (DINITROFENOL)
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Aadir por decantacin (no pipetear) 0.2 ml de la solucin de dinitrofenol 40 mM
para una concentracin final de 200 M.
3. Determinar el pH de la solucin y repetir la medicin dos veces ms con
intervalos de 3 minutos para obtener la lnea basal.
4. Incubar 5 minutos
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.
EXPERIMENTO 3 (AZIDA)
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Aadir por decantacin (no pipetear) 0.5 ml de la solucin de azida de sodio 400
mM, concentracin final de 5 mM. Agitar con cuidado.
3. Determinar el pH de la solucin y repetir la medicin dos veces ms con
intervalos de 3 minutos para obtener la lnea basal.
4. Incubar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.
ANLISIS DE RESULTADOS
Llenar la siguiente tabla
pH
AZIDA DE SODIO

TIEMPO (min)
GLUCOSA
DINITROFENOL
0
5
10
15
20
30
40
1. Realizar una grfica de ejes cartesianos para cada uno de los experimentos;
con los valores de pH en funcin del tiempo.
2. Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control, con
dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio com inhibidor de la cadena
de transporte de electrones de la mitocondria.
Bibliografa
Manual de prcticas de laboratorio, Bioqumica y Biologa Molecular Departamento
de Bioqumica Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autnoma de Mxico.
2006
Nelson DL, Cox MM 2006. Lehninger: Principios de Bioqumica. Cuarta Edicin.
Editorial Omega.

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AISLAMIENTO DE ADN PLASMIDICO POR LISIS ALCALINA.

Objetivo.- Aprender los fundamentos para el aislamiento y el anlisis de la
molcula de ADN.
FUNDAMENTO
Los plsmidos o vectores son molculas de ADN extracromosmico circular que
se replican y transcriben independientemente del ADN cromosmico. Se
encuentran normalmente en bacterias y en algunas ocasiones en levaduras. Su
tamao puede ir desde 1 hasta 250 kb, y en nmero de copias puede haber desde
1 hasta 100, dependiendo del tipo de plsmido.
Los plsmidos usados en ingeniera gentica son llamados vectores. Son
herramientas importantes y normalmente son usados para multiplicar o expresar
genes especficos. El gen de inters es insertado en las copias de este plsmido,
el cual adems contiene genes que le dan una resistencia especifica a algn
antibitico, y un sitio mltiple de clonacin (polilinker); esta es una regin corta que
contiene varios sitios en los que puede cortarse por enzimas de restriccin, y
permite la fcil insercin de fragmentos de ADN. Posteriormente el plsmido es
insertado en una bacteria mediante un proceso llamado transformacin, estas
bacterias son crecidas en grandes cantidades y listas para lisarse (mediante lisis
alcalina) para aislar el plsmido de inters.
MATERIAL
Soluciones:
Solucin I: Buffer GET (glucosa 20mM, tris base 25mM, EDTA 10mM)
Solucin II: mezcla ltica (SDS 1%, NaOH 0.2N)
Solucin III: acetato de sodio 3M pH 4.8
METODO:
De un cultivo de 10 ml centrifugar 10 minutos a 14000 rpm, descartar el
sobrenadante.
Aadir 1 ml de buffer GET para re suspender y pasar a un tubo eppendorf
de 1.5 ml. Centrifugar a 14000 rpm por 2 minutos, descartar el
sobrenadante.
Agregar 100 microlitros de solucin GET y resuspender, incubar 10 minutos
a T. amb.
Aadir 5 ul de RNAsa y dar vrtex
Agregar 200 microlitros de solucin II e incubar en hielo por 10 minutos
Aadir 150 microlitros de solucin III e incubar en hielo por 20 minutos,
centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
Pasar el sobrenadante a otro tubo y aadirle un volumen igual de
isopropanol
Mezclar y centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
Descartar el sobrenadante
Agregar 500 microlitros de etanol 75% mezclar y centrifugar a 14000 rpm
por 10 minutos
22

Descartar el sobrenadante y dejar secar

Re suspender en 40 microlitros de agua
Almacenar a -20C, correr en gel de agarosa al 1%

Preparacin de gel de agarosa 1%

Pesar 0.35 g de agarosa, pasarlo a un matraz y agregar 35 ml de buffer
TAE 1X (Tris, Acido actico, EDTA).
Calentar para disolver la agarosa (hasta que quede transparente la
solucin).
Dejar enfriar un poco y aadir 4-5 gotas de bromuro de etidio.
Vaciar al molde, colocar el peine y dejar enfriar completamente.
Mezclar 3ul de DNA con 1microlitro de buffer de carga. Cargar la muestra
en el pozo.
Dejar correr a 100 volts por aproximadamente 30 minutos.
Ver en el transiluminador y tomar foto.
ANLISIS DE RESULTADOS
a) Identificar en el gel el plsmido y correlacionar su tamao con los
marcadores de pares de bases.
Bibliografa
Russell, David W.; Sambrook, Joseph 2001. Molecular cloning: a laboratory
manual. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory.

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