Tcnicas e teoria de Biologia Molecular referentes

ao artigo The human transcriptome across tissues

and individuals.

Amanda Lopes Santiago

Kelly Cristine Borsatto
Disciplina: Biologia Molecular
Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

So Jos do Rio Preto

2016
A regulao da transcrio e os processos ps transcricionais so fatores importantes
para a expresso do fentipo do organismo. No artigo, os autores propuseram retratar a
expresso gnica e a regulao transcricional em diferentes tipos de tecido e identificar como
que em um organismo composto por clulas com o mesmo material gentico estas apresentam
padres diferentes de expresso e compe os diferentes tecidos com suas caractersticas e
especificidades do organismo humano. Foi observado que tecidos exibem traos gnicos de
caractersticas transcricionais para essa diferenciao e essas so determinadas por um pequeno
nmero de genes com expresso interindividual.
A poro do genoma de um organismo que atua como molde para a sntese de RNA
conhecida como transcriptoma (ALBERTS, 2010). Compreender o transcriptoma essencial
para interpretar os elementos funcionais do genoma; revelar os constituintes moleculares de
clulas e tecidos nos diferentes estgios de desenvolvimento; compreender os elementos
presentes no desenvolvimento de doenas (WANG et al. 2009).
Vrias tecnologias foram
desenvolvidas para quantificar e deduzir o transcriptoma. No entanto, estes mtodos tm vrias
limitaes, que incluem: dependncia de conhecimento existente sobre a sequncia do genoma;
elevados nveis de fundo devido hibridizao cruzada; e uma gama limitada de deteco
devido ao fundo e a saturao de sinais.
O Genotype-Tissue Expression (GTEx) um projeto de organizao internacional que
realiza pesquisas acerca da expresso gnica para a analisar as diferentes expresses. As
recentes pesquisas visam integrar o estudo dos tecidos em indivduos simultaneamente e ao
identificar as expresses nos tecidos em grupos humanos comparado idade, raa, gnero e etnia
pode-se propor o estudo de doenas hereditrias relacionadas aos tecidos, como e quando estas
ocorrem e como a regulao e expresso gnica contribuem no processo para deteco prvia
destas. O GENCODE um projeto de pesquisa integrado que visa compreender as
caractersticas genticas, regies codificantes de protenas com variantes de splicing
alternativos, loci no-codificantes com evidncias de transcrio e pseudogenes.
Para anlises da expresso gentica nos diferentes tecidos e como os padres de variao
do transcriptoma so associados aos fentipos humanos, os autores do artigo utilizaram a base
de dados do GTEx de material congelado processado por meio de RNA-seq de 1641 amostras de
175 indivduos, sendo 29 rgos slidos, 11 sub-regies do crebro, sangue total, clulas
Epstein-Barr e cultura de fibroblastos da pele. Utilizaram das leituras feitas pelo projeto
GENCODE para quantificar os genes codificadores de protenas, RNAs no codificantes.
A transcrio forma fitas de RNA mensageiro e essas fitas podem ser responsveis pela
produo de diversas molculas proteicas. Ento, cada gene pode ser transcrito e traduzido sob
expresses diferentes (frequncias diferentes), a clula pode produzir grande quantidade de uma
protena e baixa quantidade de outra.
A sntese de mRNA um processo com de trs fases marcadas. A primeira fase
composta pelo complexo da RNA-polimerase. A regio de incio de transcrio do DNA
reconhecida e o complexo da enzima RNA-Polimerase inicia rompendo as ligaes de
hidrognio entre os pares de base, permitindo acesso as fitas moldes. Aps isso, ocorre o escape
do promotor, uma sntese de RNAs curtos que geram um incio abortivo para posteriormente a
enzima, RNA-polimerase, entrar na fase de alongamento, deslocando ao longo do gene abrindo
a fita de DNA e recompondo no sentido da transcrio adicionando ribonucleotdeos. Nesta
etapa j atua na correo dos nucleotdeos inseridos erroneamente.

A regulao pode ocorrer em vrias das etapas da expresso gnica resultando na

produo de protenas diferentes em diversos tipos de clulas ou estgios do desenvolvimento,
ou em resposta a condies externas. No artigo, foi visto que apesar de ocorrerem regulaes em
todas as etapas da expresso gnica, a iniciao e a elongao so as etapas cruciais que
determinam a expresso ou no do gene e quantificar a produo de mRNA e protenas.
Muitos genes eucariticos so, portanto, mosaicos compostos por blocos com sequncias
codificadoras separadas entre si por blocos com sequncias no codificadoras, xons e ntrons
respectivamente. Ao serem transcritos em uma molcula de RNA, os ntrons devem ser
removidos e os xons, unidos para criar um mRNA para o gene. Alguns pr-mRNAs podem ser
processados de mais de uma maneira. Assim, mRNAs contendo diferentes grupos de xons
podem ser gerados a partir de um mesmo pr-mRNA. Esse processo denominado splicing e,
por meio dessa estratgia, um gene pode dar origem a mais de um produto polipeptdico. Esses
produtos alternativos so chamados de isoformas.(WATSON, 2015)
O desenvolvimento de tcnicas de alto rendimento de sequenciamento de DNA forneceu
a metodologia para o mapeamento e quantificao de transcriptomas. Este mtodo, denominado
RNA-Seq, tem vantagens claras sobre as abordagens j existentes e modificam a maneira pela
qual transcriptomas eucariticos so analisados, alm de fornecer uma medida muito mais exata
dos nveis de transcritos e suas isoformas que outros mtodos.
RNA-Seq uma abordagem que analisa o perfil transcriptoma atravs de tecnologias
deep-sequencing. Em geral, uma populao de RNA (totais ou fraccionados, tais como poli (A)
+) convertida para uma biblioteca de fragmentos de cDNA (DNA complementar), uma
molcula de DNA sintetizada como uma cpia de mRNA e, portanto, sem os ntrons que esto
presentes no DNA genmico, com adaptadores ligados a uma ou ambas as extremidades. Cada
molcula, com ou sem amplificao, ento sequenciada de um modo de elevado rendimento
para se obter sequncias curtas de uma extremidade (sequenciao de um nico final) ou ambas
as extremidades (sequenciao de paired-end). As leituras so tipicamente de 30-400 pb. Em
princpio, qualquer tecnologia de sequenciao de alto rendimento pode ser utilizado para o
RNA-Seq, e o Ilumina IG, Applied Biosystems SOLiD 2 e Roche 454 Life Science so sistemas
que j foram aplicados para este propsito.
Para evitar erros na montagem de RNA, preciso retirar o passo de amplificao por
PCR. J possvel fazer o sequenciamento sem amplificao usando as plataformas Helicos e
Pacific Biosciences. O sequenciamento atravs de uma nica molcula tambm possvel,
porm essas tecnologias ainda sofrem com a alta taxa de erro. Cuidados particulares devem ser
tomados nos experimentos de RNA-Seq para garantir uma alta qualidade na montagem do
transcriptoma. Na fase de anlise de dados, as leituras curtas so pr-processadas para remover
erros de sequenciamento e outros artefatos. As leituras so subsequentemente montadas nos
RNAs originais e ento sua abundncia avaliada.
Para montagem do transcriptoma usa-se estratgias baseadas em trs categorias que so:
estratgia baseada em referncia; estratgia De Novo; estratgia combinada.
A estratgia de referncia utilizada quando existe um genoma de referncia, assim o
transcriptoma pode ser construdo a partir dele. Esse mtodo inclui trs passos: alinhamento das
leituras sobre o genoma de referncia; as leituras sobrepostas em cada locus so agrupadas para
construir um grfico de todas as isoformas possveis; o grfico analisado para resolver
isoformas individuais. Este mtodo pode produzir um grande conjunto de transcritos de um
locus.
A estratgia De Novo no utiliza um genoma de referncia, se utiliza da redundncia das
leituras para encontrar sobreposies entre as leituras. semelhante montagem de genoma.
A estratgia combinada uma combinao dos dois mtodos que pode ser utilizada. O
alinhamento tem a vantagem da sensibilidade, o De Novo para encontrar transcritos novos e
trans-spliced. Quando o genoma de referncia tem baixa qualidade, a montagem do De Novo

pode ser feita primeiro, os contigs (conjunto de sobreposio de segmentos de DNA que, juntos,
representam uma regio de consenso de DNA) e singlets (sequncias que foram determinados
para no se sobrepor com qualquer outra sequncia no conjunto de dados de entrada) so
alinhados no genoma e as lacunas podem ser preenchidas com informaes do genoma.
Outra tcnica utilizada que vale citar a de microarray, que eficaz em permitir uma
viso global na busca de padres de expresso gnica em amostras biolgicas. Por meio da
determinao da expresso de milhares de genes simultaneamente, a tcnica permite a
comparao do comportamento molecular de diversos tipos de linhagens celulares e tecidos
diferentes, quando expostos a uma determinada condio patolgica ou experimental.
O princpio da tcnica baseia-se na propriedade de hibridizao por complementaridade
dos cidos nuclicos e no fato das sondas no array apresentarem sequncias similares s dos
genes de interesse, e complementares s do RNAm ou s do DNAc (DNA complementar),
dependendo da tecnologia utilizada.
A tcnica envolve a converso do RNA total obtido a partir do tecido de interesse em
DNAc dupla-fita por meio de uma reao de transcriptase reversa. Em seguida, o DNAc serve
de molde para uma reao de transcrio in vitro na presena de nucleotdeos marcados com
fluorforos, resultando no RNAc (RNA complementar) marcado. Essas molculas marcadas so
hibridizadas lmina de microarray e podem se ligar ou no s sondas representadas no mesmo,
se ambas as sequncias forem complementares. A lmina hibridizada ento corada e submetida
a um scanner, conectado a um software especfico que analisa os dados e quantifica a
intensidade da fluorescncia em cada ponto. O sinal gerado representa a ligao do RNAc
proveniente da amostra em estudo com a sonda no array, e tende a ser proporcional abundncia
do RNAc presente, at certa concentrao de transcritos.
Ao utilizar as tcnicas e as anlises dos dados, foi observado que para a maioria dos
tecidos a maior parte da transcrio tem origem mitocondrial, como nos rins, em outros mostram
domnio de expresso nuclear, por exemplo, no sangue. Menos de 200 genes so expressos em
um dado tecido, isso pode resultar num baixo nvel de transcrio primria comum a todos os
tipos de clula, resultando na heterogeneidade do tecido geral com poucas especificidades entre
os tecidos. Tambm foi observada a repetio de elementos correlacionada com a expresso do
elemento mais prximo, o que tambm recapitula tipos de tecido.
Os autores puderam observar com anlises lineares mistas que a variao na expresso
de genes entre tecidos maior do que entre indivduos (47% tecidos; 4% indivduos), os que
fogem desse padro so majoritariamente genes dos cromossomos sexuais. Em analise com base
no sexo foram identificados modos de co-expresso gentica masculinos e femininos,
relacionados com desenvolvimento de espermtide e desenvolvimento do ectoderma,
respectivamente.
Foram detectados genes codificadores de protenas e incRNAs expressos de formas
diferentes entre indivduos Europeus e Africano-Americanos, apresentando genes com certa
susceptibilidade para doenas cardacas em indivduos afro-americanos.
Observaram mudanas na expresso de genes ao passar da idade e com a diminuio da
expresso sofriam com vias relacionadas a doenas neurodegenerativas, esses genes abrigam
polimorfismos de nucleotdeo nico.
A pesquisa apontou que micro-exons so frequentes na expresso do crebro, com um
padro de splicing especfico para o rgo pela regulao de protenas de ligao de RNA
principalmente no cerebelo. A abundncia de isoformas de splicing reflete as aes de
transcrio primria e o processamento ps-transcricional (splicing alternativo em sua maioria).
Conclumos que a pesquisa props o monitoramento do transcriptoma de diversos
tecidos e indivduos para compreenso de como ocorre a regulao da transcrio por tecido e o
que determina a variao fenotpica entre indivduos para que possa ser aplicado em quadros
clnicos.

Referncias Bibliogrficas
ALBERTS, B. et al. Biologia Molecular da Clula. 5 Edio. Editora Artmed. 2010.
GUINDALINI, C. Use of microarrays in the search of gene expression patterns - application to
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HARROW,J. et al, GENCODE: The reference human genome annotation for The ENCODE
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LODISH, H. et al. Biologia celular e molecular .7 edio. Editora Artmed. 2014.
MEL, M. et al. The human transcriptome across tissues and individuals. Science, Vol 348,
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The GTEx Consortium. The Genotype-Tissue Expression (GTEx) pilot analysis: Multitissue
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WANG, Z. et al. "RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics." Nature reviews genetics
10.1 (2009): 57-63.
WATSON, J.D.et al. Biologia Molecular do Gene, 7 Edio. Artmed, 2015.