Procesar Tecnicas Bacteriologicas

Colegio de Bachilleres del
Estado de Quintana Roo
CAPACITACIN DE LABORATORISTA CLNICO

MODULO II
Cuadernillo de Prcticas
PROGRAMA TERICO PRCTICO
SUBMDULO I
PROCESAR TCNICAS BACTERIOLGICAS BSICAS
Agosto de 2013
Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

Procesar tcnicas bacteriolgicas bsicas
NDICE
BLOQUE I. Realizar la Toma De Muestras Biolgicas del Cuerpo Humano
Prctica 1. Esterilizacin De Materiales Utilizados En Microbiologa

Prctica 2. Preparacin Medios De Cultivo Mixtos Y Puros
Practica 3. Tcnicas De Aislamiento Bacteriano
Practica 4. Coprocultivo
Practica 5. Urocultivo
Practica 6. Observacin De Microorganismos, Coloraciones Simples, Tincin De Gram Y
cidos Resistentes.
6
13
21
27
29
35
BLOQUE II. Aplicar los Mtodos de Tincin de Bacterias

Practica 7. Preparacin De Bioqumicas E Identificacin De Los Grupos Bacterianos
Practica 8. Antibiograma
39
45
BLOQUE III. Determinar las Tcnicas para Identificar Cocos y Bacilos Gram Positivos de Inters
Medico.
Practica 9. Tcnica De Tincin De Sheaffer Y Fulton
Prctica 10. Tcnica De Tincin De Knaysi
52
55
Practica 11. Identificacin De Cocos Gram Positivos En Diversos Cultivos Bacteriolgicos
58
VO1/08/13
CB-DAC-DOC-CP -QUI-05

PRESENTACIN
Este mdulo contribuye a la adquisicin de los conocimientos necesarios para la operacin de diversos equipos
de laboratorio, as como habilidades en el manejo de reactivos, material y equipos de acuerdo a tcnicas y
procedimientos de competencia laboral, para el funcionamiento de laboratorios clnicos ya sea en escenarios
nacionales como internacionales.
Referentes normativos para la elaboracin del mdulo
CSSA0359.01 Dictamen de muestras citolgicas. Nivel de competencia 2.
NOM-166-SSA1-1997 Organizacin y funcionamiento del laboratorio clnico.
NOM-005-STPS-1998.- Relativa a las condiciones de seguridad e higiene en los centros de trabajo para
el manejo, transporte y almacenamiento de reactivos qumicos peligrosos.
NOM-087-ECOL-2002.- Norma oficial mexicana para la eliminacin y tratamiento de RPBI.
ISO-15189:2003 .- Estandarizacin internacional para la acreditacin de laboratorios clnicos.
Resultado de aprendizaje del mdulo

Adquirir habilidades y destrezas para el manejo de material, equipo y reactivos, as como la obtencin, manejo y
conservacin de muestras biolgicas de acuerdo a las normas oficiales mexicanas (NOM), internacionales (ISO)
y de competencia laboral (CONOCER) establecidas para el laboratorio clnico.
VO1/08/13

UBICACIN CURRICULAR
Mapa de la capacitacin:
El mapa de la capacitacin est compuesto por submdulos, los cuales se dividen de la siguiente manera:
3ro Semestre
4 Semestre
APLICAR FUNCIONES
BSICAS DEL
LABORATORIO CLNICO
BAJO NORMAS QUE
RIGEN SU OPERACIN,
ATENDIENDO AL
PACIENTE CON BIOTICA.
MATERIAL
LABORATORIO.
DEL
OPERARA
EQUIPO
LABORATORIO
DE
CARACTERSTICAS Y
FUNCIONAMIENTO DEL
CUERPO HUMANO
5 Semestre
6 Semestre
REALIZAR LA TOMA DE
MUESTRAS
BIOLGICAS DEL CUERPO
HUMANO
DESARROLLAR
TCNICAS
PARASITOLGICAS.
PROCESAR TCNICAS
BACTERIOLGICAS
BSICAS.
APLICAR LAS
MICOLGICAS.
TCNICAS
La presente asignatura se ubica en el 4 semestre del bachillerato y dentro de la Capacitacin para el

Trabajo denominado Laboratorista Clnico. Esta asignatura tiene como antecedentes Qumica I y II, en
relacin horizontal con el mismo semestre con Biologa I. Asimismo, el Submdulo I sirve de antecedente a las
asignaturas del 4, 5 y 6 semestre como Temas Selectos de Qumica I y II, Temas Selectos de Biologa I y II,
Ciencias de la Salud I y II, Submdulos III, IV, V, VI, VII y VIII.
LINEAMIENTOS DIDCTICOS Y EVALUACIN.

Dado que la asignatura es eminentemente prctica, es decir, que se desarrolla bsicamente en el laboratorio,
se han elaborado once prcticas con el fin de apoyarla. Es importante que el docente presente los
fundamentos tericos que sustentan las prcticas antes de realizarlas con los alumnos, aclarar las
competencias y recomendaciones pertinentes del Submodulo.
Es conveniente que los alumnos preparen por anticipado todas las disoluciones que requiere cada prctica
antes de desarrollarlas, a fin de obtener mejores resultados.
Se sugiere que el profesor presente a los alumnos ejemplos de aplicacin de lo considerado en las prcticas,
apoyando en situaciones de la industria.
En lo concerniente a la evaluacin el profesor designar los rubros y aspectos a evaluar de las prcticas de
laboratorio, as como las estrategias de operatividad de las mismas.
JUSTIFICACIN DEL MDULO
Este mdulo contribuye a la adquisicin de los conocimientos necesarios en el manejo de equipos, reactivos y
material de laboratorio de acuerdo a tcnicas y procedimientos de competencia laboral, para el funcionamiento
de laboratorios clnicos ya sea en escenarios nacionales como internacionales.
VO1/08/13

COMPETENCIAS PROFESIONALES DE EGRESO

Durante el proceso de formacin de los dos mdulos, el estudiante desarrollar las siguientes competencias
profesionales, correspondientes a la capacitacin en Laboratorista Clnico:
REGISTRAR OPERACIONES BSICAS DEL LABORATORIO CLNICO CON BASE A LAS NORMAS
ESTABLECIDAS.
PROCESAR LAS TCNICAS PARA EL DIAGNSTICO MICROBIOLGICO.

Adems se presentan las 11 competencias genricas, para que usted intervenga en su desarrollo o
reforzamiento, y con ello enriquezca el perfil de egreso del bachiller. Se considera que el egresado de la
capacitacin en Laboratorista Clnico est en posibilidades de desarrollar las competencias genricas nmero
uno, tres, cuatro, ocho y diez. Sin embargo se deja abierta la posibilidad de que usted contribuya a la
adquisicin de otras que considere pertinentes, de acuerdo con el contexto regional, laboral y acadmico:
1. Se conoce y valora a s mismo y aborda problemas y retos teniendo en cuenta los objetivos que persigue.
2. Es sensible al arte y participa en la apreciacin e interpretacin de sus expresiones en distintos gneros.
3. Elige y practica estilos de vida saludables.
4. Escucha, interpreta y emite mensajes pertinentes en distintos contextos mediante la utilizacin de medios,
cdigos y herramientas apropiados.
5. Desarrolla innovaciones y propone soluciones a problemas a partir de mtodos establecidos.
6. Sustenta una postura personal sobre temas de inters y relevancia general, considerando otros puntos de
vista de manera crtica y reflexiva.
7. Aprende por iniciativa e inters propio a lo largo de la vida.
8. Participa y colabora de manera efectiva en equipos diversos.
9. Participa con una conciencia cvica y tica en la vida de su comunidad, regin, Mxico y el mundo.
10. Mantiene una actitud respetuosa hacia la interculturalidad y la diversidad de creencias, valores, ideas y
prcticas sociales.
11. Contribuye al desarrollo sustentable de manera crtica, con acciones responsables.
Es importante recordar que, en este modelo educativo, el egresado de la Educacin Media Superior desarrolla
las competencias genricas a partir de la contribucin de las competencias profesionales al componente de
formacin profesional, y no en forma aislada e individual, sino a travs de una propuesta de formacin integral,
en un marco de diversidad.
VO1/08/13

BLOQUE I. REALIZAR LA TOMA DE MUESTRAS BIOLGICAS DEL CUERPO HUMANO.

No. DE PRCTICA: 1
ESTERILIZACIN DE MATERIALES DE LABORATORIO.
INDICADOR DE DESEMPEO
Nombra el material y equipo para anlisis microbiolgico.
Conoce y aplica los mtodos para la esterilizacin de materiales de microbiologa.

Actividades Especficas
Opera y esteriliza adecuadamente el material utilizado en Microbiologa.
Higieniza, prepara y envuelve correctamente el material que se someter a esterilizacin.
Selecciona los mtodos de esterilizacin adecuados para las diversas necesidades del laboratorio de
microbiologa.
Comprueba la efectividad del proceso de esterilizacin.
INTRODUCCIN.
Por su minsculo tamao, los microorganismos no pueden estudiarse como individuos, sino que es necesario
manejarlos como poblaciones. Para ello es necesario cultivarlos, es decir, favorecer su multiplicacin in Vitro, en
ambientes especiales que proporcionen las condiciones semejantes a las de sus hbitats naturales. En estos
ambientes se debe eliminar a todos aquello microorganismos que interfieren en el estudio del microorganismo
de inters, al que adems de proporcionar los nutrientes necesarios para su crecimiento multiplicacin.
La esterilidad es un trmino utilizado para indicar la ausencia de cualquier forma de vida en un objeto
determinado, la esterilizacin es el proceso para llegar a este fin.
Un requisito indispensable en el laboratorio de Microbiologa es que los materiales y medios de cultivo
estn estriles y protegidos adecuadamente para conservar esterilidad durante su uso y
almacenamiento.
Existen varios mtodos de esterilizacin, los ms utilizados en el laboratorio son: calor hmedo, calor
seco, incineracin, substancias qumicas, filtracin.
La esterilizacin
La esterilizacin es un proceso a travs del que se puede lograr la destruccin total de los microorganismos
viables presentes en un determinado material. Este procedimiento es de gran utilidad dentro del campo
farmacutico, ya que existen muchos procesos que requieren la utilizacin de materiales estriles. Entre stos
podemos destacar:
La esterilizacin de equipos quirrgicos y otros materiales de uso mdico con el propsito de reducir
de infecciones en pacientes.
El acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas, etc.) que va a ser utilizado
laboratorios de microbiologa.
el riesgo
en los
La preparacin de medios de cultivo que sern empleados con diferentes propsitos (cultivo de
microorganismos, control de ambiente, equipos o personal, anlisis microbiolgico de medicamentos,
cosmticos, alimentos, etc.)
Existen diversos mtodos de esterilizacin. La seleccin del mtodo a aplicar en cada caso est determinada
por el tipo de producto a esterilizar.
VO1/08/13

Clasificacin de los mtodos de esterilizacin:

En la siguiente pgina se presenta un esquema de los principales mtodos de esterilizacin, clasificados de
acuerdo al tipo de agente que acta.
1) Agentes fsicos
El calor se puede aplicar como agente esterilizante de dos formas: el calor hmedo el cual destruye a los
microorganismos por desnaturalizacin de las protenas y el calor seco que destruye a los microorganismos por
oxidacin de sus componentes celulares. El calor es considerado como el mtodo de esterilizacin por
excelencia siempre y cuando el material a esterilizar soporte altas temperaturas sin sufrir ningn tipo de dao.
La radiacin, o emisin y propagacin de la energa a travs de un medio, puede ser utilizada como agente para la
eliminacin de microorganismos. As tenemos que las radiaciones ionizantes se pueden utilizar para la esterilizacin
de materiales termolbiles, como por ejemplo materiales plsticos, y las radiaciones no ionizantes, como la luz
ultravioleta, puede ser empleada en el control de reas cerradas.
a) Esterilizacin por calor:

El calor es el mtodo de eleccin para esterilizar el material de laboratorio resistente a las altas temperaturas.
La temperatura y el tiempo requeridos para esterilizar un material dependen de que se est utilizando calor
seco o calor hmedo.
Esterilizacin con calor seco: La accin bactericida del calor seco
se debe a la oxidacin fsica de un procedimiento lento o
coagulacin de la protena bacteriana por quemadura. En
ausencia de humedad se necesita una temperatura ms alta, ya
que en esta forma los microbios son destruidos al absorber el
calor. Pueden ser dos tipos:
Directa: flameado o incineracin ms utilizada en laboratorios y
en algunos hospitales pequeos.
Indirecto: aire caliente u
horno de Pasteur con
temperatura de 160C a 180C por 1 a
2 horas siendo
el ms eficaz y seguro el elctrico.
Ventajas:
El aire caliente penetra ciertos materiales que no se pueden
esterilizar en el autoclave
Puede utilizarse en laboratorios para la esterilizacin de
artculos de vidrio
El calor seco da proteccin en esterilizacin de instrumentos
delicados con punta o filo al que daara el vapor
El acero no se corroe o decolora
Desventajas:
Se requiere ms tiempo de accin, porque el aire penetra con
lentitud y uniformidad
El tiempo y la temperatura varan segn el tipo de material
La sobre exposicin puede daar algn producto
Destruye telas o material de caucho
VO1/08/13

Esterilizacin con calor hmedo: El calor hmedo es la forma de vapor saturado a presin es eficaz para la
destruccin de todas las formas microbianas, incluso espora. La muerte de las bacterias es causada por la
desnaturalizacin y coagulacin de su protena o su sistema intercelular enzima-protena. Estas reacciones son
catolizadas por medio del agua. Estas pueden de dos tipos:
Calor hmedo discontinuo: algunos medios de cultivo que contiene carbohidratos como la
Gelatina, leche, etc. no soportan temperaturas elevadas y se realiza mediante los siguientes
Procedimientos:
Tindalizacin: hace uso del calor hmedo, para una buena esterilizacin se debe realizar a 100C por
hora (por tres veces discontinuas) durante 1 da.
Ebullicin: es el paso de un lquido al estado de vapor. El agua en ebullicin representa
en forma eficaz y prctica de proporcionar una desinfeccin de alto nivel de instrumentos y guantes que
entren en contacto de las membranas mucosas, si bien al hervirlos por 20 minutos se aniquilan todas
las formas vegetativas de las bacterias, los virus, las levaduras y los hongos, pero no destruye a las
esporas.
Pasteurizacin: elimina a todos los microorganismos no esporulados se puede variar las temperaturas
por ejemplo: 62C por 30 min.; 70C por 15 min. Se utiliza para preservar alimentos como ser leche,
cerveza.
Vapor a presin: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables como
grados de temperatura y tiempo de exposicin, que junto con el tamao del autoclave y el flujo del
vapor, la densidad y el tamao de la carga en la cmara aumentan la tasa se muerte de los
microorganismos, en una temperatura de 121C 132C durante 15 minutos o ms.
Ventajas:
Es ms fcil segura y eficaz
El uso del vapor es el procedimiento ms rpido, el ciclo total de tiempo es ms corto
Es ms barato y de obtencin ms fcil
La mayora de las autoclaves poseen controles automticos y dispositivos de control
Desventajas:
Se requiere mucho cuidado en la preparacin y confeccin de bultos, en la carga y manejo del
autoclave, as como el secado de los artculos
Los artculos a esterilizar deben estar limpios, sin grasa ni aceite
El vapor tiene que estar en contact directo con todas las partes de los artculos
Los ciclos de tiempo se ajustan segn el tipo de material y tamao de la carga
El vapor puede no ser puro
La cmara presurizada utilizada normalmente en el laboratorio es el autoclave. En muchos aspectos una

autoclave se parece a una olla de presin casera. De hecho, en algunos pequeos laboratorios de
microbiologa se utilizan estas ollas en lugar de autoclaves. Ambos son recipientes de metal con paredes
suficientemente fuertes para resistir la presin de vapor.
VO1/08/13

Las autoclaves son grandes cmaras de acero inoxidable que funcionan automticamente. Los objetos deben
ser colocados de manera que el vapor de agua entre en contacto con todas las partes de cada uno de ellos, y el
aire no quede atrapado en su interior. El aire que no es reemplazado por vapor crea una bolsa seca, donde la
esterilizacin no ser efectiva.
b) Esterilizacin por radiacin: La ionizacin por radiacin genera iones al liberar electrones de los tomos,
estos se desprenden violentamente con tomos adyacentes y se une a ellos, o bien se desprenden del segundo
tomo. La energa liberada se transforma en energa trmica o qumica la cual causa la muerte de los
microorganismos al romper la molcula del ADN e impide la divisin molecular y la propagacin de la vida. Las
principales fuentes de radiacin ionizante son las partculas Beta y rayos gamma.
Ventajas:
Penetra la mor parte de todos los materiales para esterilizarlos con confiabilidad
Es el mtodo de esterilizacin ms eficaz
No genera radiacin residual
Penetran en objetos grandes y voluminosos
2) Agentes mecnicos
La filtracin permite la remocin de todos los microorganismos presentes en un lquido o un gas retenindolos
sobre la superficie de un material.
Filtracin: Las clulas microbianas pueden retirarse de los lquidos o gases por filtracin. La filtracin es lenta y
cara (debe usarse un filtro nuevo cada vez); por esta razn, se utiliza slo para los lquidos termolbiles, que no
se pueden esterilizar en el autoclave. Los slidos termolbiles tambin se pueden esterilizar por filtracin, si
previamente se disuelven en un lquido. Tcnicamente, la filtracin no esteriliza porque los virus pueden pasar a
travs de los filtros, pero el proceso es suficiente para la mayora de los estudios de rutina que se llevan a cabo
en el laboratorio.
Los filtros utilizados se denominan filtros de membrana. Estas membranas estn compuestas de nitrocelulosa,
con un poro de dimetro constante. La nitrocelulosa es un derivado qumico de la celulosa, que tambin se
utiliza como explosivo. El dimetro de poro es aproximadamente 0,45 m; este tamao es lo suficientemente
pequeo como para eliminar todos los microorganismos, con excepcin de los virus y algunas bacterias muy
pequeas. Un lquido se filtra hacindolo pasar a travs de un filtro de membrana acoplado a un matraz
especial. Para hacer pasar el lquido por el filtro se utiliza una bomba de vaco; los microorganismos quedan en
la superficie de la membrana. La filtracin es el mtodo de eleccin para esterilizar soluciones de vitaminas,
antibiticos v otros compuestos termolbiles, que son aadidos a los medios.
3) Agentes qumicos
Algunas sustancias qumicas pueden ser usadas como agentes esterilizantes porque tienen la capacidad de
promover una o ms reacciones qumicas capaces de daar los componentes celulares de los microorganismos
(protenas, membranas, etc.)
Esterilizacin por gas oxido de etileno: Este es un gas incoloro, soluble en agua y en solventes
comunes, se emplea para esterilizar objetos sensibles al calor, este proceso es relativamente lento. El poder
bactericida depende de la concentracin del mismo gas, temperatura, humedad y tiempo de exposicin. La
actividad esporicida se produce por aniquilacin de los grupos terminales hidroxilo, carboxilo, amino y sulfridrilo.
Ventajas:
Es un buen sustituto eficaz cuando los artculos no pueden ser esterilizados por calor
Es anticorrosivo y no daa el material
Penetra totalmente todo el material poroso
No deja pelcula sobre los instrumentos
VO1/08/13

Desventajas:
Es un proceso complicado por lo que se debe usarse indicadores biolgicos
La esterilizacin lleva ms tiempo, es un proceso lento y largo
Necesita equipo especial y costoso
Puede formar productos secundarios txicos
Necesita ser ventilado por lo menos 24 horas
Por frecuentes esterilizaciones pueden formar y aumentar residuos totales de gas en artculosporosos
En contacto con la piel produce vesculas y an quemaduras se inhala puede ser irritante para las
mucosas.
Esterilizacin por glutaraldehido: La solucin acuosa de glutaraldehido activado y amortiguado al 2%,
destruye a los microorganismos por desnaturalizacin de la protena. Es preferida para esterilizar instrumentos
que no pueden esterilizarse al vapor o no se cuenta con otro mtodo de esterilizacin.
No es absorbible por caucho ni plstico
Es poco voltil de modo que puede reutilizarse
Es eficaz a la temperatura ambiente
Es anticorrosivo, no mancha y eficaz para esterilizar instrumentos
Tiene una tensin superficial baja
Desventajas:
Puede ser irritante, por lo tanto se debe enjuagar exhaustivamente con agua estril
Es una solucin con olor
Es costoso
Control del proceso de esterilizacin:
Todos los procesos de esterilizacin se deben controlar para poder asegurar que han sido efectivos. Para ello
se pueden utilizar indicadores fsicos, qumicos y/o biolgicos, los cuales deben ser colocados en cada carga de
esterilizacin.
Indicadores fsicos
Entre los principales indicadores fsicos se encuentran los medidores de presin y los termmetros los cuales
permiten constatar las condiciones fsicas dentro de la cmara de esterilizacin. Tambin existen los
termgrafos los cuales, adems de registrar la temperatura alcanzada en el proceso, permiten conocer durante
cunto tiempo sta se mantuvo
La mayora de estos indicadores son cintas adhesivas que se adhieren al material a esterilizar. Estas cintas
estn impregnadas con una sustancia qumica que cambia de color cuando el material ha sido sometido al
proceso de esterilizacin. Este tipo de cintas no son completamente confiables debido a que muchas veces slo
indican que se lleg a la temperatura deseada, pero no indican por cuanto tiempo sta se mantuvo. Tambin
existen cintas diseadas de manera que el cambio de color es progresivo, estas cintas son un poco ms
seguras porque permiten estimar si el tiempo de esterilizacin fue el adecuado.
Indicadores biolgicos
Son preparaciones de una poblacin especfica de esporas de microorganismos, las cuales son altamente
resistentes a un proceso de esterilizacin en particular.
Estos indicadores se deben colocar junto con la carga de esterilizacin, en el sitio que se considera que es ms
difcil que llegue el vapor y despus del proceso, se deben incubar durante 24 horas en condiciones adecuadas.
Si despus de este periodo hay evidencia de crecimiento microbiano (por ejemplo cambio de color del medio de
cultivo), el proceso de esterilizacin no fue satisfactorio.
VO1/08/13
10

Cuando se utilizan indicadores biolgicos se debe verificar:

Tipo de microorganismo
Tipo de proceso de esterilizacin
Nmero de lote
Fecha de expiracin
Medio de cultivo utilizado
Condiciones de incubacin del indicador despus de aplicado el proceso de esterilizacin.
Mtodos de descontaminacin para evitar la diseminacin de esporas en el medio ambiente
Con este tipo de indicadores se controlan la esterilizacin por vapor a presin, por calor seco y la esterilizacin
con xido de etileno.
Almacenamiento del material estril:
Una vez que un material est estril puede mantener esta condicin si est protegido en la forma apropiada. Es
decir, la duracin de la esterilidad de un material no est relacionada directamente con el tiempo, sino con
factores que comprometen su exposicin al medio ambiente.
Los materiales estriles pierden su esterilidad:
Cuando se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo recubre durante su
transporte o almacenamiento.
Al humedecerse el material de empaque.
Es importante no manipular los materiales estriles con las manos hmedas, ni colocarlos sobre superficies
mojadas. Al almacenar los materiales estriles se deben tomar una serie de precauciones, tales como:
Controlar el acceso a las reas de almacenamiento de materiales estriles.

Mantener el rea de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio e insectos.
Controlar la temperatura y la humedad de las reas de almacenamiento.
La temperatura ideal debe estar por debajo de los 26C y la humedad relativa entre 30 y 60%.
Los periodos prolongados de almacenamiento en lugares tibios y hmedos, pueden producir
condensacin de humedad sobre el material de empaque.
Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material.
Dejar que los materiales que salen del horno o el autoclave alcancen la temperatura ambiente antes
de ser almacenados; de esta forma se evita la condensacin dentro del empaque.
MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
Cantidad
7
100
7
2 Bolsa
5 Mtros
90
MATERIALES Y EQUIPO
Capacidad Y
Nombre
Descripcin
Matraz Erlenmeyer
250 ml
Tubos de ensaye
Pipetas
1, 5, 10 ml.
Material
Algodn
proporcionado por
el alumno
Material
Papel estraza
proporcionado por
el alumno
Cajas de Petri
60 X15 mm
*Bata
laboratorio.
VO1/08/13
de
Cantidad
SUSTANCIAS
Nombre Y
Descripcin
Frmula
Qumica
Manga Larga
11

MTODOS.
A) Siguiendo las instrucciones del profesor preparar el
siguiente material:
1. Poner un filtro de algodn a cada pipeta y envolverla con papel.
Marcar el volumen de cada pipeta y la fecha de preparacin.
2. Tapar con algodn los tubos de ensayo y colocarlos en un bote.
Tapar el bote con papel.
3. Envolver con papel las cajas de Petri, en grupos de 10.
Colocarlas con la tapa hacia abajo.
4. Poner un tapn de algodn a cada matraz y cubrirlo con un
gorro de papel.
5. Este material se esterilizar en autoclave a 120C durante 20
minutos a 15 libras de presin.
INFORME.
Ser presentado en forma individual en el formato de la UVE de Gowin al titular.
CUESTIONARIO
1.- Por qu es importante en el rea de microbiologa la esterilizacin?
2.- Qu tipos de esterilizacin conoces?
3.- Que mtodo de esterilizacin crees que sea el mejor y por qu?
CONCLUSIONES.
NOMBRE DEL ALUMNO:

Apellido Paterno
GRADO Y GRUPO:
Apellido Materno
FECHA:
Nombre(s)
CALIFICACIN:
FIRMA DEL ALUMNO
VO1/08/13
FIRMA DEL PROFESOR
12

BLOQUE I. APLICAR TCNICAS BACTERIOLGICAS BSICAS

PRCTICA No. 2
PREPARACIN DE DIVERSOS MEDIOS DE CULTIVOS MIXTOS Y PUROS.

INDICADOR DE DESEMPEO:
Conoce el uso y aplicacin de algunos medios de cultivo tiles para el cultivo de microorganismos, as
como la tcnica para su esterilizacin.
Identifica y prepara los medios de cultivo para microbiologa.
Conoce y obtiene cultivos microbiolgicos mixtos y puros.

Conoce los pasos necesarios para una correcta preparacin de los medios de cultivo.
Elabora adecuadamente los medios de cultivo deshidratados y por componentes.
Envasa los medios de cultivo de manera adecuada en los diferentes recipientes de acuerdo al uso que
se les dar.
Relaciona la composicin de los diversos medios de cultivo con sus caractersticas y aplicaciones.
II. INTRODUCCIN.
Un cultivo es cualquier preparacin en la que ha habido crecimiento artificial de
microorganismos. Suele emplearse el trmino para denotar el desarrollo artificial
de microorganismos en el laboratorio. Un cultivo puro incluye un tipo nico de
microorganismos. Pocas veces fuera del laboratorio se encuentran cultivos puros
porque en la naturaleza los microorganismos suelen asociarse.
En las poblaciones mixtas un tipo de microorganismos puede ayudar, destruir o
no tener efecto en otros; su actividad social, en consecuencia, se asemeja a la
de plantas y animales superiores, incluyendo el hombre.
Un medio de cultivo es un substrato o solucin de nutrimentos en que se cultivan
los microorganismos en el laboratorio.
Los microorganismos necesitan distintos materiales nutritivos, y se emplean
ciertos medios para finalidades especficas como por ejemplo: precisar la
capacidad de digestin de protenas de un microorganismo, carbohidratos, etc.
Medios de cultivo
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas
ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de
Microbiologa por lo que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso, asegura la exactitud,
confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos.
Clasificacin de los medios de cultivo
En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados
en forma lquida o en forma slida. Usualmente para preparar un medio slido se parte de un medio lquido al
que se le aade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel.
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:
Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las
que son usualmente complementadas por la adicin de minerales y otras sustancias. En ellos no se
conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos.
Medios definidos o sintticos: son los medios que tienen una composicin qumica definida cualitativa
y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigacin. (Para bacterias como:
Echerichia coli y Leuconostoc citrovorum)
VO1/08/13
13

De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en:

Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de
microorganismo en particular. Permiten aumentar el nmero de microorganismos de ese tipo.
Usualmente contienen una o ms sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con
excepcin de los que se quieren cultivar.
Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios slidos y
estn diseados para el aislamiento de microorganismos especficos. (Para bacterias como Salmonella
typhi y Clostridium botulinum)
Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad
microbiana de los microorganismos. No contienen ningn tipo de sustancia con actividad
antimicrobiana. Permiten revelar caractersticas fisiolgicas de los microorganismos. ( para bacterias
como: Streptococcus pyogenes y Escherichia coli)
Por su composicin los medios de cultivo se clasifican en:
Lquidos: conocidos como caldos, estos son especialmente tiles para hacer diluciones, para
homogenizar mezclas de microorganismos, para enriquecer cultivos y para rehidratar cepas liofilizadas.
Slidos: Para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de las colonias aisladas en las que es
posible observar las caractersticas tpicas de un solo tipo de microorganismo.
Semislidos: Son aquellos medios lquidos a los que se adiciona agar en concentraciones de 0.4 a
0.8%. Estos se emplean para determinar la movilidad de los microorganismos microaeroflicos.
Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes bsicos o
por simple rehidratacin de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados).
Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, adems de simplificar el
trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
Prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren
productos de calidad.
Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y fisicoqumica adecuada.
Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin.
Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.
VO1/08/13
14

Cantidad
MATERIALES Y EQUIPO
Capacidad Y
Nombre
Descripcin
1 paquete
Algodn
Autoclave
Balanza
90
Cajas de Petri
60 X 15 mm
Esptula
Metlica
14
Gasa
7
7
7
7
100
Matraz Erlenmeyer
Mechero de
Tela
Tripie
Tubos de bioqumica
250 gr
40 lt
Cantidad
SUSTANCIAS
Nombre Y
Descripcin
Frmula
Qumica
2 de 500 gr
Agar Salmonella- Sigella
2 de 500 gr
Agar hierro de Kliger
2 de 500 gr
Agar Muller Hinton
2 de 500 gr
Agar MacConkey
250 ml
Bunsen
de asbesto
Metlico
Recomendaciones: Antes de servir en las cajas de petri, se realiza la asepsia del rea limpiando
meticulosamente la mesa de trabajo y despus eliminando impurezas restantes con alcohol prendido.
Despus se colocaron 2 mecheros (uno en cada lado, paralelamente) para por medio del calor eliminar
cualquier impureza proveniente del are, para servir el medio en las cajas de petri esterilizadas colocando la
boca del matraz en el fuego (antes de servir) y despus sirviendo en las cajas una cantidad considerable, para
despus semitaparlas y dejando las muestras cerca de los mecheros sobre la mesa de trabajo. Esto se realiz para
todas las cajas de petri.
VO1/08/13
15

Preparar un
Medio de cultivo
Pesar
9gr y
colocar
en un
M atraz
MEDIO EMB
Esterilizar:
(en matraz y
autoclave) a no
ms de 121C
Hidratar
agregar 250
ml de agua
destilada
Homogenizar:
Con calor y agitacin (ya

que
contiene
Agar);
mezclar y dejar en reposo
5min.
Calentar
agitando
frecuentemente
y
hervir
durante 1min. Aprox.
Durante 15 min.
Servir en rea asptica en cajas de petri ,

previamente esterilizadas
IV. MTODOS.
1. Utiliza un matraz lo suficientemente grande para que permita una agitacin y un mezclado correctos. La
capacidad del matraz deber ser alrededor de 2 a 2.5 veces el volumen del medio a prepararse. Por ejemplo, si
se van a preparar 500 ml de medio de cultivo, use un matraz de un litro. Siga cuidadosamente las instrucciones
impresas en la etiqueta de cada medio.
VO1/08/13
16

2. Destape el frasco que contiene el medio de cultivo lejos de ventanas y de las zonas hmedas del laboratorio
y una vez tomada la cantidad requerida, vulvalo a tapar muy bien e inmediatamente. Evite la inhalacin del
polvo y el contacto prolongado del mismo con la piel, especialmente cuando el medio de cultivo contiene
colorantes, a fin de prevenir la aparicin de manifestaciones alrgicas y la inhalacin de sustancias txicas
como sales biliares, salenito, etc.
3. Los medios que carecen de agar, generalmente se disuelven por agitacin continua y ebullicin suave pero
suficiente. En cambio, los medios slidos que si llevan agar es necesario humedecerlos totalmente y enseguida
dejarlos en contacto con el agua de 10 a 15 min., agitndolos de vez en cuando para que se hidraten bien las
partculas slidas del agar y se forme un gel correcto y uniforme. Una vez que el agar ha absorbido una buena
cantidad de agua, calentar la suspensin del medio de cultivo agitndolo siempre hasta que comience a hervir.
Al llegar a este punto, disminuya la altura de la flama y procure sostener la ebullicin lentamente durante un
minuto, agitando continuamente el matraz para evitar que el medio se derrame y para lograr que todo el agar se
disuelva. Evite el sobrecalentamiento.
4. Los medios que no requieren ser esterilizados en la autoclave, como el SS, el XLD, Caldo Tetrationato, Caldo
Selenico, por la sola ebullicin ya estarn listos para ser utilizados. Otros medios que son la mayora, es
necesario esterilizarlos en el autoclave; generalmente la esterilizacin se hace a 15 libras, durante 15 min.
NOTA:
Siempre debe utilizarse en la preparacin de los medios agua destilada de buena calidad, libre de cobre, cloro y
otros metales pesados. El material de vidrio deber estar escrupulosamente limpio y libre de huellas de
sustancias txicas que puedan absorberse en la superficie del vidrio, tales como telurito, selenito, cidos
biliares, etc.
5. Una vez esterilizado el medio de cultivo, se deja enfriar y posteriormente se vierten en cajas de Petri o tubos
de bioqumica, segn el medio de cultivo. Se deja gelificar a temperatura ambiente.
6. Una vez gelificados, se proceder a guardar los medios de cultivo entre 2 y 8C a menos de que se vallan a
utilizar el mismo da. Sin embargo algunas veces se guardan a 30C, primero para asegurarse de que estn
estriles y segundo para estimular el crecimiento del pequeo nmero de microorganismos que lleva el
producto en estudio.
Las placas de medios de cultivo debern almacenarse en el refrigerador, en posicin invertida dentro de
bolsitas cerradas de plstico, para impedir prdida de humedad. Segn el medio de cultivo de que se trate y del
hecho de que est preparado en placas o en tubos, guardados en bolsas, es posible conservarlos entre 2
semanas y 4 meses. Cuando se va a utilizar estos medios, se deben dejar calentar a la temperatura del
ambiente.
VO1/08/13
17

PROBLEMAS Y ERRORES MS COMUNES QUE SE PRESENTAN DURANTE LA RECONSTITUCIN DE LOS MEDIOS

DE CULTIVO DESHIDRATADOS Y SUS POSIBLES CAUSAS.
FALLA
CAUSA PROBABLE
Cambio de pH y cambio de color en el medio de

cultivo.
Sobrecalentamiento,
mezclado
inadecuado,
esterilizacin prolongada, empleo de material de vidrio
con lcali, recipientes contaminados, agua destilada
impura, por fundir el medio en varias ocasiones por
mantener el medio a temperaturas altas durante
mucho tiempo, hidrlisis de los ingredientes.
Calentamiento inadecuado, mezclado incompleto por
lo que se sobrecalienta algunas porciones del medio,
agua destilada de mala calidad, insuficiente
hidratacin del agar, recipiente demasiado pequeo
por lo que no es posible homogeneizar el lquido.
NOTA:En algunos casos existe un pequeo
precipitado despus de esterilizar el medio, por lo que
es necesario agitar suavemente el matraz antes de
vaciarlo en las cajas de Petri. Ejemplo: agar EMB,
agar de Mueller-Hinton.
Sobrecalentamiento al disolver el agar o por
esterilizacin prolongada.
Grumos de agar no solubilizados, mezclado e
hidratacin incompletas, proporcin incorrecta entre la
cantidad del medio y el volumen de agua (pesado
errneo del polvo), pH del medio demasiado cido.
Por fundir el agar en varias ocasiones, calentamiento
excesivo o prolongado, mezclado e hidratacin
incompletas, medios acaramelados o quemados
parcialmente, daos causados a la frmula del medio
por el inoculo. Ejemplo: La adicin de soluciones
azucaradas y de electrolitos; detergentes, antispticos,
venenos metlicos, materiales proteicos, etc.
Solubilidad incompleta.
Oscurecimiento.
Falta de dureza en el agar (gel blando).
Prdida de las propiedades nutricionales para

promover el desarrollo y alteraciones en
las propiedades diferenciales del medio.
PROCEDIMIENTO:
Almacenamiento de los medios de cultivo deshidratados
Los frascos con el polvo deshidratado deben almacenarse en un lugar fresco y seco, evitando la luz
directa.
Todos los medios de cultivo son higroscpicos, por lo que una vez que han sido abiertos, tienden a
tomar la humedad del medio ambiente.
Es particularmente importante cerrar lo antes posible el tapn interior y la tapa exterior firmemente
despus de usar cada frasco.
Es necesario tambin colocar los frascos lejos de lugares en donde se encuentren aparatos de
calentamiento o ventanas, ya que esto puede provocar reacciones inexactas y un desarrollo adecuado.
VO1/08/13
18

Es necesario tener un estricto cuidado en el momento de preparar nuestros medios de cultivo para
evitar errores, como los antes mencionados y uno muy importante: el de contaminacin de los medios, y
es este el error que nosotros cometimos en las primeras preparaciones, debido a la desorganizacin
con la que llevamos a cabo estas preparaciones.
Cabe notar que es conveniente hacerles el control de calidad a los medios que preparemos, ya que de esto
depende el buen resultado de nuestros cultivos.
Realizar videos y tomas fotogrficos del evento.
INFORME.
CUESTIONARIO
1. Qu tipos de medios de cultivos existen?
2. Cul es el fundamento de los medios de cultivo?
3. Qu error consideras que sea de mayor importancia a la hora de hacer los medios de cuItivo?
4. Por qu se deben almacenar los medios de cultivo en posicin invertida?
VO1/08/13
19

5. Por qu se tapan los tubos y matraces que contienen los medios para esterilizar?
6. Cmo creas rea estril para vaciar los medios de cultivo ya esterilizados a las cajas de petri? Y por qu
es necesario?
CONCLUSIONES
NOMBRE DEL ALUMNO:
Apellido Paterno
GRADO Y GRUPO:
Apellido Materno
FECHA:
Nombre(s)
CALIFICACIN:
FIRMA DEL ALUMNO
VO1/08/13
FIRMA DEL PROFESOR
20

BLOQUE I APLICAR TCNICAS BACTERIOLGICAS BSICAS

PRCTICA No.3
TCNICA DE AISLAMIENTO BACTERIANO
INDICADOR DE DESEMPO:
Conoce y obtiene cultivos microbiolgicos puros

Aplica tcnicas para aislamiento de bacterias aerobias por las
tcnicas ms comunes.
II. INTRODUCCIN
La identificacin de bacterias puede hacerse de manera exacta solamente con cultivos puros, ya que las
caractersticas empleadas para clasificarlas dependen de la actividad, poblacin y no de las clulas
individuales, an cuando, algunas propiedades bacterianas cambian cuando se toman los microorganismos de
su medio natural y se cultivan en el laboratorio. La realidad es que la clasificacin suele basarse en las
propiedades de bacterias en cultivos de laboratorio.
El aislamiento de un cultivo puro, se lleva a cabo tomando en cuenta las caractersticas especficas de los
microorganismos por aislar; por ejemplo si se desea obtener en forma pura una bacteria esporgena se
calentar a 85C y se tratar con un desinfectante adecuado que destruya todas las clulas excepto las
esporas.
Al hacer la siembra se obtendr fcilmente el crecimiento de la bacteria esporgena.
Si se toma un asa bacteriolgica cargada con una muestra que contenga bacterias y se van haciendo estras de
sta sobre una placa de agar nutritivo de tal manera que el material se vaya diluyendo sobre la superficie (Fig.
12.1), llegar un momento en que las bacterias depositadas en la estra estn bien separadas unas de otras,
reproducindose cada una en progresin geomtrica (1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, etc.).
Dependiendo del tiempo de generacin, que vara segn la especie bacteriana, despus de cierto tiempo, cada
una se habr multiplicado muchas veces, formando sobre la superficie del medio un pequeo promontorio
constituido por clulas bacterianas llamado Colonia, que se obtiene generalmente en unas 24-48 horas.
Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamao, color, consistencia etc., y pueden ser
diferenciadas sobre estas bases.
Las colonias de cada especie bacteriana son diferentes ya sea en tamao, color, consistencia etc., y pueden ser
diferenciadas sobre estas bases.
Cada colonia aislada est constituida de un solo tipo de bacterias, ya que se supone que es la descendencia de una
sola clula y por tanto, un cultivo puro.
Para estudiar las caractersticas fsicas, qumicas, fisiolgicas, etc., de una bacteria, se necesita que sta sea aislada
en cultivo puro y el aislamiento en caja Petri es el primer paso para ello, siendo el segundo paso la siembra de una
porcin de una colonia en un medio de cultivo en tubo, verificando su pureza despus de la incubacin apropiada,
mediante observacin al microscopio.
La morfologa de las colonias es importante por lo anteriormente expuesto y debe familiarizarse el alumno con ella.
(Fig. 12.2). La terminologa mencionada a continuacin sobre algunas de las caractersticas ms constantes de una
colonia bacteriana es muy til:
VO1/08/13
21

FORMA: Puntiforme, circular, irregular, alargada, fusiforme, filamentosa, rizoide, etc.

TAMAO: Estimar el dimetro en mm.
SUPERFICIE: Lisa, rugosa, cerebriforme, en anillos concntricos, etc.
ELEVACION: Aplanada, elevada, pulvinada, convexa, umbonada, umblicada, etc.
BORDE: Continuo, ondulado, lobulado, erosionado, festoneado, filamentoso, etc.
ESTRUCTURA INTERNA: Amorfa o granulosa.
COLOR: Segn sea observado por la luz reflejada o por la luz transmitida, puede ser de
color blanco, amarillo, rojo ladrillo, anaranjado, etc.
OPACIDAD: Transparente, opaca, etc.
CONSISTENCIA: Dura, viscosa, membranosa, gelatinosa, mucosa, etc. Usar el asa bacteriolgica para
determinar la consistencia.
VO1/08/13
22

90
MATERIALES Y EQUIPO
Capacidad Y
Nombre
Descripcin
Cajas de Petri con
gelosa simple
60 X 15 mm
Matraz Erlenmeyer
14
Pipetas
de 250 ml
de 10 ml (1 x 10)
estriles
14
Pipetas
de 1 ml (1 x 100)
estriles
100
Tubos de ensaye
de 16 x 150 mm
estriles
Cantidad
Cantidad
30 ml
SUSTANCIAS
Nombre Y
Frmula
Descripcin
Qumica
Muestras de suelo y agua
Material proporcionado por el
alumno
MTODOS
A) AISLAMIENTO POR EL MTODO DE LAS DILUCIONES.
1. Marcar una serie de 10 tubos (de 16 x 150 mm estriles) del 1 al 10.
2. Adicionar a cada tubo 9 ml de agua destilada estril en condiciones de esterilidad (seguir instrucciones del
profesor).
3. Agregar al primer tubo 1 gramo 1 ml de la muestra. En el caso de suelo, homogeneizar la suspensin y
dejar sedimentar las partculas gruesas.
4. Efectuar diluciones decimales de cada muestra, como se indica a continuacin.
TUBO
DILUCIN
1
1 g. 1 ml de muestra + 9 ml de agua 10 -1
2
1 ml del tubo 1 + 9 ml de agua 10 -2
3
4
5
6
7
8
9
10
NOTAS:
a) Homogeneizar la suspensin en cada tubo antes de transferir el volumen indicado al siguiente tubo.
b) Cambiar de pipeta al efectuar cada dilucin.
c) Introducir la pipeta usada en la envoltura original.
5. Seleccionar cinco diluciones segn instrucciones del profesor.
6. Colocar 0.1 ml de cada dilucin en la superficie de cada una de cinco placas de gelosa simple, previamente
marcadas con la dilucin correspondiente.
7. Homogeneizar el inculo en la placa con una varilla de vidrio acodada, segn las instrucciones del profesor.
8. Envolver las cajas en papel de estraza, de tal manera que la tapa quede abajo.
VO1/08/13
23

AISLAMIENTO POR EL MTODO DE LAS DILUCIONES.
B) TCNICAS DE AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

(Bacterias Aerobias)
El alumno aislar diferentes tipos de bacterias.
9. Incubar a 37C por 24-48 horas.
10.Observar si hubo o no, aislamiento de colonias.B) Aislamiento por el mtodo de estra cruzada.
1. Esterilizar el asa bacteriolgica por incineracin.
2. Dejar enfriar el asa a un lado del mechero.
3. Tomar una asada de la muestra (tubo 1 de la serie de diluciones) y colocar en los bordes de la placa,
haciendo estras continuas hacia el centro de la caja .
4. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla.
5. Hacer una segunda serie de estras tocando la porcin final de la anterior.
6. Esterilizar el asa nuevamente y enfriarla.
7. Repetir los pasos 4 y 5 para hacer las series de estras que se indica.
8. Esterilizar el asa y enfriarla.
9. Incubar el material a 37C durante 24 horas.
VO1/08/13
24

Observe los pasos en el ejemplo siguiente:

1. Con el lpiz graso dividir la caja Petri en 3 sectores, de tal manera que al destaparla para proceder a la
inoculacin, se tenga como se indica en la figura:
2
1
3
El sector No. 1 es ms pequeo y sirve para descargar el asa.

2. Usando la tcnica ya conocida, tomar el cultivo bacteriano y en condiciones aspticas obtener una asada del
material.
3. Una vez cerrado el tubo, colocarlo en una gradilla.
4. Con la mano izquierda levantar parcialmente la tapa de la caja de Petri y descargar el material en el sector 1,
trazando una serie de zig-zags muy cerrados a todo lo ancho del sector. Cerrar la caja.
5. Esterilizar el asa flamendola y mientras que se enfra, girar la caja 90 hasta que el sector 1 quede a la
izquierda y el 2 hacia arriba a la derecha.
6. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 2 invadiendo el sector 1 para llevar un poco de material al sector 2 y las
siguientes estras no deben tocar el sector 1. En esta forma se diluye el material quedando unas bacterias
separadas de las otras.
7. Esterilizar de nuevo el asa, girar la caja 90 y ahora el sector 2 estar a la izquierda y el 3 a la derecha.
8. Trazar unos 5 zig-zags en el sector 3 invadiendo el sector 2 y el resto sin tocar el sector 2, como se muestra
en el dibujo:
9. Incubar a 37C por 24-48 horas.

10. Observar si hubo o no, aislamiento de colonias.
NOTA:
En el sector 1 generalmente no se obtienen colonias aisladas, pero en 2 y 3 s.
VO1/08/13
25

CUESTIONARIO
1) Asilamiento por el mtodo de diluciones.
a) Indicar hasta que dilucin encontr colonias aisladas a partir de las muestras estudiadas.
MUESTRA
DILUCIN
_______________________________ ____________________________
_______________________________ ____________________________
_______________________________ ____________________________
_______________________________ ____________________________
_______________________________ ____________________________
_______________________________ ____________________________
b) Escribir en la tabla siguiente, el nmero de colonias encontradas en cada una de las diluciones indicadas por
el profesor.
2.- DILUCIN
___________________
___________________
___________________
___________________
No. DE COLONIAS / 0.1 ml

__________________________
__________________________
__________________________
__________________________
No. DE COLONIAS / ml
___________________________
___________________________
___________________________
___________________________
2) Describir una tcnica de aislamiento bacteriano a partir de una fuente natural.
3) Consultar dos tcnicas de aislamiento en tubo.
4)
Qu es un cultivo astnico o puro?
5) Qu importancia tiene la obtencin de un cultivo puro?
6) Mencionar 5 Colecciones de Cultivos suministradoras de cultivos microbianos puros.
INFORME.
CONCLUSIONES.
NOMBRE DEL ALUMNO:

Apellido Paterno
GRADO Y GRUPO:
Apellido Materno
FECHA:
Nombre(s)
CALIFICACIN:
FIRMA DEL ALUMNO

VO1/08/13
FIRMA DEL PROFESOR

26

BLOQUE I APLICAR TCNICAS BACTERIOLGICAS BSICAS

PRCTICA No. 4
COPROCULTIVO
Obtiene cultivos microbiolgicos puros.

Actividad Especfica
Identifica Enterobacterias por medio del coprocultivo.
INTRODUCCIN
Es de reconocer la importancia de la tcnica, recalcando que las enterobacterias representan la mayor parte de
la flora microbiana del tracto intestinal del hombre. En ella se incluyen grmenes comensales (Proteus y bacilos
coliformes), as como patgenos del gnero Salmonella y Shigella . Pueden estar presentes tambin
estreptococos intestinales (enterococos), Clostridium, levaduras (incluso Candida albicans) y ocasionalmente
estafilococos patgenos. El Vibrin colrico puede ser aislado en casos de clera; ocasionalmente es necesario
tratar de aislar Mycobacterium tuberculosis en materia fecal.
CONCEPTOS PREVIOS
Tracto intestinal
Flora bacteriana patgena
Cantidad
MATERIALES Y EQUIPO
Capacidad Y
Nombre
Descripcin
21
Cajas de petri
con agar ss
21
Asas
de platino
Mecheros
de bunsen
7
7
1
Telas
Soportes
Alcohol
asbesto
universales
1 lt
Paquete
algodn
Hisopos
de
Cantidad
2 de 500 gr
SUSTANCIAS
Nombre Y
Descripcin
Salmonella y
Shigella agar
Frmula
Qumica
Muestras de
copro ( 1 por
equipo)
500 gr
de algodn
a) Raspado rectal con hisopo, conservando ste en medio de caldo simple o solucin gliceral salina de
Feague-Clurman modificada por Sachs en tubo de 13 por 100 mm. Este ser el mtodo de eleccin,
particularmente en nios menores de cinco aos.
VO1/08/13
27

b) Materia fecal evacuada recientemente y llevada al laboratorio en frasco de boca ancha.

c) Papel filtro impregnado de material fecal.
1.- Con el hisopo se inocular directamente en el
medio S-S agar.
2.- Arrastrar a muestra con el asa de platino haciendo
la forma del pentgono en el medio de cultivo.
3.- Se introducen las cajas de petri previamente
inoculadas en la incubadora bacteriolgica de 48 a 72
horas.
4.- Se observa la flora bacteriana aislada.
INFORME.
CUESTIONARIO
1. Mencione los errores comunes que se presentaron durante el cultivo
2. Describa las caractersticas coloniales que se observaron durante el cultivo de cada medio inoculado.
3. Cules son las caractersticas de las enterobacterias, y porqu se les denomina como tal?
4. Mencione el nombre de la bacteria resultante de este cultivo, adems de las caractersticas propias de ella y
las afectaciones que origina.
5. Cules son las principales bacterias patgenas que pueden ser aisladas por medio del coprocultivo? Qu
enfermedades producen cada una de stas?
CONCLUSIONES
NOMBRE DEL ALUMNO:
Apellido Paterno
GRADO Y GRUPO:
Apellido Materno
FECHA:
Nombre(s)
CALIFICACIN:
FIRMA DEL ALUMNO
VO1/08/13
FIRMA DEL PROFESOR
28

BLOQUE I APLICAR TECNICAS BACTERIOLGICAS BSICAS

PRCTICA No. 5
UROCULTIVO
Obtiene cultivos microbiolgicos puros.

Actividad Especfica: Identifica la diferente flora patgena que puede desarrollarse en el tracto urinario.
INTRODUCCIN
Las infecciones urinarias pertenecen al grupo de los
procesos infecciosos ms frecuentes de la patologa mdica.
Su importancia radica en el dao que pueden ocasionar
sobre la funcin renal.
Las vas urinarias normalmente son estriles por encima del
nivel de la uretra distal. Los microorganismos que infectan las
vas urinarias altas son comensales localizados en reas
vecinas. En esta colonizacin intervienen varios factores
predisponentes que pueden ser de origen local o general.
Los primeros incluyen la contaminacin fecal del meato
urinario, el cateterismo, la patologa urinaria congnita o
adquirida y el reflujo vesical. Entre los factores generales estn la diabetes mellitus, el embarazo y la terapia
con frmacos de amplio espectro.
Las bacterias que con mayor frecuencia se aslan de la orina de pacientes
ambulatorios con infeccin urinaria son:Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticcus, Proteus sp, Klebsiella
sp, Enterococcus faecalis etc.
Para lograr que el cultivo de orina realmente sea veraz, requiere que las muestras sean obtenidas en
condiciones ptimas. La orina de pacientes con pielonefritis tiene mayor nmero de leucocitos que el normal, y
el nmero de bacterias viables de la porcin media de la miccin excede de 100 000 en un mililitro. El uso de la
sonda para obtener la muestra de orina, aun bajo las mejores condiciones de asepsia, puede producir
infecciones en las vas urinarias.
CONCEPTOS PREVIOS
Aparato genito-urinario.
Flora bacteriana en vas urinarias.
VO1/08/13
29

Cantidad
MATERIALES Y EQUIPO
Capacidad Y
Nombre
Descripcin
21
Asas calibradas
Cubrebocas
2 pares por
mesa
1
(de 4 mm. de
dimetro
da
0.01ml., de 1.5
mm. de dimetro
da 0.001 ml.)
Cantidad
2 de 500 gr
SUSTANCIAS
Nombre Y
Descripcin
Frmula
Qumica
Agar Mac
Conckey.
Guantes.
Alcohol
21
Cajas de petri con

agar Mac Conckey
21
Tubos de centrfuga
96
60 X 15 mm
De 7 ml.
MATERIAL PROPORCIONADO POR EL ALUMNO:

El material biolgico es la orina, obtenida del modo siguiente: se dan instrucciones a la persona para que se
presente en el laboratorio sin haber orinado al levantarse. Se asean con agua y jabn los rganos genitales externos
y en seguida se aplica en la regin que rodea al meato urinario una solucin de merthiolate o de cloruro de
benzalkonio.
Una vez que empieza la miccin, se desecha la primera orina que arrastrar los organismos contaminantes; se
interrumpe la miccin para recoger en un matraz estril unos 10 ml. de orina de la porcin media de la miccin, se
desecha el resto de la orina.
En los nios tambin se asean los rganos genitales externos y regiones vecinas, se aplica despus el dispositivo
de Machuca o bolsas de plstico adhesivas.
El urocultivo debe hacerse dentro de la hora siguiente a la recoleccin de la orina, o bien si esto no es posible,
debe guardarse la orina en el refrigerador a 4 C hasta que pueda cultivarse.
PROCEDIMIENTO
El nmero de leucocitos se determina en el sedimento urinario; para ello se depositan 10 ml. de orina en un
tubo de centrfuga graduado; se centrifuga a 2 000 r.p.m. durante 5 minutos, se desecha el sobrenadante y se
resuspende en la gota de orina residual el sedimento. De ste se toma una gota, la cual se deposita en un
portaobjeto limpio y se cubre con un cubreobjeto.
Se observa con el microscopio con objetivo seco fuerte y se cuenta el nmero de leucocitos por campo.
Observe 10 campos y saque el promedio.
VO1/08/13
30

a) Cuenta de leucocitos:
b) Cuenta de Bacterias:
Mtodos con asa calibrada. El mtodo cuantitativo que se utiliza
de rutina es el de la asa calibrada, el mtodo de diluciones slo
en casos especiales. Como su nombre lo indica, en el primero se
usa una asa calibrada para inocular, dicha asa es de 4 mm. de
dimetro y de 0.01 ml. de capacidad.
Se toma una asada de la orina y se hace una siembra por estras
en toda la superficie de la placa. Como en las infecciones del
tracto urinario pueden encontrarse bacterias grampositivas
(estretococos y estafilococos) y bacilos Gram negativos. (E. coli
Paracolobactrum y Proteus), es conveniente sembrar la orina en
una placa de agar sangre y en uno de los medios selectivos para
las bacterias Gram negativas, tales como el medio EMB o el de
Mac-Conkey. En ambas placas la orina debe sembrarse del
modo descrito anteriormente, incubarlas a 37 C y examinarlas
despus de 24 a 48 horas. Se multiplica por 100 el nmero de
colonias que aparecen en la placa, para determinar el nmero
de bacterias que existen en un mililitro de orina.
Si no hay desarrollo en las primeras 24 horas, se reincuba otras
24 y si tampoco esta vez hubo desarrollo se informa que no
hubo desarrollo despus de 24 horas de incubacin.
Ordinariamente se hace antibiograma a las bacterias encontradas en el urocultivo.
Adems de la siembra se hace un frotis con orina bien mezclada, para estudio microscpico directo. La orina se
deposita en la lmina con la misma asa calibrada y se usa la tincin de Gram para el frotis; ste ser positivo
cuando contenga por lo menos unas cuantas bacterias por campo. Si en el frotis directo se encuentran cocos
Gram positivos, se sembrar la orina en una capa con medio de S-110.
El resultado del frotis est en relacin con la contaminacin o la infeccin. La correlacin entre los resultados de
frotis y cultivo es de 75 a 95 por ciento.
c) Mtodo de diluciones:
Con solucin salina al 0.85 por ciento se hacen diluciones 1:10, 1:100, 1:1000 y 1:10 000 de la orina. En tubos
que contienen 13 o 15 ml. de BHI, triptosa-agar o cualquier otro medio nutritivo, el cual se fundir y cuando se
encuentre de 45 a 47C de temperatura poner un mililitro de cada una de las diluciones de orina; agitar por
rotacin y practicar la tcnica de vaciado en placa, incubar a 37 C durante 24 horas y hacer la cuenta de las
colonias que desarrollaron al cabo de este tiempo, se multiplica por la dilucin, y as se obtendr el nmero de
bacterias por mililitro de orina.
Observaciones:
VO1/08/13
31

Estimacin cuantitativa de colonias: en general, cuentas de menos de 10 000 bacterias por mililitro de orina
indican contaminacin; cuando el nmero est entre 10 000 y 100 000, se sospechar infeccin, y si es mayor
de 100 000, se confirmar la sospecha.
Hay casos de pielonefritis en los que el nmero de bacterias es menor de 100 000 en un mililitro de de orina.
Esos casos se presentan cuando el volumen de orina es muy grande y por lo tanto disminuye la concentracin
de bacterias en la unidad de volumen, cuando el paciente tiene micciones frecuentes, y cuando est siendo
tratado con agentes antimicrobianos o cuando el pH de la orina es menor de 5.
Microorganismos presentes en el tracto urinario:
Las infecciones bacterianas del tracto urinario pueden
presentarse en pacientes de cualquier edad y cualquier sexo pueden variar desde infecciones inaparentes
hasta enfermedades sistemticas severas. El diagnstico clnico de pielonefritis frecuentemente pasa
inavertido, debido a la ausencia de sintomas en el tracto urinario. La relacin entre bacteriuria y pielonefritis
activa inaparente slo ha sido demostrada recientemente en autopsias.
La demostracin de los
microorganismos por cultivos apropiados es, por lo preciso, la nica manera posible de hacer el diagnstico.
Debido a que las muestras de orina frecuentemente se contaminan en su recoleccin, el desarrollo de
microorganismos, aun de los patgenos conocidos, no establece necesariamente el diagnstico de infeccin del
tracto urinario. Las publicaciones recientes de Kass, Sanford, McDonald, Beeson y otros, constituyen una
bibliografa extensa y contienen una revisin actual de este tema indican que la cuenta de bacterias en orina
fresca de pacientes con infeccin de las vas urinarias es, habitualmente, mayor de 100 000 en un mililitro,
mientras que las muestras de personas no infectadas y normales o son estriles o no contienen ms de 10 000
bacterias en un mililitro.
Por lo tanto, para valorar el significado clnico de un cultivo de orina, se recomienda tomar en cuenta el nmero
de bacterias presentes en la muestra.
3. Valores normales:
Leucocitos en orina:
Adultos: hasta 100 en un mm.
Nios:
hasta 50 en un mm.
La flora bacteriana de las orinas normales difiere de la de las orinas con microorganismos patgenos. En
el primer caso, los microorganismos encontrados ms frecuentemente son:
En personas normales, generalmente no hay desarrollo de grmenes o tienen menos de 10,000 en 1 ml., sin
aumento de leucocitos en la orina.
Medidas de seguridad y Control:
Las generales para efectuar las pruebas de microbiologa.
INFORME.
VO1/08/13
32

CUESTIONARIO
1. Mencione las caractersticas distintivas del Urocultivo.
2. Mencione porqu se consideran caractersticas cuantitativas en ste cultivo
3. Cules son las caractersticas cualitativas detectadas durante la tcnica?
4.
Apoyndose en el cuadro para Urocultivo anexo seale las caractersticas resultantes de la bacteria
sospechosa
5. Mencione el nombre de las bacterias resultantes en las prcticas, adems de las caractersticas propias de
ellas y sus patologas que origina; esto es del trabajo colaborativo.
CONCLUSIONES
NOMBRE DEL ALUMNO:

Apellido Paterno
GRADO Y GRUPO:
Apellido Materno
FECHA:
Nombre(s)
CALIFICACIN:
FIRMA DEL ALUMNO
VO1/08/13
FIRMA DEL PROFESOR
33

ANEXO.
Cuadro para urocultivo

PATOGENA
GRAM POSITIVA
NO PATOGENA
Estreptococo betahemoltico
Estafilococo coagulasa positiva
Cndida albicans
Escherichia coli
Aerobacter
Proteus
GRAM NEGATIVA
BAAR
VO1/08/13
Difteroides
Bacillus subtilis
Estafilococo coagulasa
negativa
Levaduras saprfitas
Mycobacterium
tuberculosis
34

BLOQUE I. APLICA TCNICAS BACTERIOLGICAS BSICAS

PRCTICA No.6
OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS, COLORACIONES SIMPLES, TINCIN DE GRAM Y DE
ACIDORRESISTENTES
INDICADOR DE DESEMPEO.
Prepara tinciones microbiolgicas..

Prepara correctamente su mesa de trabajo.

Identifica claramente el material adecuado para el desarrollo de la prctica.
Realiza la obtencin de la muestra adecuada.
Ejecuta correctamente el mtodo adecuado de coloracin para la identificacin de diversas estructuras
bacterianas, como apoyo en el diagnostico de enfermedades.
Higieniza adecuadamente su rea de trabajo y su persona, despus de concluida la prctica.
II. INTRODUCCIN
El mundo microscpico, al igual que el macroscpico, presenta gran diversidad entre sus individuos. Los
microorganismos se caracterizan en parte por su morfologa, aunque algunos sean pleomorfos.
Para observar a los microorganismos en ocasiones basta ponerlos debajo del objetivo del microscopio y afocar
(caso de las algas, protozoarios y algunos hongos), ya que su tamao, presencia de pigmentos, etc., hace fcil
la observacin. Las bacterias en cambio, por su pequeez y por estar constituidas en su mayor parte por agua,
requieren de ser teidas.
Cantidad
21 pzas
7 cajas
20 pzas
7 pzas
VO1/08/13
MATERIALES Y EQUIPO
Capacidad Y
Nombre
Descripcin
Capacidad de
0.5mm de
Asa y alambre para
dimetro. Colocar
siembras
en cada mesa de
trabajo.
Caja con 30
cerillos.
Cerillos
Proporcionar en
cada mesa de
trabajo.
22 x 22 mm
Laminillas de
Cubreobjetos
vidrio, colocar en
cada mesa de
trabajo.
Mechero
Colocar en cada
mesa de trabajo.
35
Cantidad
SUSTANCIAS
Nombre Y
Descripcin
Frmula
Qumica
120ml
Cristal violeta, colocar 5 ml en frasco

gotero, para cada mesa de trabajo.
120 ml
Azul de metileno, colocar 5 ml en

frasco gotero, para cada mesa de
trabajo.
1 kit de
colorantes
para tincin
de Gram
Incluye 4 de los colorantes: cristal

violeta, alcohol-cetona, sol. de lugol,
safranina con capacidad de 50 ml por
cada reactivo.
1 kit de
colorantes
para tincin
de BAAR
Incluye 3 de los colorantes: fucsina

fenicada, alcohol-acido, azul de
metileno, con capacidad de 50 ml por
cada reactivo.

7 pzas
Pao que no deje

pelusa
7 pzas
Papel filtro
Pinzas de crisol
20 pzas
Portaobjetos
7 pzas
Tela de alambre
7 pzas
Tripie
7 pzas
Varilla doblada en U
Colocar en cada
mesa de trabajo
20 ml
Aceite de inmersin.
Proporcionar en frasco gotero a cada
mesa de trabajo.
Colocar en cada
mesa de trabajo
Colocar en cada
mesa de trabajo
25 x 75mm
Laminillas de
vidrio. Colocar en
cada mesa de
trabajo.
Colocar en cada
mesa de trabajo.
Colocar en cada
mesa de trabajo.
Colocar en cada
mesa de trabajo.
MATERIAL BIOLOGICO:
Muestra de diversos charcos de agua.
PROCEDIMIENTO
1. OBSERVACIN DE MICROORGANISMOS.
A) Colocar una gota de infusin de paja o agua de charco en un portaobjetos limpio y desengrasado. Cubrir con
un cubreobjetos siguiendo las indicaciones del profesor de prcticas. Para la observacin hacer uso PRIMERO
del objetivo seco dbil y despus del seco fuerte. Hacer un esquema de los microorganismos que observe
anotando sus caractersticas ms sobresalientes.
2. COLORACIONES SIMPLES.
A) Preparacin de Frotis.
1. Con el asa previamente esterilizada y enfriada de manera
conveniente, siguiendo las indicaciones del profesor de
prcticas, tomar una pequea gota de cultivo en caldo o
pulque y colocarla sobre un portaobjetos limpio y
desengrasado en el que se habrn puesto las iniciales del
cultivo que se va a teir y todo lo que indique el profesor de
prcticas. Si se toma el cultivo de un medio slido, se coloca
una pequea gota de agua sobre el portaobjetos y en ella se
emulsiona el cultivo (una cantidad muy pequea).
2. Extender con el asa o el alambre la emulsin sobre el
portaobjetos a fin de tener una pelcula muy delgada.
3. Dejar secar la pelcula al aire o dentro de una estufa.
4. Una vez seco el frotis fijarlo hacindolo pasar rpidamente, tres veces, con el frotis hacia la llama, por en
medio de la llama, siguiente las indicaciones del profesor.
VO1/08/13
36

B) Tincin de Frotis.
1. Teir el frotis con alguno de los colorantes que se proporcionen, dejndolo actuar, si se trata de cristal violeta
o fucsina fenicado 30 seg., si de azul de metileno 5 min.
2. Lavar con agua de la llave.
3. Escurrir, secar suavemente con papel filtro.
4. Dejar secar perfectamente al aire o bien pasando varias veces el frotis, con la preparacin hacia arriba, sobre
la llama.
5. Una vez perfectamente seco, colocar una pequea gota de aceite de inmersin.
6. Observar a inmersin.
7. Dibujar lo que se observa.
3. TINCIN DE GRAM
1. Teir el frotis con cristal violeta 1 min.
2. Lavar con agua de la llave
3. Cubrir el frotis con lugol y dejar actuar 1 min.
5. Decolorar con alcohol-acetona (o con alcohol de
95%) durante 10 seg. o gota a gota hasta que la
ltima salga clara sin colorante.
7. Teir con safranina 1 min.
8. Lavar con agua de la llave y quitar el exceso de
agua con papel filtro (por la parte suave y sin frotar).
9. Dejar secar al aire.
10. Observar a inmersin y dibujar lo que se
observa.
NOTA:
Los microorganismos positivos al Gram tomar el
primer colorante y aparecen teidos de color violeta o azul obscuro. Los que aparecen en rojo toman la
safranina y son negativos al Gram. Existen microorganismos variables al Gram, conviene, por tanto, hacer los
frotis de cultivos jvenes. Si apareciera dentro de la clula una parte sin teir puede tratarse de endosporas que
no toman fcilmente los colorantes.
4. TINCIN DE CIDORRESISTENTES.
A) Tcnica de Ziehl-Neelsen.
1. Preparar un frotis del cultivo que se proporcione o de saliva.
2. Colocar encima del frotis un pedazo de papel filtro que cubra toda su
superficie e impregnarlo con colorante de Ziehl-Neelsen.
3. Colocar encima de una tela de alambre sobre un bao de agua o sobre una
platina calentadora.
4. Dejar actuar el colorante en forma de vapor 3-5 min sin permitir que se seque el colorante adicionando ms o
manteniendo con agua hmedo el papel constantemente.
6. Decolorar un alcohol-cido hasta que la ltima gota salga slo ligeramente rosa.
8. Teir con azul de metileno.
10. Secar y observar a inmersin.
VO1/08/13
37

NOTA: Los cidorresistentes aparecen en rojo los dems en azul.
INFORME.
Ser presentado en forma individual en el
formato de la UVE de Gowin al titular.
CUESTIONARIO
1.- Menciona las diferentes formas que presentan las bacterias.
2.- Cul es el fundamento de la tincin de gram?
3.- Cul es el fundamento de la tincin de Zielh- Neelsen?
4.- Menciona los antibiticos que se utilizan para bacterias gram + y para bacterias gram . Y por qu?.
CONCLUSIONES.
NOMBRE DEL ALUMNO:

Apellido Paterno
GRADO Y GRUPO:
Apellido Materno
FECHA:
Nombre(s)
CALIFICACIN:
FIRMA DEL ALUMNO
VO1/08/13
FIRMA DEL PROFESOR
38

BLOQUE II. APLICAR LOS METODOS DE TINCION DE BACTERIAS

PRCTICA No.7
PREPARACIN DE BIOQUMICAS E IDENTIFICACIN DE GRUPOS BACTERIANOS
.
Conoce las tcnicas de identificacin de bacterias a travs de mtodos de tincin y pruebas bioqumicas.
Aplica experimentalmente mtodos de tincin y bioqumicas para identificar bacterias de acuerdo a su
metabolismo.

Conoce e identifica claramente los medios de cultivo para las pruebas bioqumicas.
Ejecuta correctamente el mtodo adecuado de preparacin y esterilizacin en la preparacin de las
pruebas bioqumicas.
Identifica claramente a travs de los cambios de coloracin el resultado de las pruebas bioqumica e
identificacin de la bacteria como apoyo en el diagnstico medico de diversas enfermedades.
INTRODUCCIN
Los medios de cultivo especiales tambin denominados bioqumicas son peculiares y necesarios para poder
determinar la especie bacteriana del cultivo realizado, es decir, nos permite tener un resultado mas especfico.
Por ello, se debe tener atencin desde la forma de preparacin, siembra y lectura de resultados. Nos
apoyaremos en tablas de bioqumicas y reactivos adecuados para su mejor observacin
CONCEPTOS PREVIOS
Preparacin de medios de cultivos

Lectura de bioqumicas
Siembra de bioqumicas
Anlisis de resultados
Tcnicas de muestreo
Caractersticas coloniales
Requerimientos nutricionales bacterianos
Identificacin bacteriana
Esterilizacin
Medidas de seguridad
VO1/08/13
39

Cantidad
21 pzas
21 pzas
7 pzas
130 pzas
MATERIALES Y EQUIPO
Capacidad Y
Nombre
Descripcin
Asa y aguja
Proporcionar 3
bacteriolgica
pzas en cada
mesa de trabajo
Hisopos esteriles
Proporcionar 3
pzas en cada
mesa de trabajo
Material comnmente
empleado en
bacteriologa
Mechero de Fisher
Proporcionar en
cada mesa de
trabajo
Tubos con tapa de
Proporcionar 18
rosca para pruebas
tubos en cada
bioqumicas
mesa de trabajo
200 ml
SUSTANCIAS
Nombre Y
Descripcin
citrato de
Simmons
200ml
Agar hierro de
Kligler
Cantidad
200ml
7 pzas
Proporcionar
en cada mesa de
trabajo
Medio MIO
Caldo de Urea
200 ml
200 ml
200ml
Gradilla para tubos de

ensaye .
Agar de hierro
y triple azcar
Medio SIM
Reactivo de
Erlich
50 ml
Reactivo de
Kovacs
50 ml
1 equipo
7 equipos
Olla de esterilizacin o
autoclave.
Parrillas de
calentamiento.
Agitadores de vidrio
7 pzas
Frmula
Qumica
Proporcionar 0.5
ml en tubos de
ensaye para
cada mesa de
trabajo
Proporcionar 0.5
ml en tubos de
ensaye para
cada mesa de
trabajo
Proporcionar 1 pza
en cada mesa de
trabajo
Proporcionar 1 pza
en cada mesa de
trabajo
PROCEDIMIENTO
La siembra de las pruebas bioqumicas se realiza despus de la resiembra, con la finalidad de realizar la
prueba a un organismo ya aislado y poder contribuir a su correcta identificacin.
Medios para estudiar la fermentacin de los azucares por las bacterias:
Las enterobacterias fermentan numerosos azcares. En el trabajo de rutina se emplean slo algunos y que nos
servirn para diferenciarlas.
VO1/08/13
40

Los medios para bioqumicas ms comunes son:

AGAR CITRATO DE SIMMONS:
Se puede emplear para la prueba de utilizacin de Citrato como una de las pruebas del IMVIC.
Pueden hacerse en placa o si se prefiere, inclinado, donde se inocula picando el fondo y estriando la superficie, los
cultivos se incuban hasta por 4 das a temperatura de 35 a 37C. La aparicin de un crecimiento visible v por lo
general acompaado ce un cambio alcalino (azul del indicador bromotimol).
Negativos
Escherichia
Shigella
Listeria
Positivos
Arizona
Enterobacter
Citobacter
Klebsiella
Salmonella
serratia
AGAR HIERRO DE KLIGLER

Es un medio para diferenciar bacilos entricos gramnegativos con una forma similar al TSI
(hierro y triple azcar) y se basa en las mismas propiedades de fermentar la glucosa y lactosa junto con la formacin de
sulfuros, ste medio se debe inocular por picadura en el fondo y estra en la superficie.
Los grmenes fermentadores de la lactosa acidifican totalmente el medio, comunicndole a este un color amarillo, los
microorganismos que no la fermentan acidifican el fondo del medio permaneciendo del color rojo cereza inicial y por
ltimo los formadores de cido sulfhdrico ennegrecen el medio. Se recomienda usar el medio el mismo da de su
preparacin.
En este medio se pueden observar las fermentaciones de la glucosa, lactosa y la produccin del sulfuro de
hidrgeno y gas.
Se siembra por picadura y estras en su superficie, se incuba 24 horas a 37 C.
Fondo amarillo: Fermenta la glucosa.
Superficie amarilla: Fermenta la lactosa.
Trayecto de la picadura negro: Produce sulfuro de hidrgeno.
Formacin de burbujas en el medio y elevacin del mismo: produce gas.
Organismos
Enterobacter
Hafnia
Klebsiella
Escherichia coli
Shigella
Salmonella tiphy
S. paratiphy
S. choleraesuis
Otras salmonellas
Citrobacter
Edwardsiella
Serratia
Proteus
VO1/08/13
Superficie
inclinada
cido
alcalino
cido
cido (alcalino)
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino (cido)
Alcalino
Alcalino (cido)
cido (Alcalino)
41
Fondo
alcalino
cido
cido
cido
cido
cido
cido
cido
cido
cido
cido
cido
cido
Gas
++
+
++
+(-)
+
+
+
+
+
-
H2S
+ (-)
+++
+++ (-)
+++
-

P. vulgaris
P. mirabilis
P. morganii
P. rettgeri
Providencia
Alcalino (cido)
Alcalino
Alcalino
Alcalino
Alcalino
cido
cido
cido
cido
cido
+
+
+-
+++
+++
-
MEDIO MIO:
Se usa para la identificacin de Enterobacterias sobre la base de miovilidad, ornitina descarboxilasa y de Indol.
Los cultivos son inoculados por puncin preparados en tubos por 18 a 24 horas a 35- 37C, se leen las caractersticas
de movilidad y ornitina antes de agregar el reactivo de Kovacs para la prueba de indol. La movilidad es apreciada por la
turbiedad del medio o por crecimiento extyendido a partir de la lnea de inoculacin. La ornitina es indicada por el color
prpura del medio y la prueba negativa produce un color amarillo, que puede ser prpura al final. Para la prueba del
indol se agregan 3 o 4 gotas del reactivo de Kovacs y se agita suavemente el tubo, la aparicin del color rosa o rojo del
reactivo, se interpreta como prueba positiva del indol y siempre se deber comparar con un tubo testigo.
MEDIO SIM:
Sirve para diferenciacin e identificacin de enterobacterias, es un medio semislido, de rutina y que detecta la
produccin de sulfuros, indol y movilidad de las mismas.
En este medio se puede observar la produccin de sulfuro de hidrgeno, de indol y la movilidad del germen.
Se siembra por picadura y se incuba 24 horas a 37 C. Trayecto de la picadura negro: produce sulfuro de
hidrgeno.
Cuando se aade el reactivo de Kovac y da color rojo: produce indol.
Cuando el germen se desarrolla en el trayecto de la picadura y se exiende a los lados:
es mvil.
Urea sacarosa (surraco): en este medio se puede observar la fermentacin de la
sacarosa y la hidrlisis de la urea.
Color morado: Hidroliza la urea.
Color amarillo: Fermenta la sacarosa.
bacteria
Salmonella tiphy
Salmonella
Shigella
E. coli
Klebsiella
Enterobacter
Citrobacter
VO1/08/13
ProduccinProduccin
de
de indol
H2S
+ + +o
+
+
+
-
42
Movilidad
+
+
+
+
+

CALDO DE UREA
Se emplea para la identificacin de bacterias, particularmente para diferenciar los miembros del gnero Proteus
de la Salmonella y Shigella.
Tambin puede usarse para la determinacin de la actividad de la ureasa en microorganismos de la familia
Brucella, Bacillus, Sarcina y Mycobacterium..
Batera de pruebas incluidas y tablas de lectura con coloraciones positivas y

negativas
Las reacciones bioqumica:
Prueba
Glucose
Dulcitol
PA
Reaccin / Enzimas
fermentacin de glucosa
produccin de gas en la fermentacion de
la glucosa
lisina descarboxilasa
ornitina descarboxilasa
produccin de H2S
produccin de indol
produccin de adonitol
fermentacin/oxidacin de lactosa
fermentacin/oxidacin de arabinosa
fermentacin/oxidacin de sorbitol
produccin de acetona (VogesProskauer)
utilizacin del dulcitol
fenilalanina descarboxilasa
Urea
ureasa
Citrate
utilizacin del citrato
Gas
Lysine
Ornithine
H2S
Indole
Adonitol
Lactose
Arabinose
Sorbitol
VP
Negativo
rojo (a naranja)
sin desprendimiento de
cera
amarillo
amarillo
de beige a mbar claro
incoloro
rojo (a naranja)
rojo (a naranja)
rojo (a naranja)
rojo (a naranja)
de incoloro a mbar
claro
verde
cualquier tono de verde
de incoloro a mbar
claro
verde
Positivo
amarillo (a dorado)
sin desprendimiento
de cera
morado
morado
negro
rojo o rosa
amarillo (a dorado)
amarillo (a dorado)
amarillo (a dorado)
amarillo (a dorado)
rojo
amarillo (a dorado)
de negro a gris oscuro
de rosa claro a rosa
azul
INFORME: Ser presentado en forma individual en el formato de la UVE de Gowin al titular
VO1/08/13
43

CUESTIONARIO:
1) Mencione las caractersticas de las enterobacterias patgenas en el medio de AHK (agar hierro de Kligler)
2) Mencione la funcin del reactivo de Kovacs, y en qu pruebas en especfico se utiliza.
3) Cules son las caractersticas en comn que se leen en el medio AHK SIM y MIO?
4) Apoyndose en el cuadro para pruebas bioqumicas anexo, seale las caractersticas resultantes de la
bacteria sospechosa:
5)
Mencione el nombre de las bacterias resultantes en las prcticas, adems de las caractersticas propias de
ellas y sus patologas que origina; esto es del trabajo colaborativo.
CONCLUSIONES
NOMBRE DEL ALUMNO:

Apellido Paterno
GRADO Y GRUPO:
Apellido Materno
FECHA:
Nombre(s)
CALIFICACIN:
FIRMA DEL ALUMNO
VO1/08/13
FIRMA DEL PROFESOR
44

BLOQUE II. APLICAR LOS METODOS DE TINCION DE BACTERIAS

PRCTICA No.8
PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)
.
Aplica experimentalmente mtodos para la reproduccin y crecimiento de bacterias
Realizar la Prctica de susceptibilidad de los grmenes a los antimicrobianos, mediante la tcnica de

Bondi, probando la sensibilidad a diferentes antibiticos, para el reporte de resultados confiables en un
ambiente de seriedad y respeto

Conoce e identifica claramente los medios de cultivo para la prueba de sensibilidad a los antibiticos.
Ejecuta correctamente el mtodo adecuado para la prueba de sensibilidad a los antibiticos.
Identifica claramente a travs de mediciones los niveles de sensibilidad y resistencia de la bacteria a
diversos antibiticos.
Desinfecta adecuadamente su rea de trabajo y su persona, despus de concluida la prctica.
INTRODUCCIN
El mtodo consiste en sembrar el germen en un
medio en el que se desarrolle perfectamente y en
ponerlo en contacto con discos de papel
impregnados con los antimicrobianos.
En el caso de Mycobacterium tuberculosis los medios
en los que se siembra este germen contienen
distintas concentraciones de los antimicrobianos que
se utilizan para tratar las infecciones producidas por
l.
1. Divisin de los grmenes segn la constancia

de su susceptibilidad a los antimicrobianos.
2. Indicacin de la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos segn la muestra de donde se les aisl.
3. Grupos de antibiticos que deben usarse, segn sean su afinidad a los colorantes de la tincin de Gram.
4. Podemos dividir a los grmenes en dos grupos segn su susceptibilidad a los antibiticos:
a) Grmenes con susceptibilidad constante a un antibitico.
b) Grmenes con susceptibilidad variable a los antibiticos.
VO1/08/13
45

Slo haremos pruebas de susceptibilidad a los grmenes que pertenecen al segundo grupo y que se
hayan aislado de sitios donde normalmente no se encuentran, o si se les encuentra predominan en forma
importante sobre los dems (cultivo puro).
A los grmenes cuya sensibilidad es constante a determinado antibitico es innecesario practicar pruebas de
susceptibilidad a los antimicrobianos.
Como son:
Diplococcus pneumoniae (neumococo).
Streptococcus pyogenes (streptococo beta hemoltico).
Neisseria gonorrhoeae (gonococo).
Neisseria meningitidis (meningococo).
Haemophilus influenzae.
Bordetella pertussis.
Brucellas.
Treponemas.
Staphylococcus epidermidis
A los grmenes cuya sensibilidad es constante a determinado antibitico, pero que algunas de sus cepas
son resistentes, puede ser til la determinacin de la susceptibilidad.
Streptococcus viridans (streptococo alfa hemoltico).
Shigellas.
Mycobacterium tuberculosis (bacilo de Koch).
S. faecalis (estreptococo gama no hemoltico).
Salmonella typhi.
Hay grmenes a los que es necesario hacer pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos debido a la
gran variabilidad de cepas sensibles o resistentes que se observan dentro de la misma especie:
Staphylococcus aureus.
Escherichia coli, cuando se asla de muestras que no sean fecales o cepas patgenas aisladas de
materias fecales de nios de menos de diez aos.
Proteus, cuando se asla de muestras que no sean fecales.
Paracolon (Citrobacter y Arizona), cuando se asla de muestras que no sean fecales, Klebsiella
(aerobacter), cuando se asla de muestras que no sean fecales.
Pseudomonas (piocinico), cuando se asla de muestras que no sean fecales o en materias fecales
cuando desarrollan en cultivo puro o casi puro.
VO1/08/13
46

Cantidad
21
MATERIALES Y EQUIPO
Capacidad Y
Nombre
Descripcin
Proporcionar 3
Hisopos esteriles
pzas en cada
mesa de trabajo
7 pzas
Mechero
Proporcionar 1 pza
en cada mesa de
trabajo
7 cajitas
cerillos
Proporcionar 1
cajita en cada
mesa de trabajo
1 equipo
Estufa bacteriologica
Cantidad
21 pzas
21 pzas
SUSTANCIAS
Nombre Y
Descripcin
Frmula
Qumica
Medio de
Mller-Hinton
Sensi-Disc
(12) Dispenser
(B.B.L.)
Discos de
papel
impregnados
con
antibiticos.
PROCEDIMIENTO
a) Sembrar con un hisopo toda la superficie del medio.
b) Poner los discos de papel impregnados con los antimicrobianos segn el
germen.
Ejemplo:
Grupos de antibiticos segn el germen.
Antibiticos para
Gram positivos
Antibiticos para
Gram negativos
Cloxacilina
Eritromicina
Leucomicina
Kanamicina
Gentamicina
Penicilina
Tetraciclina
Ampicilina
Rifamicina
Cloranfenicol
Isoxasolil penicilina
Cefalosporina
Dicloxacilina
Rifamicina
cido oxilnico
Carbecin
VO1/08/13
cido nalidxico
Furadantina
Polimixina B y E (colimicina)
Cloranfenicol
Gentamicina
Kanamicina
Sulfadiazina
Estreptomicina
Ampicilina
Tetraciclina
Neomicina
Noxibiol
Sulfisoxazole
Cefalosporina
Rifamicina
cido oxolnico
Carbecin
47

Lectura:
El germen que es susceptible al antimicrobiano no crece alrededor del disco de papel impregnado con l,
y se observa un halo claro de inhibicin. El informe se da: susceptible o resistente, segn el caso.
El siguiente cuadro contiene los grmenes, los lugares donde se les asla y a cules debe hacrseles prueba
de susceptibilidad a los antimicrobianos.
Debe recordarse que el resultado de la prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos (antibiograma) es
slo una orientacin al tratamiento, cuando un germen se informa que es resistente a todos los antimicrobianos
es conveniente dar el antibitico al que habitualmente es susceptible.
4. Resultados habituales:
Antimicrobianos especficos y los que se suponen tiles en la prctica diaria.
Cocos Gram positivos:
Streptococcus pyogenes
Penicilina G. cristalina
Fenoximetil-Penicilina
Sulfadiazina
Eritromicina
Estreptococcus anaerobio
(Peptostreptococcus)
Streptococcus viridans
Streptococcus faecalis
Penicilina G cristalina
(Dosis altas)
Tetraciclina
Cloramfenicol
Ampicilina
(en relacin con la forma clnica y la evolucin)
(Enterococo)
Staphylococcus aureus
Rifamicina
Dicloxacilina
Cefalosporina, cuando los otros antimicro-bianos no
han sido eficaces.
Diplococccus pneumonaie
Fenoximetil-penicilina
Cocos Gram negativos:

Neisseria meningitidis
N. gonorrhoeae
Bacilos Gram positivos:
Corynebacterium diphtheriae
Sulfadiazina y cloranfenicol
Eritromicina
Penicilina
Tetraciclina
Eritromicina
Listeria monocytogenes
Bacilos Gram negativos:

Brucella
Estreptomicina
Tetraciclina
Salmonella
VO1/08/13
Cloranfenicol (hay cepas resistentes)

Ampicilina
48

Shigella
Enterobacteriaceae
Cloranfenicol
Tetraciclina
Sulfadiazina
Slo en casos de
infeccin severa.
Penicilina
(Grandes dosis)
Cefalosporina
Cloranfenicol
Tetraciclina
En relacin con la
forma clnica del
padecimiento y la
eficacia
teraputica.
Pseudomona aeruginosa
Polimixina B
Polimixina E (Colimicina)
Penicilina (Grandes dosis)
Otros antimicrobianos como tetraciclina, cloranfenicol,
solos o combinados con la estreptomicina, segn la
forma clnica y la evolucin, Gentamicina y carbencin.
Bordetella pertussis
Cloranfenicol
Treponema
Penicilina benzatina
Penicilina G. procana
Eritromicina
Slo en casos de
Tetraciclina
alergia a la penicilina
Cefalosporina. Formas especiales en que no fueron
eficaces la penicilina, la eritromicina o la tetraciclina
Rickettsias
Cloranfenicol
Bacilo tuberculoso
H.A.I.N.
Mycobacterium tuberculosis
Estreptomicina
Tuberculosis
Uso combinado de antimicrobianos

H.A.I.N.
Estreptomicina
Brucelosis
Tetraciclina
Estreptomicina
Grangrena gaseosa
Tetraciclina (solas o combinadas)
Meningitis purulenta
Penicilina G. cristalina y sulfadiacina, en tanto se

conoce el germen que la produce. Si hay sospecha de
infeccin por H. influenzae: ampicilina o cloranfenicol.
VO1/08/13
49

E. Medidas de Seguridad y Control:

Las generales para efectuar las pruebas de microbiologa.
ANEXO 19 Grupos de antibiticos segn el germen.
Antibiticos para
Gram positivos
Antibiticos para
Gram negativos
Cloxacilina
Eritromicina
Leucomicina
Kanamicina
Gentamicina
Penicilina
Tetraciclina
Ampicilina
Rifamicina
Cloranfenicol
Cefalosporina
Dicloxacilina
Rifamicina
cido oxilnico
Carbecin
cido nalidxico
Furadantina
Polimixina B y E
Cloranfenicol
Gentamicina
Kanamicina
Sulfadiazina
Estreptomicina
Ampicilina
Tetraciclina
Neomicina
Noxibiol
Sulfisoxazole
Cefalosporina
Rifamicina
cido oxolnico
Carbecin
INFORME.
VO1/08/13
50

CUESTIONARIO,
1. Mencione la importancia de realizar un antibiograma y en qu casos, puede dar resultados falsos
2. Mencione algunos errores que se cometen a menudo en los trabajos que se realizaron
3. Cules son las afectaciones que se pueden tener al reportar un resultado errneo?
4. Defina los conceptos de sensibilidad, resistencia y mencione como afecta darle un uso indiscriminado a los
antibiticos.
5. Explique la manera en que el estafilococo dorado ha logrado ser resistente a la penicilina y
INFORME.
CONCLUSIONES.
NOMBRE DEL ALUMNO:

Apellido Paterno
GRADO Y GRUPO:
Apellido Materno
FECHA:
Nombre(s)
CALIFICACIN:
FIRMA DEL ALUMNO
VO1/08/13
FIRMA DEL PROFESOR
51

BLOQUE III. DETERMINAR LAS TECNICAS PARA IDENTIFICAR COCOS Y BACILOS GRAM POSITIVOS
DE INTERES MEDICO
PRCTICA No.9
TCNICA DE TINCIN DE SHEAFFER Y FULTON
Probar la importancia de la tcnica de tincin de Sheaffer-Fulton, por medio de su realizacin tomando

consciencia de su utilidad, con actitud de inters y solidaridad
Aplica experimentalmente mtodos de tincin y bioqumicas para identificar
Desinfecta adecuadamente su rea de trabajo y su persona, despus de concluida la prctica.
INTRODUCCIN
Dado que la clasificacin de las bacterias dependen principalmente de su tamao, forma y propiedades de
coloracin, el microscopio ha sido durante mucho tiempo el instrumento principal del microbilogo. Las
preparaciones no teidas pueden ser observadas al microscopio de contraste de fases, pero en general se
utilizan preparaciones fijadas al calor y teidas.
CONCEPTOS PREVIOS
Tipos de tinciones
Pasos de las tinciones
Caractersticas de los Colorantes por usar
Mordentes
Caractersticas de las esporas, formacin , tipos y su clasificacin
Enfermedades producidas por esporas
MATERIALES Y EQUIPO
Capacidad Y
Cantidad
Nombre
Descripcin
Asas bacteriolgicas
Proporcionar 3
21 pzas
pzas en cada
mesa de trabajo
Cantidad
50 ml
Cubre objetos
Proporcionar 3
pzas en cada
mesa de trabajo.
21 pzas
VO1/08/13
Proporcionar 1 pza
en cada mesa de
trabajo.
52
Alumbre
potasio
de
Verde
malaquita
de
50 ml
Mecheros
7 pzas
SUSTANCIAS
Nombre Y
Descripcin
cido tnico
50 ml
Capacidad y
descripcin
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo

Portaobjetos
Safranina
Proporcionar 3
pzas en cada
mesa de trabajo.
21 pzas
50 ml
Varillas de tincin
7 pzas
Fucsina bsica
Proporcionar 1 pza
en cada mesa de
trabajo.
50 ml
Fenol
50 ml
Etanol
50 ml
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo
PROCEDIMIENTO
Tcnica de Shaeffer y Fulton, (Tincin de Esporas).
1. Hacer un frotis de Bacillus sp. de la manera usual.
2. Cubrir el frotis con verde de malaquita y dejarlo actuar durante un minuto.
3. Calentar la preparacin a emisin de vapores durante 5 minutos. El colorante no debe hervir ni secarse.
4. Lavar la preparacin con agua de la llave.
5. Cubrir la preparacin con safranina y dejarla actuar durante un minuto.
6. Lavar la preparacin con agua de la llave, dejar secar al aire y observar al microscopio rojo. con el objetivo
de inmersin. Las esporas se observan de color verde y las bacterias de color contrastante
INFORME: Ser presentado de manera individual en forma de uv de Gowin al titular.
VO1/08/13
53

CUESTIONARIO
1. Cuntos tipos de esporas existen? , Cules son?
2. Cmo se clasifican las esporas bacterianas segn su posicin? Dibuje y nmbrelas
3. Dibuje el desarrollo de una endospora
4. Cules son las partes de una espora bacteriana?
5. Se puede obtener el mismo resultado de cualquier muestra bacteriana? Justifique su respuesta
CONCLUSIONES
NOMBRE DEL ALUMNO:

Apellido Paterno
GRADO Y GRUPO:
Apellido Materno
FECHA:
Nombre(s)
CALIFICACIN:
FIRMA DEL ALUMNO
VO1/08/13
FIRMA DEL PROFESOR
54

DE INTERES MEDICO
PRCTICA No.10
TCNICA DE TINCIN DE KNAYSI
Realizar la tcnica de tincin de Knaysi, por medio del quehacer analtico y mesurado de la
prueba y tomando consciencia de los beneficios de su determinacin
INTRODUCCIN
Dado que la clasificacin de las bacterias dependen principalmente de su tamao, forma y propiedades de
coloracin, el microscopio ha sido durante mucho tiempo el instrumento principal del microbilogo. Las
preparaciones no teidas pueden ser observadas al microscopio de contraste de fases, pero en general se
utilizan preparaciones fijadas al calor y teidas
De ah la importancia de distinguir la pared celular a partir de tinciones diferenciales como la es de Knaysi.
CONCEPTOS PREVIOS
Tipos y constituyentes de paredes bacterianas
Pasos de las tinciones
Caractersticas de los Colorantes por usar
Caractersticas de las paredes, sus componentes
Constitucin del peptidoglucano
MATERIALES Y EQUIPO
Capacidad Y
Cantidad
Nombre
Descripcin
Asas bacteriolgicas
Proporcionar 3
21 pzas
pzas en cada
mesa de trabajo
Cantidad
50 ml
Cubre objetos
21 pzas
VO1/08/13
Proporcionar 3
pzas en cada
mesa de trabajo.
55
SUSTANCIAS
Nombre Y
Descripcin
cido tnico
Alumbre
potasio
50 ml
de
Capacidad y
descripcin
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo

Mecheros
Proporcionar 1 pza
en cada mesa de
trabajo.
7 pzas
Verde
malaquita
50 ml
Portaobjetos
Safranina
Proporcionar 3
pzas en cada
mesa de trabajo.
21 pzas
50 ml
Varillas de tincin
7 pzas
de
Fucsina bsica
Proporcionar 1 pza
en cada mesa de
trabajo.
50 ml
Fenol
50 ml
Etanol
50 ml
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo
Proporcionar 5
ml en frasos
goteros para
cada mesa de
trabajo
PREPARACIN DE SOLUCIONES
a) Mordente de Knaysi
Alumbre de potasio a saturacin 70.0 ml.
cido tnico a saturacin 30.0 ml.
Preparacin:
Mezclar ambas sustancias en el momento de usarse
b) Solucin de fucsina fenolada
Fucsina bsica 5.0 g.
Fenol 25.0 g
Etanol al 95% 50.0 ml.
Agua destilada 500.0 ml.
PREPARACIN DE LOS REACTIVOS:
Colocar en un recipiente 100 ml. de agua destilada y aadir 25 g. de fenol.
Colocar la solucin en un bao de agua hirviendo.
Agregar 5 g. de fucsina bsica y disolver.
IV Aadir 50 ml. de etanol al 95% y mezclar.
Aforar la solucin a 500 ml. con agua destilada.
VO1/08/13
56

PROCEDIMIENTO
Tcnica de Knaysi (Tincin de la Pared Celular)
1. Hacer un frotis de Bacillus sp. en la forma usual y fijarlo al calor.
2. Cubrir el frotis con el mordente de Knaysi y dejarlo actuar durante 10 minutos.
3. Lavar la preparacin con agua.
4. Colocar con el asa una gota de fucsina fenolada sobre la preparacin.
5. Poner un cubreobjetos sobre la preparacin y observar al microscopio con el objetivo de inmersin. La pared
se observa de color rojo intenso alrededor de la bacteria cuyo citoplasma se ve de un color rosa o rojo tenue.
Se dibujarn las observaciones, las cuales irn posteriormente en el reporte
INFORME: Ser presentado de manera individual en forma de UV de Gowin al titular.
CUESTIONARIO
1. Cmo se clasifican los microorganismos segn sus tipos de paredes? , Cules son?
2. Cules son las partes de las paredes bacterianas? Dibuje y nmbrelas
3. Cmo funcionan cada uno de los reactivos en esta tcnica?
4. Qu otra tincin apoya en la identificacin de las paredes bacterianas?
5. Se puede obtener el mismo resultado de cualquier muestra bacteriana? Justifique su respuesta
CONCLUSIONES
NOMBRE DEL ALUMNO:

Apellido Paterno
GRADO Y GRUPO:
Apellido Materno
FECHA:
Nombre(s)
CALIFICACIN:
FIRMA DEL ALUMNO
VO1/08/13
FIRMA DEL PROFESOR
57

DE INTERES MEDICO
PRCTICA No.11
IDENTIFICACIN DE COCOS GRAM POSITIVOS EN DIVERSOS CULTIVOS BACTERIOLGICOS
Se realizarn cultivos bacteriolgicos diversos para la identificacin de cocos gran positivos de inters
medico
Ejecuta correctamente el mtodo adecuado para la identificacin de cocos gran positivos en diversos
cultivos bacteriolgicos par el diagnostico oportuno de diversas enfermedades.
INTRODUCCIN
A la microbiologa mdica corresponde el aislamiento e identificacin de los microorganismos que estn
causando una infeccin en el paciente. En la mayora de los casos el diagnstico debe basarse en la
demostracin del agente etiolgico, aunque a veces sea posible hacer el diagnstico presuntivo exclusivamente
sobre bases clnicas.
Los microorganismos desempean un papel importantsimo que requiere entenderse a cabalidad para
garantizar que en simbiosis con ellos un manejo sanitario e higinico apropiado, que si bien nos proteja de su
accin nociva en el caso de las especies patgenas, permita preservar y enfatizar el efecto protector de las
especies amigables que conviven con nosotros en una verdadera simbiosis.
La piel contiene un flora residente, constante y bien definida, que vara dependiendo de la zona anatmica, es
especial dependiendo de las secreciones o de la proximidad de las membranas mucosas. Los factores ms
determinantes en eliminacin no residente son:
pH bajo, cidos grasos, lavado diario, sudor
Flora normal: los microorganismos que normalmente colonizan la piel y las membranas mucosas de las
personas sanas. La piel y las mucosas siempre estn colonizadas de manera dinmica, sin embargo, de una
forma general, se pueden dividir en 2 poblaciones:
Flora residente: Consiste en un nmero relativamente fijo de especies. Estn formados por
Microorganismos comensales que se reproducen en una zona del cuerpo (no son
esenciales para la vida)
Patgenos oportunistas: son microorganismos de la flora normal alterados o que han
tenido acceso a lugares normalmente estriles produciendo una infeccin.
Flora transitoria: son microorganismos que colonizan en perodo corto de tiempo.
Estos pueden estar formados por

Microorganismos no patgenos: no producen enfermedad
Microorganismos patgenos : La colonizacin de estos producen infecciones.
VO1/08/13
58

El Staphylococcus aureus, conocido comnmente como estafilococo ureo o dorado, es una bacteria
anaerobia facultativa grampositiva productora de coagulasa y catalasa que se encuentra ampliamente
distribuida por todo el mundo, estimndose que una de cada tres personas se hallan colonizadas, que no
infectadas, por ella.
Puede producir una amplia gama de enfermedades, que van desde infecciones cutneas y de las mucosas
relativamente benignas, tales como foliculitis, forunculosis o conjuntivitis, hasta enfermedades de riesgo vital,
como celulitis, abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumona. Adems, tambin
puede afectar al aparato gastrointestinal, ya sea por presencia fsica de Staphylococcus aureus o por la ingesta
de la enterotoxina estafiloccica secretada por la bacteria.
En la actualidad, este microorganismo se erige como el principal causante de las infecciones nosocomiales.
Esta situacin se ve favorecida por el hecho de que esta especie habita tanto en las mucosas como en la piel
de los seres humanos, lo que permite que a travs de las heridas quirrgicas pueda penetrar en el torrente
sanguneo del paciente por medio del contacto directo o indirecto con el personal sanitario, con un objeto
contaminado, o incluso, con otro paciente.
Las cepas habituales de Staphylococcus aureus son resistentes a la penicilina, siendo los antibiticos ms
eficaces para combatirlos los aminoglucsidos, las cefalosporinas, la oxacilina o la nafcilina. Adems de la
administracin del tratamiento antimicrobiano correspondiente, puede ser conveniente, en funcin del caso, la
eliminacin de puertas de entradas como catteres venosos permanentes o drenajes quirrgicos.
Este microorganismo fue descrito por vez primera en el ao 1880, concretamente en la ciudad escocesa de
Aberdeen, por el cirujano Alexander Ogston en el pus que drenaba un absceso infectado
CONCEPTOS PREVIOS
Tipos de flora
Preparacin de medios Cultivo
Medios de cultivo, clasificacin, tipos, componentes
Caractersticas coloniales
Requerimientos nutricionales bacterianos
Identificacin bacteriana
Tablas de caractersticas bioqumicas
Esterilizacin
Medidas de seguridad
Cantidad
MATERIALES Y EQUIPO
Capacidad Y
Nombre
Descripcin
21 pzas
Matraz erlenmeyer de
300ml
21 pzas
Agitadores de vidrio
35 pzas
Cajas de petri
VO1/08/13
Proporcionar 3
pzas en cada
mesa de trabajo
Proporcionar 3
pzas en cada
mesa de trabajo
Proporcionar 5
cajas en cada
mesa de trabajo
59
Cantidad
50 ml
50 ml
50 ml
SUSTANCIAS
Nombre Y
Descripcin
Medio de cultivo
de
Staphyloccocus
110
Medio de cultivo
de Manitol sal y
agar
Medio de cultivo
de Gelosa sangre
Frmula
Qumica

1 equipo
Olla de esterilizacion
o autoclave.
7 equipos
Balanza granataria
Proporcionar 1
equipo por cada
mesa de trabajo
MATERIAL PROPORCIONADO POR EL ALUMNO:

Material biolgico:
Para cultivos de: exudados de lceras, fstulas, heridas y alimentos diversos etc.., debe tenerse en cuenta lo
siguiente:
Tomar muestras en condiciones aspticas para evitar contaminaciones.
Debe obtenerse una cantidad suficiente de material, sobre todo en aquellos casos en que se requieran
varios exmenes; por ejemplo: estudios de rutina para investigar cocos gram positivos
La muestra deber ser tomada, si es posible, directamente de la lesin.
El producto deber obtenerse antes de que se inicie el tratamiento.
a) Heridas:
Las heridas a menudo se infectan por cocos pigenos.
Otros grmenes aislados con frecuencia son pseudomonas, proteus y otras enterobacterias.
Las heridas infectadas por clostridia son fcilmente reconocidas, sobre todo si se trata de alguna gangrena
gaseosa. Es muy importante obtener el producto de la parte ms profunda de la herida para aislar los
organismos etiolgicamente interesantes.
b) Huesos y Articulaciones:
Se aislan tambin cocos pigenos aerobios y anaerobios, M. tuberculosis, salmonellas y brucellas y en
ocasiones hongos. Esos son los grmenes que con ms frecuencia causan las osteomielitis.
c) Ojos:
Los organismos que se aislan con ms frecuencia son:
Bacilos difteroides.
Neisseria.
Bacilos Gram negativos (haemophilus, klebsiella).
Estafilococos, estreptococos aerobios y anaerobios.
d) Odo:
Los grmenes causantes de otitis media y mastoiditis provienen generalmente de las infecciones de la
garganta.
Estreptococo.
Etafilococo.
Neumococo.
Proteus.
Pseudomonas.
Klebsiella.
VO1/08/13
60

Hongos:
Aspergillus.
Mucor sp.
PROCEDIMIENTO
1.- Tome la muestra en condiciones aspticas con hisopo y depostela en un tubo estril.
2.- Haga frotis.
3.- De acuerdo con el sitio de la lesin y el diagnstico presuntivo hasta la tincin correspondiente.
4.- Realizar la siembra en el medio correspondiente
5.- Meter a incubar las muestras de 48 a 72 horas en la estufa bacteriolgica.
6.- Realizar el antibiograma correspondiente.
C. Medidas de Seguridad y Control:
Las generalidades para efectuar las pruebas de microbiologa.
INFORME.
CUESTIONARIO
1. Cules son las afectaciones que se pueden tener al realizar un muestreo de manera incorrecta?
2. Seale las caractersticas resultantes de la bacteria identificada
3. Mencione los errores que se produjeron en esta prctica y la forma de evitarlos
CONCLUSIONES.
NOMBRE DEL ALUMNO:

Apellido Paterno
GRADO Y GRUPO:
Apellido Materno
FECHA:
Nombre(s)
CALIFICACIN:
FIRMA DEL ALUMNO
VO1/08/13
FIRMA DEL PROFESOR
61

El Cuadernillo de Prcticas de la Capacitacin de Laboratorista Clnico del:
MDULO II
PROCESAR LAS TCNICAS PARA EL DIAGNSTICO MICROBIOLGICO
PROGRAMA TERICO PRCTICO
SUBMODULO I
PROCESAR TCNICAS BACTERIOLGICAS BASICAS
Se elabor en el Departamento de Docencia y Apoyo Acadmico con la valiosa participacin de

los docentes del rea de Qumica del Colegio de Bachilleres de Quintana Roo.
Docentes
Q.F.B. Emma Gallego Cuevas.
Lic. Q.C. Emilia Preza Ros
Plantel
Cancn I
Jefa de Materia del rea de Qumica.
Mayo de 2011
VO1/08/13
62

Procesar Tecnicas Bacteriologicas

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Procesar Tecnicas Bacteriologicas

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

Colegio de Bachilleres del

Estado de Quintana Roo

CAPACITACIN DE LABORATORISTA CLNICO

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

BLOQUE I. Realizar la Toma De Muestras Biolgicas del Cuerpo Humano

Prctica 1. Esterilizacin De Materiales Utilizados En Microbiologa

BLOQUE II. Aplicar los Mtodos de Tincin de Bacterias

Practica 11. Identificacin De Cocos Gram Positivos En Diversos Cultivos Bacteriolgicos

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

Resultado de aprendizaje del mdulo

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

La presente asignatura se ubica en el 4 semestre del bachillerato y dentro de la Capacitacin para el

LINEAMIENTOS DIDCTICOS Y EVALUACIN.

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

COMPETENCIAS PROFESIONALES DE EGRESO

PROCESAR LAS TCNICAS PARA EL DIAGNSTICO MICROBIOLGICO.

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

BLOQUE I. REALIZAR LA TOMA DE MUESTRAS BIOLGICAS DEL CUERPO HUMANO.

Nombra el material y equipo para anlisis microbiolgico.

Conoce y aplica los mtodos para la esterilizacin de materiales de microbiologa.

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

Clasificacin de los mtodos de esterilizacin:

a) Esterilizacin por calor:

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

La cmara presurizada utilizada normalmente en el laboratorio es el autoclave. En muchos aspectos una

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

Cuando se utilizan indicadores biolgicos se debe verificar:

Controlar el acceso a las reas de almacenamiento de materiales estriles.

MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

2.- Qu tipos de esterilizacin conoces?

NOMBRE DEL ALUMNO:

FIRMA DEL ALUMNO

FIRMA DEL PROFESOR

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

BLOQUE I. APLICAR TCNICAS BACTERIOLGICAS BSICAS

PREPARACIN DE DIVERSOS MEDIOS DE CULTIVOS MIXTOS Y PUROS.

Identifica y prepara los medios de cultivo para microbiologa.

Conoce y obtiene cultivos microbiolgicos mixtos y puros.

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en:

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS

Agar Salmonella- Sigella

Agar hierro de Kliger

Agar Muller Hinton

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

Con calor y agitacin (ya

Servir en rea asptica en cajas de petri ,

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

PROBLEMAS Y ERRORES MS COMUNES QUE SE PRESENTAN DURANTE LA RECONSTITUCIN DE LOS MEDIOS

Cambio de pH y cambio de color en el medio de

Prdida de las propiedades nutricionales para

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

2. Cul es el fundamento de los medios de cultivo?

4. Por qu se deben almacenar los medios de cultivo en posicin invertida?

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo

FIRMA DEL ALUMNO

FIRMA DEL PROFESOR

Colegio de Bachilleres del Estado de Quintana Roo