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RNA
DNA
Extraccin de RNA
Extraccin
Para la extraccin es necesario romper las paredes y membranas
celulares, adems es importante trabajar rpido y en frio (por eso el uso
de nitrgeno) para evitar la degradacin de RNA por accin enzimtica.
1.- Pulverizar 150mg de material vegetal con Nitrgeno lquido.
2.- Homogenizar el material vegetal con 1.5ml de buffer de maceracin
CTAB e incubar durante 10min a 65C.
Inhibicin enzimtica
Importante inhibir la actividad enzimtica, pues esta puede degradar el
RNA a extraer.
1.- Adicionar un volumen igual de cloroformo:isoamilalcohol (24:1 v/v) y
centrifugar durante 15min a 12000rpm a 4C. Transferir la fase acuosa a
un tubo de reaccin nuevo.
Precipitacin
Purificacin y precipitacin de RNA, para la obtencin de un RNA puro y
limpio.
1.- Adicionar un volumen igual de LiCl 4M e incubar toda la noche a 4C.
2.- Centrifugar durante 30min a 12000rpm a 4C y eliminar el
sobrenadante.
3.- Re suspender el pellet en 1ml de buffer TE-SDS.
4. Adicionar 100l NaCl 5M y 300l de isopropanol e incubar durante
30min a -20C.
5.- Centrifugar durante 10min a 12000rpm a 4C y eliminar el
sobrenadante.
6.- Lavar el pellet con 1ml de etanol absoluto, agitar vigorosamente,
centrifugar durante 5min a 7500rpm a 4C y eliminar el sobrenadante.
7.- Adicionar 1ml de etanol 70%, agitar vigorosamente, centrifugar
durante 5min a 7500rpm a 4C y eliminar el sobrenadante.
8.- Dejar secar el pellet y re suspender con 30l de agua tratada con
DEPC.
9.- Almacenar los extractos a -20C hasta su procesamiento.