KELOMPOK 1

Tugas Makalah Bioteknologi

PRODUKSI PROTEIN TERAPEUTIK

INSULIN
Dosen : Endah Puspitasari, M.Sc. Apt
Disusun Oleh :
122210101040 Ika Nur Masruroh
122210101042 Mia Riswani
122210101050 Galuh Sinoarsih

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2014

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Penyakit kencing manis (diabetes mellitus/DM) memiliki jumlah penderita yang cukup
banyak di Indonesia. Penyakit ini berkembang karena pola makan dan gaya hidup yang salah.
Misalnya terlalu banyak mengonsumsi makanan yang mengandung kolesterol tinggi, jarang
berolahraga, dan sebagainya. Penderita kencing manis diperkirakan akan terus meningkat.
Kalau dulu sebagian besar pengidapnya adalah usia tua, kini mereka yang berusia muda.
Bahkan anak-anak pun, bisa terkena penyakit ini. Diperkirakan DM, di antara penyakitpenyakit noninfeksi, menjadi penyebab kematian paling tinggi di negara maju seperti
Amerika Serikat.
Pada penderita kencing manis, fungsi insulin di dalam tubuhnya terganggu. Padahal
fungsi insulin sangat penting, untuk memasukkan gula dari dalam darah ke sel-sel tubuh
untuk digunakan sebagai energi. Karena itu, pada penderita DM gula tidak dapat masuk ke
dalam sel sehingga tetap beredar di dalam darah. Hal ini dapat diketahui dari kadar gula darah
yang semakin meningkat. Untuk menyembuhkan penyakit ini penderita diberi obat berupa
insulin. Fungsi insulin yang disuntikkan ini adalah mengembalikan fungsi insulin di dalam
tubuh yang mengalami gangguan.
Kencing manis atau dikenal dengan penyakit gula (diabetes mellitus-DM) adalah
penyakit yang ditandai dengan meningkatnya kadar gula (glukosa) dalam darah. Tanda atau
gejala awal diabetes antara lain rasa haus yang berlebihan, rasa lapar, dan sering buang air
kecil. DM yang tidak terkontrol bisa menyebabkan kerusakan dinding pembuluh darah atau
kapiler. Kerusakan ini akan menyebabkan sumbatan yang bisa mengganggu aliran darah ke
jaringan. Jika tidak segera ditangani, DM bisa menyebabkan komplikasi pada organ tubuh
yang lain. Salah satunya adalah mata. Bentuknya adalah glaukoma (peningkatan tekanan bola
mata) dan katarak (kekeruhan pada lensa mata). Ada dua tipe kencing manis, yaitu tipe 1 dan
2. DM tipe-1 terjadi karena kekurangan insulin. Sedangkan DM tipe-2 terjadi karena insulin
di dalam tubuh tidak berfungsi dengan baik.
Insulin adalah hormon yang diproduksi oleh sel beta di pankreas di dalam tubuh, yaitu
sebuah kelenjar yang letaknya di belakang lambung. Fungsi kelenjar ini mengatur
metabolisme glukosa menjadi energi. Selain itu juga mengubah kelebihan glukosa menjadi

glikogen yang disimpan di hati dan otot. Untuk mencegah terjadinya kencing manis, ada
beberapa hal yang bisa dilakukan. Di antaranya memeriksakan diri secara teratur ke dokter,
diet rendah gula, bila kelebihan berat badan maka sebaiknya diturunkan hingga ke posisi
normal.
Meskipun insulin babi dan sapi serupa dengan insulin manusia, komposisinya sedikit
berbeda. Sebagai akibatnya, sistem imun dari sejumlah pasien memproduksi antibodi untuk
melawan insulin, menetralkan aksinya dan menghasilkan reaksi inflamasi pada daerah
suntikan. Selain efek samping di atas, timbul juga ketakutan adanya komplikasi jangka
panjang yang terjadi akibat injeksi terus-menerus suatu bahan asing. Selain itu juga
diproyeksikan akan terjadi penurunan produksi dari insulin yang dihasilkan oleh hewan.
Faktor ini mendorong peneliti untuk mencoba mensintesa Human insulin dengan cara
menyisipkan gen insulin pada vektor yang sesuai, yaitu sel bakteri E. coli untuk
menghasilkan insulin yang secara kimia identik dengan insulin yangterbentuk secara
alami. Hal ini telah dicapai dengan menggunakan teknologi DNArekombinan. Metode ini
lebih dapat diandalkan daripada metode pembuatan insulin yang diperoleh dengan
cara ekstraksi dan pemurnian insulin dari hewan. Selain menggunakan bakteri sebagai host,
dapat juga digunakan host berupa ragi (yeast).
1.2 Rumusan Masalah
1. Apakah pengertian dari insulin?
2. Bagaimana struktur dan fungsi insulin?
3. Bagaimana cara produksi insulin?
4. Bagaimana mekanisme kerja dari insulin dalam menyembuhkan penyakit diabetes?
1.3 Tujuan
1. Mengetahui pengertian dari insulin
2. Mengetahui struktur dan fungsi insulin
3. Mengetahui cara produksi insulin dengan memanfaatkan mikroorganisme.
4. Mengetahui mekanisme kerja dari insulin dalam menyembuhkan penyakit diabetes

PEMBAHASAN
a. Pengertian Insulin
Protein terapeutik merupakan molekul protein yang memiliki aktivitas sebagai obat
sehingga dapat digunakan untuk keperluan klinis. Sejak penemuan insulin pada tahun 1920,
perkembangan penelitian dan produksi protein terapeutik mengalami kemajuan yang sangat
pesat. Saat ini lebih dari 130 protein atau peptida telah disetujui oleh Food and Drug
Administration untuk digunakan dalam kepentingan klinis dan sebanyak

95 protein

diantaranya diproduksi menggunakan teknologi DNA rekombinan.

Beberapa faktor yang harus diperhatikan dalam melakukan produksi protein
rekombinan adalah : pengetahuan mengenai pemilihan sistem ekspresi untuk memperoleh
protein terapeutik dengan sifat dan aktivitas sesuai harapan; penyesuaian dengan regulasi dari
badan berwenang untuk tujuan komersialisasi; penguasaan berbagai metode untuk
karakterisasi dan purifikasi protein serta pengetahuan mengenai status permasalahan terkini
dari protein terapeutik dan pemecahannya untuk melakukan pengembangan melalui
modifikasi protein.
Saat ini, pemenuhan kebutuhan protein terapetik di Indonesia masih tergantung pada
impor sehingga tingginya harga dan ketersediaan merupakan masalah yang tidak bisa
dihindari. Berdasarkan pertimbangan tersebut, Kami bermaksud menyelenggarakan seminar
dan pelatihan mengenai protein terapeutik. Acara tersebut ditujukan untuk melakukan
langkah awal bersama antara berbagai pihak untuk mencapai kemandirian bangsa dalam
produksi protein terapeutik.
Sekarang ini teknik DNA rekombinan digunakan untuk menghasilkan protein yang
memiliki sifat terapeutik. Salah satu protein semacam ini yang pertama kali dibuat adalah
insulin manusia. Karena tidak mengalami glikosilasi, protein ini dapat dihasilkan dalam E.
coli. Dipersiapkan DNA yang sesuai untuk rantai A dan B insulin manusia dan sisipkan ke
dalam plasmid yang digunakan untuk mengubah bentuk (menyebabkan transformasi) sel E.
coli. Kemudian bakteri in mensintesis rantai insulin yang kemudian dimurnika dan dibiarkan
membentuk lipatan serta ikatan sulfida sehingga dihasilkan molekul insulin aktif (Marks,
Marks, & Smith , 2000).

Insulin merupakan sejenis hormon jenis polipeptida yang dihasilkan oleh kelenjar
pankreas. Sel yang menghasilkan hormon insulin dalam kelenjar pankreas dikenali sebagai
sel beta, yaitu sejenis sel yang terdapat dalam kelompokan sel yang digelar pepulau (islet of)
Langerhans dalam pankreas (Indah, 2004).
Hormon

insulin

diproduksi

oleh

kalenjar

pankreas.

Dalam

kelenjar

pankreas mengandung kurang lebih 100.000 pulau Langerhans dan setiap pulau mengandung
100 sel beta. Oleh sel beta-lah hormon insulin diproduksi, dimana sel beta dapat diibaratkan
sebagai anak kunci yang dapat membuka pintu masuknya glukosa ke dalam sel. Untuk
kemudian di dalam sel, glukosa tersebut dimetabolisasikan menjadi tenaga energi. Jika
hormon insulin tidak ada, maka glukosa tidak dapat masuk ke sel dengan akibat glukosa akan
tetap berada di dalam pembuluh darah yang artinya kadar glukosa di dalam darah meningkat.
Sebaliknya, disamping sel beta, terdapat juga sel alfa yang memiliki fungsi memproduksi
glukagon yang bekerja sebaliknya dari hormon insulin, yakni meningkatkan kadar glukosa
darah.
b. Struktur dan Fungsi Insulin
Insulin manusia terdiri dari 51 asam amino dan memiliki berat molekul 5808 Da. Hal
ini diproduksi oleh sel beta pankreas dan memiliki peran penting dalam regulasi
metabolisme karbohidrat dan lemak dalam tubuh. Insulin disintesis sebagai polipeptida
tunggal yang dikenal sebagai preproinsulin dalam sel beta pankreas. Preproinsulin memiliki
peptida dengan sinyal 24-residu, yang terbentuk dari polipeptida ke retikulum endoplasma.
Sinyal peptida dipisah sebagai polipeptida yang mengalami translokasi ke retikulum
endoplasma manusia dalam pembentukan proinsulin (Baeshen et al., 2014).
Insulin adalah suatu hormon polipetida yang diproduksi dalam sel-sel kelenjar
Langerhaens pankreas. Insulin berperan penting dalam regulasi kadar gula darah (kadar gula
darah dijaga 3,5-8,0 mmol/liter). Hormon insulin yang diproduksi oleh tubuh kita dikenal
juga sebagai sebutan insulin endogen. Namun, ketika kalenjar pankreas mengalami gangguan
sekresi guna memproduksi hormon insulin, disaat inilah tubuh membutuhkan hormon insulin
dari luar tubuh, dapat berupa obat buatan manusia atau dikenal juga sebagai sebutan insulin
eksogen. Kekurangan insulin dapat menyebabkan penyakit seperti diabetes mellitus
tergantung insulin (diabetes tipe 1). Insulin terdiri dari 51 asam amino. Molekul insulin

disusun oleh 2 rantai polipeptida A dan B yang dihubungkan dengan ikatan disulfida. Rantai
A terdiri dari 21 asam amino dan rantai B terdiri dari 30 asam amino.
Secara kimia, insulin merupakan suatu protein yang kecil dan sederhana. Insulin terdiri
dari 51 asam amino, 30 diantaranya menyusun 1 rantai polipeptida dan 21 asam amino
menyusun rantai kedua. Kedua rantai tersebut dihubungkan dengan ikatan disulfida seperti
gambar dibawah. Kode genetik dari insulin ditemukan dalam DNA pada bagian atas short
arm dari kromosom ke-11. Kromosom ini mengandung 153 basa nitrogen (63 pada rantai A
dan 90 pada rantai B).

Dalam retikulum endoplasma, proinsulin dilipat untuk membentuk 3 ikatan disulfida.

Kemudian dibawa ke jaringan trans-golgi untuk diubah menjadi insulin aktif oleh
endopeptidases seluler yang disebut sebagai prohormon konvertase (PC1 dan PC2) dan
karboksipeptidase exoprotease E. Endopeptidase memotong di dua posisi, sehingga
pelepasan fragmen disebut sebagai C-peptida. Insulin matang yang terbentuk terdiri dari
rantai-A dengan 21 asam amino dan rantai-B yang mengandung 30 asam amino dan kedua
polipeptida dihubungkan oleh dua ikatan disulfida. Selain itu, rantai-A memiliki rantai intra
disulfida obligasi (Baeshen et al., 2014).
c. Produksi Insulin
Insulin rekombinan manusia dapat diproduksi di dalam E. coli atau Saccharomyces
cerevisiae, babi, serta dalam tanaman transgenic. Berikut penjelasan masing-masing
produksinya.

Produksi insulin dari babi

Sumber insulin ini bisa berasal dari kelenjar mamalia atau dari mikroorganisme hasil

rekayasa genetika. Jika dari mamalia, insulin yang paling mirip dengan insulin manusia
adalah dari babi (lihat strukturnya).
Insulin manusia : C256H381N65O76S6 MW=5807,7
Insulin babi : C257H383N65O77S6 MW=5777,6 (hanya 1 asam amino berbeda)
Insulin sapi : C254H377N65O75S6 MW=5733,6 (ada 3 asam amino berbeda)
Adapun proses singkat pembuatan insulin dari babi ini anatar lain dengan mula-mula
insulin dibuat dari gen pangkreas babi yang diklon dalam bakteri. Dalam waktu 24 jam dari
satu gen menghasilkan milyaran gen. Selain itu kini insulin juga dibuat dari gen pangkreas
babi yang diklon dalam ragi. Karena organism ragi lebih komplek dari bakteri, maka hasilnya
lebih baik. Dari 1 gen pangkreas babi yang diklon dalam ragi pada tabung fermentor
kapasitas 1.000 liter dihasilkan 1 liter insulin. Berdasarkan penelitian (Hammerman, 2011),
sel-sel yang memproduksi insulin juga berasal dari pankreas embrio babi yang diperoleh
sangat awal setelah pembentukan primordial pankreas (embrio hari 28 (E28)) lalu
menanamkan non-imun jangka panjang dan ditekankan pada tikus diabetes atau kera rhesus.
Secara morfologi, sel-sel sama yang berasal dari sel Langerhans babi dewasa ditanamkan
non-imun lalu ditekan tikus atau kera rhesus sebelumnya dan ditransplantasikan dengan E28
pankreas babi primordia. Jadi hasilnya yaitu terdapat

potensi untuk digunakan dan

memungkinkan penggunaan babi sebagai donor sel langerhans (islet) manusia dengan tidak
ada persyaratan penekanan kekebalan(non imun).

Produksi insulin dari Eschericia coli (E. coli)

E. coli merupakan mikroorganisme yang sering digunakan untuk produksi pro skala

besar protein rekombinan. Bakteri Campylobacter jejuni memiliki kemampuan untuk

glikosilasi protein dan juga menunjukkan jalur aktivasi N-glikosilasi fungsional yang dapat
ditransfer ke E. coli. Meskipun struktur bakteri N-glycan berbeda dengan yang diamati pada
eukariota, rekayasa genetic dari jalur glikosilasi ikatan N Campylobacter ke E. coli akan
mengekspresikan protein heterolog dalam bentuk glikosilasi di E. coli.
Produksi protein human insulin dalam kultur bakteri :
1. Mengidentifikasi dan mengisolasi gen penghasil insulin dari sel pancreas manusia.

Mula-mula mRNA yang telah disalin dari gen penghasil insulin diekstrak dari sel
pancreas. Kemudian enzim transcriptase ditambahkan pada mRNA bersamaan dengan
nukleotida penyusun DNA.

Enzim ini menggunakan mRNA sebagai cetakan untuk membentuk DNA berantai
tunggal.

DNA ini kemudian dilepaskan dari mRNA.

Enzim DNA polymerase digunakan untuk melengkapi DNA rantai tunggal menjadi
rantai ganda, disebut DNA komplementer (c-DNA), yang merupakan gen penghasil
insulin.

2. Melepaskan salinan gen penghasil insulin tersebut dengan cara memotong kromosom
secara khusus menggunakan enzim restriksi.
3. Mengekstrak plasmid dari sel bakteri, kemudian membuka plasmid dari sel bakteri dengan
menggunakan enzim restriksi yang lain. Sementara itu, di dalam serangkaian tabung reaksi
atau cawan petri, gen penghasil insulin manusia (dalam bentuk c-DNA) disiapkan untuk
dipasangkan pada plasmid yang terbuka tersebut.
4. Memasang gen penghasil insulin ke dalam cincin plasmid. Mula-mula, ikatan yang terjadi
masih lemah, kemudian enzim DNA ligase memperkuat ikatan ini sehingga dihasilkan
molekul DNA rekombinan / plasmid rekombinan yang bagus.
5. Memasukkan plasmid rekombinan kedalam bakteri E. coli. Di dalam sel bakteri ini
plasmid engadakan replikasi.
6. Mengultur bakteri E. coli yang akan berkembang biak dengan cepat menghasilkan klonklon bakteri yang mengandung plasmid rekombinan penghasil insulin. Melalui rekayasa
genetika dapat dihasilkan E. coli yang merupakan penghasil insulin dalam jumlah banyak
dan dalam waktu yang singkat.

Praktis penggunaan teknologi DNA rekombinan dalam sintesis insulin manusia

membutuhkan jutaan salinan plasmid bakteri yang telah digabungkan dengan gen insulin
dalam rangka untuk menghasilkan insulin. Gen insulin diekspresikan bersama dengan sel
mereplikasi galaktosidase-B di dalam sel yang sedang menjalani mitosis.

Protein yang terbentuk, sebagian terdiri dari B-galaktosidase, bergabung ke salah satu
rantai insulin A atau B. Rantai insulin A dan rantai B kemudian diekstraksi dari fragmen Bgalaktosidase dan dimurnikan.

Kedua rantai dicampur dan dihubungkan kembali dalam reaksi yang membentuk
jembatan silang disulfida, menghasilkan Humulin murni (insulin manusia sintetis).

Vektor yang digunakan sebagai pabrik yang memproduksi insulin secara rekayasa
genetika adalah berupa bakteri Escherichia coli, suatu bakteri gram negatif yang mendiami
saluran pencernaan manusia . Sewaktu bakteri itu berkembang biak, gen insulin bereplikasi

bersama dengan plasmid, suatu daerah sirkuler dari DNA . E. coli memproduksi enzim yang
secara cepat mendegradasi protein asing seperti insulin. Dengan menggunakan strain mutan
yang tidak memiliki enzim ini, masalah ini dapat dihindari.
Pada E. coli , B-galaktosidase merupakan enzim yang mengendalikan transkripsi
dari gen. Untuk membuat bakteri memproduksi insulin, gen insulin perlu diikatkan pada
enzim ini. Enzim restriksi, yang secara alami diproduksi oleh bakteri, bertindak sebagai
gunting biologik (biological scalpels), yang hanya mengenali bagian tertentu dari nukleotida,
seperti bagian yang mengkode insulin.
Dengan adanya restriction enzymes ini, dimungkinkan untuk memotong daerah DNA
yang mengkode insulin dari satu kromosom organisme sehingga dapat diproduksi insulin.
DNA ligase adalah enzim yang bekerja sebagai lem genetik (genetic glue) yang
menempelkan kedua ujung nukleotida yang bebas menjadi satu.
Pembuatan Human Insulin (Humulin, Eli Lilly)
Insulin rekombinan pertama yaitu humulin memiliki urutan asam amino identik
dengan insulin manusia. Humulin biasanya dalam bentuk oligomer sebagai zat besi yang
mengandung heksamer dengan konsentrasi yang sangat tinggi. Namun dalam darah, insulin
biologis aktif tersedia dalam bentuk monomer. Oleh karena itu, kompleks oligomer harus
dipecah agar insulin dapat diserap dari tempat suntikan dapat masuk ke dalam darah.
Sehingga insulin rekombinan yang disuntikkan melalui subkutan biasanya memiliki onset
lambat dengan konsentrasi puncak plasma setelah 2 jam injeksi dan durasi yang lebih lama
yang berlangsung selama 6-8 jam.
Tahap pertama adalah mensintesa secara kimia rantai DNA yang membawa urutan
nukleotida spesifik yang mengkarakterisasi rantai polipeptida A dan B dari insulin . Urutan
DNA yang diperlukan dapat ditentukan karena komposisi asam amino dari kedua rantai
tersebut telah tersusun. Sebanyak 63 nukleotida diperlukan untuk mensintesa rantai A dan 90
nukleotida untuk rantai B, plus satu kodon pada ujung setiap rantai, menandakan akhir dari
sintesis protein. Suatu antikodon, yang mengandung asam amino methionine, diletakkan pada
awal setiap rantai yang memungkinkan pelepasan protein insulin dari asam amino sel bakteri.
Gen rantai sintetik A dan B kemudian dimasukkan secara terpisah ke dalam gen enzim
bakteri, B-galaktosidase, yang dilakukan dalam plasmid vektor .

Pada tahap ini, penting untuk meyakinkan bahwa kodon dari gen sintetik sesuai dengan
kodon dari B-galaktosidase. Plasmid rekombinan kemudian dimasukkan ke dalam sel E. coli.
Penggunaan praktis dari teknologi rekombinan DNA dalam sintesa human insulin
memerlukan jutaan kopi dari bakteri yang plasmidnya telah digabungkan dengan gen insulin
untuk menghasilkan insulin. Gen insulin diekspresikan sewaktu bakteri bereplikasi dengan Bgalaktosidase dalam sel mengalami mitosis . Protein yang terbentuk, terdiri dari sebagian Bgalaktosedase, tergabung baik pada rantai A maupun B dari insulin . Rantai A dan B
kemudian diekstraksi dari fragmen B-galaktosidase dan dimurnikan. Kedua rantai tersebut
kemudian dicampur dan dihubungkan kembali dalam suatu reaksi yang membentuk jembatan
disulfida, menghasilkan Humulin murni .
Insulin Lispro memiliki urutan asam amino yang sama seperti insulin asli tetapi
memiliki inverse pada urutan prolin-lisin pada posisi 28 dan 29 dari rantai-B, yang
mengakibatkan berkurangnya interaksi hidrofobik, namun dapat dicegah dengan
pembentukan dimer. Untuk produksi komersial insulin Lispro, sebuah sintesis pengkode
cDNA untuk Lys B28- Pro B29 pada proinsulin manusia yang ada didalam E. coli. Insulin
Lispro telah dipotong proteolitik dari proinsulin dengan menggunan tripsin dan
Carboxypeptidase, sehingga didapatkan analog insulin yang lebih cepat.
Insulin glargine adalah salah satu dari analog insulin long-acting seperti yang
dikembangkan oleh Aventis Farmasi. Glargine dihasilkan dengan mengganti aspayeastn Cterminal dari rantai A dengan residu glisin dan C-terminal dari rantai B yang dimodifikasi
dengan menambahkan dua residu arginin.

Produksi insulin pada yeast

Protein terapeutik yang diproduksi dalam yeast dari Saccharomyces cerevisiae dan

termasuk hormone (insulin, analog insulin, hormone pertumbuhan somatropin pada manusia
yang non-glikosilasi, glukagon), vaksin (antigen virus hepatitis B), uprate oxidase dari
Aspergillus flavus, koloni makrofag granulosit sebagai faktor stimulasi, albumin, hirudin dari
medicinalis Hirudo dan platelet faktor pertumbuhan pada manusia. Seperti E. coli, yeast
yang digunakan untuk produk rekombinan pada biofarmasi dapat digunakan sebagai terapi
untuk penyakit-penyakit menular, endokrin, atau gangguan metabolik.
Secara khusus, Pichia pastoris memiliki kemampuan untuk mencapai densitas sel
yang tinggi dengan promotor yang telah diinduksi methanol atau alkohol oxidase 1 (AOX1)

sehingga dapat dihasilkan produk protein rekombinan yang memiliki kualitas dan kuantitas
tinggi.
Selain insulin rekombinan sebenarnya, berbagai analog insulin juga diproduksi di S.
cerevisiae. Insulin Aspart adalah analog insulin lain yang diproduksi di S. cerevisiae. Aspart
memiliki reaksi dengan cepat dengan tubuh sehingga dapat digunakan terapi pada manusia.
Insulin Aspart dihasilkan dengan mengganti residu prolin pada posisi 28 dengan asam
aspartat dalam rantai B. Modifikasi genetik ini mengakibatkan penolakan antar rantai
meningkat, sehingga menyebabkan insulin masuk cepat ke dalam darah dari tempat injeksi
melalui subkutan.

Tanaman transgenik sebagai host untuk produksi insulin

Tanaman transgenik digunakan untuk memproduksi protein rekombinan karena

memiliki beberapa keuntungan, antra lain efektivitas biaya, sintesis protein memiliki kualitas
tinggi, tidak adanya patogen pada manusia, dan proses produksi yang mudah.
Insulin rekombinan manusia telah berhasil diungkapkan dan diproduksi di oilseeds
dari tanaman Arabidopsis thaliana. Teknologi ini melibatkan target ekspresi insulin yang
terdapat pada organel subselular, dikenal sebagai oilbodies. Oilbodies adalah organel
penyimpanan dalam oilseeds, yang terdiri dari inti triasilgliserol hidrofobik dilapisi oleh
membran fosfolipid dan dinding luar protein disebut oleosins. Rekayasa genetik oilseeds
yang dihasilkan dengan protein rekombinan, khusus ditargetkan untuk oilbodies sebagai
oleosin fusion. Kemudian oilbodies mudah dipisahkan dari biji komponen-komponen lain
dengan pemisahan fasa cair-cair, degan langkah kromatografi untuk mendapatkan insulin
murni. Telah diamati bahwa akumulasi insulin memiliki tingkat yang tinggi dalam benih
transgenik (0,13% dari protein biji total).
Dalam pendekatan lain, tanaman transgenic dari kloroplas tembakau dan selada yang
diubah menjadi proinsulin manusia yang terdiri dari rantai A, B, dan C yang menyatu
dengan toksin kolera B subunit. Daun tembakau tua akan mengakumulasi proinsulin hingga
47%. Selain itu, dalam daun selada ditemukan prosulin hingga 40% dalam kondisi sangat
stabil.
Pemberian oral dari proinsulin, dikemas dalam sel tanaman atau melalui suntikan ke
dalam tikus yang mengungkapkan penurunan kadar glukosa darah yang mirip dengan insulin

yang tersedia secara komersial. Berdasarkan hasil tersebut (3 mg proinsulin/gm daun),

diperkirakan bahwa satu hektar perkebunan tembakau dapat menghasilkan insulin hingga 20
juta dosis harian per tahun. Proinsulin C-peptida, tidak dapat ditemukan pada insulin dan
analog insulin yang berasal dari E. coli dan S. Cereviciae. Hal tersebut, akan menjadi
keuntungan besar dalam pengobatan jangka panjang komplikasi diabetes seperti stimulasi
saraf dan ginjal fungsi. Ekspresi proinsilin biologis aktif paling tinggi terdapat pada daun
tembakau dan selada. Dimana insulin tersebut memiliki stabilitas dalam jangka panjang yang
terkandung dalam daun kering. Oleh karena itu, penelitian ini menunjukkan bahwa teknologi
ini murah dan dapat digunakan untuk kedua injeksi proinsulin serta pemberian secara
oralnya.
d. Terapi Insulin
Tikus diinduksi oleh injeksi streptozotocin pada intraperitoneal sehingga menderita
diabetes. Hal ini dilakukan untuk pengujian terapi insulin pada hewan yan menderita
diabetes. Kemudiab mencit diberi injeksi insulin subkutan harian. Dosis insulin yang berikan
sebesar 8 dan 15 U/kg. Sehingga tikus mengalami hiperglikemia. Adanya hasil hiperglikemia
menjadi faktor utama yang memicu OS, dan produksi O 2- pada diabetes tipe 1. Hiperglikemia
menyebabkan produksi O2- berlebihan, sehingga terjadi komplikasi diabetes. Reaksi O2dengan NO menyebabkan penurunan bioavailabilitas vasorelaksasi endotelium dan
pembentukan senyawa sangat beracun yaitu ONOO. Penelitian ini bertujuan untuk mencegah
atau mengurangi OS penyebab diabetes, terutama produksi O 2-, tetapi beberapa uji klinis
gagal untuk meneliti penggunaan antioksidan dalam diabetes. Dimana antioksidan dapat
mengurangi resiko diabetes tipe 1 dan disfungsi kardiovaskular. Pada diabetes, eNOS dipicu
oleh hiperglikemia dengan adanya aktivasi NOX. Hiperglikemia menginduksi pembentukan
produk akhir dan aktivasi jalur PKC, keduanya dapat

merangsang aktivitas NOX.

Peningkatan aktivitas NOX akan memperoleh NADPH, kofaktor penting Enos. Sehingga
dapat diketahui bahwa XO berkontribusi terhadap produksi O 2- di aorta tikus yang mengalami
diabetes.
Adanya insulin pada hiperglikemia berhubungan dengan pengurangan produksi O 2pada aorta, sehingga menyebabkan pengaruh glukosa dan OS yang tinggi pada diabetes.
Pengobatan insulin dapat menurun dengan adanya produksi O 2- pada hiperglikemia. Aktivasi
ketiga enzim tiga yang terlibat dalam produksi O2- diamati dalam pembuluh darah diabetes,
dimana aktivasi tersebut dapat ditekan dengan terapi insulin (secara konsisten pada data

menunjukkan bahwa NOX dan eNOS diaktifkan oleh hiperglikemia). Pengurangan

hiperglikemia disebabkan oleh terapi insulin juga menyebabkan aktivasi XO berkurang.
Sementara aktivitas XO akan meningkat jika terjadi diabetes tipe 1. Penelitian menunjukkan
bahwa hiperglikemia memiliki peran penting dalam aktivasi XO. Dimana hiperglikemia dan
produksi O2- memiliki korelasi. Apabila korelasinya kurang maka hiperglikemia adalah
penyebab utama superoksida yang berlebihan.
Ketahanan Pelatihan Protokol
Aktivitas fisik yang teratur juga dapat digunakan sebagai terapi pasien diabetes.
Ketahanan pelatihan telah ditunjukkan untuk mengatur glikemia, meningkatkan efisiensi
terapi insulin, dan meningkatkan pertahanan antioksidan. Terapi ini dapat menurunkan
hiperglikemia dengan induksi OS sehingga dapat mengurangi disfungsi endotel. Antara tiga
enzim yang terlibat dalam produksi O2-

diaktifkan pada diabetes, hanya NOS dan XO

ditekan oleh adanya pelatihan. Pelatihan lebih efisien untuk mengurangi aktivitas XO dan
OS. Hiperglikemia sebagian diperbaiki oleh adanya pelatihan. Hiperglikemia merupakan
faktor kunci yang bertanggung jawab untuk aktivasi NOX aktivasi pada diabetes tipe 1.
Kombinasi Terapi Insulin dan Pelatihan Ketahanan Fisik
Terapi insulin dengan pelatihan ketahanan dapat menurunkan kadar glukosa darah
lebih rendanh jika dibandingkan dengan terapi insulin saja. Dimana terapi juga dapat
menurunkan produksi O2penyebab diabetes.

berlebih. Selain itu, terapi ini juga menghambat aktivasi enzim

KESIMPULAN
Insulin rekombinan manusia diproduksi dengan menggunakan bakteri E. coli dan
Saccharomyces cerevisiae dapat

digunakan terapi pada manusia. Namun, untuk

meningkatkan hasil produksi insulin biologis aktif dan analognya dari E. coli dan yeast
menjadi beberapa kali lipatnya dapat digunakan teknologi baru yang lebih efisien.
Adapun teknologi lain yang dapat dilakukan yaitu dengan menggunakan ekspresi
host yang berbeda (selain E. coli dan Saccharomyces cerevisia). Sistem ekspresi nabati
memiliki potensi yang sangat besar untuk produksi insulin dan juga dapat menghemat biaya.
Tingkat ekspresi proinsulin biologis aktif yang sangat tinggi terdapat dalam biji atau daun.
Proinsulin memiliki keuntungan, antara lain stabil dalam jangka panjang, biaya produksi
rendah untuk kedua injeksi serta pemberian oral proinsulin. Selain itu, benih transgenik juga
dapat bertindak sebagai host insulin rekombinan.
Berdasarkan penelitian diatas dapat diambil kesimpulan bahwa produksi O2- yang
berlebih dapat menyebabkan diabetes tipe 1 dengan ditandai hiperglikemia yang
mengaktifkan tiga enzim vaskular yang terlibat dalam produksi O 2- : NOX, NOS, dan XO.
Terapi insulin adalah pengobatan diabetes yang paling efisien untuk menurunkan
hiperglikemia dan menurunkan produksi O2- dengan menghambat aktivasi NOX, NOS, dan
XO. Selain terapi insulin, juga ada terapi dengan pelatihan ketahanan. Pada terapi pelatihan
ketahanan fisik memberikan efek yang lebih rendah pada kontrol glikemik bila dibandingkan
dengan terapi insulin. Adapun kombinasi antara kedua terapi, dimana kombinasi ini dapat
memberikan terapi yang lebih efektif dan efisien pada pasien diabetes tipe 1.

DAFTAR PUSTAKA
Baeshen, N. (2014). Cell factories for insulin production. Microbial cell factories , 141.
Hammerman, M. R. (2011). Engraftment of insulin-producing cells from porcine islets in
non-immune-suppressed rats or nonhuman primates transplanted previously with
embryonic pig pancreas. Journal of transplantation , 261352.
Malard, L. (2014). Superoxide production pathways in aortas of diabetic rats: beneficial
effects of insulin therapy and endurance training. Molecular and cellular biochemistry ,
8-113.
Marks Dawn B, Marks Allan D, Smith Colleen M. Biokimia kedokteran dasar : Sebuah
pendekatan klinis, Edisi 1, Jakarta, : EGC, 2000.h.248-249
Smith, S. B. (2010). Rfx6 directs islet formation and insulin production in mice and humans.
Nature , 775-80.
Wanscher, A. S. (2010). Production of functional human insulin-like growth factor binding
proteins (IGFBPs) using recombinant expression in HEK293 cells. Protein expression
and purification .
Wanscher, A. S. (2014). Production of functional human insulin-like growth factor binding
proteins (IGFBPs) using recombinant expression in HEK293 cells. Protein expression
and purification .
Zhang, T. (2014). Glucose-regulated insulin production in the liver improves glycemic
control in type 1 diabetic mice. Molecular Metabolism , 1-7.

LAMPIRAN