Codificacin de las expresiones faciales

del dolor en el laboratorio

ratn
Dale J Langford1, Andrea L Bailey1, Mona Lisa Chanda1,
Sarah E Clarke1, Tanya E Drummond1, Stephanie Echols2,
Sarah Glick1, Joelle Ingrao1, Tammy Klassen-Ross2,
Michael L LaCroix-Fralish1, Lynn Matsumiya1,
Robert E Sorge1, Susana G Sotocinal1, John M Tabaka1,
David Wong2, Arn M J M van den Maagdenberg3,4,
Michel D Ferrari4, Kenneth D Craig2 y Jeffrey S Mogil1
La expresin facial es ampliamente utilizado como una medida de dolor en los
bebs;
si los animales no humanos muestran tales expresiones de dolor
nunca se ha evaluado sistemticamente. Hemos desarrollado el
escala mueca ratn (MGS), una codificacin estandarizada del comportamiento
sistema con alta precisin y fiabilidad; ensayos que implican
estmulos nocivos de duracin moderada se acompaan de la cara
expresiones de dolor. Esta medida del dolor espontneamente emitida
puede dar una idea de la experiencia subjetiva del dolor de los ratones.
Darwin famoso afirm que los animales no humanos son capaces de
expresando la emocin (incluyendo dolor) a travs de expresin1 facial y
que tal expresin puede ser tanto innata y adaptativa. Observaciones
que una expresin facial similar de dolor aparece de neonatos y
incluso por la ceguera congnita prestar apoyo a esta notion2. los
capacidad de comunicar la propia experiencia de dolor a los dems pueden
beneficiarse
tanto el emisor y el receptor, de manera que la ayuda podra ser ofrecidas o un

advirtiendo heeded3 seal. Sin embargo, emitiendo seales visibles de dolor

Tambin podran ser seleccionados en contra de los animales de presa como
roedores.
Las expresiones faciales de prcticamente todas las emociones comunes,
incluyendo
dolor, se han caracterizado bien en seres humanos, y puede ser fiable
codificada utilizando los basados anatmicamente "unidades de accin" de la
accin facial
sistema4 codificacin. Escalas similares se han adaptado y se han convertido
herramientas tiles en la evaluacin del dolor y analgesia en poblaciones
clnicas
en el que la comunicacin verbal es limitada o inexistente,
tales como los lactantes y las personas con impairments2 cognitivo.
A pesar de la evidencia de que los mamferos no humanos incluyendo rats5
exhiben expresiones faciales de otros estados emocionales, se ha producido
ningn estudio de las expresiones faciales de dolor en las especies no
humanas.
Teniendo en cuenta la fuerte dependencia y la continuacin del campo de dolor
a la
modelos de roedores y la escasez de medidas utilizables de espontnea
(en oposicin a experimentador evocado) dolor en animales6, la capacidad
para detectar fiable y precisa del dolor, en tiempo real, utilizando facial
expresin podra ofrecer una herramienta cientfica nica y poderosa en
Adems de tener beneficios obvios para la medicina veterinaria.
Desarrollar la escala, se utiliz un ensayo preclnico dolor clsica, el
0,9% de cido actico prueba de constriccin abdominal (Mtodos en lnea).
Nosotros
colocados ratones individualmente en plexigls cubculos de observacin (9 x 5
x 5 cm
alta) con cmaras de vdeo digitales posicionado en cada extremo y

ellos film durante 30 minutos antes y despus de administrar el dolor

estmulo. Nos agarramos fotogramas de vdeo tomadas antes de la inyeccin
en ~ 3-min intervalos y se toma despus de la inyeccin como los ratones
experimentaron
una constriccin abdominal. Nos recortadas los archivos JPEG resultantes
de tal manera que la posicin del cuerpo ya no era visible.
Nos collages compilados de "no-dolor" (lnea de base) y fotografas de "dolor",
junto con no-dolor y el dolor de fotos individuales para cada
ratn, para disear un sistema de codificacin, la escala mueca ratn (MGS),
que consta de cinco rasgos faciales (unidades de accin) percibidos por
humanos
expertos de expresin de dolor facial (miembros del laboratorio KDC)
ndices como potencialmente fiables de dolor (Fig. 1). Hemos definido la accin
unidades de la siguiente manera. Endurecimiento Orbital est reduciendo del
orbital
rea, con un prpado bien cerrado o un apretn ojo (denotado por
arrugas alrededor de los ojos). Abultamiento de la nariz es una extensin
redondeada de piel
visible en el puente de la nariz. Abultamiento Cheek refiere a convexo
apariencia del msculo mejilla (entre el ojo y los bigotes) a partir de
su posicin de lnea de base. Posicin del odo se refiere a los odos se
separaron y
detrs de su posicin de lnea de base o con crestas verticales que
forma debido a la punta de las orejas est elaborando espalda. El cambio de la
barba es
el movimiento de los bigotes de su posicin de lnea de base, ya sea hacia
atrs,
contra la cara o hacia adelante, como si de punta; bigotes
Tambin pueden agruparse. Hemos observado piloereccin obvia en

mayora de los casos (datos no mostrados). Tenga en cuenta que tres de estas
caractersticas son
idnticos a los observados en los seres humanos: endurecimiento orbital, la
nariz
abultamiento y bulge7 mejilla, el apoyo a la prediccin de Darwin centenario
que las expresiones faciales son evolutivamente conservados.
Despus de una breve, sesin de entrenamiento formal, presentamos
aleatorios
conjuntos de fotos digitales a siete codificadores cegados al estado de
sufrimiento
evaluar la precisin y fiabilidad de los MGS. Los codificadores asignado una
valor de 0 (no presente), 1 (moderadamente visible) o 2 (grave) para
cada unidad de accin en cada foto y hizo un dolor global o sin dolor
juicio para cada ratn. La precisin media global fue del 72%
y el 81% para un codificador con un ao de experiencia (Suplementario
Fig. 1a). De los errores, las falsas alarmas eran ms raros que se pierde. los
escala que se muestra una alta consistencia interna ( de Cronbach = 0,89),
as como una alta fiabilidad entre evaluadores evaluado por correlacin
intraclase
coeficiente (ICCaverage = 0,90;. Complementario figura 1b).
Puntajes ms altos generales codificadores asignados constantemente
(promedio de todos
unidades de cinco accin) para el dolor frente fotografas no sin dolor (P
<0,001).
Uso posterior de las cmaras de vdeo de alta definicin cedi sustancial
comunicaciones breves
mejora en la precisin, de manera que ms del 97% del dolor en comparacin
con NOPAIN
llamadas eran correctas (Suplementario Fig. 1a).
Tambin se evalu la escala de 14 comnmente usados dolor preclnica

ensayos (Mtodos en lnea), comparando las puntuaciones de la unidad de

accin media
asignado al "dolor" fotos a los asignados a 'sin dolor' y fotos
luego comparar las puntuaciones de diferencia resultantes a cero para una
muestra
pruebas t. Los MGS revel cambios significativos desde la lnea de base en
algunos ensayos, pero no en otros (Fig. 2a). Los estmulos nocivos de
moderada
duracin (10 min-4 h) eran ms propensos a ser asociado con un "dolor
cara ". Los estmulos nocivos aplicadas a los tejidos profundos (articulaciones y
las vsceras)
dado mayores puntuaciones de diferencia MGS que cuando se aplica ms
superficialmente (Fig. 2a, b). Esta especificidad puede ser debido a una
incapacidad
para suprimir las expresiones faciales dolorosas para los estmulos de mayor
duracin
y / o origen interno debido a la inhibicin de la expresin tales hara
de lo contrario ser adaptable para reducir la vulnerabilidad a los depredadores
potenciales
o congneres agresivos. El dolor neuroptico despus de presunta
lesin del nervio experimental es de muy larga duracin, sin embargo, y era
no se asocia con una cara de dolor. Esto puede ser debido a su paroxstica
naturaleza (y nuestra incapacidad para reconocer a un paroxismo en curso),
pero ninguna cara dolor se indujo mediante la aplicacin de un clip de la
carpeta
(700 g) a la pata trasera ipsilateral de los ratones nerviosas daadas (datos no
se muestra). Alternativamente, tal especificidad puede reflejar diferencias en
la fuerza de la componente afectivo de la prolongada y / o profunda
dolor (especialmente visceral), como se inform en humans8. Lesioning
Qumica

de dos estructuras previamente asociados con el dolor afectar en el

roedores, la corteza cingulada anterior y la amygdala9, no lo hizo
afecta a las puntuaciones de MGS (datos no mostrados). Sin embargo, las
lesiones cido ibotnico
de la nsula anterior rostral, que se activa en los seres humanos por el dolor
con una importante component10 emocional, la atenuacin producida
el dolor de la cara (Fig. 2c) sin afectar a la constriccin abdominal
comportamiento (Fig. 2d). Las personas con lesiones insulares puedan
presentar con
asimbolia dolor, en el que las respuestas emocionales al dolor son
marcadamente
reducen los umbrales de dolor, pero son unaffected11, y por tanto, es tentador
a especular que la cara de dolor refleja negativa relacionada con el dolor
afecta.
Por ltimo, como Darwin1 y otros12 ms recientemente han sugerido,
como la expresin facial puede servir una funcin sensorial egocntrica por
la modificacin de la informacin sensorial en una direccin beneficiosa; en
este caso, a
limitar la entrada sensorial lo que podra reducir la percepcin del dolor.
Se necesitan investigaciones adicionales para elegir entre estas alternativas,
y los roedores podran ser modelos tiles para hacerlo, dado que los
mecanismos
por el que la experiencia del dolor es codificada por la expresin facial en el ser
humano
Todava no son understood2.
El cambio de la barba
Posicin del odo
Abultamiento Mejilla
Abultamiento Nariz

Endurecimiento Orbital
Grave
2
Moderado
1
No presente
0
Figura 1 | En los MGS, intensidad de cada funcin se codifica en una de tres
puntos
escala. Para cada una de las cinco caractersticas, las imgenes de los ratones
que exhiben comportamiento
correspondiente a los tres valores se muestran.
un 0,8 b c d
0.6
0.4
0.2
0
Horas Das
**
** ** **
***
*** *** ***
Segundos Minutos
Fearly
TW (45 C)
TW (49
TF

 C)
AA
Flate
MgSO4
GORRA
CCI (PO 1)
CCI (PO 14)
CCI (PO 7)
SNI (PO 14)
SNI (PO 1)
SNI (PO 7)
LAP
ZYM
CYP
Incisin
Sham
Lesin
Perdidas
Sham
Lesin
Perder
AITC
ed
TC
-0,2
00

0.8
1
Dosis Zymosan (g)
10 100 1000
0
0.5
1.0
1.5 tobillo
* ***
Paw
0.6
** 0,4
0.2 10
20
30
40
50
La media de puntuacin de diferencia
Constricciones Porcentaje
La media de puntuacin de diferencia
La media de puntuacin de diferencia
Figura 2 | La especificidad de los MGS. (a) ensayos nociceptivos de duracin
moderada (~ 10 min a ~ 12 h) cuentan con un "rostro el dolor '. Los ensayos se
enumeran de izquierda a derecha
por (aproximado) aumento de la duracin de las medidas de comportamiento
conocidos de la nocicepcin y / o hipersensibilidad. Las barras de error,
S.E.M. .; TC, 700 g de clip cola

(n = 20); TF, cola pelcula lejos del calor radiante (n = 20); TW, la retirada de la
cola del agua caliente (n = 11); Fearly, prueba de la formalina al 5%, primera
fase (0-5 min)
(n = 12); CAP, 12,5% de capsaicina intraplantar (n = 8); MgSO4, 120 mg kg-1
inducida por MgSO4 constriccin abdominal (n = 10); AA, 0,9% inducida por
cido acticoconstriccin abdominal (n = 14); Flate, prueba de la formalina 5%, de fase
tarda (de 15-60 min) (n = 11); AITC, 5% intraplantar alil isotiocianato (aceite
de mostaza)
(n = 8); incisin, incisin pata trasera (n = 8); LAP, laparotoma (n = 12); ZYM,
200 g intraplantar zymosan (n = 8); CYP, 400 mg kg-1
cyclophosphamideinduced
la cistitis de vejiga (n = 12); CCI, lesin por constriccin crnica (n = 8); SNI,
lesin del nervio escatimado (n = 9); PO, da del postoperatorio. Puntajes de
diferencia eran
en comparacin con el cero por pruebas t de un solo sentido de Student; * P
<0,05, ** p <0,01 y *** P <0.001 (todo sin corregir). Todos los hallazgos
significativos en un permanecieron as que despus de
correccin para comparaciones mltiples, con excepcin de TC. Etiquetas de
tiempo indican la duracin aproximada de los ensayos. (b) la dependencia de la
intensidad del estmulo de MGS
puntajes de diferencia despus de la inyeccin de zymosan en la pata trasera
plantar o articulacin del tobillo. Las barras de error, S.E.M. .; n = 6 (todas las
dosis de tobillo), n = 8 (pata 200 g); n = 10
(pata 100 mg); n = 15 (pata 5 mg). La inyeccin ms profunda (tobillo) dio
lugar a un gran desplazamiento de la curva dosis-respuesta. * P <0,05, *** p
<0,001 en comparacin
a otro grupo (en algn dosis) mediante la prueba t de dos vas de Student. (c,
d) La media de puntuaciones de diferencia (c) y el porcentaje de muestras que
ofrecen abdominal significara
constricciones (d) de los ratones que recibieron solucin salina (tratamiento
simulado lesiones; n = 6), dirigidos correctamente lesiones de cido ibotnico
de la nsula anterior rostral (lesin; n = 4) y
incorrectamente dirigidos lesiones cido ibotnico (perdidas; n = 2). Las barras
de error, S.E.M. .; ** P <0,01 en comparacin con otros grupos (ANOVA de un
factor: F2,9 = 7,9).

 2010 Naturaleza America, Inc. Todos los derechos reservados.

mtodos naturales | AVANCE LNEA PUBLICACIN |?
comunicaciones breves
Por necesidad prctica, se realizaron pruebas de dolor superficial
requiriendo el objetivo preciso de un estmulo nocivo usando una restriccin
aparatos que pueden haber inducido por el estrs moderacin, y esta elevada
las puntuaciones iniciales MGS; sin embargo, en ensayos superficiales
laboriosamente realizada
utilizando cubculos estndar, puntuaciones de diferencia (Mtodos en lnea)
no fueron significativas (P> 0,05; datos no mostrados). Aparte de estrs,
otros estados como el sueo, el aseo y la enfermedad tienen algunos (pero no
todos) los rasgos faciales en comn con el dolor. (Fig Complementario 2),
y le aconsejamos que dichas fotografas no ser codificados.
Hemos validado la escala primero determinando que las puntuaciones de dolor
en la
MGS estaban relacionados con los estmulos de intensidad. Porque
encontramos resultados sean
invariable con la intensidad del estmulo durante la exposicin de los
observables
el comportamiento de dolor en el ensayo de constriccin abdominal (datos no
mostrados),
hemos utilizado dos ensayos desprovisto de paroxismos de comportamiento
evidentes, intraplantar
o zymosan intraarticular y ciclofosfamida inducida
la cistitis de vejiga, y la intensidad del estmulo alterado variando la inyectada
la dosis. Encontramos una relacin positiva y lineal entre la dosis y la
Puntajes MGS (. Figuras 2b y 3a). Tambin se observ una relacin dosisdependiente
reversin del dolor facial inducida por ciclofosfamida despus de la
administracin

de sulfato de morfina (5 y 10 mg kg-1), en ausencia de cualquier

efecto sobre la expresin facial de la morfina en s (Fig. 3a).
Hemos probado la sensibilidad y la utilidad de los MGS en dos adicionales
experimentos. Inflamacin Zymosan en ratones producidos
no manifiesta comportamientos espontneos pero se asoci con robusta
hipersensibilidad mecnica (alodinia) y una cara de dolor. El dbil
analgsicos, paracetamol (300 mg kg-1), no produjeron detectable
efectos antialodnicos en nuestras manos, pero reducida diferencia MGS
puntajes por ms de 50% (Fig. 3b y Fig complementario. 3).
Como parte de una caracterizacin del comportamiento continuo de
transgnicos
CACNA1A knockin ratones mutantes que llevan la hemipljica familiar humana
migraa, tipo 1 R192Q mutacin sin sentido en el codificada
protena que causa efectos ganancia de funcin en voltagegated neuronal
Channels13 calcio Cav2.1, se observ un dolor 'lnea de base'
cara en ratones mutantes restringidas en comparacin con los ratones de tipo
salvaje,
que fue impedido por 50 mg kg-1 rizatriptn (Fig. 3c), sugerente
del dolor endgeno en los ratones mutantes.
En conclusin, hemos desarrollado un sistema de codificacin facial
estandarizada,
el MGS, que se caracteriza por una alta precisin, fiabilidad y validez,
que puede ser usado para evaluar el dolor en el ratn de laboratorio para
veterinaria
la atencin y el desarrollo de frmacos. Un manual de formacin detallado
se proporcionar a las partes interesadas que lo soliciten. El MGS tiene
La ventaja de la medicin de una (probable involuntario) comportamiento
espontneamente

emitida por el propio sujeto, en ausencia de un Looming

experimentador y en condiciones perfectamente cegado al dolor
de estado. La demostracin de una "cara de dolor 'en el ratn parecera
para apoyar las cuentas evolutivas de expresin2 dolor facial humana
ms explicaciones operantes populares. Finalmente, dado que los ratones
puede
verse afectado por el estado de dolor de un familiar y que conspecific14
ratones hembras prefieren mantener las proximidades de los familiares en
pain15, tambin es concebible que esta modulacin social est mediada
asistiendo a la expresin facial de los otros ratones.
Mtodos
Mtodos y todas las referencias asociadas estn disponibles en la lnea
versin del documento en http://www.nature.com/naturemethods/.
Nota: La informacin complementaria est disponible en el sitio web de Nature
Methods.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por la Fundacin Louise Edwards y Alan (JSM).
D.J.L. fue apoyado por un premio de doctorado Becas Canad Graduados de la
Institutos Canadienses de Investigacin en Salud.
CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES
D.J.L. y J.S.M. concebido los experimentos, y D.J.L. y S.G.S. eran principalmente
responsables de su ejecucin. A.L.B., M.L.C., S.E.C., T.E.D., S.G., M.L.L.-F.,
L. M., R.E.S. y J.M.T. participado en la recogida de datos. S. E., J. I., T.K.-R., D.W.
y K.D.C. fueron los encargados de disear la escala. A.M.J.M.v.d.M. y M.D.F.
proporcionado transgnico ratones knock-in y porciones editadas del
manuscrito. J.S.M.
y D.J.L. escribi el manuscrito.
Conflicto de intereses FINANCIEROS

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Publicado en lnea en http://www.nature.com/naturemethods/.
Las reimpresiones y permisos informacin est disponible en lnea en http:
//npg.nature.
com / reprintsandpermissions /.
1. Darwin, C. La expresin de las emociones en el hombre y los animales
(Albemarle,
1872).
2. Williams, A.C. Behav. Cerebro Ciencia. 25, 439 a 455 (2002).
3. Craig, K.D. Lata. Psychol. 50, 22-32 (2009).
4. Ekman, P. & Friesen, W. Accin Facial Coding System (Consulting
Psiclogos Press, 1978).
5. Grill, H.J. y Norgren, R. Brain Res. 143, 263 a 279 (1978).
6. Mogil, J.S. Nat. Rev. Neurosci. 10, 283-294 (2009).
7. Prkachin, K.M. Dolor 51, 297-306 (1992).
8. Strigo, IA, Bushnell, MC, Boivin, M. & Duncan, GH Dolor 97, 235-246
(2.002).
9. Gao, Y.J., Ren, W.H., Zhang, Y.Q. Y Zhao, Z.Q. Dolor 110, 343-353 (2004).
10. Schweinhardt, P. et al. Neuroimagen 32, 256-265 (2006).
11. Berthier, M., Starkstein, S. & Leiguarda, R. corteza 23, 673-678 (1987).
12. Susskind, J. M. et al. Nat. Neurosci. 11, 843-850 (2008).
13. van den Maagdenberg, A.M.J.M. et al. Neurona 41, 701 a 710 (2004).
14. Langford, D.J. et al. Ciencia 312, 1967 a 1970 (2.006).
15. Langford, D.J. et al. Soc. Neurosci. (en la prensa).
100
Salvaje
escribe

CACNA1A
knockin
0
0.5
1.0
15
2.0
Rizatriptn
Saline
Porcentaje analgesia
Puntuacin de MGS (0 -2)
-50
-25
0
25
von
Frey
MGS
50
75
0.8
0
Dosis CYP
(mg kg-1)
+ Dosis de morfina
(mg kg-1)

***
***
*
**
100
200
400
CYP + 0
No CYP + 10
CYP + 10
CYP + 5
La media de diferencia de puntos 0.2
0.4
0.6
abc
Figura 3 | Validez y utilidad de los MGS. (a) Correlacin entre
ciclofosfamida (CYP) dosis y puntuaciones de diferencia MGS (efecto principal
de CYP
dosis: F2,17 = 8,9; p <0,005) y dependiente de la dosis de morfina reversin
de
La cara del dolor inducido por CYP 400 mg kg-1 (principal efecto de la dosis de
morfina: F2,12 =
26,6, p <0,001). Las barras de error, S.E.M. .; n = 4 (100, 200, CYP + 10, n +
10 CYP),
n = 5 (CYP + 5), n = 6 (CYP + 0), n = 12 (400); ** P <0,01; *** P <0.001
en comparacin con CYP ms solucin salina (CYP + 0) mediante la prueba de
Dunnett. Tenga en cuenta que
la administracin de 10 mg kg-1 de morfina (sin CYP + 10) no produce ningn
cambio

desde la lnea base. (b) Eficacia analgsica de 300 mg kg-1 acetaminofeno

despus
administracin de 100 mg zymosan como ensay por MGS pero no por von Frey
fibra mide la alodinia mecnica. Las barras de error, S.E.M. .; n = 4 (MGS), n =
8
(von Frey); *** P <0,001 en comparacin con cero (u otro grupo) mediante la
prueba t.
(c) marca "lnea de base" MGS en refrenado CACNA1A transgnico mutante
knockin
los ratones que lleva la migraa hemipljica familiar humana, tipo 1 R192Q
mutacin de sentido errneo en la protena codificada comparacin con los
controles de tipo salvaje
tratados con solucin salina o el frmaco antimigraoso, rizatriptn (50 mg kg1,
intraperitoneal). Las barras de error, S.E.M. .; n = 4 (rizatriptn), n = 6
(solucin salina).
Despus de dos vas ANOVA revel un genotipo significativo interaccin
medicamentosa
(F1,16 = 10,9; p = 0,005), se realizaron pruebas t. * P <0,05 en comparacin
con
MTODOS EN LNEA
Animales. Todos los ratones (excepto en el experimento "ratn migraa ')
eran CD-1 (ICR: Crl) los ratones, con edades entre 6-18 semanas, criados en
nuestro vivero
con los ratones obtenidos de Charles River Laboratories. Los ratones eran
alojados en grupos de dos o ms, en virtud de un 14 h de luz, 10 h oscuridad
ciclo (luces a las 07:00 h) en un ambiente de temperatura controlada
(20 1 C), con acceso ad lib a la alimentacin (Harlan Teklad) y
agua del grifo. Para cada ensayo nociceptivo una nueva cohorte de ratones fue
se utiliza, de tal manera que ningn ratn particip en ms de un ensayo.

Nmeros iguales de ratones machos y hembras fueron probados en cada

cohorte. No hay diferencias de sexo estadsticamente significativas en la lnea
de base
o puntaje promedio MGS poststimulus se observaron en cualquier ensayo,
aunque las tendencias hacia mayores poststimulus MGS puntuaciones en
femenino
Se observaron los ratones en varios casos. Todos los experimentos con
animales se
aprobado por la Universidad McGill (Downtown) cuidado de los animales y
utilizar comit.
Compuestos. Todos los compuestos qumicos nocivos y acetaminofen
se obtuvieron de Sigma-Aldrich y se disolvi en
solucin salina fisiolgica, excepto cuando se indique lo contrario. La morfina
sulfato fue generosamente proporcionada por Sandoz Canad.
Captura de fotogramas inicial y el desarrollo a escala. Los ratones fueron
individualmente
colocado sobre una mesa en cubculos (9 5 5 cm) con dos
paredes de plexigls transparente y dos paredes laterales de extrable
acero inoxidable. Dos cmaras de vdeo digitales se colocaron inmediatamente
fuera de las dos paredes de plexigls para maximizar la oportunidad de
disparos a la cabeza clara. Los ratones se aclimataron y grabaron en video
digital
(640 480 pxeles) con cmaras de vdeo digital en blanco y negro y
(Sony Handycam Videocmara Digital modelo DCRSR100)
durante 30 min antes de la inyeccin (lnea de base; 'sin dolor') y para
30 min despus de la inyeccin intraperitoneal de cido actico 0,9% (despus
de
inyeccin; "Dolor"). El uso de Microsoft Windows Media Player, individuales
marcos de la resultante WMV eran "agarraron" siempre

Se observ una clara y disparo en la cabeza despejada. En el perodo posterior

inyeccin, marcos fueron agarraron especficamente durante la exposicin
del comportamiento de retorcimiento o estiramiento (longitudinalmente
constricciones
de la musculatura abdominal) que se utiliza normalmente como dependiente
medir en este ensayo. Los archivos JPG resultantes se recortan
(de modo que la posicin del cuerpo ya no era visible) y autoadjusted
para el contraste y el brillo en Adobe Photoshop CS 8.0. Higherresolution
(1.920 1.080 pxeles) vdeos de color (utilizados en ms
experimentos realizados recientemente mostradas en las figuras 2b, c y 3b
y la Figura complementario 1a) se obtuvieron usando el Sony
De alta definicin Handycam videocmara (modelo HDR-CX100).
Mltiples collages de dolor y sin dolor fotografas fueron compilados
y enviado a S.E., T.K., D.W. y K.D.C., quien utiliz estos
collages, junto con la lnea de base y postinyeccin fotos individuales
para probar cada ratn para idear un sistema de codificacin (MGS) que
consiste
de las unidades de accin faciales (AUS) se perciben como potencialmente
confiable
ndices de dolor.
La precisin y la determinacin de la fiabilidad. Un folleto detallado
as como una presentacin de Microsoft PowerPoint se prepararon y
distribuida (por DJL) para graduarse McGill y pregrado
miembros de la J.S.M. laboratorio. Durante una sesin formal de capacitacin
de 1 h,
cada funcin se discuti, y una expresin prototpica para cada
Se visualiza puntuacin de intensidad (0-2). Siete de posgrado y pregrado
codificadores de estudiantes se les dio diez conjuntos aleatorios de

64 fotos de los no marcados para evaluar la precisin y fiabilidad de los MGS.

La precisin fue determinada por "dolor" global frente a los juicios "sin dolor";
fiabilidad mediante la comparacin de los puntajes promedio de la UA a travs
de codificadores,
utilizando la CPI (bidireccional diseo mixto, con una media anotar a travs de
10 rdenes informaron) 16.
Ensayos nociceptivo. Se utilizaron los siguientes ensayos (n = 8-20
ratones por ensayo en la Figura 2a; ver ms abajo para tamaos de muestra en
otra
experimentos), describen a continuacin en orden alfabtico de abreviaturas.
Se inform descripciones detalladas de la mayora de estos ensayos
previously17,18. Todos los estmulos se cree que son nocivos porque
los ratones, ya sea: (i) por reflejo retiro de ellos, (ii) presentan evidentes
comportamientos nocifensive o de recuperacin, como lamer, morder
o agitando en respuesta a ellos o (iii) Indicacin de hipersensibilidad
(hiperalgesia y / o alodinia) para evocar trmica y / o
estmulos mecnicos despus del insulto. En muchos casos, idnticos o
insultos muy similares son conocidos por ser dolorosa en los seres humanos.
Sino
no hay evidencia directa de la existencia de dolor espontneo
en muchos de estos ensayos. En todos los casos los ratones se habituaron para
30 min antes de la prueba comenz.
Para el ensayo de constriccin abdominal cido actico (AA), 10 ml kg-1
de 0,9% de cido actico se inyect por va intraperitoneal. Los ratones eran
inmediatamente devueltos a sus cubculos y filmado durante 30 minutos
despus de la inyeccin. Para el isotiocianato de alilo de prueba (AITC), 20 l de
5% AITC se inyect por va subcutnea en la superficie plantar
de la pata trasera derecha. Los ratones fueron inmediatamente devueltos a su

cubculos y filmaron durante 30 minutos despus de la inyeccin. Para la

capsaicina
(PAC) de prueba, 20 l de 125 mg ml-1 capsaicina (disuelto en 80%
solucin salina, 10% de Tween 10 y% de etanol) se inyect por va subcutnea
en la superficie plantar de la pata trasera derecha. Los ratones eran
inmediatamente devueltos a sus cubculos y filmado durante 20 minutos
despus de la inyeccin. Por la lesin por constriccin crnica (CCI), la ciruga
se llev a cabo bajo anestesia general esencialmente como anteriormente
described19. Los ratones fueron devueltos a sus jaulas hasta que las pruebas.
En los das de prueba (1, 7 y 14 das postoperatorios), se habituaron ratones
durante 30 min antes de ser filmada durante 1 h. Para la ciclofosfamida
(CYP) Prueba de cistitis, 10 ml kg-1 de CYP (100, 200 o 400 mg kg-1)
se inyect por va intraperitoneal. Esta droga se convierte en acrolena
en el hgado y se acumula en la vejiga, causando una cistitis dolorosa
en los seres humanos y los cambios de comportamiento y la alodinia se refiri
a la
parte inferior del abdomen en mice20. Los ratones se mantuvo en sus jaulas
durante 2 h y luego fueron devueltos a sus cubculos de observacin para
60 min antes de ser filmados durante 1 h.
Para el ensayo de la formalina (Fearly, Flate), 20 l de 5% de formalina se
inyecta por va subcutnea a la superficie plantar de la pata trasera derecha.
Los ratones fueron devueltos a sus cubculos y filmaron durante 60 minutos
despus de la inyeccin. La temprana (aguda; Fearly) fase de la prueba de la
formalina
se define como conservadora de 0-5 min despus de la inyeccin y la
fase como 15-60 min despus de la inyeccin; tarda (Flate tnica). Para la
incisin
modelo, el modelo de incisin pata trasera del dolor postoperatorio

se realiz bajo anestesia isoflurano en oxgeno como antes

described21 para el ratn, una adaptacin de la model22 rata. Una vez que
recuperado de la anestesia, los ratones fueron devueltos a sus cubculos
y filmado durante 2 h.
Para el modelo de laparotoma (LAP), una laparotoma, diseado para imitar
una ovariectoma ventral farsa, se realiz bajo isofluraneoxygen
anestesia. Despus del afeitado y la desinfeccin, una lnea media 2 cmincisin se hizo utilizando tijeras iris. Capas musculares eran
cerrada con sutura de polidioxanona 5-0 y la piel bordes apposed
2010 Naturaleza America, Inc. Todos los derechos reservados.
doi: 10.1038 / nmeth.1455 mtodos naturales
el uso de adhesivo tisular. Una vez recuperado de la anestesia, los ratones se
regresado a sus cubculos y filmado durante 2 h. Para el magnesio
prueba de constriccin abdominal sulfato, 125 mg kg-1 MgSO4 fue
inyectados por va intraperitoneal en un volumen de 10 ml kg-1. Los ratones
eran
regresado a sus cubculos y filmado durante 20 minutos despus de la
inyeccin.
Para la lesin del nervio escatimado (SNI), ciruga (con el nervio sural
dejado intacto) se realiz bajo anestesia general como antes
described23 para el ratn, una adaptacin de la model24 rata. Ratones
fueron devueltos a sus jaulas hasta que las pruebas. En los das de prueba (1, 7
y 14 d postoperatorio), los ratones se habituaron durante 30 min antes
siendo filmada durante 1 h. Para la prueba de la cola-clip (TC), un clip de la
carpeta aplicacin
Se aplic 700 g de la fuerza ~ 1 cm desde la base de la cola.
El punto final fue un intento propsito de eliminar el clip (cabeza
movimiento hacia la cola), por lo general ocurre dentro de 2-3 s (datos

no mostrada). Debido a que este ensayo es sensible a pruebas repetidas,

solamente
un ensayo se llev a cabo por asignatura. Para la prueba de retirada de la cola
(TF), una
fuente de calor radiante se aplica a la superficie ventral de la cola
(~ 3 cm de la base). El punto final fue retirada reflexiva de
la cola del estmulo. La intensidad del dispositivo comercial
(Modelo CITI 33) se fij a 5% de la produccin mxima, dando lugar a
latencias medias de aproximadamente 4 s (datos no mostrados). Para el
prueba de una cola-retiro (TW), la mitad distal de la cola se sumergi
en un bao de agua caliente con temperatura controlada (45 C o 49 C). los
punto final fue retirada reflexiva de la cola del agua,
que se produjo en aproximadamente el 10 y 5 s, respectivamente (datos
no mostrada). Por ltimo, para la prueba de inflamacin zymosan (ZYM),
20 l de 0,1-10 mg ml-1 zymosan se inyectaron por va subcutnea
en la superficie plantar de la pata trasera derecha, o intraarticular
en el tobillo derecho (n = 06/10 ratones por dosis en cada sitio). los
conjunta tibiotarsal est marcada por dos prominencias seas que pueden ser
sentir a travs de la piel (en representacin de la cabeza del hueso tibial
y la cabeza del hueso del tarso). En breve isoflurano en oxgeno
la anestesia, una aguja de calibre 30,5 se insert en un ngulo a la derecha en
el espacio articular. La exactitud de las inyecciones se determin utilizando
tinte azul en estudios piloto. Los ratones se mantuvo en sus jaulas
durante 2 h y luego fueron devueltos a sus cubculos de observacin para
60 min antes de ser filmados durante 1 h.
El acaparamiento de Marco. Para los ensayos que implican la retirada brusca
respuestas (TC, TF y TW), nos agarraron fotogramas durante la exposicin

de la respuesta s (dolor) y los comparo con marcos

agarrado despus de la aparicin del estmulo nocivo pero varios segundos
antes de la respuesta (sin dolor). Es discutible si un ms
base de referencia podra marcos tomada antes de la aplicacin
del estmulo nocivo, pero esto se plante por la mayora negativos
los datos obtenidos (Fig. 2a). Para ensayos que implican ms duradero
respuestas nocifensive (por ejemplo, AA, AITC, CAP, Fearly, Flate
y MgSO4), se agarr fotogramas durante la exposicin de tales
comportamiento (por constricciones abdominales) o inmediatamente
precedente
el comportamiento (para lamer, como la cara en general se oscurece
durante este comportamiento; dolor); comparamos estos marcos a los
agarr de vdeo de lnea de base (antes de la inyeccin; sin dolor). Para el
ensayos de incisin y LAP, nos agarraron marcos al azar de
video grabado 1-2 h despus de la ciruga (dolor) y los comparo
a los marcos agarr 1 d antes de la ciruga (sin dolor). Para el CYP
y ensayos ZYM, nos agarraron marcos azar 3-4 h despus de la inyeccin
(dolor) y los comparo con marcos agarraron desde la lnea base
de vdeo (antes de la inyeccin; sin dolor). Para la ICC y SNI neuroptico
ensayos, se tomaron al azar de marcos de vdeo grabado
1, 7 y 14 das despus de la ciruga (dolor) y los comparo con los marcos
agarr de vdeo de lnea de base (recogido una semana antes de la ciruga;
sin dolor).
Para todos los ensayos descritos anteriormente nociceptivo, el dolor y el dolor
nomarcos se agarraron de vdeo digitales (WMV), guardan como
Archivos JPG y recortadas y editadas como se describe anteriormente. Editado

Archivos JPG fueron copiados en PowerPoint, una imagen JPG por

diapositiva. Una macro obtenerse en la web (http: //www.tushar-mehta.
a continuacin, se utiliz com / powerpoint / randomslideshow / index.htm)
para
aleatorizar el orden de las diapositivas. Se eliminaron Identificaciones para
asegurar
que la codificacin posterior se realiz de una manera ciega.
MGS codificacin. Aleatorios y fotos sin marcar fueron presentados
en un monitor de ordenador grande, de alta resolucin, uno a la vez. por
cada foto, el anotador le asigna un valor de 0, 1 o 2 para cada uno de los
cinco UA: ajuste orbital, abultamiento nariz, comprobar las Ardenas, la posicin
del odo
y el cambio de la barba. En todos los casos, una puntuacin de 0 indica alta
confianza de la media luna que la UA no estaba presente. Una puntuacin de
1 indica ya sea alta la confianza de una apariencia moderada de
la UA o ambigedad sobre si la UA estuvo presente o no.
Una puntuacin de "2" indica la deteccin de alta confianza de una severa
aparicin de la UA. En los casos en que el codificador juzg que
la caracterstica anatmica se oscureci, no hay puntuacin fue dada para que
AU. Si se oscurecen ms de dos unidades administrativas, la puntuacin global
fue
no calculado para esa foto.
En cada ensayo, un no-dolor promedio y un dolor medio MGS
Se calcul la puntuacin, y la existencia de una cara de dolor infiere en
la mayora de los casos por una diferencia estadsticamente significativa (en
comparacin a cero) el dolor
MGS menos sin dolor MGS puntuacin media de diferencia.
Lesiones qumicas. Los ratones fueron anestesiados con isofluraneoxygen,

afeitada y se coloca en un aparato estereotxico de tal manera que

el crneo era horizontal. Tras la incisin, la perforacin a travs del crneo
y la eliminacin de la duramadre con una aguja dental, 0.1 l de 10 mg l
-1
(5-hidroxi--isoazoleacetic-amino-3 cido; Sigma) cido ibotnico
en PBS o PBS solo (n = 6 ratones por condicin por sitio) era
inyectada bilateralmente durante 1 min usando esterilizados 0.5-l Hamilton
microjeringas (dimetro de la punta de 90 micras). Las agujas se dejaron en
colocar durante 5 minutos para permitir la difusin. Clips para heridas se
aplicaron a
el cuero cabelludo para cerrar las incisiones; stos se eliminaron una semana
despus de
la ciruga. Los ratones se recuper de la anestesia en una placa de
calentamiento
y luego fueron devueltos a sus jaulas. Las pruebas de comportamiento
producido no menos de una semana despus de la ciruga.
En experimentos separados, la circunvolucin cingulada anterior (ACC),
la amgdala basolateral (BLA) y la nsula anterior rostral
(RAI) fueron atacados. Coordenadas fueron elegidos con el ratn
atlas25 estereotxica de la siguiente manera (en relacin a bregma): para la
ACC, antero-posterior
(AP) 0,50 mm, dorsal-ventral (DV) -1,75 mm y
lateral (L) 0,25 mm; para BLA, AP -1,46 mm, -4,75 mm DV,
L 2,75 mm; y para la RAI, AP 1,80 mm, DV -2,50 mm y
L 2.50 mm.
Las pruebas de comportamiento se produjo en la constriccin abdominal
Prueba ('retorcindose'). Los ratones fueron grabados en vdeo durante 30
minutos despus de una intraperitoneal

inyeccin de 10 ml kg-1 de 0,9% de cido actico. La cinta de vdeo

se anot en los MGS y tambin para constricciones abdominales
utilizando un strategy14 de muestreo, en el que la presencia o ausencia de
constricciones abdominales o "retorcimientos" (longitudinalmente
caracterstica
tramos de la torso con un arco cncavo concomitante de la
espalda) en un perodo de 5 a 20 s-s intervalos (90 muestras en total) se
anotaron
2010 Naturaleza America, Inc. Todos los derechos reservados.
Nature Methods doi: 10.1038 / nmeth.1455
por un observador ciego a la condicin de dolor. Despus de las pruebas de
comportamiento, ratones
se anestesiaron con pentobarbital (100 mg kg-1) y perfundidos
con 4% de paraformaldehdo en tampn de fosfato 0,1 M y sodio
nitrito (0,1%). Los cerebros fueron extrados, procesados en 4% de
paraformaldehdo
y luego 30% de sacarosa, cryosectioned en 25-micras de espesor
rodajas y se tieron con violeta de cresilo para confirmar la orientacin. Basado
en esto, dos de los seis lesiones Rai fueron juzgados para haber perdido la Rai,
y los datos para estos ratones fueron analizados como un grupo separado.
Experimento morfina. La morfina analgesia se evalu en el
Modelo CYP utilizando la dosis ms alta de CYP, 400 mg kg-1. CYP era
administrado por va intraperitoneal en un volumen de 10 ml kg-1 despus de
filmacin lnea de base. Saline o sulfato de morfina (5 o 10 mg kg-1)
se administr por va subcutnea 3,25 h despus de la inyeccin de CYP
(n = 4-6 ratones por dosis), lo que permite 15 min antes del inicio de una
30 min grabacin en vdeo despus de la inyeccin de drogas. Un grupo de
ratones fue

inyectado con nicamente 10 mg kg-1 morfina.

Experimento acetaminofeno. Grupos separados de ratones ingenuo
(n = 4-8 ratones por medicamento por ensayo) se pusieron a prueba en los
MGS y
para la alodinia mecnica despus de la inyeccin de 100 mg 5 mg ml-1
zymosan. Sensibilidad mecnica se midi en el von Frey
prueba utilizando el method26 escalera de arriba-abajo. Los ratones fueron
colocados en
un suelo de malla metlica en plexigls pequeos cubculos (9 5 5 cm de
altura),
y ocho fibras de von Frey calibrados (0,007 a 1,4 g) se aplicaron a
la superficie plantar de la pata trasera hasta que se inclin. El umbral
fuerza requerida para provocar la retirada de la pata (mediana 50%
retirada de la pata) se determin. Los datos presentados son tanto
patas traseras izquierda y derecha promediados juntos como no hay efectos de
lateralidad
se observaron.
Para ambas medidas, los datos de referencia se recogieron en un 30 min
perodo antes de la administracin zymosan. Post-zymosan (pero
preacetaminophen)
los datos se recogieron en ambos casos en un 30 min
periodo que comenz 4 horas despus de la administracin zimosn.
Enseguida
a partir de entonces, los ratones fueron inyectados por va subcutnea con
cualquiera
300 mg kg-1 acetaminofeno o vehculo (polietilenglicol;
10 ml kg-1). Esta dosis fue elegido ya que se la recomienda
dosis analgsica postoperatoria del ratn en nuestra institucin (http: //
www.mcgill.ca/files/researchoffice/101_02-Rodent_Analgesia.

doc; 8 julio 2009), pero tomamos nota de que las manifestaciones

convincentes
de la eficacia del paracetamol en ensayos inflamatorios distintos de
el (intensidad modesta) prueba de constriccin abdominal cido actico
son rare27,28. Treinta minutos ms tarde, a 30 min de larga grabacin en vdeo
o von
Pruebas de Frey se produjo otra vez, para evaluar la posible analgsicos o
antialodnico afecta de acetaminofeno. Porcentaje analgesia
las puntuaciones de los ratones tratados con paracetamol presentan en la
Figura 3b
se calcularon con respecto al efecto mximo posible para
cada ratn, como sigue: porcentaje de analgesia = ((post-zymosan
umbral - umbral post-acetaminofeno) / (umbral de la lnea de base
- Umbral de post-zimosn)) 100. Los resultados completos incluyendo
vehiclegroup
estn disponibles en la Figura 3 suplementario de datos.
Experimento "ratn Migraa '. El MGS se aplic a una transgnico
modelo de ratn de la migraa hemipljica familiar, tipo 1 (FHM-1).
Como previously13 descrito, utilizando un enfoque y la orientacin de genes
aplicacin de la tecnologa Cre-lox para eliminar la resistencia a la neomicina
casete, un ratn knockin fue desarrollado llevando el CACNA1A
mutacin de sentido errneo (que codifica una protena con la mutacin
R192Q)
que en los seres humanos provoca FHM-1 (Ref. 29). Ganancia de funcin
efectos se han observado en este mutante, incluyendo un aumento
en neuronal densidad de corriente Cav2.1, mejorado la neurotransmisin
cortical
y una mayor propensin a la depression13,30 propagacin cortical,
el mecanismo probable que subyace a la aura31 migraa.

Se puede especular, por lo tanto, que los ratones que lleva la CACNA1A
mutacin de sentido errneo (que codifica una protena con la mutacin
R192Q)
en realidad podra experimentar headaches32 migraa. Hemos llevado a cabo
una caracterizacin sistemtica del fenotipo conductual
de estos mutantes (datos no publicados;. ML Chanda et al).
Ingenuo, adulto (21/7 semanas de edad) CACNA1A ratones knockin y su
homlogos de tipo salvaje fueron colocados en plexigls cilindros transparentes
(3 cm de dimetro; 10 cm de longitud) delante de las cmaras de vdeo como
descrito arriba. Despus de una habituacin de 30 min, los ratones fueron
brevemente
eliminado y se inyecta por va intraperitoneal con 50 mg kg-1
de rizatriptn o solucin salina (n = 4-6 ratones por medicamento por
genotipo).
Marcos fueron capturados desde vdeo a intervalos aleatorios durante 2 h,
produciendo aproximadamente 45 fotografas por ratn. En este caso, hay
puede haber ninguna "lnea base" para la comparacin; creemos que el cilindro
moderacin en s puede haber provocado las migraas en un subconjunto de
mutante
los ratones, lo que lleva a un aumento de puntajes MGS general en este
genotipo.
Acompaando a la cara dolor en ratones mutantes son otra headspecific
comportamientos que son considerablemente ms frecuente en el mutante
ratones y normalizado por rizatriptn en esta misma dosis (indito
datos; M.L. Chanda et al.).
El anlisis estadstico. Todos los anlisis estadsticos se realizaron con
Systat v.11 (SPSS Inc.), con un criterio de = 0,05, a excepcin de la CPI
en Complementario figura 1b, que se calcul con el programa SPSS

v. 17. En la mayora de los casos en que MGS significan se calcularon

puntuaciones de diferencia,
esos resultados se compararon a cero usando una sola muestra,
una cola la prueba t de Student. Correccin para comparaciones mltiples
En la Figura 2a se ha realizado mediante la tasa de falso descubrimiento
technique33, aunque observamos que los experimentos se llevaron a cabo por
separado,
no al mismo tiempo. La dosis o estmulo de intensidad dependencia
(Figs. 2b y 3a) se analiz mediante ANOVA de una va, seguido
en su caso por la prueba post hoc entre maysculas y comparacin de Dunnett
(comparado con vehculo). Las diferencias de grupo en los experimentos de
lesiones
(Fig. 2c) se evaluaron mediante ANOVA de una va seguido por
Prueba post hoc de Tukey. Efectos del genotipo y de drogas en el 'migraa
experimento del ratn '(Fig. 3c) fueron analizados por ANOVA de dos vas,
seguido de pruebas t de Student.
16. Shrout, educacin fsica Y Fleiss, J. L. Psychol. Bull. 86, 420-428 (1979).
17. Mogil, J.S. et al. Dolor 80, 67-82 (1999).
18. Mogil, J.S. et al. Dolor 126, 24-34 (2006).
19. Bennett, G.J. Y Xie, Y.-K. Dolor 33, 87-107 (1988).
20. Bon, K., Lichtensteiger, CA, Wilson, los gastos de Mogil, JS J. Urol. 170,
1008-1012 (2003).
21. Pogatzki, E.M. y Raja, S.N. Anesthesiology 99, desde 1023 hasta 1027
(2003).
22. Brennan, T.J., Vandermeulen, E.P. Y Gebhart, G.F. Dolor 64, 493-501 (1996).
23. Shields, SD, Eckert, WA III y Basbaum, AI Dolor J. 4, 465-470 (2003).
24. Decosterd, I. & Woolf, CJ Dolor 87, 149-158 (2000).
25. Franklin, K.B. Y Paxinos, A. El Ratn cerebral estereotxica en Coordenadas,

2 ed. (Academic Press, 2003).

26. Chaplan, SR, Bach, FW, Pogrel, JW, Chung, JM & Yaksh, TL
J. Neurosci. Mtodos 53, 55-63 (1994).
27. Dickinson, A. L., Leach, M. C. Y Flecknell, P.A. Lab. Anim. 43, 357 a 361
(2009).
28. Wilson, S. G. et al. J. Pharmacol. Exp. El R. 305, 755-764 (2003).
29. Ophoff, R.A. et al. Cell 87, 543-552 (1996).
30. Tottene, A. et al. Neurona 61, 762-773 (2009).
31. Goadsby, PJ, Lipton, RB y Ferrari, MDN Engl. J. Med. 346, 257 a 270
(2.002).
32. Xue, M. & Rosenmund, C. Neurona 61, 653-654 (2009).
33. Benjamini, Y. y Hochberg, Y. J. Roy. Estatista. Soc. Ser. B. 57, 289-300
(1995).