BACTERIFAGO M13

El fago M13 es un bacterifago filamentoso compuesto por una nica molcula de

ADN monocatenario circular la cual tiene aproximadamente 6407 nucletidos de
longitud; esta molcula se encuentra encapsulada en una cubierta proteica
formada por aproximadamente 2700 copias de la protena mayor de recubrimiento
P8, y encapuchada en los extremos por cinco copias de dos diferentes protenas
de recubrimiento menores (P9, P6, P3). La protena de recubrimiento menor P3
permite que el fago se una a un receptor presente en la punta de los pilli del
hospedador Escherichia coli. La infeccin con bacterifagos filamentosos no es
letal para las bacterias; sin embargo la infeccin causa placas turbias en los
cultivos de E. coli. Aunque no se trata de un virus ltico, si se ha observado una
disminucin en la velocidad de reproduccin de las clulas infectadas.
Los plsmidos M13 llamados fagmidos son utilizados en numerosos procesos de
recombinacin de ADN, y el virus ha sido estudiado por las posibles aplicaciones
en nanoestructuras y nanotecnologa de los principios que dominan su proceso de
encapsulamiento.
La familia de los fagos filamentosos pertenece al gnero de los Inovirus, que
comprende una serie de bacterifagos acoplados con el ADN en forma de simple
cadena . Los fagos filamentosos infectan las cepas de E.coli que contengan el
plsmido conjugativo F, a travs de su unin al extremo del pilus y su
translocacin al citoplasma de la clula. El ensamblaje en la membrana de la
clula de E.coli y la salida de las partculas virales no causan la lisis celular o
muerte de la bacteria. Las bacterias infectadas continan vivas; aunque su
velocidad de crecimiento decrece.
Los fagos filamentoso tienen una morfologa cilndrica de 900 nm de largo por 6,5
nm de dimetro, y su cpsida est formada mayoritariamente por la protena pVIII
con alrededor de 2 700 copias por fago. En una de estas extremidades se
encuentran tres o cinco copias de las protenas menores pVII y pIX . Las dos
protenas forman uniones con las regiones correspondientes de la protena pVIII.
La regin de pIX que llega hasta el extremo amino-terminal de la protena pVIII
tiene la funcin de estabilizar esta estructura desde el interior. Las protenas pVI y
pIII se encuentran en el extremo contrario de las protenas pVII y pIX en el fago.
Cada fago tiene 5 copias de cada de una de estas protenas. La protena pIII es
responsable por la unin del fago al pilus de E.coli y as iniciar el proceso de
infeccin de E.coli.

Los vectores con los fragmentos clonados en fusin con la protena pIII o pVIII son
transformados en clulas competentes de E. coli de la cepa TG1 ya que produce
pili por lo tanto puede ser infectada por el fago M13.
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Bacterifago temperado del gnero INOVIRUS que infecta a las enterobacterias,

especialmente a la E. coli. Es un fago filamentoso constituido por una hebra de ADN y
que es permutada circularmente.

El M13 es un fago filamentoso. Se trata de un virus en forma de hilo (900 nm de

longitud, con slo 9 nm de dimetro), con un ADN en forma de anillo de una nica
hebra (tambin denominada hebra +) y una cubierta proteica de 2710 subunidades
proteicas idnticas.
El bacteriofago M13 tiene una cpside de tipo filamentoso dentro de la cual se
encuentra una molcula circular de ADN de hlice sencilla de 6.400 nucleotidos. Al
igual que X174, tambin pasa por una forma replicativa dplex.

Fago filamentoso M13

Esquema del bacteriofago M13

Azul: Protena pIII; Marrn: Protena pVI; Rojo: Protena pVII; Verde: Protena pVIII; Fucsia: Protena
pIX; Prpura: ADN monocatenario.

Grupo:

II (Virus ADN monocatenario)

Familia:

Inoviridae

Gnero:

Inovirus

Especie:

Fago M13 de Enterobacteria

Caractersticas del Fago M13:

Simetra helicoidal. Tiene 6 nm de dimetro y 860 nm de longitud.
Infectan a travs del Pili. (E. coli Dh5 F)
Poseen DNA monocatenario circular (+).

 Se forman ciertos loops por apareamientos de bases complementarias.

El ciclo replicativo es complejo: mecanismo de CIRCULO RODANTE.
En algunos casos puede integrarse en el genoma bacteriano.
Hay solapamiento de genes
Durante la replicacin, se forman FORMAS REPLICATIVAS de dsDNA. El DNA
(-) producido puede utilizarse para sintetizar mRNA.
Puede liberarse de la clula sin lisarla, produciendo fagos continuamente.
Este fago ha sido muy utilizado en BIOLOGIA MOLECULAR. Permite la
secuenciacin de genes por el mtodo de Sanger, se puede utilizar como
vector de expresin, en ensayos de mutagnesis, as como en ensayos de
clonacin de fragmentos de gran tamao.

Estructura del fago:

La cubierta proteica del fago se encuentra formada primariamente por un ensamble de
monmeros de una protena formada por 50 aminocidos llamada pVIII (o p8), la cual se
encuentra codificada por el gen VIII (o g8) en el genoma del fago. Un fago M13 de tipo
silvestre emplea aproximadamente unas 2700 copias de la protena p8 para formar la cubierta
que, tpicamente, tiene aproximadamente 900 nm de longitud. Sin embargo, las dimensiones
de la cubierta son flexibles y el nmero de monmeros de p8 utilizados para formarla se
pueden ajustar para empacar correctamente el tamao del genoma de cadena simple que lo
forma. Por ejemplo, cuando el genoma del fago se muta para reducir el nmero de bases de
ADN (de 6,4 kb a 221 pb),1 el nmero de copias de p8 utilizadas para empacarlo se reduce a
menos de 100, provocando que la cubierta de p8 se ajuste para acomodar el genoma
reducido. Aparentemente existe una limitacin en la capacidad del fago para contener material
gentico que est en torno al doble de su contenido normal de ADN. Sin embargo,
la delecin del gen que codifica para la protena p3 del fago previene que este pueda escapar
de su hospedador E. coli, y en estas condiciones es posible encontrar dentro de la clula
hospedadora fagos con una longitud de entre 10 y 20 veces la longitud normal, partculas
vricas que poseen varias copas del genoma del fago.
Existen tambin otras cuatro protenas en la superficie del fago, dos de las cuales han sido
extensamente estudiadas. En uno de los extremos del filamento hay cinco copias de la
protena de superficie pIX (p9) y de su protena acompaante pVII (p7) que se encuentra ms
profundamente enclavada en la cubierta proteica del fago. Si fuera posible comparar a la
protena p8 con el material del cual est formada el asta del bastn que es el fago, entonces

p7 y p9 forman el pomo que es posible ver en las microfotografas. Estas protenas son muy
pequeas, conteniendo 33 y 32 aminocidos respectivamente, sin embargo es posible aadir
residuos a la porcin terminal de cada una, ya que esta porcin se encuentra presente en la
parte exterior de la cubierta. En el otro extremo del fago hay cinco copias de la protena pIII
(p3) expuestas en la superficie y de la protena accesoria pVI (p6) la cual se encuentra un
poco menos expuesta. Estas forman el extremo redondeado del fago y son las primeras
protenas en interaccionar con el hospedador E. coli en el momento de la infeccin. La
protena p3, es adems el ltimo punto de contacto con el hospedador cuando la partcula
viral abandona la superficie bacteriana.

Ciclo de vida:
Las etapas generales del ciclo de vida viral son: infeccin, replicacin del genoma viral,
ensamble de nuevas partculas virales, y liberacin de la progenie de partculas del
microorganismo hospedador.

Infeccin
Los fagos filamentosos utilizan una estructura bacteriana conocida como pilus F para infectar
a E. coli. La protena p3 del extremo del fago se ancla a la protena To1A del pilus bacteriano
permitindole al fago transferir su genoma hacia el citoplasma de la bacteria, donde las
enzimas de la maquinaria metablica bacteriana convierten el genoma formado por una
cadena simple de ADN (llamada cadena positiva o +), en la forma replicativa (FR) de ADN
doble cadena. Esta forma replicativa sirve adems de molde para la expresin de los genes
virales.

Replicacin del genoma

El ADN de fago que entra en la clula es de cadena sencilla y se lo suele llamar "hebra +".
Apenas penetra en la clula, la ARN polimerasa de la clula hospedadora sintetiza un cebador
en el origen de replicacin. La ADN polimerasa de la clula hospedadora empieza a sintetizar
la cadena complementaria que se denomina "hebra -". Cuando la Pol III encuentra el cebador
se disocia del ADN. Luego la ADN Pol I con actividad exonucleasa 5'elimina el cebador y llena
la brecha. Finalmente la ligasa suelda los dos tramos de ADN recin sintetizados. La sntesis
de la cadena - da lugar a un ADN de doble cadena llamado "forma replicativa".
Dos productos de los genes del virus cumplen un rol crtico en esta etapa del ciclo de vida del
fago: Estos son la protena pII (p2) que es una endonucleasa y provoca una "muesca" en el

genoma viral cuando se encuentra en su forma de doble cadena, para posibilitar la iniciacin
en la replicacin de la cadena + y permanece unida al fosfato en el extremo 5' dejando el
extremo 3' libre. Sin la presencia de p2, no se puede producir la replicacin del fago. Las
enzimas de la bacteria hospedadora van completando las cadenas + con su cadena
complementaria formando de esta manera mltiples copias del ADN viral en su forma de doble
cadena. La protena pV (p5) compite con la formacin de ADN de doble cadena secuestrando
copias sencillas de la cadena + formando un complejo nucleoproteico que servir de ncleo
para la formacin de nuevas partculas virales.
La protena Rep del husped es una helicasa que ayuda a desenredar el ADN en el punto
donde se encuentra la muesca. La ADN Pol III del anfitrin utiliza extremo 3' libre como un
cebador para la sntesis de una nueva hebra +, mientras que la vieja se quita. Una vez
completada la replicacin se obtienen dos molculas de ADN: una circular de doble cadena y
una de cadena sencilla, sobre esta ltima acta la protena p2 soldando el extremo 5 'y 3' por
medio de una reaccin de transesterificacin recreando de esta forma una hebra +. Este
proceso contina hasta que se empieza a acumular p5. Esta protena se une al ADN de
cadena sencilla + y evita que se siga replicando.
Existe adems una protena adicional codificada por el genoma del fago, la pX (p10), que es
importante para regular el nmero de genomas de doble cadena en el hospedador bacteriano.
Sin la protena p10 no se acumulan cadenas +. Lo que resulta particularmente interesante con
respecto a esta protena es que es idntica a la porcin carboxilo terminal de p2, ya que el gen
que codifica para p10 se encuentra de hecho dentro del gen p2 y la protena surge de
una iniciacin diferencial de la transcripcin dentro del gen de p2. Esto hace que la
manipulacin de p10 se encuentre inextricablemente unida a la manipulacin de p2 (un
verdadero dolor de cabeza desde el punto de vista de la ingeniera) pero esto logra una
estructura gentica sumamente compacta y eficiente en la naturaleza.

Ensamble de las partculas virales

La maduracin del fago requiere de las protenas pIV (p4), pI (p1) codificadas tambin en el
genoma viral, y de la protena pXI (p11). Esta ltima es una protena codificada por el mismo
gen pI, y es producto de un punto de iniciacin de transcripcin diferencial. En la membrana
externa de la bacteria se ensamblan mltiples copias (generalmente entre 12 y 14) de p4 para
formar una estructura estable con forma de barril. En forma similar un puado de p1 y p11 (5 o
6 copias de cada una) se ensamblan en la membrana interna de la bacteria, y la evidencia
gentica sugiere que las porciones C terminales de p1 y p11 interaccionan con la porcin N
terminal de p4 en el periplasma. Estas protenas en conjunto, p1, p11, p4; forman un complejo
en forma de canal a travs del cual el fago maduro es secretado de su hospedador bacteriano.

Excresin
Para iniciar la secrecin del fago, dos de las protenas menores de la envoltura: p9 y p7,
interactan con el complejo formado por ADN monocatenario y p5 a la altura de la regin del
ADN llamada secuencia de empaque (tambin conocida como secuencia PS). Entonces las
protenas p5 que recubren la hebra de ADN monocatenario son reemplazadas por las
protenas p8 que se encuentran empotradas en la membrana celular de la bacteria y el fago
en crecimiento es "hilado" al atravesar el canal formado por p1, p11 y p4. Este proceso de
reemplazo de p5 por p8 explica la evidencia de microfagos presentada anteriormente
indicando como es que el tamao de la partcula viral se encuentra determinado por el nmero
de bases empacadas dentro del fago. Una vez que el ADN viral se encuentra completamente
recubierto con p8, se finaliza la secresin aadiendo los capuchones p3/p6 y el fago se
desprende de la superficie bacteriana.

Replicacin en E. coli
Debajo se listan los pasos involucrados en la replicacin del fago M13 en el anfitrin E. coli.

La cadena de ADN viral (+) entra al citoplasma.

Las enzimas bacterianas sintetizan la cadena complementaria (-).

La ADN girasa, una topoisomerasa tipo II, acta sobre el ADN de doble cadena y
cataliza la formacin de superenrrollamientos de ADN doble cadena.

El producto final es la forma replicativa (RF) parental de ADN.

Una protena del fago, pII, hace una muesca en la cadena RF (+).

El extremo 3'-hidroxilo acta como cebador en la creacin de una nueva cadena viral.

La pII forma cadenas circulares a partir de la cadena (+) viral.

Se produce un reservorio de molculas RF de doble cadena como progenie.

La cadena (-) de la RF funciona como molde para la transcripcin.

Los ARNm son traducidos a protenas del fago.

Los dmeros pV unen a las cadenas simples de ADN recin sintetizadas, y previenen
la conversinn de estas a ADN RF.

La sntesis de ADN RF contina hasta que pV alcanza una concentracin crtica

La replicacin del ADN cambia hacia la sntesis de ADN viral (+) de simple cadena.

Se forman estructuras de pV-ADN de aproximadamente 800 nm de longitud y 8 nm de

dimetro.

Los complejos pV-ADN sirven como sustrato para la reaccin de ensamble del fago.

Fagos con de ADN monocatenario. El fago M13 como herramienta en

biologa molecular.
El bacterifago M13 destaca entre los fagos utilizados en biologa molecular. Se
trata de un fago de cadena sencilla circular. A diferencia del fago , este fago
infectan cepas de E. coli a travs del Pili, por ello la cepa E. coli Dh5 F resulta
un receptor idneo. Dentro de los fagos con ssDNA nos encontramos 2 familias:
Inoviridae (fago filamentoso M13, que infecta Enterobacterias ) y Microviridae
(Enterofago X174). El fago M13 es un bacterifago filamentoso de 900nm de
longitud y 6.5nm de ancho que contiene una molcula de ADN circular

monocatenario de sentido positivo encapsulado por ~2300 copias de la

protena de la capside gp8 ms cinco copias de 4 proteinas menores. El ADN se
extiende en el interior a lo largo del eje longitudinal de la partcula. Las
protenas menores estn implicadas en el inicio del ensamblaje y estabilidad de
la partcula. Las protenas gp3 y gp6 participan en la unin a la clula husped.

Cuando el fago M13 infecta a una clula bacteriana, la cadena sencilla (cadena
+) se replica y produce una molcula de doble cadena denominada forma
replicativa (RF). Las molculas RF pueden considerarse similares a los
plsmidos, pudindose insertar DNA exgeno en sitios de restriccin nicos
presentes en el DNA del fago. Cuando se reinsertan en clulas bacterianas, las
molculas RF se replican y producen cadenas sencillas (+), en las que hay una
cadena del DNA insertado. La clula hace salir los clones de DNA de cadena
sencilla que produce M13, que pueden recuperarse y utilizarse directamente
para su secuenciacin, o como molde para alteraciones mutacionales de la
secuencia clonada.

Tambin se utilizan otros bacterifagos como vectores, entre los que destaca el
fago de cadena sencilla M13. Cuando M13 infecta a una clula bacteriana, la
cadena sencilla (cadena +) se replica y produce una molcula de doble cadena
denominada forma replicativa (RF). Las molculas RF pueden considerarse
similares a los plsmidos, pudindose insertar DNA exgeno en sitios de
restriccin nicos presentes en el DNA del fago. Cuando se reinsertan en
clulas bacterianas, las molculas RF se replican y producen cadenas sencillas
(+), en las que hay una cadena del DNA insertado. La clula hace salir los
clones de DNA de cadena sencilla que produce M13, que pueden recuperarse y
utilizarse directamente para su secuenciacin, o como molde para alteraciones
mutacionales de la secuencia clonada.

Mutagnesis dirigida. Los avances en las tcnicas de sntesis de DNA han

acelerado los progresos experimentados en el estudio de las funciones de las
protenas y de la expresin gnica. Una de las formas ms efectiva de estudiar
la relacin entre la estructura y la funcin proteicas consiste en alterar una
porcin determinada de la protena y observar los cambios funcionales que se
producen. Hasta hace unos aos, esto se realizaba mediante la modificacin
qumica de aminocidos individuales o mediante induccin de mutaciones en el
gen que codifica la protena objeto de estudio. Sin embargo, la modificacin
qumica de una protena no siempre es especifica, ya que pueden verse
alterados varios aminocidos y no slo el que se desea alterar; por otro lado,
hasta hace unos aos no siempre era posible producir la mutacin adecuada en
la localizacin del gen que se deseaba. Estas dificultades han sido superadas
en los ltimos aos gracias a la tcnica de la mutagnesis dirigida; en ella se
sintetiza un oligonucletido de unas 20 bases que contiene el cambio de
secuencia deseado. Posteriormente se permite que dicho oligonucletido
alterado con la mutacin objeto de estudio hibride con una copia
monocatenaria del gen salvaje original completo; posteriormente se amplifica
el complejo mediante PCR, con lo que la polimerasa extiende el olignucletido
y copia el resto del gen diana para producir una nueva copia del gen con la

mutacin deseada. Si unimos el gen a un fago de DNA monocatenario como es

el caso del fago M13, puede introducirse el gen mutado en una bacteria
husped y clonarse, con lo que obtendremos grandes cantidades de una
protena mutante para el estudio de su funcin.

Virus M13

El virus penetra E. coli a travs del pilus, que posibilita el intercambio de ADN
entre bacterias. M13 es muy til por la posibilidad de obtener ADN en forma de
hebras simples. Las hebras simples de los genes clonados se necesitan
especialmente para la secuenciacin del ADN y la mutagensis in vitro.

Mapa gentico del fago M13

El ADN de M13 no se integra (como en el fago lambda) en el genoma bacteriano.

No provoca tampoco la lisis de las clulas. La bacteria crece y se divide, sin
embargo, ms lentamente que las clulas no infectadas. Las clulas hijas liberan
todava fagos M13.
Por generacin se originan aproximadamente mil nuevos fagos M13. Puesto que
el husped no muere, se pueden cultivar y cosechar fcilmente en grandes
cantidades.

M13 como vector de clonacin

Dado que el ADN de M13 es monocatenario, este bacterifago es un vector conveniente para
la clonacin de ADN. La longitud de su genoma no es fijo y por lo tanto es capaz de aceptar
ADN extrao sin comprometer la viabilidad del fago. Un vector de clonacin particular que
explota el ciclo de vida del fago M13 se llama "fagmido".
El fagmido es una molcula circular de ADN de doble cadena de plsmido que contiene un
origen de replicacin (ori V) y el origen de replicacin de M13 pero que no contiene los genes
que codifican para las protenas estructurales del fago. En un fagmido se puede clonar una
secuencia de ADN de inters que se desea que se exprese en una poblacin de clulas
mediante la explotacin de la infeccin por fagos. Debido a que el fagmido contiene solo el
origen de replicacin de fago, es incapaz de generar las protenas estructurales necesarias
para el ensamblaje del fago y para el empaquetamiento del ADN dentro de l. Por esta razn,
se utiliza el fago auxiliar M13K07. Este fago contiene un origen de replicacin y de codificacin
para todas las protenas estructurales necesarias para el montaje de la forma infectiva del
fago. Cuando las clulas que contienen el fagmido se superinfectan con M13K07, la Gp2
producida por los genes del M13K07 reconoce como secuencia de origen de fago a la que se
encuentra presente en el fagmido por lo que en consecuencia es capaz de replicarse y de
empaquetarse junto con las protenas estructurales codificadas por el fago auxiliar.

Otras investigaciones
George Smith, entre otros, mostr que los fragmentos producidos por la endonucleasa EcoRI
pueden ser soldados en un sitio Bam nico de los fagos filamentosos f1, y por lo tanto resultar
expresados en el gen III; cuya protena pIII resulta accesible desde el exterior. ste no es el
nico sitio Bam existente en el gen III de M13. Se puede modificar al M13 para obtener
diferentes sitios de insercin accesibles, hacindolo til en su flexibilidad para el manejo de
insertos de diferente tamao. Debido a que el sistema de expresin M13 permite una gran
flexibilidad en la localzacin y nmero de protenas recombinantes que pueden obtenerse del
fago,

es

una

herramienta

popular

para

la

construccin

investigacin

de

nanoestructuras.2 por ejemplo, el fago puede ser genticamente modificado para expresar
protenas diferentes en sus extremos y en su segmento medio. Esto puede ser utilizado para
ensamblar estructuras tales como nanocables de oro u xido de cobalto para la fabricacin
de bateras,3 o para empacar nanotubos en forma de manojos orientados para su utilizacin
en celdas fotovoltaicas.4

Desde la aparicin de la tecnologa de despliegue en fagos la bsqueda e

identificacin de molculas de inters biolgico ha tenido un avance inminente.
Dicha tecnologa fue descrita y desarrollada por vez primera por George P.
Smith en 1985, en la cual emple fagos filamentosos de Escherichia coli (M13,
fd y f1) como vehculos para expresar diversas protenas o pptidos como parte
de las protenas de su cubierta. Esta tecnologa ha tenido un auge muy
importante en las reas de la inmunologa, biologa celular, farmacologa y en
la investigacin de frmacos. La tcnica es una herramienta poderosa para
identificar y caracterizar interacciones de polipptidos recombinantes con sus
blancos de unin. Su aplicacin potencial incluye la identificacin de molculas
lderes para su uso en teraputica, por ejemplo, eptopes con potencial uso
inmunognico para el desarrollo de vacunas o anticuerpos bloqueadores64 .
Los bacterifagos son virus que infectan una variedad de bacterias gramnegativas, usando el pili F como receptor. El genoma total del fago consiste de
11 genes. Un fago viable expresa cerca de 2 700 copias de la protena VIII
(pVIII) y de tres a cinco copias de la protena III (pIII) en su conformacin
estructural, ambas son las protenas de eleccin para expresar, en fusin a los
genes correspondientes de las protenas recombinantes de inters65 (Figura 5).
No obstante, a ltimas fechas se han empleado los genes de las protenas VI66,
VII y IX con gran xito67,68. Los fagos Figura 5. Representacin esquemtica
de (a) un fago silvestre, (b) un pptido desplegado en la protena III (pIII), y (c)
un pptido desplegado en la protena VIII (pVIII) de un fago. filamentosos no
desarrollan infeccin ltica en Escherichia coli, pero si inducen un estado en el

cual la bacteria infectada produce y secreta partculas virales, vindose

atenuada la divisin celular. En una primera generacin se obtienen cerca de
1000 partculas virales, y subsecuentemente por cada divisin celular son
liberadas cerca de 100 a 300 partculas69 al medio a travs de la membrana
bacteriana, esto representa una gran ventaja, ya que facilita los procesos de
purificacin de las partculas virales70. Asimismo, las nuevas INMUNOLOGA
ENERO-MARZO ANTICUERPOS: PROPIEDADES APLICACIONES Y PERSPECTIVAS
23 metodologas proporcionadas por la ingeniera gentica, tales como la
inclusin de pptidos etiqueta facilitan el proceso de recuperacin de los
anticuerpos recombinantes mediante el simple empleo de la cromatografa de
afinidad71, 72 .

http://revistas.uis.edu.co/index.php/revistamedicasuis/article/viewFile/1988/235
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