Universidad Politcnica de Puebla. Juan C. Bonilla, Julio 2016.

Estudio de la cintica de crecimiento de Bacillus subtilis mediante el mtodo de

Turbidez, Peso seco y Nmero ms probable.
Chavelas Reyes Jos Luis, De Jess Reyes Sergio Paulo, Flores Ojeda Guadalupe, Lpez Flores Arely, Vzquez Bustos
Grissel.
Palabras clave: cintica, crecimiento, Bacillus subtilis.

Resumen
Actualmente resulta de gran importancia el uso de productos bioqumicos, como metabolitos primarios y
secundarios, durante procesos industriales, debido a esto es necesario conocer su crecimiento de modo
que se pueda maximizar la productividad del compuesto de inters. En el presente trabajo se analiz la
cintica de crecimiento de Bacillus subtilis mediante tres mtodos de valoracin cada uno por
duplicado: turbidez, peso seco y nmero ms probable (tcnica de Miles y Misra), incubado a 30 C
durante 48 horas y 100 rpm en un matraz en caldo nutritivo.
Introduccin
Las enzimas son protenas especializadas
capaces de acelerar la velocidad de una reaccin
qumica, promoviendo as la transformacin de
diferentes molculas en productos especficos.
La alta especificidad con la que se llevan a cabo
dichas transformaciones, el volumen reducido
de desechos que generan dichos procesos y las
condiciones poco agresivas en las que se operan,
han permitido que estos biocatalizadores se
posicionen como elementos preponderantes en
diversos sectores industriales (1). Para la
obtencin de este y ms productos de inters
industrial resulta fundamental conocer el
crecimiento bacteriano del microorganismo de
inters, para poder predecir cmo va a
evolucionar un cultivo, la manera en que va a
consumir el substrato y cmo va a ir
acumulando el producto de una fermentacin.
Para determinar este parmetro existen diversas
tcnicas. En el presente trabajo se expone la
realizacin de tres tcnicas: La determinacin
del nmero ms probable (Miles y Misra),
determinacin de la masa celular y la
determinacin de la densidad celular.
Marco terico
Bacillus subtilis es una bacteria Gram positiva
comnmente
encontrada
en
suelo,
frecuentemente reconocida por su habilidad para
formar una resistente endospora protectora,

permitindole tolerar condiciones ambientales

extremas (2).
Al inocular clulas bacterianas en un volumen
finito de medio de cultivo apropiado, despus de
cierto tiempo experimentarn un aumento del
tamao y posterior divisin celular, por lo que se
incrementar el nmero de clulas microbianas.
El tiempo que requiere una clula para que a
partir de esta se formen dos se llama tiempo de
duplicacin (td). As pues, si se grafica el
nmero de clulas o la cantidad de biomasa con
respecto al tiempo, se obtendr una curva de
crecimiento caracterstica con cuatro fases,
entonces el nmero de clulas y el tiempo de
duracin de cada fase depende de la especie de
microorganismo, la preparacin y estado
fisiolgico del inculo, la composicin qumica
del medio de cultivo y las condiciones
ambientales de incubacin (T, pH, NaCl, O2)
(1).
La curva de crecimiento representa el
comportamiento
del
crecimiento
del
microorganismo a travs del tiempo. Con base
en ella se producen la mayor cantidad de
biomasa o de metabolitos (primarios o
secundarios). El crecimiento microbiolgico
est dado por el incremento del nmero de
clulas en una poblacin de microorganismos,
(3) en el cual se pueden identificar cuatro fases
principales: (4) Inicialmente, se transita por una
etapa de latencia en la que los microorganismos

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se adaptan al medio ambiente y no hay

crecimiento celular aparente, a continuacin,
ocurre la fase de crecimiento exponencial, en la
que la masa bacteriana crece hasta que se agotan
los nutrientes y se acumulan sustancias txicas
que inhiben el crecimiento, luego, se alcanza la
fase estacionaria que se caracteriza por un cese
del crecimiento poblacional debido a la
compensacin de la formacin y muerte de
clulas y finalmente, se llega a la fase de muerte
(4).
Metodologa
Aislamiento e identificacin.
La cepa se aisl de una muestra conservada de
un fertilizante comercial, incubndose a 30 C
durante 24 horas en placas Petri en Agar
nutritivo. Transcurrido este periodo se realizaron
pruebas de Tincin Gram para confirmar la
naturaleza de las microestructuras de la bacteria.
Obtencin del inculo
EL inoculo se obtuvo de colonias jvenes
incubadas durante 24 horas a 30 C en placas de
agar nutritivo, inoculando dos tubos de ensaye
con 10 ml de caldo nutritivo y extracto de
levadura al 0.1 % cada uno, hasta igualar la
turbidez al tubo 0.7 de la escala de Macfarland.,
aadindose posteriormente a dos matraces con
250 ml del mismo medio lquido, uno a la hora
cero y el segundo a las 12 horas posteriores de
la primera inoculacin.
Muestreo
Se tomaron alcuotas de 15 ml de los medios
lquidos inoculados cada dos horas, repartidos
en tubos falcon para peso seco y tubos
eppendorf para absorbancia y nmero ms
probable (tcnica de Miles y Misra).
Determinacin de cintica de crecimiento
Se llev a cabo la determinacin mediante tres
mtodos para establecer los tiempos en los que
inicia la fase estacional y la produccin de
esporas para la posterior preparacin de un stock
de biomasa microbiana. Cada mtodo se evalu
por duplicado.

Medicin mediante espectrofotometra

Medicin mediante peso seco
Se determina el peso constante de charolas de
aluminio. Se colocan 4 ml de la muestra en
tubos Falcon y se centrifugan a 6000 rpm
durante 15 min. Posteriormente se decanta y el
lavado de la pastilla celular concentrado se hace
con solucin salina isotnica. Luego las clulas
concentradas se colocan en las charolas para
llevarlas a la estufa durante 24hrs a 90C, hasta
que hayan alcanzado un peso constante.
Finalmente se pesa nuevamente las charolas
para obtener la curva de crecimiento por
diferencia de pesos.
Medicin mediante nmero ms probable
(tcnica de miles y misra)
Resultados
Tabla 1. Determinacin de masa celular Bacillus subtilis.
Tiempo (hrs).
Peso g/4ml.
Peso g/4ml. Replica.
0
0,00400
0,0030
2
0,00700
0,0030
4
0,01100
0,0130
6
0,01700
0,0190
8
0,02100
0,0230
10
0,02200
0,0260
12
0,02400
0,0270
14
0,02500
0,0280
16
0,02600
0,0290
18
0,02800
0,0310
20
0,03300
0,0330
22
0,03700
0,0370
24
0,04000
0,0400
26
0,04100
0,0410
28
0,04300
0,0430
30
0,04400
0,0430
32
0,04500
0,0450
34
0,04800
0,0460
36
0,04800
0,0470
38
0,05300
0,0530
40
0,05400
0,0540

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42
44
46
48

0,05600
0,05700
0,05800
0,06100

0,0550
0,0560
0,0570
0,0590

Curva de crecimiento Bacillus subtilis

Conclusiones
Discusin
En el caso de la tcnica de peso seco la
desventaja principal es que es un procedimiento
lento y requiere de muestras relativamente
grandes.

0.07000
0.06000
0.05000
0.04000

Biomasa g/4ml 0.03000

Referencias

0.02000
0.01000
0.00000

1.
0

10 20 30 40 50 60

2.

Tiempo (horas).
3.

Curva de crecimiento Bacillus subtilis. Replica.

0.0700
0.0600
0.0500
0.0400

Biomasa g/4ml 0.0300

0.0200
0.0100
0.0000

0 10 20 30 40 50 60

Tiempo (horas).

4.

Alicia Hernndez y colaboradores. (2003).

Microbiologa industrial. EUNED.
Madigan M; Martinko J. (2005). Brock Biology
of Microorganisms, Onceovers Edition, Prentice
Hall.
Madigan M, Martinko JM, Parker J. (2001).
Biologa de los microorganismos. Octava
Edicin, Prentice Hall.
Cobas H, Pavoni S, Zayas A, Rodrguez F,
lvarez E, Contreras R. (2007). Aplicacin de la
voltametra en el anlisis del crecimiento
microbiolgico.
Sociedad
Cubana
de
Bioingeniera, La Habana.