Expresin diferencial y la

funcin de los receptores

nicotnicos de la acetilcolina
en el epitelio de la vejiga
urinaria de la rata
autores

Jonathan M. Beckel,

.
.

Lori A. Birder

.
.

Publicado por primera vez:

14 marzo 2012La historia completa

por la publicacin

DOI: 10.1113 / jphysiol.2011.226860

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JM Beckel: Departamento de Anatoma y Biologa Celular de la

Universidad de Pennsylvania, 431 Edificio Levy, 240 S 40th St,
Philadelphia, PA 19104, EE.UU.. E-mail: jmbeckel@gmail.com

Ingls
Espaol;castellano

Puntos clave

Se

ha demostrado previamente que la

estimulacin de los receptores nicotnicos de la
acetilcolina uroteliales (nAChRs) puede alterar
la actividad de la vejiga reflejo en la rata; el
estudio actual examina ms a fondo.
La estimulacin de las clulas uroteliales de
rata con un 7 nAChR aumenta agonista del
calcio intracelular a travs de los almacenes
internos y disminuye la liberacin de ATP basal.
La estimulacin con un agonista de nAChR 3
* aumenta el calcio intracelular a travs de
afluencia extracelular y aumenta la liberacin
de ATP basal.
La infusin de un 3 * agonista en el lumen
de la vejiga de la actividad de la vejiga
aumenta reflejo de rata, que se bloquea por la
administracin intra-arterial de un antagonista
purinrgicos.
Los efectos celulares de la estimulacin 3 *
se bloquean cuando las clulas se tratan
previamente con un agonista 7, lo que sugiere
la diafona entre los receptores: esta diafona
puede ser mediada a travs de la protena
quinasa A o la protena quinasa C.

abreviaturas
-BTX

-bungarotoxina
HBSS

solucin de sal tamponada de Hanks

ICI

intervalo entre contracciones

MLA

citrato de metillicaconitina
nAChR

receptor nicotnico de acetilcolina

PKA

la protena quinasa A
PKC

protena quinasa C
PPADS

piridoxalfosfato-6-azofenil-2 ', 4' cido disulfnico

TMPH

2,2,6,6-tetrametil-piperidin-4-il heptanoato

Introduccin
Receptores de acetilcolina nicotnicos neuronales (nAChR)
durante mucho tiempo han sido conocidos por tener muchas
funciones fisiolgicas en todo el cuerpo. Por ejemplo, ellos
son los receptores primarios responsables de la transmisin
sinptica en los ganglios autonmicos ( De Biasi, 2002 ). nAChR
tambin estn presentes en las neuronas del sistema nervioso
central, donde estn siendo estudiados por su papel en la
nocicepcin ( Damajet al.1998 ; Kesingland. et al2000 ), la cognicin
( Dajas-Bailador y Wonnacott, 2004 ; Singhet al .2004 ), y la memoria
( Chanet al.2007 ). Un nuevo papel para los nAChR neuronales,
sin embargo, ha comenzado a ser dilucidado: su papel en la
fisiologa de los tejidos no neuronales ( Conti-Fineet al.
2000 ). Por ejemplo, los receptores nicotnicos de subtipo
neuronal (es decir, 3, a4 o receptores a7) se han encontrado
en los queratinocitos de la piel ( Kurzenet al.2007 ), las clulas
epiteliales bronquiales ( Wessler y Kirkpatrick, 2001 ), clulas
epiteliales del colon ( Summerset al.2003 ), las clulas
endoteliales vasculares ( Macklinet al.1998 ), y numerosas
clulas inmunes como los macrfagos, mastocitos y leucocitos
mononucleares ( Gwiltet al.2007 ). En estos tipos de clulas,
nAChRs median una amplia variedad de funciones
fisiolgicas, como la proliferacin y la diferenciacin celular,
la motilidad celular, la modulacin de la permeabilidad
endotelial y la liberacin de quimioquinas / citoquinas
( Wessleret al.1998 ).
Hemos informado anteriormente de que el revestimiento
epitelial de la vejiga urinaria (urotelio) tambin expresa
nAChRs y que la estimulacin de estos receptores a travs de
la administracin intravesical de agonistas podra alterar
significativamente la actividad de la miccin funcional de la
rata ( Beckelet al.2006 ). En concreto, el urotelio expresa dos
tipos de nAChR: receptores (1) a7 homomeric que inhiben los

reflejos de la vejiga, y (2) que contiene 3-(3 *), los

receptores heteromricos que tienen un efecto excitatorio en
los reflejos de la vejiga. Se ha planteado la hiptesis de que
estos receptores median sus efectos por la modulacin de la
liberacin de transmisores de urotelio. Se cree que estos
transmisores para luego actuar sobre los terminales nerviosos
aferentes en la pared de la vejiga a (directa o indirectamente)
la actividad influencia de la vejiga ( Andersson, 2002 ). La
verosimilitud de esta hiptesis est apoyada por un nmero de
diferentes estudios que demuestran que los comunicados de
urotelio neurotransmisores tales como el ATP, la ACh y el
xido ntrico (NO) en respuesta a la estimulacin fsica y
qumica (para revisin ver Apodacaet al.2007 ; Birder, 2010 ). En
trminos de los receptores colinrgicos, el urotelio tambin
expresa los cinco receptores de acetilcolina muscarnicos (M1
a M5) ( Bschleipferet al.2007 ; Zarghooniet al.2007 ; Kullmannet al.
2008a ) y la estimulacin de estos receptores in vitro da como
resultado la liberacin de mediadores incluyendo ATP y NO,
lo cual puede afectar la funcin de la vejiga ( Beckelet al.
2004 ; Kullmannet al.2008b ). Hay mucha menos informacin
sobre la participacin de los receptores nicotnicos y eventos
de sealizacin que pueden conducir a cambios en la funcin
reflejo de miccin.
El presente estudio se realiz para examinar la participacin
de nAChR uroteliales en la liberacin de un transmisor,
especficamente ATP, y si la excitacin de los reflejos de la
vejiga observados in vivo despus de la estimulacin 3 *
nAChR podra ser bloqueado por antagonistas contra los
receptores purinrgicos.Debido a la liberacin de ATP de la
urotelio se piensa que es un proceso dependiente de calcio
( Birderet al.2003 ), que tambin examin el efecto de cada
subtipo de nAChR en la sealizacin de calcio intracelular, en
un intento de aclarar an ms los mecanismos celulares
responsables de los efectos de nAChR estimulacin observ in
vivo. Nuestros resultados indican que la estimulacin de
diferentes receptores nicotnicos en el urotelio modula la

liberacin de ATP de una manera recproca, con la

estimulacin 7 inhibir la liberacin de ATP y 3 *
estimulacin disminuyendo o aumentando la liberacin basal
ATP, dependiendo de la concentracin agonista. El mecanismo
de estos efectos puede implicar vas de sealizacin
intracelulares dependientes de calcio, como la estimulacin de
los dos subtipos de receptor nicotnico tambin aument de
calcio intracelular a travs de mecanismos
distintos. Finalmente, nuestra investigacin indica una
interaccin no declarada previamente entre los nAChR, como
la activacin de los receptores a7 puede inhibir la [Ca 2
+ ] i transitorios normalmente provocados por 3 *
estimulacin.

mtodos
animales

Todos los experimentos utilizaron ratas Sprague-Dawley

hembras (250-300 g) que fueron alimentados con una dieta
estndar con acceso libre al agua antes de la
experimentacin. Un total de 60 ratas se usaron para los
experimentos descritos. Los tejidos se recogieron de ratas que
murieron por inhalacin de 100% de CO 2 seguido por
dislocacin cervical. Todos los estudios se llevaron a cabo con
la aprobacin de la Universidad de Pittsburgh Institucional
Cuidado de Animales y el empleo y mantenidos de acuerdo
con las normas establecidas en la Gua del American
Physiological Society para el cuidado y uso de animales de
laboratorio.
Reactivos y soluciones

Todos los agonistas nicotnicos y antagonistas utilizados en

este estudio se obtuvieron de Tocris Bioscience (Ellisville,
MO, EE.UU.). Todos los dems reactivos se obtuvieron de
Sigma-Aldrich Inc. (St Louis, MO, EE.UU.), con excepcin
de los reactivos de cultivo celular, que se obtuvieron de
Invitrogen, Inc. (Carlsbad, CA, EE.UU.). La composicin de
la solucin de sal equilibrada de Hanks (HBSS) utilizado
durante ATP y calcio experimentos fue (en m M ): KCl,

5,0; KH 2 PO 4 , 0,3; NaCl, 138; NaHCO 3 , 4.0; Na 2 HPO 4 ,

0,3;glucosa, 5,6; CaCl 2 , 2.0; MgCl 2 , 1,0; Hepes, 10.0. En
experimentos en ausencia de calcio extracelular, CaCl 2 se
omiti, la concentracin de NaCl se increment a 140 m M y
0,5 m M se aadi EGTA. La composicin de la solucin de
Krebs se utiliza para toda la preparacin de la vejiga fue (en
m M ): NaCl, 113; KCl, 4,7;MgSO 4 , 1.2; NaHCO 3 ,
25,0; KH 2 PO 4 , 1.2; glucosa, 11,5; CaCl 2 , 2.5; Hepes,
10.0. Todas las soluciones se ajustaron a pH 7,4 con NaOH y a
300 mOsmol l -1 utilizando manitol.
cultivo de clulas uroteliales Rat

Vejigas urinarias de rata se escindieron y se colocaron

inmediatamente en medio de Eagle modificado por Dulbecco
(DMEM). La vejiga se abre, se extenda suavemente con el
lado epitelial hacia arriba y clavado en una placa recubierta
con Sylgard. La vejiga se incub durante la noche a 4 C en
DMEM, aumentada con penicilina / estreptomicina /
fungizona y 2,5 mg ml -1 dispasa. A continuacin, el epitelio se
rasp suavemente del tejido subyacente con una esptula, se
coloc en un matraz de cultivo y se trata con enzima (0,25%
de tripsina) para disociar las clulas uroteliales. Despus de la
disociacin, la suspensin celular se coloc en medio esencial
mnimo que contena suero bovino fetal al 10% y se centrifug
a 416 gdurante 15 min. Las clulas se resuspendieron en 1 ml
de medio de queratinocitos y 0,1 ml de la suspensin celular
(50.000-250.000 clulas ml -1 ) se aadi a la superficie de
cubreobjetos de vidrio revestidos con colgeno para
Ca 2+ formacin de imgenes o de cultivo de plstico recubierta
con colgeno 35 mm placas para estudios de liberacin de
ATP. Las clulas se utilizaron dentro de los primeros 1-2 das
siguientes de chapado.
La tincin de inmunofluorescencia

Para la tincin de la vejiga entera, vejigas fueron retirados,

abiertos cortado longitudinalmente y se congelaron en
compuesto OCT utilizando nitrgeno lquido. Estas vejigas
fueron entonces seccionaron a 6 micras, colocado en

portaobjetos y se seca al aire. Para las clulas cultivadas, las

clulas se hicieron crecer en cubreobjetos de vidrio revestidos
con colgeno durante 48 h antes de la fijacin. Los
portaobjetos o cubreobjetos se fijaron en 4% de
paraformaldehdo en solucin salina tamponada con fosfato
(PBS) durante 30 min. Despus de lavados en PBS, los
portaobjetos se incubaron en 0,3 M de glicina durante 20 min
para reducir auto-fluorescencia. Las diapositivas fueron
permeabilized en 0,1% de Triton X-100 y luego se bloquearon
durante 30 min. La solucin de bloqueo contena 0,1% de
Triton X-100, 0,5% de albmina de suero bovino y 10% de
suero normal de burro. Los portaobjetos se incubaron despus
con Alexa-488- bungarotoxina (para los receptores a7, 1 M )
o anticuerpo de cabra anti-3 policlonal (dilucin 1: 100)
durante 2 horas a 25 C. Despus de la incubacin primaria,
los portaobjetos a3 se lavaron con PBS y se incubaron con un
isotiocianato (FITC) de anticuerpos de burro cabra
fluorescena contra secundario (1: 250 en PBS) durante 1
h. Para los estudios de co-localizacin, diapositivas tambin
fueron incubadas con anticuerpos monoclonales de ratn
contra cualquiera de citoqueratina 17 o 20 (dilucin 1:50 de
cada uno) seguido de un burro anti-ratn-Cy3 (1: 250)
anticuerpo secundario. Todos los portaobjetos se incubaron
tambin con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; 1: 5000 en
PBS durante 5 min) para proporcionar una contratincin
nuclear. Despus de lavados finales con PBS, los portaobjetos
se montaron y ver. Los resultados mostrados son
representativos de experimentos llevados a cabo a partir de las
vejigas de tres animales distintos. Los anticuerpos para las
citoqueratinas se obtuvieron de Dako; el anticuerpo policlonal
anti-3, Alexa marcado con -bungarotoxina y todos los
anticuerpos secundarios se obtuvieron a travs de Invitrogen.
El calcio de imgenes (Fura-2)

Las clulas uroteliales cultivadas en cubreobjetos revestidos

con colgeno de 24 a 48 h se lavaron con HBSS despus se
incubaron con la forma de ster de acetoximetilo de Fura-2

(Fura-2 a.m.; 5 M , 30 min de incubacin a 37 C). Las

clulas se mantuvieron en HBSS durante todo el experimento
mediante el uso de un sistema de perfusin por gravedad a una
velocidad de flujo de aproximadamente 2,4 ml min -1 .Para
registrar los cambios en la relacin de Fura-2, las clulas se
iluminan alternativamente a 340 y 380 nm usando una
lmpara de arco de xenn y la imagen a 510 nm con un DageMTI cmara CCD enfriada con 640 480 pxeles de
resolucin. Un intensificador de imagen del sistema y
software de paquete Dage-MTI Gen. II (compix Inc.,
Cranberry, PA, EE.UU.) se utiliz para recopilar datos. Las
clulas se estimularon despus cambiando el perfundido a un
agonista nicotnico y se tomaron muestras cada 5 s para la
duracin de la estimulacin (tpicamente 2 min). Para los
estudios de antagonistas, el antagonista apropiado se perfundi
durante 10 min antes de, as como durante la estimulacin
agonista. En los experimentos que examinan los efectos de
quinasas en las seales de calcio mediada por nAChR, la
protena quinasa A (PKA) / protena quinasa C (PKC)
agonistas y antagonistas se perfundieron durante 15 min antes
y durante la estimulacin del receptor nicotnico. Antes del
experimento, cada clula en un campo se denota como una
regin de inters (ROI). La fluorescencia de fondo tambin se
caracteriz por un retorno de la inversin que no contena
clulas. Para calcular la relacin de Fura-2, la intensidad de
fluorescencia se promedi a travs de cada ROI y el fondo
resta antes de la proporcin de fluorescencia (340/380) fue
tomada. Para calcular el cambio mximo en la relacin de
Fura-2 despus de la aplicacin de medicamentos, la seal
inicial de calcio, segn lo determinado por el promedio de las
cinco lecturas inmediatamente antes de la aplicacin del
frmaco, se rest de la ms alta seal observada durante la
aplicacin del frmaco. Los aumentos en la proporcin Fura-2
que tenan menos de 3 veces mayor que la desviacin estndar
de la media de las muestras de referencia se elimina del

anlisis, ya que estaban dentro del intervalo que podra

atribuirse a ruido durante la grabacin.
la liberacin de ATP

Las clulas uroteliales se cultivaron como se describe

anteriormente, se colocan en placas de cultivo de plstico 35
mm y utilizados dentro de 24 a 48 h despus de
chapado. Durante el experimento, las clulas se perfundieron
con HBSS usando una bomba peristltica (caudal: 0,6 ml min 1 ) y perfundido (100 l) se tomaron muestras a intervalos de 30
s. Se tomaron muestras durante 5 min antes de la perfusin
agonista, por 5 min durante la perfusin agonista y durante 5
minutos durante el lavado del agonista con HBSS. Para los
estudios de antagonistas, se tomaron muestras durante la
perfusin inicial HBSS, por 5 min durante la perfusin
antagonista, por 5 min durante la perfusin de antagonista y
agonista combinada y para los 5 min durante el lavado de los
medicamentos utilizando HBSS. Los niveles de ATP se
cuantificaron inmediatamente despus del muestreo,
utilizando el reactivo luciferina-luciferasa (Kit de
luminiscencia ATP, Sigma-Aldrich) y la bioluminiscencia
medido utilizando un luminmetro (Turner Designs, TD 20/20
Sunnyvale, CA, EE.UU.). Unidades relativas de luminiscencia
se convirtieron a concentraciones de ATP utilizando un
conjunto de estndares con concentraciones conocidas de ATP
(rango dinmico: 1 p M a 1 M). Para eliminar la posibilidad
de que los cambios en las mediciones de ATP eran debido a la
interferencia de la droga con la reaccin de luciferinaluciferasa las normas tambin se llevaron a cabo en presencia
de cada agonista y antagonista en la concentracin ms alta
utilizada en nuestros experimentos. Los datos se presentan
como un cambio en la liberacin basal ATP, medida como la
diferencia en la concentracin de ATP (en p M ) entre el
promedio de cinco lecturas tomadas inmediatamente antes de
la perfusin y el promedio de cinco lecturas tomadas durante
la perfusin de un medicamento.

Para los estudios de la vejiga enteros, vejigas fueron retirados,

cortados longitudinalmente abierta, colocada en una cmara de
tejido, y se cubren con solucin de Krebs. Durante el
experimento, el tejido se perfundi con solucin de Krebs
utilizando un sistema de alimentacin por gravedad (velocidad
de flujo: ~3.0 ml min -1 ) y perfundido (50 l) se tomaron
muestras de la superficie de la mucosa en intervalos de 30
s. Cada muestra se aadi a un tubo de microcentrfuga que
contiene 50 l de 200 M , -ATP de metileno (un inhibidor de
la ATPasa) en hielo. Al final de cada experimento las muestras
se congelaron a -80 C hasta que la lectura. Las muestras se
tomaron cada 30 s durante 5 minutos antes de la perfusin
agonista, por 5 min durante la perfusin agonista y durante 5
minutos durante el lavado del agonista con solucin de
Krebs. Para los estudios de antagonistas, se tomaron muestras
durante la perfusin inicial Krebs, por 5 min durante la
perfusin antagonista, por 5 min durante la perfusin de
antagonista y agonista combinada, y por 5 min durante el
lavado de las drogas usando solucin de Krebs. Los niveles de
ATP se cuantificaron utilizando el reactivo de luciferinaluciferasa y se analizaron como se ha descrito anteriormente,
la correccin de la dilucin de 2 veces.
In vivo cistometrograma vejiga

Las ratas ( n = 4) se anestesiaron con uretano (1,2 g kg 1 , SC ). Despus de confirmar un plano quirrgico de anestesia,
una incisin en la lnea media se hizo y se insert un catter
(tubo Intramedic, PE 50) en el lumen de la vejiga a travs de
una pequea incisin en la cpula de la vejiga y se asegura
con una sutura en bolsa de tabaco. El catter se conect por
medio de una llave de paso de tres vas para una bomba de
jeringa para infusin de fluidos y un transductor de presin
conectado a un ordenador para registrar los cambios en la
presin de la vejiga. Los urteres tambin fueron atadas y
cortadas para evitar el llenado de la vejiga desde los
riones. Una mecha humedecida de gasa estril se inserta en la
incisin de lnea media y se cose en el lugar para drenar la

orina de la cavidad abdominal. Adems, un catter (tubo

Intramedic, PE 10) se coloc en la arteria femoral para
permitir la administracin intra-arterial de drogas. Saline se
infundi por va intravesical (0,04 ml min -1 ) para un perodo
de control (generalmente 1-2 h) para establecer la actividad de
la vejiga de lnea de base. Despus del perodo de control, el
lquido de infusin se cambi a una solucin salina que
contiene 100 M citisina y grabaciones tomadas durante una
hora adicional. Los antagonistas purinrgicos piridoxalfosfato6-azofenil-2 ', 4' cido disulfnico (PPADS; 1 o 3 mg kg -1 )
fue luego se inyecta intra-arterial y actividad de la vejiga
registr durante 10 min despus de la administracin de
drogas.
anlisis estadstico

La significacin estadstica se evalu en todos los

experimentos, usando o no apareados de Student de dos
colas t pruebas o ANOVA de una va con la prueba de
comparacin mltiple de Tukey posterior. La significacin
estadstica fue aceptada cuando P <0,05.

resultados
Las clulas uroteliales expresan nAChR, tanto in
vivo y in vitro

Con el fin de localizar cada subunidad del receptor a una

ubicacin especfica en la vejiga, se realiz estudios de colocalizacin en tejido de la vejiga de rata con citoqueratinas 17
y 20, que se sabe que se expresa diferencialmente en el
urotelio de la rata. La citoqueratina 20 se ha demostrado que
se expresa en las clulas paraguas del urotelio ( Schaafsmaet al.
1989 ), mientras que la citoqueratina 17 se localiza en las
clulas intermedias y basales ( Troyanovskyet al.1992 ).
En el tejido de la vejiga de rata, la subunidad 3 ti una capa
de tejido consistente con el urotelio, como la tincin era
frecuente en el tejido directamente adyacente al lumen de la
vejiga ( Fig. 1 ). Esta tincin desapareci si el anticuerpo se
preincub con su antgeno o si slo se utiliz el anticuerpo

secundario (datos no mostrados). Estudios de co-localizacin

con citoqueratina 20 sugirieron que el receptor 3 se expresa
principalmente en las clulas paraguas ( Fig. 1A-C ), ya que los
dos anticuerpos co-localizan casi exclusivamente.

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" \l "figure-viewer-f1" \o "Abrir la figura 1. En la figura espectador"

Figura 1.

Abierta en la figura espectador

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La tincin fluorescente de tejido de la vejiga y las clulas uroteliales cultivadas para

nAChR A- I

, co-localizacin de nAChR con los marcadores-uroteliales

especfica de citoqueratina 17 (clulas intermedias y basales) y
citoqueratina 20 (clulas paraguas). La columna de la izquierda
representa la tincin de nAChR, la columna central representa
citoqueratina y tincin DAPI nuclear, y la columna derecha representa

una imagen fusionada para mostrar co-localizacin. El lumen de la

vejiga se denota con la letra "L". Todas las micrografas se tomaron
con un objetivo 20; las barras de calibracin representan 50
micras. A-C , 3 nAChR tincin (verde) co-localiza con citoqueratina 20
(rojo), lo que indica la expresin del receptor en las clulas
paraguas. Algunas manchas tambin se observ a lo largo de la vejiga
en el msculo liso (denotado por el * en C ), y en las fibras nerviosas
suburotelial. D - F , la tincin 7 (verde) co-localiza con citoqueratina
20 (rojo), lo que indica la expresin del receptor en las clulas
paraguas. G - I , la tincin 7 (verde) co-localiza con citoqueratina 17
(rojo), lo que indica la expresin del receptor en las clulas basales e
intermedias. J - L , la tincin de nAChR en cultivos primarios de clulas
uroteliales, crecido para 48 h. J , 7 tincin. K , la tincin 3. L , una
imagen resultante de la concentracin, junto con una tincin nuclear
DAPI (azul). Micrografas tomadas con un objetivo 40; las barras de
calibracin representan 25 micras.

Para localizar la 7 nAChR subunidad, un marcado con

fluorescencia (AlexaFluor 488) eptopo de la neurotoxina bungarotoxina (-BTX) en lugar de un anticuerpo. Esto se
hizo porque los anticuerpos contra los receptores disponibles
en el mercado a7 todava no se han desarrollado
completamente y -BTX se une a receptores a7 con alta
afinidad y alta especificidad. -BTX de unin en las secciones
de vejiga de rata revel tincin consistente con urotelial de
localizacin ( Fig. 1DyG ), como la tincin era frecuente en el
tejido circundante del lumen de la vejiga. -BTX tincin en la
vejiga de rata fue disminuida cuando pre-incub con una
concentracin 100 veces mayor de no marcado -BTX (datos
no mostrados).Con el fin de determinar qu capas del epitelio
urinario expresan receptores a7, que co-manchado secciones
de vejiga de rata con -BTX y citoqueratinas 17 y 20. -BTX
tincin co-localizada con tanto citoqueratina 17 ( Fig. 1D-F ),
lo que sugiere la expresin 7 en las clulas intermedias y
basales, y con citoqueratina 20 ( Fig. 1G-I ), lo que sugiere la
expresin en clulas 7 paraguas.
Adems de examinar la expresin de nAChR en el tejido de la
vejiga, que tambin examin la expresin in vitro utilizando
cultivos primarios uroteliales. Como se muestra en la Fig.1J-

, clulas cultivadas expresa tanto 3 y subunidades a7. Se

observ que esta tincin a lo largo de todas las clulas en el
cultivo, y se encuentra tanto en el citoplasma as como a lo
largo de la membrana celular.
L

La estimulacin de nAChR modula la liberacin de ATP a

partir de cultivos primarios de clulas uroteliales
de rata y de vejigas de ratas enteros

Un pequeo (pero cuantificable) la liberacin de ATP puede

ser inducida por el flujo de fluido (HBSS en 0,6 ml min -1 ) (de
liberacin media: 20-40 p M Fig. 2A ). En primer lugar, examin
los efectos de los agentes nAChR-subtipo especficos tenan
en este comunicado inducida por el flujo de ATP basal. La
liberacin basal de ATP puede ser inhibida de una manera
dependiente de la concentracin por la colina agonista 7 ( Fig.
2AyB ), la disminucin de la liberacin de ATP en un
promedio de 55,4% a 1 m M colina. Esta disminucin de colina
inducida en la liberacin basal ATP fue reversible al lavado (8
min, Fig. 2AyB ).Para descartar cualquier posibilidad de
colina interferir con el ensayo de luciferina-luciferasa, se
realiz una curva estndar con concentraciones conocidas de
ATP, tanto en presencia de, y en ausencia de, colina
(Supplemental Fig. 1, slo disponible en Internet). Estas
curvas de calibracin fueron idnticas, lo que indica que la
colina no interfiere con el ensayo. Se utiliz el citrato de
antagonista 7 metillicaconitina (MLA; 100 M , en HBSS)
para determinar si esta disminucin de ATP siguiente colina
era debido a la activacin especfica de los receptores
a7. MLA bloque los efectos de la colina, y tambin aument
la liberacin de ATP basal cuando se administra solo ( Fig. 2
C ). MLA no alter la curva estndar, sin embargo, lo que
indica que el aumento de la liberacin de ATP no era debido a
la interferencia con el ensayo (. Supplemental Fig 1).

HYPERLINK
"http://onlinelibrary.wiley.com/enhanced/figures/doi/10.1113/jphysiol.2011.226860
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Figura 2.

Abierta en la figura espectador

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,
vestigios representante del efecto de la colina sobre la liberacin de
ATP a partir de clulas uroteliales cultivadas. B , resumen de los
experimentos que implican ATP colina, expresado como un cambio en
la concentracin de ATP medida. Estos cambios se calcularon en cada
experimento como la diferencia entre el promedio de 5 lecturas
tomadas antes y durante la perfusin de colina. Cada columna se
resumen los cambios en 6 experimentos, tomados de 3 cultivos
separados. Normal HBSS perfundidos sobre las clulas cultivadas en
lugar de colina (primera columna) en 6 experimentos producido ningn
cambio significativo en los niveles de referencia, lo que sugiere que se
ejecutan abajo de la liberacin de ATP urotelial en condiciones de flujo
no era un factor que contribuye. ** P <0,05 por ANOVA de un factor
seguido por el test post de Dunnett para comparar cada columna con el
control (HBSS solo). C , los efectos del antagonista 7 ALM en la
La colina inhibe la liberacin de ATP a partir de clulas uroteliales cultivadas A

liberacin de ATP a partir de clulas uroteliales. ** P <0,05 en

comparacin al de Student t prueba.

Las bajas concentraciones de la citisina agonista 3 * (1-10

mu M en HBSS, Fig. 3AyC ) se redujeron 'basal' o liberacin
de ATP-evoc flujo. Esta disminucin en la liberacin de ATP
(disminuciones de 14,7% para 1 M citisina, y 23,3% para 10
M citisina) se mantiene durante la duracin de la aplicacin
del frmaco, pero se recupera casi inmediatamente despus de
lavado, a diferencia de la prolongada disminucin observada
siguiente colina ( Fig. 3A ). Por el contrario, concentraciones
ms altas de citisina (50-100 mu M , en HBSS) evocan una
emisin importante de ATP por encima de los niveles basales
( Fig. 3ByC ). Este efecto (un incremento del 43,2% durante la
perfusin de 100 M citisina) tambin se mantiene durante la
duracin de la aplicacin del frmaco y se recupera con lavado
( Fig. 3B ). Para determinar si los efectos citisina inducida eran
debido a las acciones en a3 * receptores y no a travs de
efectos no especficos, se utiliz el 3 * antagonista de
2,2,6,6-tetrametil-piperidin-4-il heptanoato de metilo
(TMPH). La perfusin de TMPH (90 M , en HBSS) no tuvo
ningn efecto sobre la liberacin de ATP solo, pero bloque la
respuesta a la citisina a ambas concentraciones altas y bajas
( Fig. 3D ). Citisina no interfiri con el ensayo de luciferinaluciferasa, como se realiz una curva estndar con cantidades
conocidas de ATP con y sin 100 M citisina. No hubo
diferencias en las curvas de calibracin, lo que indica que la
citisina no tiene ningn efecto en el ensayo de luciferinaluciferasa (Supplemental Fig. 1).

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"http://onlinelibrary.wiley.com/enhanced/figures/doi/10.1113/jphysiol.2011.226860
" \l "figure-viewer-f3" \o "Abrir la figura 3. En la figura espectador"

Figura 3.

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yB,
vestigios representante de la liberacin de ATP a partir de clulas
uroteliales en respuesta a 10 mu M ( A ) o 100 M ( B ) citisina. C ,
Resumen de los efectos de citisina sobre la liberacin de ATP a partir
cultivadas Las clulas uroteliales. Estos cambios se calcularon en cada
experimento como la diferencia entre el promedio de 5 lecturas
tomadas antes y durante la perfusin de colina. Cada columna se
resumen los cambios en 6 experimentos, tomados de 3 cultivos
separados. ** P <0,05 por ANOVA de un factor seguido por el test post
de Dunnett para comparar cada columna con el control (HBSS
solo). D , resumen de los efectos de la 3 * TMPH antagonista sobre la
liberacin de ATP a partir de clulas uroteliales cultivadas. ** P <0,05
en comparacin al de Student t prueba.
Citisina modula bifsica liberacin de ATP de las clulas uroteliales cultivadas A

Adems de clulas cultivadas, se examin si la liberacin de

ATP a partir de tejido urotelial intacta podra ser modulada por

agentes nicotnicos. De una manera similar a lo que se observ

en las clulas uroteliales cultivadas, colina (100 M , n = 3)
disminucin de la liberacin basal de ATP por 64,1% ( Fig. 4 ),
que fue bloqueado por la 7 nAChR antagonista MLA (10,9%
de disminucin de control, n = 3, P 0,05). La liberacin de
ATP en respuesta a citisina tambin refleja los resultados
observados previamente en clulas cultivadas, con una
concentracin ms baja (10 M ) del agonista de la
disminucin de la liberacin de ATP basal (40,8%, n = 3, P
0,05), mientras que una concentracin ms grande ( 100 M )
aument la liberacin de ATP basal (33,2% sobre el
control, n = 3, P 0,05). El aumento en la liberacin de ATP
por citisina fue bloqueado por el antagonista de 3 * TMPH
(100 M , n = 3, P 0,05).

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"http://onlinelibrary.wiley.com/enhanced/figures/doi/10.1113/jphysiol.2011.226860
" \l "figure-viewer-f4" \o "Abrir la figura 4. En la figura espectador"

Figura 4.

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Agentes nicotnicos modulan la liberacin de ATP a partir de toda la vejiga

grfico de resumen que representa los efectos de los agentes

nicotnicos sobre la liberacin de ATP basal en toda la preparacin de

la vejiga. Estos cambios se calcularon en cada experimento como la
diferencia entre el promedio de 5 lecturas tomadas antes y durante la
perfusin del frmaco. Cada columna se resumen los cambios de 3-5
experimentos separados cada uno. ** P<0,05 comparado con el control
(solucin de Krebs solamente) por una de Student no
apareadot prueba. ++ P <0,05 entre las dos columnas denotadas por la
lnea de acompaamiento, en comparacin por una de Student no
apareado t prueba.
La excitacin de los reflejos de la vejiga por citisina
intravesical puede ser bloqueado por PPADS

Se utiliz la miccin cistometra para evaluar el efecto de

citisina en actividad de la vejiga reflejo en la rata
anestesiada. Como se muestra en la Fig.5 , el intervalo entre
contracciones (ICI) entre miccionales contracciones de la
vejiga se reduce cuando citisina (100 M ) se infunde por va
intravesical (0,04 ml min -1), en comparacin a cuando la
solucin salina se infundi como control usando la misma
velocidad de infusin. Esta facilitacin se evit cuando los
PPADS antagonistas purinrgicos (1 o 3 mg kg -1 , dosis
acumulativa) se inyecta en la arteria femoral, donde es
probable que sea terminales nerviosas aferentes situadas
dentro de la pared de la vejiga al sitio de accin. Esta
inhibicin del reflejo de la vejiga se prolonga, de al menos 15
min despus de la inyeccin.

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"http://onlinelibrary.wiley.com/enhanced/figures/doi/10.1113/jphysiol.2011.226860
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Figura 5.

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PPADS intraarteriales pueden bloquear la excitacin de los reflejos de la vejiga causados por

- C , trazas representativas de la cistometra de los

controles de solucin salina infundido ( A ), 100 M citisina ( B ), y 100
M citisina despus de 3 mg kg - 1 PPADS ( C ).D , resumen de intervalo
entre contracciones de tiempo (ICI) (segundos) durante
cystometrograms tomadas durante la infusin de solucin salina
(control), la administracin intravesical de citisina (100 M ), y
despus de la administracin intra-arterial de PPADS (1 o 3 mg kg 1 dosis) concurrente acumulada con citisina intravesical. n = 4
ratas. * P <0,05, ** P <0,005 en comparacin al de Student t prueba.
citisina intravesical A

La activacin de nAChR aumenta el calcio intracelular en

las clulas uroteliales rata cultivadas a travs de
distintos mecanismos

Para examinar el papel de los R-nic en la sealizacin de

calcio urotelial, primero estimulados a3 * receptores en las
clulas uroteliales de rata cultivadas con citisina. Como se

muestra en la Fig.6 , citisina (1-100 M , en HBSS) caus un

aumento dependiente de la concentracin en la relacin de
Fura-2 (2,83 0,54%, 9,35 0,65% y 24,46 0,80% de
incremento sobre el valor inicial de 1, 10 y 100 M citisina,
respectivamente). Estos transitorios de calcio volvieron
lentamente a la lnea de base despus de aproximadamente 30
s de la infusin continua, y pueden ser completamente
bloqueados por un 10 min pre-incubacin con el antagonista
del receptor de 3 * TPMH (30 M aumento, 3,74 0,36%
sobre la lnea base). Adems, los transitorios de calcio
inducida por citisina se bloquearon cuando son estimuladas en
HBSS sin calcio que contiene 0,5 m M EGTA.

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"http://onlinelibrary.wiley.com/enhanced/figures/doi/10.1113/jphysiol.2011.226860
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La Figura 6.

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La estimulacin de las clulas uroteliales cultivadas con citisina aumenta el calcio

, trazas representativas de experimentos de formacin de

imgenes de calcio despus de la estimulacin con 100 M citisina solo
(trazo continuo), citisina siguiente pre-incubacin con 3 * antagonista
del receptor TMPH (30 M , vestigios de trazos) y citisina en HBSS
que no contiene calcio extracelular (trazo de puntos). B , grfico de
resumen que representa los cambios en el calcio intracelular despus
de la estimulacin citisina como un cambio en la relacin de Fura-2
intracelular A

(340/380). ** P <0,05 comparado con el control HBSS segn lo

determinado por ANOVA con la prueba de comparacin mltiple de
Tukey posterior. P <0,05 en comparacin con 100 M citisina por
ANOVA con mltiples pruebas. Despus de la comparacin de
Tukey n = 15, 45, 37, 73, 72 y 115 clulas, respectivamente.

Para determinar la contribucin de los receptores a7

uroteliales sealizacin de calcio, las clulas uroteliales de
rata cultivadas se estimularon con la colina (1-100 mu M , en
HBSS). Si bien estas concentraciones estn en el rango
inferior de las concentraciones que pueden activar los
receptores a7 (CE50 , ~ 400 mu M ), que se eligieron con el fin
de eliminar cualquier efecto de la estimulacin de los
receptores muscarnicos, que tambin puede ser activado por
concentraciones ms altas de colina (concentraciones mayores
de 100 M ). Adems, estos experimentos se llevaron a cabo
en presencia de 10 M atropina, un antagonista del receptor
muscarnico no selectivo, para evitar la activacin del receptor
muscarnico. Cuando se aplic de colina, se observa un
aumento dependiente de la concentracin en la relacin de
Fura-2 (4,63 0,19%, 14,25 0,69% y 34,1 3,30% de
incremento sobre la lnea base para 1, 10 y 100 M ,
respectivamente; Fig. 7A ). Este aumento se prolong durante 3
a 5 min ( Fig. 7A ), y se redujo significativamente por preincubacin con el antagonista de -bungarotoxina-7
especfico (1 M en HBSS, 5 min de incubacin), lo que
indica una accin especfica en el receptor 7. A diferencia de
citisina, sin embargo, la eliminacin de calcio extracelular y la
adicin de EGTA al bao no bloquean la seal de colina
inducida, lo que sugiere la liberacin de calcio desde las
reservas intracelulares. Pre-incubacin con rianodina (10
M en HBSS, 15 min) bloquea esta respuesta. Esta
concentracin de rianodina es generalmente aceptado para
bloquear rianodina liberacin mediada por el receptor de
calcio desde el retculo endoplsmico ( McPhersonet al.1991 ), lo
que indica un papel para los receptores de rianodina en la
liberacin de colina inducida ( Fig. 7B ).

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La Figura 7.

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La activacin de nAChR a7 utilizando colina aumenta el calcio intracelular a travs de la

, trazas representativas de
experimentos de formacin de imgenes de calcio despus de la
estimulacin con 10 M colina solo (trazo continuo), colina siguiente
pre-incubacin con el receptor 7 antagonistas -BTX (1 mu M ,
vestigios de trazos) y de colina en HBSS que no contiene calcio
extracelular (trazo de puntos). B , grfico de resumen que representa los
liberacin por los almacenes intracelulares A

cambios en el calcio intracelular despus de la estimulacin de colina

como un cambio en la relacin de Fura-2 (340/380). ** P <0,05
comparado con el control HBSS segn lo determinado por ANOVA
con la prueba de comparacin mltiple de Tukey posterior. P <0,05
en comparacin con 10 M de colina por ANOVA con mltiples
pruebas. Despus de la comparacin de Tukey n = 15, 30, 31, 40, 39,
35 y 92 clulas, respectivamente.
7 estimulacin inhibe 3 * efectos mediados por el
receptor a travs de la activacin de la PKC / PKA

Para examinar ms a fondo el papel de nAChR a7 para

provocar cambios en el calcio urotelial, utilizamos otro
agonista selectivo de los receptores a7, PNU 282987. PNU
282987 es un agonista 7 altamente selectivo y potente
( Bodnaret al.2005 ), lo que eliminara la necesidad para incluir
atropina en el bao para bloquear el potencial de activacin no
selectiva de los receptores muscarnicos. La estimulacin de
las clulas uroteliales cultivadas con PNU 282987 (10 n M a 1
M , en HBSS) provoc ningn cambio en la relacin de Fura2 ( Fig. 8A ). Sin embargo, se observ que la aplicacin de
PNU 282987 (100 n M , 2 min de preincubacin) bloque
cualquier incremento en la relacin de Fura-2 observada
despus de una estimulacin posterior con citisina (100
M , Fig. 8A ). Esta inhibicin de la 3 * respuesta mediada por
un agonista del receptor 7 fue bloqueada siguiente preincubacin con el antagonista 7 MLA (100 M , Fig. 8B ),
pero no si se le dio el antagonista despus de PNU 282987, lo
que indica que la resultado no fue debido a las acciones aguas
abajo de la activacin 7. Tambin fue posible recuperar la
respuesta citisina si PNU 282987 se lav fuera de la baera
durante 10 minutos con HBSS normales antes de la
estimulacin con citisina.

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Figura 8.

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La estimulacin de 7 receptores bloques 3 * aumentos mediados por receptores en el

, trazas representativas de aumentos del coeficiente de

Fura-2 siguientes, ya sea la estimulacin citisina sola (100 M , lnea
discontinua) o citisina siguiente PNU 282987 (100 N M , continua
lnea). Solicitudes de frmacos estn indicados por los bares por debajo
de los rastros.Tenga en cuenta que la estimulacin de las clulas con
PNU 282987 solo provocado ningn cambio en la relacin de Fura2. B , grfico de resumen que muestra el cambio en la relacin de Furacalcio intracelular A

2 despus de la estimulacin de las clulas uroteliales cultivadas con

100 M citisina solo y despus de la estimulacin con varios nAChR
7 agentes. La seal inducida por citisina se bloquea despus de la
estimulacin con el agonista 7 PNU 282987 (100 N M , segunda
columna).Este bloque es recuperable despus de lavado 10 min con
HBSS (tercera columna) y se evita si las clulas son pre-incubadas con
el citrato de antagonista 7 metillicaconitina (MLA, 100 M , cuarta
columna). El efecto inhibitorio no est bloqueado, sin embargo, si se da
el antagonista despus de que el agonista (quinta columna). ** P <0,05
en comparacin con 100 M citisina solo segn lo determinado por
ANOVA con la prueba de comparacin mltiple de Tukey
posterior. P <0,05 en comparacin con 100 M citisina despus PNU
por ANOVA con mltiples pruebas. Despus de la comparacin de
Tukey n = 73, 87, 87, 65 y 71 clulas, respectivamente.

Se ha demostrado que la fosforilacin puede resultar en la

inhibicin de nAChR ( Nishizaki y Sumikawa, 1998a,b ). Por lo
tanto, la hiptesis de que esta inhibicin de la 3 * respuesta
mediada puede ser debido a la fosforilacin del receptor 3
*. Para probar esta hiptesis, se incubaron las clulas
uroteliales, ya sea con PKA o PKC moduladores y examin la
influencia sobre los transitorios de calcio inducida por
citisina. La incubacin durante 15 min con cualquiera de las
PKC activador de forbol 12-miristato, 13-acetato (PMA, 100
n M en 0,1% de DMSO) o Pseudo RACK1 (20 M , en HBSS)
bloqueados Ca citisina inducida 2+ seales (79,1% y 83,2% de
disminucin de la citisina solo, respectivamente; Fig. 9
A ).DMSO, 0,1%, tambin se ensay para descartar cualquier
efecto vehculo en la relacin de Fura-2; no se observ ningn
cambio en la seal (datos no mostrados). Se observaron
resultados similares cuando se utilizan activadores de PKA; 8bromo-AMPc (30 M , en HBSS) o dibutiril-AMPc (1 m M ,
en HBSS) aumenta bloqueados en la relacin de Fura-2
despus de la estimulacin citisina (86,4% y 78,0% de
disminucin de la citisina solo, respectivamente; Fig . 8B ).

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La Figura 9.

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, grfico de resumen que

representa los cambios en el calcio intracelular despus de la
estimulacin citisina en presencia de activadores de PKC (forbol 12miristato 13-acetato (PMA) y Pseudo RACK1) e inhibidores de
(cloruro de queleritrina y ro 32-0432) como un cambio en la relacin
de Fura-2 (340/380). ** P<0,05 en comparacin con citisina solos
como se determin por ANOVA con la prueba de comparacin post
mltiple de Tukey. N = 73, 70, 84, 90 y 56 clulas, respectivamente. B ,
grfico de resumen que muestra los cambios en el calcio intracelular
despus de la estimulacin citisina en el presencia de activadores de
PKA (8-Br-AMPc y dibutiril-AMPc) y los inhibidores (PKI 14-22 y el
inhibidor de PKA (6-22)) como un cambio en la relacin de Fura-2
(340/380). ** P <0,05 en comparacin con citisina solo segn lo
determinado por ANOVA con la prueba de comparacin mltiple de
Tukey posterior. N = 73, 62, 85, 65 y 74 clulas, respectivamente.
Seales citisina inducida son modulados por PKC / PKA A

A continuacin examin si la inhibicin de la quinasa

aumentara los cambios inducidos por citisina en intracelulares
de Ca 2+ . La inhibicin de la PKC utilizando cloruro de
queleritrina (1 M en HBSS) o Ro 32-0432 (1 M , en DMSO
al 0,1%) potenci el Ca 2+ seal observada despus de la
estimulacin citisina ( Fig. 9A ). Esta potenciacin fue evidente
como un aumento en el pico de la respuesta de calcio (20,0%
y el aumento de 193% sobre citisina solo,
respectivamente). Del mismo modo, los inhibidores de PKA
PKI 14-22 (100 n M , en HBSS) y PKA inhibidor de 6-22 (10
M , en HBSS) tambin potenci las seales de calcio
inducida por citisina (54,3% y 64,0%, respectivamente; Fig. 9
B ).
Tambin se examin si a7 y a3 * interacciones pueden
implicar la activacin de la protena quinasa. Pre-incubacin
con cualquiera de 1 M cloruro de queleritrina o 100 n M PKI
14-22 de 15 min invirti la disminucin PNU 282987 inducida
por agonista 7 en 3 * (citisina) inducida por Ca 2 + aumento
( Fig. 10 ).Estos datos indican que los efectos inhibidores de
PNU 282987 sobre 3 * mediada por Ca 2 + transitorios pueden
implicar la activacin de PKA o PKC.

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La Figura 10.

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Resumen de los efectos de la PKA inhibidor PKI 14-22 o el inhibidor de PKC cloruro de
queleritrina sobre la inhibicin mediada por 282.987 PNU de las seales de calcio evocadas
por citisina

PNU 282987, 100 n M, bloquea los aumentos de la relacin de Fura-2

siguiente 100 M citisina (primera columna), pero antes de la
incubacin de las clulas, ya sea con PKI 14-22 o queleritrina cloruro
elimina que la inhibicin. ** P <0,05 en comparacin con 100
M citisina despus PNU por ANOVA con la prueba de comparacin
mltiple de Tukey posterior. N = 73, 87, 71 y 90 clulas,
respectivamente.

Discusin
La acumulacin de evidencia apoya la opinin de que el
urotelio est implicado en funciones sensoriales que controlan
la miccin ( Apodacaet al.2007 ; Birder de 2010 ). Mecanismos de
sealizacin uroteliales que influyen en la actividad de la
vejiga es probable que sean compleja, con liberacin de la
acetilcolina transmisores y ATP probable que el impacto de la
contractilidad del msculo liso ( Santosoet al.2010 ), as como la

excitabilidad neuronal ( Andersson, 2002 ). Ambos transmisores

pueden ser liberados por el urotelio en respuesta a estirar o
estimulacin qumica ( Yoshidaet al.2004, 2006 ; Hanna-Mitchellet al.
2007 ; Lipset al.2007 ), aunque los mecanismos no colinrgicos
pueden jugar un papel ms importante en patologa. Adems,
aunque el urotelio expresa todo el complemento de receptores
que se activan por ACh (es decir, los receptores muscarnicos
y nicotnicos) ( Beckelet al.2006; Bschleipferet al.2007 ; Zarghooniet
al.2007 ; Kullmann. Et al2008una ) , se sabe menos sobre el papel
de nAChR uroteliales y la participacin en funcin de la
vejiga.
En trminos de estimulacin AChR muscarnico urotelial, un
estudio reciente ( Kullmannet al.2008b ) demostraron que la
estimulacin de los receptores muscarnicos de la vejiga
urotelial utilizando reflejos oxotremorina-M (Oxom)
modificado de una manera dependiente de ATP y la liberacin
de NO. La administracin intravesical de Oxom
(concentraciones bajas) tena un efecto inhibidor sobre la
miccin reflejos lo que fue impedido por el inhibidor de la
xido ntrico L -NOMBRE. Por el contrario, la administracin
intravesical de las concentraciones ms altas de Oxom facilit
actividad de la vejiga, que fue mediada en parte por la ATP ya
que esta respuesta podra ser impedido por los PPADS
antagonistas purinrgicos. Nuestro estudio tambin demuestra
un papel para ATP en la modulacin de los reflejos de la
vejiga despus de la activacin de los receptores nicotnicos
uroteliales. Adems, es probable que la participacin ATP
como PPADS podran bloquear esta respuesta el efecto
facilitador de citisina en la actividad de la vejiga. Adems, la
activacin de nAChR a7 inhibe la liberacin de ATP a partir
de clulas uroteliales, y esta disminucin puede desempear
un papel en los efectos inhibitorios de la 7 nAChR urotelial
estimulacin in vivo , que se inform anteriormente ( Beckelet al.
2006 ). No se examin la funcin de los transmisores
adicionales, tales como NO, por lo tanto, tambin es posible
que la produccin de NO tambin puede jugar un papel en la

inhibicin de los reflejos de la vejiga observados tras la

estimulacin 7 nAChR.
Oxom provoca tanto un efecto inhibidor y excitador
dependiente de la concentracin en los reflejos de la vejiga en
la rata anestesiada. Aunque el mecanismo no se ha
establecido, una posible explicacin para este tipo de
respuesta bifsica puede ser debido a la no selectividad
general a los subtipos de receptores muscarnicos presentes en
urotelio. Por lo tanto, los efectos inhibidores de Oxom podra
ser debido a la activacin de receptores de alta afinidad y los
efectos excitatorios debido a la activacin de los receptores de
baja afinidad. En el presente estudio hemos demostrado que la
citisina tambin puede provocar tanto un inhibidor, as como
efecto de excitacin sobre la liberacin de ATP a partir de
clulas uroteliales.Tambin es interesante observar la
respuesta bifsica similares las exposiciones urotelio despus
de la estimulacin con el agonista citisina 3 *. Mientras que
los receptores que contienen a3-generalmente se agrupan
juntas debido a la falta de agonistas o antagonistas especficos
que podran distinguir entre ellos, hay pruebas de que el
urotelio puede expresar un nmero de receptores a3 *, tales
como 34, 354, 334 y 3534 ( Beckelet al.,
2006 ). Cuando se estudi en sistemas de expresin heterlogos
tales como ovocitos, es evidente que cada subtipo de receptor
tiene farmacolgico distinto y propiedades electrofisiolgicas
que pueden provocar diferentes efectos fisiolgicos en la
clula ( Lindstromet al.1996; Gerzanichet al.1998 ; Nelson y Lindstrom,
1999 ; Genzenet al.2001 ). Por lo tanto, no podemos descartar la
posibilidad de que los resultados que observamos no se deben
a la activacin de dos (o ms) subtipos distintos de 3 *
receptor de los cuales tienen diferentes afinidades por la
citisina agonista: un receptor de alta afinidad que se activa una
va inhibitoria y un receptor de baja afinidad que tiene un
efecto excitatorio.

Nuestra comprensin de los mecanismos subyacentes a la

liberacin de transmisores de clulas uroteliales es an
relativamente inexplorada. En contraste con un papel en las
clulas no neuronales, la modulacin del receptor nicotnico
de liberacin del transmisor de los nervios ha sido bastante
bien caracterizado (para ver comentarios Wonnacott, 1997 ; Vizi y
Lendvai, 1999 ; Marchi y Grilli, 2010 ). Por ejemplo, los nAChR
situados presinpticamente pueden modular la liberacin de
un nmero de transmisores incluyendo noradrenalina
(norepinefrina), glutamato, GABA y dopamina en el cerebro,
la mdula espinal y la periferia. Un ejemplo en particular es el
de modulacin nAChR presinptica de la liberacin de
aminocidos excitadores de las neuronas cultivadas de la
corteza prefrontal de rata ( Dickinsonet al.2008 ). Estas neuronas
expresan tambin dos clases distintas de nAChR a7:
receptores y receptores que contienen beta 2(presumiblemente 42), que modulan la liberacin de [ 3 H]
aspartato (como un sustituto de glutamato) a travs de
distintos mecanismos. Liberacin de [ 3 H] aspartato despus
de la activacin de la 2 * receptores era muy sensible a la
eliminacin de extracelular Ca 2 + y a la sustitucin de Ca 2+ con
el Cd ion no permeable 2 + , lo que sugiere un papel para el
calcio extracelular y, posiblemente, de acoplamiento para
canales de calcio operados por voltaje. Sin embargo, la
liberacin de [3 H] aspartato despus de la activacin de los
receptores a7 no fue bloqueado por Cd 2+ , y fue bloqueada por
rianodina y xestospongin-C, bloqueadores de las reservas de
calcio intracelular. Nuestros datos sugieren que los nAChR
uroteliales tambin modulan calcio intercelular a travs de dos
mtodos distintos: los receptores a3 * a travs de receptores de
afluencia y a7 extracelulares a travs de la liberacin de los
almacenes intracelulares. Estos datos sugieren algunas
propiedades 'neuron'-como de urotelio, con la expresin de
nAChR y la capacidad de modular (directa o indirectamente)
el miembro sensorial del reflejo de miccin.

Dado que una inyeccin de PPADS en la arteria femoral de la

rata bloqueado los efectos excitatorios en ICI por citisina
intravesical, hemos planteado la hiptesis de que PPADS
bloquea la activacin de los receptores P2X presentes en las
terminales nerviosas aferentes de la vejiga. Nuestro
fundamento de esta hiptesis proviene de la variacin de la
intervalo entre contracciones; la ICI es la creencia
generalizada de ser influenciados por los cambios en la
excitabilidad de los nervios aferentes. Por lo tanto, ya que la
ICI se disminuye despus de la inyeccin sistmica de
PPADS, se supone que su sitio de accin es en los nervios
aferentes. Esta hiptesis se apoya en un trabajo anterior de Yu y
de Groat (2008 ), que examin el papel de los receptores
purinrgicos en aferente excitabilidad de los nervios de la
vejiga usando una preparacin nervio aislado. En sus
experimentos, PPADS aplican al bao de mantenimiento de la
vejiga disminucin de emisiones de los nervios aferentes en
respuesta a estirar. Esto sera consistente con los resultados
que hemos visto en vivo. Sin embargo, los receptores
purinrgicos se expresan tambin en varios lugares a lo largo
de la va de la vejiga, incluidos los ganglios de la raz dorsal
( Ruanet al.2005 ), msculo liso de vejiga ( Birderet al .2004 ), y la
mdula espinal ( Burnstock, 2001 ). Debido a que no examin
directamente la actividad del nervio aferente en nuestros
experimentos, hay que tener en cuenta la posibilidad de que
nuestros datos son el resultado de las acciones de PPADS en
otra ubicacin.
Posiblemente el hallazgo ms interesante de este estudio es
que la estimulacin de los receptores a7 puede desactivar los
efectos excitadores de a3 * receptores; agonistas a7 pueden
bloquear el aumento de intracelular de Ca 2+ y el aumento de la
liberacin de ATP exhibida por citisina. Estos datos revelan un
mecanismo que an sin explorar de la sealizacin de nAChR:
la modulacin de un tipo de receptor nicotnico por
otro. Nuestras investigaciones indican que este mecanismo
puede ser mediada a travs de una va de PKA / PKC-

dependiente, presumiblemente a travs de la fosforilacin de

la 3 * receptor que conduce a la inactivacin. Estos datos son
compatibles con estudios anteriores que unen a los receptores
nicotnicos protenas quinasas. Por ejemplo, se ha demostrado
que la estimulacin de los receptores nicotnicos a7 puede
conducir a la activacin de PKC ( Chernyavskyet al.2004 ; Sunet
al.2004 ). Otros estudios han indicado que los residuos
especficos localizados en el M3 / M4 dominio citoplsmico
de los receptores nicotnicos 42 pueden ser fosforilados por
cualquiera de PKC o PKA ( Pollocket al.2007 ).Esto podra llevar
a cambios en la maduracin del receptor y la insercin en la
membrana plasmtica ( Jeancloset al.2001 ; Nashmiet al.
2003 ; Exleyet al.2006 ), as como las propiedades
electrofisiolgicas del receptor, tal como la tasa de
desensibilizacin y el tiempo de recuperacin de
desensibilizacin ( Marszalecet al.2005 ). La experimentacin
adicional debe ser realizado, sin embargo, para determinar si
existen estos sitios en a3 * receptores y si la fosforilacin de
estos residuos conduce a la inhibicin del receptor que se
demuestra en el presente estudio.
Nuestra conclusin de que nAChR uroteliales pueden
desempear un papel en la modulacin de la liberacin de ATP
puede indicar un papel en la sealizacin nociceptivo en el
tracto urinario inferior. Por ejemplo, los agonistas de nAChR
ya se han demostrado tener propiedades analgsicas, que se
cree que es debido a las acciones en nAChRs en los terminales
centrales de los nervios aferentes, la prevencin de la
liberacin de neurotransmisores ( Ribeiro-da-Silva y Cuello,
1990 ; Khanet al.2004 ) que activan los nervios espinales
secundarios. Nuestra investigacin demuestra que una 7
nAChR agonista tambin puede bloquear la liberacin de ATP
a partir de urotelio, que puede ser til en el tratamiento de los
trastornos viscerales, como el sndrome de vejiga dolorosa /
cistitis intersticial (PBS / IC), donde el aumento de la
liberacin de ATP urotelial pueden jugar un papel importante
en la sintomatologa de este trastorno (Cook & McCleskey,

; Birderet al.2003 ). Adems, la activacin de a7 receptores

da como resultado efectos inhibidores sobre la frecuencia
miccional ( Beckelet al.2006 ), lo que sugiere una funcin
adicional para los receptores nicotnicos uroteliales como una
diana teraputica para trastornos de la vejiga hiperactiva. Esto
puede ser de importancia clnica adicional dada la posible
implicacin de los receptores muscarnicos del urotelio en los
cambios en la sensibilidad de la vejiga y los temas, incluyendo
la no selectividad y perfiles de efectos secundarios.
2000