Bioqumica Analtica

Taller de purificacin de protenas

David Alejandro Lpez
Diego Jaimes Gonzlez

3. Dado que lo que se busca es separar las protenas por precipitacin de una
solucin acuosa, lo ideal sera realizar el proceso de Salting out al valor de pH
que corresponde al punto isoelctrico de la correspondiente protena ya que es
a este valor de pH que la protena presenta la mnima solubilidad.
4. Para retener la protena Y en una columna empacada con DEAE-agarosa es
necesario un pH bsico; 7,5-8,0 que permita que la protena tenga una carga
neta negativa ya que el intercambiador mencionado es aninico. Por otro lado,
si se usa un intercambiador catinico como CM-sefarosa es necesario que la
protena est cargada positivamente; de manera que lo ideal es usar un pH
alrededor de 5,0-5,5.
Si las protenas X y Y tuvieran que ser separadas en un nico paso lo ideal sera
usar el intercambiador aninico (DEAE-agarosa) y usar un buffer de elucin de
pH 7,0. Esto garantiza que la protena Y est cargada negativamente mientras
la protena X tiene una carga positiva. En la columna, la protena Y ser
retenida mientras que la protena X, que no interacta con la fase estacionaria,
es eluda. Para la elucin de la protena Y retenida en la columan se puede usar
cualquiera de dos mtodos; el primero consiste en usar un buffer de elucin
cuya concentracin salina aumente progresivamente. La alta concentracin de
aniones de la sal compite con la protena por la interaccin con la resina. El
segundo mtodo consiste en usar un buffer de elucin con un pH decreciente lo
que provocar que la protena se cargue positivamente lo que inhibe su
interaccin con la resina.
5.El volumen muerto de la columna se puede determinar usando una protena
de alto peso molecular (depende del tamao de poro del gel) que no entre en
la matriz y sea eluda sin interactuar.
El volumen de la columna se puede calcular usando la expresin para
determinar el volumen de un cilindro

V = r 2 h . De esta manera, al

reemplazar los valores de la columna,

V = ( 0,375 cm ) ( 30 cm ) . Finalmente

V =13,253 mL
Para calcular los pesos moleculares de las protenas X y Y se realiza la grfica
de log(Mr) en funcin de K:

3
f(x) = - 3.28x + 3.92
R = 0.96

2.5
2

log (Mr) 1.5

1
0.5
0
0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Tabla 1. Log (Mr) Vs K para la calibracin de la columna de filtracin en gel.

De acuerdo con los valores de K para la protena X y Y, que corresponden a

0,584 y 0,633 respectivamente, los valores de Mr seran 101 KDa y 70 kDa
respectivamente. Los valores de peso molecular para las protenas X y Y
obtenidos mediante SDS-PAGE fueron 38 y 16 KDa. El valor difiere mucho con
respecto a los valores de peso molecular obtenidos mediante SEC. Es posible
que la diferencia entre los dos mtodos se deba a que en un caso se usa
condiciones denaturantes mientras que en el otro no. Cuando se usan
condiciones denaturantes, se garantiza que todas las protenas tienen la misma
carga y que, adems, su forma no influye en su patrn de migracin. Es posible
que la conformacin de la protena afecte a la movilidad de las protenas en el
la SEC haciendo que no entre en la matriz, provocando una determinacin
errnea de su peso molecular.
En SDS-PAGE la protena que migra ms rpido es la ms pequea, de manera
que la protena Y migra una distancia mayor en el mismo tiempo. En la SEC, la
protena que eluye primero es la ms grande, es decir, la protena X. Es decir
que las protenas eluyen en orden inverso en cada mtodo.

6. Si la protena Y precipitara de forma irreversible en la precipitacin

fraccionada con sulfato de amonio, debera buscarse otra estrategia de
purificacin. Lo primero sera separar las protenas de los dems componentes
celulares mediante centrifugacin fraccionada. A continuacin, con las
protenas en solucin, se realiza una cromatografa de exclusin por tamao
para seleccionar solamente aquellas protenas de determinado peso molecular.
Luego se realiza una cromatografa de intercambio inico para purificar an
ms las protenas de acuerdo a su carga a determinado pH. Finalmente, para

purificar definitivamente cada una de las protenas se realiza una

cromatografa de afinidad con sustratos especficos para cada protena
inmovilizados sobre un soporte. Si la protena est