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La biosntesis de alcaloides de opio bencilisoquinolina

de amapola.
Abstracto
Adormidera (Papaver somniferum) es una de las plantas medicinales ms
antiguas del mundo y sigue siendo la nica fuente comercial para la morfina
analgsicos narcticos, la codena y sus derivados semisintticos como la
oxicodona y la naltrexona. La planta tambin produce varios otros alcaloides
bencilisoquinolina con propiedades farmacolgicas potentes como la
papaverina vasodilatador, el supresor de la tos y el potencial noscapina
medicamento contra el cncer y el agente antimicrobiano sanguinaria.
Adormidera ha servido como un sistema modelo para investigar la biosntesis
de alcaloides bencilisoquinolina en las plantas. La aplicacin de la genmica
bioqumicos y funcionales ha dado lugar a un reciente aumento en el
descubrimiento de los genes biosintticos implicados en la formacin de los
principales alcaloides bencilisoquinolina de adormidera. La disponibilidad de
gran cantidad de herramientas de gentica bioqumica y la informacin relativa
a bencilisoquinolina alcaloide metabolismo est facilitando el estudio de una
amplia gama de fenmenos que incluye la biologa estructural de nuevos
catalizadores, la organizacin genmica de los genes biosintticos, la
localizacin celular y subcelular de las enzimas biosintticas y una variedad de
aplicaciones biotecnolgicas. En esta revisin, se destacan los acontecimientos
recientes y resumimos las fronteras del conocimiento en relacin con la
bioqumica, biologa celular y biotecnologa de la biosntesis de alcaloides
bencilisoquinolina de adormidera.

Palabras clave
biosinttica descubrimiento de genes compartimentacin celular Genmica
funcional laticfero Papaver somniferum Tamiz elemento metabolismo
Especializada.
Abstracto
adormidera (Papaver somniferum) es una de las plantas medicinales ms
antiguas del mundo y sigue siendo la nica fuente comercial para la morfina
analgsicos narcticos, la codena y sus derivados semisintticos como la
oxicodona y la naltrexona. La planta tambin produce varios otros alcaloides
bencilisoquinolina con propiedades farmacolgicas potentes como la
papaverina vasodilatador, el supresor de la tos y el potencial noscapina
medicamento contra el cncer y el agente antimicrobiano sanguinaria.
adormidera ha servido como un sistema modelo para investigar la biosntesis
de alcaloides bencilisoquinolina en las plantas. La aplicacin de la genmica
bioqumicos y funcionales ha dado lugar a un reciente aumento en el
descubrimiento de los genes biosintticos implicados en la formacin de los
principales alcaloides bencilisoquinolina de adormidera. La disponibilidad de

gran cantidad de herramientas de gentica bioqumica y la informacin relativa


a bencilisoquinolina alcaloide metabolismo est facilitando el estudio de una
amplia gama de fenmenos que incluye la biologa estructural de nuevos
catalizadores, la organizacin genmica de los genes biosintticos, la
localizacin celular y subcelular de las enzimas biosintticas y una variedad de
aplicaciones biotecnolgicas. En esta revisin, se destacan los acontecimientos
recientes y resumimos las fronteras del conocimiento en relacin con la
bioqumica, biologa celular y biotecnologa de la biosntesis de alcaloides
bencilisoquinolina de adormidera.

Palabras clave biosinttica descubrimiento de genes compartimentacin


celular Genmica funcional laticfero Papaver somniferum Tamiz
elemento metabolismo Especializada
Introduccin
Adormidera (Papaver somniferum) es una planta medicinal antigua que sigue
siendo la nica fuente comercial de la morfina analgsicos narcticos, la
codena y anlogos semisintticos incluyendo oxicodona, hidrocodona,
buprenorfina y naltrexona (Bernyi et al., 2009). Otros alcaloides
bencilisoquinolina farmacuticamente importante (sesgo) que se encuentran
en la adormidera incluyen la sanguinaria agente antimicrobiano, la papaverina
relajante muscular y el supresor de la tos y el potencial noscapina
medicamento contra el cncer. El ~ 2.500 desviacin conocida representan un
grupo diverso de metabolitos especializados que contienen nitrgeno que se
encuentra principalmente en el orden basal eudicot Ranunculales, en
particular, las familias Papaveraceae, Ranunculaceae, BERBERIDACEAE y
Menispermaceae (Liscombe et al., 2005). Muchos parcialidad de importancia
farmacutica poseer uno o ms centros quirales, que impiden la sntesis
qumica como una opcin econmicamente viable para la produccin
comercial. Adems de su importancia farmacutica, adormidera tambin se
cultiva como una fuente ilcita de morfina, que se convierte fcilmente a O, Odiacetilmorfina, o la herona. La adormidera es un ejemplo clsico de la
tecnologa de doble uso por el cual se producen compuestos de gran valor,
tanto positivos como negativos para la humanidad. La bioqumica y la fisiologa
del metabolismo de la BIA en la adormidera durante mucho tiempo han sido
investigadas. Los principales avances se lograron a travs de (1) la aplicacin
de tcnicas de radiotrazadores en la dcada de 1960, (2) el aislamiento de la
enzima y metodologas de caracterizacin en la dcada de 1980 y (3)
tecnologas de ADN recombinante en la dcada de 1990 (Hagel y Facchini
2013).
Las ltimas aplicaciones de los sistemas de secuenciacin de ADN de prxima
generacin y poderosos mtodos de genmica funcional han acelerado el ritmo
de descubrimiento. La acumulacin de conocimientos adquiridos a lo largo del
ltimo medio siglo ofrece una plataforma extraordinaria para entender el
metabolismo BIA en la adormidera. Esta revisin resume los acontecimientos

recientes y actuales fronteras de nuestro conocimiento que definen el estado


de la adormidera como un sistema modelo para el estudio de la biosntesis de
alcaloides en las plantas.

La biosntesis de los principales alcaloides de la adormidera


Muchas de las reacciones de un nmero limitado de familias de enzimas
enzimas implicadas en el metabolismo de BIA pertenecen a un nmero
relativamente limitado de familias de protenas, incluyendo los citocromos
P450 (CYP), S-adenosilmetionina dependiente O- y N-metiltransferasas, cuatro
grupos distintos de deshidrogenasas NADPHdependent / reductasas,
oxidorreductasas FAD vinculados (FADOXs), y los nmeros ms restringidas de
la acetil-CoA-O-dependientes acetiltransferasas, 2-oxoglutarato / Fe (II)
dioxigenasas dependientes (odds) y carboxilesterasas. El monophylogeny de
BIA biosntesis en el Ranunculales (Liscombe et al. 2005) facilita la
identificacin de nuevos genes biosintticos a base de cido amino similitud de
secuencia con las enzimas previamente caracterizadas. familias de enzimas
adicionales, incluyendo UDP dependiente de glucosiltransferasas, son, sin duda
involucrados en aspectos no caracterizados del metabolismo alcaloide basado
en la aparicin de los metabolitos de la firma, como el sesgo glucosilada
producida por estas enzimas (Liscombe et al. 2009). La notable diversidad
estructural de sesgo se logra inicialmente a travs de la modificacin de la
cadena principal de 1-bencilisoquinolina, pero multiplica ampliamente por la
adicin de varios grupos funcionales. Remodelacin del andamio 1bencilisoquinolina est mediada por las enzimas oxidativas (APP es decir,
FADOXs y probabilidades). APP catalizan una amplia variedad de reacciones
que van desde hidroxilaciones a los acoplamientos C-O, C-C y y son
responsables de la formacin de la mayora de los subgrupos estructurales BIA
con la excepcin de protoberberines. En el metabolismo BIA, FADOXs slo han
sido implicados en la formacin de enlaces C-C y C-N, la ms notable es la
enzima puente berberina (BTenga), que genera el andamio protoberberine
(Dittrich y Kutchan 1991;. Facchini et al 1996 ; Winkler et al 2006).. Por el
contrario, los homlogos FADOX aparecen slo para catalizar la formacin de
enlaces C-O en la formacin de metabolitos no especializados alcaloides en
otras plantas (Custers et al 2004;. Sirikantaramas et al., 2004). Aunque las
probabilidades son conocidos para llevar a cabo una variedad de
hidroxilaciones, epoxidaciones y desaturaciones en una variedad de caminos
metablicos de la planta (Prescott y John 1996), las enzimas de esta familia
slo se han demostrado para catalizar la desalquilacin de ciertos subgrupos
BIA (Hagel y Facchini 2010; Farrow y Facchini 2013). Una coleccin de diversas
juntas methytransferases catalizan la transferencia regioespecfica de un grupo
metilo de la S-adenosilmetionina a un resto hidroxilo libre en una variedad de
subgrupos BIA, pero parecen estar dirigidas principalmente 1-bencilisoquinolina
y protoberberines (Dang y Facchini 2012). N-metiltransferasas que participan
en la biosntesis de pantalla BIA de secuencia sustancial similitud y catalizar la
transferencia de un grupo metilo al nitrgeno en el anillo de isoquinolina. A
pesar de la aparicin de un dominio de unin S-adenosilmetionina similar,

todava no se sabe si O- y N-metiltransferasas tienen un ancestro comn


(Ibrahim y Muzac 2000).

(S) -Reticuline
Biosntesis BIA comienza con la condensacin de dos derivados de L-tirosina, 4hydroxyphenylacetaldehyde (4HPAA) y dopamina, a travs de la
descarboxilacin, meta-hidroxilacin y transaminacin produciendo el
precursor de todos los dems BIA, (S) -norcoclaurine (Fig. 1). En la formacin de
4HPAA, L-tirosina puede someterse transaminacin por aminotransferasa Ltirosina (TyrAT) (Lee y Facchini 2011) y la posterior descarboxilacin por una
enzima no identificado aislado como 4-hidroxifenilpiruvato descarboxilasa
(4HPPDC) (Rueffer y Zenk 1987). meta-hidroxilacin de L-tirosina y / o tiramina
por otra enzima no caracterizado (referido como 3'OHase en la Fig. 1) produce
L-dihidroxifenilalanina
(DOPA)
y
la
dopamina,
respectivamente.
Alternativamente, L-tirosina y DOPA se convierten a la tiramina y la dopamina
por tirosina-descarboxilasa (TYDC) (Facchini y De Luca 1994). El
estereoselectiva condensacin Pictet-Spengler de (S) -norcoclaurine de 4HPAA
y la dopamina es catalizada por la sintasa de norcoclaurine (NCS), que es un
miembro de la relacionada con la patognesis (PR) / Bet v 1 familia de
protenas 10 (Liscombe et al. 2005 ; Samanani et al 2004;. Lee y Facchini
2010). Adems de un tipo PR10 NCS, se report una similitud compartir
segunda enzima (CjNCS1) con las probabilidades para catalizar la formacin de
(S) -norcoclaurine en Coptis japonica (Minami et al., 2007). Sin embargo, el
papel fisiolgico real de esta enzima no se conoce. Muchos BIA se derivan a
partir del intermedio (S) -reticuline va central, que se forma a travs de 3'hidroxilacin y una serie de O- y N-metilaciones (Fig. 1). El orden de conversin
fue inferida por la preferencia de sustrato de las enzimas relevantes aunque la
evidencia reciente sugiere que la va no es lineal, sino ms bien opera como
una cuadrcula (Desgagn-Penix y Facchini 2012). (S) -Norcoclaurine se
convierte primero por norcoclaurine-6-O-metiltransferasa (6OMT) a (S)
-coclaurine (Morishige et al 2000;.. Ounaroon et al 2003), que es aceptada por
coclaurina N-metiltransferasa (CNMT) (Choi et al. 2001). N-Methylcoclaurine es
hidroxilado por (S) -N-methylcoclaurine 3'-hidroxilasa (NMCH) (Pauli y Kutchan
1998;. Frick et al 2007) para 3'-hidroxi-N-methylcoclaurine, que se convierte
por 3'-hidroxi -N-methylcoclaurine 4 '-O-metiltransferasa (4'OMT) (Morishige et
al. 2000) a (S) -reticuline. Curiosamente, slo NMCH ha informado para mostrar
estricta sustrato y especificidad estereoismero, aceptando (S) -Nmethylcoclaurine y no el correspondiente (R) N-methylcoclaurine o compuestos
N-desmetil. En contraste, el O- y N-metiltransferasas normalmente aceptan una
variedad de (R) - y (S) -tetrahydroisoquinolines. Reticulina puede ser metilado
an ms por reticulina 7-O-metiltransferasa (7OMT) (Ounaroon et al. 2003)
laudanine rendimiento, que puede ser totalmente O-metilado a laudanosina por
un no identificado 3'-O-metiltransferasa (indicado como 3'OMT en Figura 1).

Papaverina
Se han propuesto dos rutas para la biosntesis de papaverina: (1) una va de Nmetil participacin de (S) -reticuline y la N-desmetilacin de un compuesto

intermedio no especificado por una enzima hipottica y (2) una ruta de Ndesmetil participacin de (S) - norreticuline y se opone a la exigencia de Ndesmetilacin (Fig. 1). La incorporacin eficiente de compuestos N-desmetil
radiomarcados (Brochmann-Hanssen et al 1975;.. Uprety et al 1975) y la
identificacin de un norreticuline 7-O-metiltransferasa (N7OMT), que slo
acepta norlaudanine norreticuline rendimiento (Pienkny et al. 2009),
proporciona soporte para la bioqumica de la va N-desmetil. Un estudio
reciente utilizando la espectrometra de masas y pesado etiquetado de
istopos estables de (S) -reticuline, (S) laudanine y (S) -laudanosine sugiri que
la N-metilados 1-bencilisoquinolina se incorporan en la papaverina en niveles
bajos (Han et al. 2010 ), que proporciona cierto apoyo a la va N-metilo. Sin
embargo, la mayor parte de la (S) -reticuline marcado se incorpora en
alcaloides de morfinano. El uso de la inducida por el virus de silenciamiento
gnico (GEA) demostr adems que la principal va a la papaverina es
probablemente a travs de la va N-desmetil y demostr que norreticuline y
otros desmethyled-N1-bencilisoquinolina son metabolitos naturales de
adormidera (Desgagn-Penix y Facchini 2012). La supresin mediada por VIGS
de los niveles de transcripcin CNMT en plantas de adormidera aument la
acumulacin de papaverina, mientras que la reduccin de los niveles de
transcripcin de N7OMT, que es especfico para la va N-desmetil, disminucin
de los niveles de papaverina. Por el contrario, la supresin de los niveles de
transcripcin 7OMT no afect la acumulacin de papaverina en un mayor
apoyo de la va N-desmetil como la principal va a la papaverina. Sin embargo,
una contribucin menor de la ruta de N-metilo para la biosntesis de la
papaverina no se puede descartar. Otro estudio utiliz un enfoque
transcriptmica para comparar cultivares de alta y baja papaverina (Patahnk et
al. 2013). Del mismo modo, las transcripciones que codifican enzimas en la
ruta N-desmetil se upregulated, mientras que los transcritos correspondientes
a 7OMT se downregulated. El paso final de la biosntesis de la papaverina
implica la oxidacin de la tetrahydropapaverine compuesto totalmente Ometilado y N-desmetil por dihydrobenzophenanthridine oxidasa (DBOX), una
enzima que tambin cataliza la etapa final en la formacin de la cuaternario
benzo [c] fenantridina sanguinarina (Hagel et al. 2012). Curiosamente, las
transcripciones DBOX aparecen exclusivamente en las races de adormidera
que sugieren la posible translocacin sistmica de la papaverina desde las
races a los rganos areos.

Morfina
La biosntesis de morfina slo se ha descrito en unas pocas especies de plantas
restringidas a la Papaveraceae, aunque el tetracclico salutaridine
promorphinan alcaloide y varios derivados se han reportado en algunos
miembros de la Euphorbiaceae (Theuns et al. 1986). La biosntesis de la
morfina (Fig. 1) requiere que la epimerizacin de (S) -reticuline a -reticuline (R).
El mecanismo de reaccin se ha propuesto proceder a travs de la
deshidrogenacin de (S) -reticuline a un ion 1,2-dehydroreticulinium (Hirata et

al. 2004), que se reduce posteriormente a -reticuline (R). Aunque la sintasa de


1,2-dehydroreticuline (DRS) que cataliza la primera conversin no se conoce,
una reductasa 1,2-dehydroreticuline (DRR) potencialmente implicados en el
segundo paso se ha purificado hasta la homogeneidad y parcialmente
caracterizada (De-eknamul y Zenk 1992 ). Aunque (S) intermedios
tetrahidroisoquinolina se asumen como la principal va de (R, S) -reticuline, la
mayora de las enzimas involucradas acepta ambos epmeros R S y. En algunas
plantas, se requieren -tetrahydroisoquinolines (R) para la sntesis de los
subgrupos estructurales BIA distintos de alcaloides de morfinano, incluyendo la
formacin de la berbamunine bisBIA en Berberis stolonifera a travs del
acoplamiento C-O de (S) - y (R) -N -methylcoclaurine por el CYP berbamunine
sintasa (CYP80A1) (Fig 1). (Stadler y Zenk 1993; Kraus y Kutchan 1995).
(R) -Reticuline es convertido por la sintasa CYP salutaridine (CYP719B1) para
salutaridine (Gesell et al. 2009), que despus se convierte por la
deshidrogenasa de cadena corta / reductasa salutaridine reductasa (SALR)
(Ziegler et al. 2006). Posteriormente, se salutaridinol O-acetilado por
salutaridinol 7-O-acetiltransferasa (Salat) (Grothe et al 2001;. Lenz y Zenk
1995). Curiosamente, salutaridinol 7-O-acetato se somete a ciclacin
espontnea a la primera tebana morfinano alcaloide pentacclico a pH 8-9,
mientras que un dibenzo [d, f] alcaloide azonine se forma a un pH de 6 a 7, lo
que sugiere la compartimentacin del intermedio en un bsico medio ambiente
o la implicacin de una enzima no caracterizado (Fisinger et al. 2007). Un
derivado reducido, neodihydrothebaine slo se ha informado en Papaver
bracteatum (Theuns et al. 1984). La va de la morfina se bifurca en tebana con
el paso inicial en la ruta principal catalizada por tebana 6-O-desmetilasa
(T6ODM) neopinona rendimiento, que sufre un reordenamiento supuestamente
espontnea a codeinona (Hagel y Facchini 2010). Codeinona se reduce
entonces por la aldo-ceto reductasa codeinona reductasa (COR) (Unterlinner et
al. 1999) a la codena, que se convierte a la morfina por codena O-desmetilasa
(CODM). Alternativamente, el CODM cataliza el primer paso en la ruta de
menor importancia, que implica la 3-O-desmetilacin de tebana a la oripavina.
T6ODM luego convierte la oripavina para morfinona, que se reduce por COR a
la morfina (Fig. 1). El papel fisiolgico de enzimas biosintticas de BIA se ha
investigado usando una variedad de supresin de genes y la sobre-expresin
mtodos en adormidera. La supresin mediada por ARNi de los niveles de
transcripcin COR result en la acumulacin de reticulina y derivados de 1bencilisoquinolina metilados con una disminucin correspondiente en el
contenido de alcaloide de morfinano (Allen et al. 2004). En apoyo de un papel
para COR en la modulacin de la biosntesis de la morfina, la sobre expresin
de COR result en un incremento significativo en los niveles de alcaloides de
morfinano (Larkin et al. 2007). Del mismo modo, la sobre expresin de Salat
tambin mayor contenido de morfinano alcaloide, mientras que la supresin de
los niveles de transcripcin Salat provoc la acumulacin de salutaridine, pero
no alter la abundancia o perfil de alcaloides de morfinano (Allen et al. 2008).
Las funciones fisiolgicas de T6ODM y CODM se sugirieron en el top1 mutante
de adormidera (Millgate et al. 2004), que se acumula altos niveles de tebana y

oripavina a expensas de la codena y morfina. La ausencia de transcripciones


T6ODM en un highthebaine / oripavina, bajo la codena / morfina quimiotipo de
adormidera se compar con variedades tres de alta codena / morfina para
identificar el gen correspondiente usando un enfoque basado en microarrays
(Hagel y Facchini 2010). Supresin de los niveles de transcripcin T6ODM
result en la acumulacin de tebana y oripavina y niveles sustancialmente
reducidos de la codena y morfina. Del mismo modo, la supresin de los niveles
de transcripcin CODM provoc la acumulacin de codena a expensas de la
morfina (Hagel y Facchini 2010). El aislamiento de todos los genes biosintticos
facilit una confirmacin coordinada del papel fisiolgico de cada
enzima que opera aguas abajo de (R) -reticuline (Wijekoon y Facchini 2012).
Protoberberines, protopines y sanguinarine
(S) -Scoulerine, el intermedio punto de ramificacin que conduce a
protoberberine alcaloides, se forma a partir de (S) -reticuline de BBE (Dittrich y
Kutchan 1991; Facchini y otros, 1996;. Kutchan y Dittrich 1995; Winkler et al.,
2006). (S) Scoulerine se convierte a travs de la formacin de puentes
metilendioxi y O-metilacin a una variedad de protoberberines incluyendo (S)
-canadine, (S) -stylopine y (S) -sinactine. (S) -Canadine, el precursor de la
allocryptopine protopine y la noscapina phthalideisoquinoline, se forma
secuencialmente a partir de (S) -scoulerine por (1) scoulerine 9-Ometiltransferasa (SOMT1) (Dang y Facchini 2012;. Takeshita et al 1995 )
produciendo tetrahidrocolumbamina y (2) que forma el puente metilendioxi
canadina enzima sintasa (CAS), que es un miembro de la subfamilia CYP719A
(Daz Chvez et al 2011;. Ikezawa et al 2003;.. Winzer et al 2012). Del mismo
modo, (S) -sinactine se forma a partir de (S) -scoulerine por (1) la adicin de un
puente metilendioxi por cheilanthifolina sintasa, tambin un miembro de la
subfamilia CYP719A (Daz Chvez et al 2011;.. Ikezawa et al 2009) , seguido
por (2) 2-O-metilacin de cheilanthifolina por una enzima an no caracterizado
a partir de adormidera. Un protoberberine 2-O-metiltransferasa, columbamine
O-metiltransferasa, se ha informado de la pradera rue (Coptis japonica)
(Morishige et al., 2002). Alternativamente, cheilanthifolina se pueden oxidar a
stylopine por otro CYP719A, stylopine sintasa (SPS) (Ikezawa et al 2007;.. Daz
Chvez et al 2011). alcaloides protopine se forman a travs de la 14hidroxilacin de alcaloides protoberberine cuaternario, lo que conduce a sonar
tautomerizacin a travs de C-N escisin del enlace y la formacin de un resto
ceto
C14.
protoberberines
cuaternarias
se
forman
por
(S)
-tetrahydroprotoberberine N-metiltransferasa (TNMT) y 14-hidroxilacin es
catalizada por (S) -cis-N-methylstylopine 14-hidroxilasa (MSH). TNMT
adormidera se muestra para aceptar una variedad de sustratos protoberberine,
pero muestra una preferencia por stylopine y canadina (Liscombe y Facchini
2007). MSH es un miembro de la subfamilia CYP82 N y acepta una variedad de
protoberberines cuaternario (Rueffer y Zenk 1987; Beaudoin y Facchini 2013).
El protopines allocryptopine, criptopina y protopine se forman a partir
canadina, sinactine y stylopine, respectivamente. T6ODM, CODM y otras
probabilidades son potencialmente implicados en la regulacin de la biosntesis

de alcaloides protopine a travs de la desalquilacin oxidativa de los puentes


metilendioxi o grupos metoxi (Farrow y Facchini 2013). La formacin de la
benzo especfico de la raz [c] fenantridina dihidrosanguinarina alcaloide (Fig.
1) de protopine es catalizada por protopine 6-hidroxilasa (P6H), otro miembro
de la subfamilia CYP82 N (Tanahashi y Zenk 1990;. Takemura et al 2012) . Los
resultados resultantes 6-hidroxilacin en una reordenacin espontnea de 6hydroxyprotopine a dihidrosanguinarina, que se oxida a sanguinarina por el
dihydrobenzophenanthridine enzima oxidasa FAD vinculados (DBOX) (Hagel et
al. 2012). Curiosamente, sanguinarina puede reducirse a dihidrosanguinarina
por reductasa sanguinarina (SanR) (Vogel et al 2010;.. Weiss et al 2006). El
papel fisiolgico de SanR se ha sugerido como la mitigacin de los efectos
citotxicos de la sanguinarina a travs de la conversin en el
dihidrosanguinarina menos txico. protoberberines ms oxidadas son comunes
en algunos miembros de la Papaveraceae y estn muy extendidas en familias
de plantas relacionadas. En particular, la berberina se forma a partir de (S)
canadina por la enzima FAD vinculados (S) -tetrahydroprotoberberine oxidasa
(Stox) (Fig. 1) (Amann et al 1984;. Gesell et al 2011;.. Matsushima et al 2012) .
Sin embargo, la berberina y otros protoberberines modificados en general no
han sido reportados en la adormidera (Sama y Moniot 1978; Shulgin y Perry
2002). Por otra parte, se ha informado de protoberberines en el que se ha
formado el puente berberina entre el N-metilo y los 6 'tomos de carbono, en
oposicin a la posicin 2' (scoulerine es decir, produciendo), en otras plantas,
pero no se detectan en la adormidera (Tsai y Lee 2010). Es interesante
observar que otras especies acumulan una variedad de benzo [c] alcaloides
fenantridina derivados de alcaloides protoberberine correspondiente con los
patrones de metilacin diferencial. Sin embargo, la nica benzo abundante [c]
alcaloides fenantridnicos en adormidera son dihidrosanguinarina y
sanguinaria, lo que sugiere que podra exhibir P6H relativamente estrecha
especificidad de sustrato de la adormidera. Alternativamente, la va
sanguinarina podra implicar compartimentacin inter o intra-celular restringir
la disponibilidad de sustratos, distintos de protopine, a P6H.

Noscapina
En algunos quimiotipos de amapola, la noscapina phthalideisoquinoline
alcaloide representa la mayora del contenido de alcaloide total en el ltex
(Frick et al. 2005). Noscapina tambin se produce en otros miembros de la
Papaveraceae y Menispermaceae. Debido a su actividad supresor de la tos y el
potencial como un medicamento contra el cncer (Mahmoudian y
RahimiMoghaddam 2009), la biosntesis de noscapina ha sido objeto de
renovado inters (Dang y Facchini 2012; Facchini y otros, 2007;.. Winzer et al
2012). La formacin de la noscapina no ha sido tan extensamente investigado
como otros alcaloides, como la morfina. Durante dcadas, el papel de
scoulerine como intermedio va era la medida de nuestro conocimiento en
relacin con la biosntesis de noscapina.
Con base en el aislamiento de compuestos intermedios de la va pretendidos y
la identificacin de las enzimas implicadas en la formacin de N-

methylcanadine, se propuso un esquema metablico para la biosntesis de


noscapina (Fig. 1); (Facchini y col., 2007). El esquema consiste en la
hidroxilacin secuencial del anillo de isoquinolina, escisin oxidativa del puente
berberina y dos oxidaciones posteriores para formar el anillo de lactona
phthalideisoquinoline
caracterstica.
Tras
la
identificacin
de
Ometiltransferasas pertinentes (Dang y Facchini 2012), propusieron un grupo de
genes que codifican enzimas biosintticas todos noscapina fue identificado en
la adormidera. Las funciones para algunos miembros de la agrupacin de
genes se sugirieron utilizar Vigs para mostrar correlaciones entre la supresin
de un gen especfico y la acumulacin de compuestos pretendidos como
productos intermedios de la ruta (Winzer et al. 2012). La funcin de los grupos
de genes metablicos en las plantas se ha sugerido como un mecanismo para
regular la expresin a nivel epigentico (Wegel et al. 2009) y para facilitar la
herencia completa de una va metablica especializada (Swaminathan et al.
2009). Recientemente, CAS (Dang y 2014A Facchini), N-methylcanadine 1hidroxilasa (CYP82Y1) (Dang y Facchini 2014b) y noscapina sintasa (NOS)
(Chen y Facchini 2014) se aislaron y caracterizaron a partir de adormidera. NOS
se caracteriz como un NAD + dependiente, deshidrogenasa de cadena corta /
reductasa que cataliza la conversin irreversible de narcotinehemiacetal a
noscapina.

Otros alcaloides
Los alcaloides rhoeadine, algunos de los que son tambin conocidos como
alcaloides papaverrubine, se encuentran exclusivamente en los miembros de la
Papaveraceae, incluyendo adormidera (Montgomery et al. 1983). estudios de
radiomarcaje en amapola Persa (Papaver bracteatum) demostraron que los
precursores de la alpinigenine rhoeadine fueron el protoberberines
tetrahidropalmatina (Rnsch 1972), N-tetrahydropalamatine y la muramine
protopine (Rnsch 1977). Una ruta a travs de protopines se confirm en
Papaver rhoeas por protopine alimentacin, que se convirti en rhoeadine (Tani
y Tagahara 1977). estudios de marcaje tambin mostraron que los pro-S-13hidrgeno de C13 se retira estereoespecfica, lo que sugiere que la ciclacin es
mediada por enzima y no espontnea (Battersby y Staunton 1974). Muchos
rhoeadines aisladas de adormidera son desmetilado 10-O-(Montgomery et al.,
1983). La supresin mediada por VIGS de transcripciones de genes que codifica
CODM, que cataliza la O-desmetilacin y / o O, O-desmetilenacin de
morfinano y protopine alcaloides, result en niveles elevados de alcaloides
rhoeadine, posiblemente debido a la mayor acumulacin de criptopina y 10- Odesmethylcryptopine (Farrow y Facchini 2013). Enzimas implicadas en la
conversin de protopines a rhoeadines no se conocen.

Regulacin del metabolismo del alcaloide


Localizacin celular y el transporte
La biosntesis y el almacenamiento de sesgo en los adormidera ha sido
ampliamente investigado y demostrado que la participacin de tres tipos
distintos de clulas (Facchini y De Luca 1995; Bird et al 2003;. Samanani et al

2006;. Lee y Facchini 2010). La hibridacin in situ y el etiquetado de


inmunofluorescencia demostrado la localizacin de las transcripciones de
genes biosintticos y enzimas a las clulas de compaa y elementos de tamiz,
respectivamente. Dado que todos los genes y enzimas que participan en la
formacin de (S) -reticuline, y algunos funcionamiento en diversas vas de
ramificacin caracterizados, fueron inicialmente localizado en las clulas
acompaantes y elementos de tamiz, respectivamente, se propusieron
Lacticferos para funcionar slo en el almacenamiento de alcaloides. El modelo
propone que BIA genes biosintticos se expresan en clulas de compaa y las
enzimas correspondientes son posteriormente trasladadas para tamizar
elementos. Alcaloides sintetizados en los elementos de criba son finalmente
transportados a laticferos cercanos para su almacenamiento en grandes
vesculas citoplasmticas. Sin embargo, Salat y COR transcripciones tambin
se han reportado en el citoplasma, o ltex, de laticferos (Decker et al 2000;..
Larkin et al 2007; Allen et al., 2008), aunque la hibridacin in situ y el
etiquetado de inmunofluorescencia no lograron detectar Salat y COR ARNm y
las correspondientes enzimas en laticferos (Bird et al 2003;.. weid et al 2004;
Samanani et al., 2006). Recientemente, la aplicacin de la protemica escopeta
para determinar la abundancia relativa de las protenas en ltex aislado, o en el
tallo entero incluyendo ltex, revel que los tres ltimos pasos en la biosntesis
de la morfina, catalizada por T6ODM, COR y CODM, se presentan
principalmente en Lacticferos (Onoyovwe et al. 2013). Otras enzimas
biosintticas BIA abundantes en Lacticferos incluyen NOS (Chen y Facchini
2014) y 7OMT (Onoyovwe et al. 2013), lo que indica que los pasos finales en la
formacin de noscapina y 7-O-metilados derivados de reticulina tambin se
producen en ltex y son espacialmente separada de las enzimas aguas arriba.
Los mejores candidatos para el transporte de los elementos de tamiz a
laticferos incluyen tebana y narcotinehemiacetal en las vas de morfina y
noscapina, respectivamente. Sin embargo, la deteccin de la mayora de los
productos intermedios de la va en el ltex aislado sugiere un proceso de
transporte relativamente no especfica. Aunque el mecanismo de translocacin
es desconocida, la ocurrencia de plasmodesmas entre los elementos de criba
de la adormidera y laticferos (Facchini y DeLuca 2008) sugiere que son
posibles las dos rutas de transporte y simplstica apoplsticas. Un casete (ABC)
transportador de unin a ATP ha sido implicado en la absorcin (Sakai et al.
2002) y de flujo de salida (Terasaka et al. 2003) de la berberina en Coptis
japonica, y se ha aislado el gen correspondiente (Shitan et al. 2003 , 2012). Sin
embargo, no se sabe si un transportador ABC realiza una funcin similar en la
adormidera. Los principales sitios de BIA transcripcin de genes de biosntesis y
la localizacin de la enzima y los posibles puntos de translocacin dentro de la
va de morfina se resumen esquemticamente en la Fig. 2.

Compartimentacin subcelular y el trfico


En adormidera, la sanguinarina alcaloide antimicrobiano normalmente no est
presente en el ltex, pero se acumula de forma constitutiva en las races. La
localizacin subcelular de la mayora de las enzimas implicadas en la

biosntesis de sanguinarina se ha investigado en clulas de adormidera


cultivadas utilizando bombardeo con microproyectiles seguido por formacin
de imgenes de fusiones de protena verde fluorescente (Hagel y Facchini
2012). Como se indica anteriormente por fraccionamiento en gradiente de
densidad (Amann et al 1986;. Rueffer y Zenk 1987; Tanahashi y Zenk 1990;
Bauer y Zenk 1991), y el uso de inmuno localizacin, BBE y APP asociado
(Alcantara et al 2005.) Con el retculo endoplsmico (eR). Adormidera BTenga
Tambin se demostr que contienen un 25 aminocidos, el pptido seal Nterminal de la direccin de la enzima a la sala de emergencia, y un
determinante vacuolar la clasificacin adyacente, lo que resulta en su
translocacin final a la vacuola (Bird y Facchini 2001). Curiosamente, la
translocacin intracelular de NCS fue similar a la reportada para BBE, la
prediccin del extenso trfico subcelular de los productos intermedios de la
ruta de biosntesis de sanguinaria. La compartimentacin de NCS en el lumen
del ER requiere la translocacin concomitante de la dopamina y 4HPAA, tal
como se representa esquemticamente en la Fig. 3. Como era de esperar, O- y
N-metiltransferasas se detectaron como enzimas citoslicas; Por lo tanto, la
enzima subsiguiente (6OMT) predice la exportacin inmediata de (S)
-norcoclaurine desde el RE. La biosntesis de (S) -reticuline podra implicar una
canal metablica anclado a la cara citoslica de la eR por NMCH, aunque no
hay evidencia est todava disponible para apoyar las interacciones entre las
enzimas relevantes. El co-compartimentacin de BBE en el lumen del RE
implica que (S) -reticuline tambin ha sido importada desde el citosol para su
conversin en (S) -scoulerine, que se exporta con prontitud. Cuatro de las cinco
enzimas son posteriores APP con dominios activos en la cara citoslica de la
sala de emergencia, con una enzima citoslica (TNMT) que operan en el medio.
Aunque no localizada como una fusin GFP junto con las otras enzimas (Hagel y
Facchini 2012), DBOX contiene un pptido seal N-terminal predicho (Hagel et
al. 2012) y las enzimas Stox relacionados se han asociado con la eR (Amann et
al. 1988); Por lo tanto, se predice un tercio de reentrada de una va intermedia
en el lumen del RE. La oxidacin de dihidrosanguinarina en el RE facilitara el
transporte de vesculas mediada por la sanguinaria a la vacuola central de
clulas cultivadas de amapola (Alcntara et al., 2005). Las caractersticas de
trfico subcelulares propuestas de la biosntesis de sanguinaria que tambin
ocurra en otras vas de ramificacin BIA, aunque no hay evidencias emprica
disponible. Transporte vacuolar en Coptis japonica ha informado que depender
de un antiporter H + / berberina (Otani et al. 2005), pero el proceso en
adormidera no se ha investigado.

Regulacin hormonal
La activacin del metabolismo fitohormonal BIA se ha utilizado para identificar
los genes de biosntesis en las plantas relacionados con la adormidera. La
adicin de citoquinina a Thalictrum minus cultivos de clulas caus un marcado
incremento en la acumulacin de berberina como resultado de una mayor
expresin de 6OMT (Hara et al. 1994) y Stox (Hara et al. 1995). El etileno
tambin se demostr que la promocin de la biosntesis de la berberina en T.

menos cultivos de clulas, y el inhibidor de etileno potente tiosulfato de plata


provoc una disminucin sustancial en la acumulacin de berberina (Kobayashi
et al. 1991). investigacin patrocinada por la industria se ha enfocado en el
aumento de los niveles de productos intermedios de la va de morfinano a
expensas de la morfina a travs de la aplicacin de fitohormonas especficas o
inhibidores catablicos de fitohormonas. La aplicacin de trinexapac-etilo, un
inhibidor de probabilidades que participan en la giberelina (GA) biosntesis, con
o sin metilo resultados jasmonato en la introduccin de un cuello de botella
catablico putativo que conduce a un aumento en la abundancia relativa de la
tebana y la codena y una disminucin de la acumulacin de morfina (Cotterill
2010). Curiosamente, trinexapac-etlico y acylcyclohexanediones no inhiben
T6ODM y CODM directamente (Hagel y Facchini 2010). Se inform de la adicin
exgena de GA3 para aumentar el rendimiento de la morfina (Khan et al.
2007), lo que sugiere un papel importante para el control de fitohormonas en el
metabolismo de alcaloide de morfinano. El control del desarrollo y fitohormonal
de la biosntesis de BIA de adormidera es un rea clave para la investigacin
futura, lo que podra tener consecuencias directas en la produccin comercial
de productos farmacuticos opiceos.

Regulacin transcripcional
La regulacin transcripcional de la biosntesis de BIA ha sido recientemente
investigado en la adormidera (Kawano et al 2012;. Mishra et al 2013.), Pero ha
sido ms ampliamente estudiado en Coptis japonica (Kato et al 2007;. Yamada
et al 2011.). La importancia del control de la transcripcin en el metabolismo
BIA es particularmente evidente a partir de (1) la localizacin typespecific
celular de transcripciones de genes biosintticos (Bird et al 2003;. Samanani et
al 2006;. Lee y Facchini 2010; Onoyovwe et al 2013.) Y (2 ) la induccin
coordinada de todas las transcripciones expresadas de biosntesis de genes
(Zulak et al 2007) y las protenas correspondientes (Zulak et al 2009;..
Desgagn-Penix et al 2010) en cultivos de clulas de adormidera despus de la
adicin de un inductor de derivados de hongos..
La primera regulador transcripcional del metabolismo de BIA se identific a
partir C. japonica utilizando RNAi para silenciar cinco factores reguladores
putativos que muestra la reduccin de expresin en una lnea de clulas
cultivadas con los niveles de transcripcin de genes de biosntesis
relativamente bajas BIA (Kato et al. 2007). El silenciamiento transitorio de un
candidato (CjWRKY1) dio como resultado una marcada disminucin en la
transcripcin de genes de biosntesis de berberina. Por el contrario, la
sobreexpresin de CjWRKY1 aumento de los niveles de transcripcin de genes
biosintticos de berberina. Un regulador de la transcripcin bHLH implicado en
la biosntesis de la berberina se aisl utilizando un enfoque similar (Yamada et
al. 2011). Por el contrario, las heridas y otros estmulos para inducir una
respuesta de defensa se utiliz para identificar etiquetas de secuencias
expresadas correspondientes a las transcripciones de genes inducidos en
plantas de adormidera (Mishra et al. 2013). Un factor de transcripcin putativo
wKRY se aisl y se demostr que se una conservada WRKY elementos en

promotores de ciertos genes biosintticos de unin in vitro y el uso de una


levadura de un enfoque hbrido. Otro factor de transcripcin WRKY se identific
a partir de lneas de insercin de adormidera de T-ADN que muestran alteracin
acumulacin BIA (Kawano et al. 2012). Adems, la expresin ectpica de un
factor de transcripcin WRKY Arabidopsis thaliana en la amapola de California
(Eschscholzia californica) caus la induccin de BBE y NMCH transcripciones, y
un aumento sustancial de la acumulacin de benzo [c] alcaloides fenantridina,
incluyendo sanguinarina (Apuya et al. 2008). Curiosamente, varios elementos
putativos WRKY ocurren dentro o cerca de las regiones promotoras de genes de
biosntesis en el grupo de genes noscapina informado (Winzer et al. 2012), lo
que sugiere que la biosntesis de noscapina tambin puede ser regulada por
factores WRKY.

Ingeniera metablica
Plantas
Ingeniera metablica se ha utilizado para modular la composicin de
alcaloides y el rendimiento en plantas de adormidera, con resultados mixtos.
Plantas de adormidera diseados con expresa de forma constitutiva o
antisentido-suprimido NMCH mostr modulaciones sustanciales en el contenido
de alcaloides en general, pero el perfil BIA no fue alterada (Frick et al., 2007).
Por el contrario, la sobreexpresin de COR (Larkin et al. 2007) y Salat (Allen et
al. 2008) dio como resultado especficamente en aumento de la acumulacin
de morfinano alcaloide. Sorprendentemente, el silenciamiento RNAi mediada
de COR (Allen et al. 2004) no dio lugar a la acumulacin de codena, sino ms
bien caus una acumulacin sustancial de (S) -reticuline y una disminucin
concomitante en los niveles de productos intermedios de la va corriente abajo
de la morfina salutaridine. La base bioqumica para la acumulacin de un
intermedio de varios pasos enzimticos aguas arriba del gen silenciado no se
conoce, pero sugerencias incluyen la posible aparicin de (1) regulacin de la
retroalimentacin y (2) canales metablicos (Allen et al. 2004). La aparicin de
complejos multienzimticos en la biosntesis de la morfina es apoyado por la
supresin de Salat en el uso de RNAi (Allen et al. 2008). plantas silenciadasSalat mostraron niveles de salutaridine, que normalmente no es abundante en
la adormidera aument. La acumulacin de salutaridine fue inesperado ya que
el sustrato enzimtico Salat (salutaridinol) no se acumula. Por lo tanto,
salutaridine podra ser canalizada a travs de tebana un complejo enzimtico
que incluye SALR y Salat. Por ltimo, la sobre expresin de A. thaliana
reguladores transcripcionales en adormidera dado lugar a una mayor
acumulacin de la tebana y la codena asociada con la regulacin positiva de
varios enzimas biosintticas BIA (Apuya et al. 2008).

Los microbios
Los microbios ingeniera gentica para expresar genes que codifican enzimas
de biosntesis de BIA-proporcionan un nuevo enfoque para el desarrollo de
procesos de fabricacin escalables. La disponibilidad de un gran nmero de
genes de biosntesis de BIA de adormidera y plantas relacionadas ha facilitado

la reconstitucin de varias vas que conducen a la produccin de (S) -reticuline


y (R, S) -reticuline en E. coli (Minami et al., 2008 ) y Saccharomyces cerevisiae
(Hawkins y Smolke 2008), respectivamente. Produccin de -reticuline (S) en E.
coli se consigui inicialmente por la suplementacin del medio de cultivo
bacteriano con la dopamina, algunos de los cuales se convierte en 3,4dihydroxyphenylacetaldehyde (3,4DHPAA) por un expresado de forma
heterloga de la monoamino oxidasa bacteriana (Minami et al . 2008). De tipo
PR10 NCS de C. japonica catalizada por la condensacin de la dopamina y 3,4DHPAA a (S) -norlaudanosoline, que se someti a metilaciones sucesivas a
travs de 6OMT, CNMT y 4'OMT para dar (S) -reticuline. Modificaciones
recientes de esta plataforma incluyen la sntesis de novo de la dopamina por la
expresin de dos enzimas adicionales, tirosinasa y DOPA descarboxilasa
(Nakagawa et al. 2011). El uso de enzimas bacterianas facilit la vinculacin de
metabolismo BIA al metabolismo primario de E. coli, lo que permite una
plataforma de fermentacin que crea productos vegetales a partir de fuentes
de carbono simples. A su vez, la E. coli gener-(S) -reticuline se convirti en el
magnoflorine aporfina alcaloide a travs de co-cultivo con una cepa de S.
cerevisiae modificado genticamente para expresar los genes que codifican la
sintasa de C. japonica corytuberine (CYP80G2) y un N-metiltransferasa . Del
mismo modo, (S) -scoulerine se produjo usando un BBE gen que codifica
(Minami et al. 2008). Alternativamente, (R, S) -reticuline fue producido en S.
cerevisiae a partir de (R, S) -norlaudanosoline. La biosntesis de ambos (R) - y
(S) ismeros -reticuline, junto con enzimas derivadas de tres especies de
plantas y los seres humanos diferentes, tambin se utiliz para producir
alcaloides protoberberine y salutaridine (Hawkins y Smolke 2008).

Perspectivas de futuro
Nuestro conocimiento de la biosntesis de alcaloides de opio ha sido objeto de
dos perodos de mayor avance: el primero hace, desde hace varias dcadas,
que implica la elucidacin de la qumica de algunas vas y la segunda, en la
ltima dcada, destacando el aislamiento de la mayora de los genes
biosintticos claves en gran medida facilitados por los rpidos avances en la
genmica. La disponibilidad de las vas completas a nivel gentico facilitar
renovados avances en el mejoramiento de las plantas y de la ingeniera
metablica y podra conducir a la creacin de sistemas de produccin
alternativos, tal vez los ms revolucionarios que son los microbios. Ms all del
aislamiento y la caracterizacin de las enzimas, los aspectos de la biosntesis
de alcaloides que an requieren una considerable investigacin incluyen (1) la
regulacin va, en los niveles tanto de la expresin gnica y la bioqumica
metablica, y (2) la biologa celular, especialmente la inter e intra-celular
procesos de transporte implicados en la formacin y almacenamiento de
compuestos. Los esfuerzos dedicados de un nmero relativamente pequeo de
grupos de investigacin en el ltimo medio siglo han generado un
impresionante cuerpo de la informacin y la adormidera elevada a la categora
de un sistema modelo para el estudio de la biosntesis de alcaloides en las
plantas.

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