Professional Documents
Culture Documents
INTRODUCCIN
Tipos
Clasificacin por su funcin. Hay 5 clases principales:
OBJETIVOS:
Realizar la purificacin de un plsmido bacteriano utilizando el mtodo de
lisis alcalina y el de columna.
METODOLOGA:
Prctica N 4.
Construccin molecular,
purificacin y evaluacin
de plsmidos.
1.- Un da antes del
experimento, colocar en
un tubo de centrifuga de
50 ml, 6 ml de medio LB de
50 g/mL con kanamicina
y una colonia de la cepa
pVAX1/EGFP, esto se
realizar en el laboratorio
N 8
5.-Eliminar
sobrenadante
usando una
micropipeta o
por
6.-Agregar ms
cultivo y repetir
los pasos 3,4 y 5
hasta agotar el
cultivo
7.-Agregar 150 L
de la solucin l
anteriormente
preparada
11-Agregar 150 L
de la solucin lll
previamente
almacenada a 4C,
mezclar por
inversin por 10
segundos e incubar
12.-Centrifugar por 5
min a 13,000 rpm y
recuperar el
sobrenadante que
contiene el DNA y RNA.
3.-Una vez
obtenido el
cultivo, colocar 1
ml de cultivo en 2
microtubos de 2
2.-Incubar el
inoculo a 37C
por 12 hrs
aprox, con
agitacin a 250
8.-Resuspender el
botn celular e
incubar 5 min a
temperatura
ambiente.
10.-Agregar 150 L
de sta solucin, y
mezclar por
inversin 10 veces.
Incubar por 5 min a
13.-Agregar 1 ml de
EtOH absoluto
almacenado a 4C y
mezclar por
inversin 6 veces e
incubar a temp.
Ambiente por 2
4.-Centrifugar
por 1 ml a
12,000 rpm
9.-En el periodo
de incubacin,
preparar la
solucin ll
agregando en un
tubo ependorf lo
siguiente:
400 L de agua
destilada
500 L de SDS al
10%
14.-Centrifugar a
11,000 rpm durante
10 min. Eliminar
sobrenadante con
micropipeta.
16.-Centrifugar a
11,000 rpm durante 5
min. Eliminar el
sobrenadan con
micropipeta.
Resuspender el botn
de ADN en 30L de
agua MiliQ y
almacenar a -20C
Repetir pasos
15 y 16.
Decantar el
sobrenadante e invertir
los tubos en papel
secante hasta que se
haya eliminado
totalmente el etanol
Cuantificacin del
ADN plsmidico.
Descongelar las
muestras de ADN
colocndolas en
hielo.
Posterior a su
cuantificacin,
almacenar el ADN a 20C para su posterior
uso.
Colocar X L de ADN en
el receptculo especial
del medidor del equipo
El equipo arroja
automticamente la
concentracin y
pureza del ADN, as
como la curva de
cuantificacin.
Ensayo de
restriccin.
Descongelar el
plsmido previamente
purificado colocndolo
en hielo.
Se prepararan las
siguientes
reacciones de
restricciones con el
ADN previamente
purificado.
En tubos ependorf
diferentes, se deben
de agregar los
reactivos en el orden
citado con el fin de
evitar someter al
DNA y a las enzimas a
una alta
concentracin de
sales.
Doble digestin
Uso de las enzimas kpnI y XhoI
-2 L de buffer Tango
-5 L de ADN plsmidico.
1 L de cada enzima
12 L de agua miliQ
Incubar durante 1 hora a 37C
Electroforesis en gel de
agarosa al 0.8% de los
plsmidos digeridos con
las enzimas EcoRI y XhoI
Dejar solidificar a
temperatura ambiente
y retirar el peine con
cuidado de no romper
los pozos.
Realizar los
clculos para
preparar un gel de
agarosa al 0.8%
por duplicado.
Pesar la agarosa y
colocar en un
matraz Erlenmeyer
y agregar 24.5ml
agua destilada
Calentar con un
mechero Fisher o
en microondas
hasta disolver la
agarosa
Agregar el buffer
TAE 1X hasta cubrir
el gel.
Gel N 1: equipos 1 y 2:
N de carril
1.- Marcador PM
2.- Colonia 1 EcoRI
3.- Colonia 13 Xho I
4.-Colonia 14 EcoRI
5.-Colonia 2 EcoRI
6.- Colonia 21 XhoI
7.-Colonia 22 Eco RI
8.- Marcador PM
Cargar las
muestras de la
siguiente forma:
Gel N 1: equipos 3 y 4
N de carril
1.- Marcador PM
2.- Colonia 3 EcoRI
3.- Colonia 16 Xho I
4.-Colonia 17 EcoRI
5.-Colonia 4 EcoRI
6.- Colonia 23 XhoI
7.-Colonia 24 Eco RI
8.- Marcador PM
Pasado el tiempo de
corrida, extraer el gel de
la cmara de
electroforesis y
enjuagar con agua
destilada
Exponer el gel en un
transiluminador con el
fin de observar las
bandas obtenidas.
RESULTADOS:
Resiembra de colonias:
Se realiz un cultivo de las colonias
seleccionadas en 5ml de Lb lquido
con 50g/ml de Kanamicina. La
kanamicina es para evitar el
crecimiento
de
algn
microorganismo contaminante o
bacterias no transformadas. Todo
esto fue en medio estril para evitar
contaminacin.
Estas cepas se
utilizaron posteriormente para la
construccin molecular y realizar la
evaluacin del plsmido
Se recuper el botn de los cultivos celulares ya que estas son las clulas que
contienen el ADN plasmdico de inters y al concentrarlas es ms fcil recuperar este
AND. Se observan los botones con una coloracin negruzca, lo cual indica que pudieran
estas contaminadas nuestras cepas.
AGREGADO DE SOLUCIONES
Solucin I
Solucin II
Solucin III
n de
colonia
1
14
13
2
21
22
3
16
17
4
23
24
[ ] g/l
2041.1
2181.3
961.5
1286
465.6
1310.6
1746.9
2117.9
1580.7
2815.3
1779.5
1213.6
abs. 260
nm
40.823
43.626
19.229
25.721
9.313
26.213
34.938
42.358
31.614
66.307
35.589
25.473
abs. 280 nm
19.959
21.219
9.374
13.054
4.782
13.455
17.836
21.114
16.1
27.13
17.101
12.196
260/280
2.05
2.06
2.05
1.97
1.95
1.95
1.96
2.01
1.96
2.08
2.08
2.09
Optimo
(1.8-2)
NO
NO
NO
SI
SI
SI
SI
NO
SI
NO
NO
NO
260/230
2.38
2.37
2.35
2.35
2.28
2.4
2.4
2.28
2.34
2.33
2.36
2.34
Optimo
(0.3-0.6)
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
NO
GEL 1: EQUIPO 1 Y 2
Se observan los fragmentos del ADN plasmdico cortados con las enzimas de restriccin:
Kpn I para el extremo 5 y Xho 1 y EcoR I para el extremo 3. Se observa el vector
(pVAX1) por debajo de los 3000pb y el fragmento de ADN (EGFP) por debajo de 761pb.
GEL 2: EQUIPO 3 Y 4
Se observa una gran conglomerado, lo cual podra ser RNA, es decir que an hay impurezas en
nuestro ADN plasmdico debido a que no utilizamos la enzima RNAsa para poder llevar a cabo
la digestin de este. En el carril 4 se observa un banda en los por debajo de los 3000pb los cual
nos indica que podra tratarse del vector (pVAX I), tambin esta muestra puede haberse
degradado debido a que se muestra barrida esta muestra
DISCUSIN DE RESULTADOS:
CUESTIONARIO:
Fragmento numero 4
Tamao: 921 pb
Fragmento numero 1
Tamao:338 pb
Fragmento numero 3
Tamao: 1177 pb
pVax1-GFP
2820 pb
3761 pb
940 pb
Cdigo de colores
Fragmento 2:
Fragmento 3:
Fragmento 4:
Fragmento 1