Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol . 32, No . 1, 2001 .

Absorcin intestinal in vitro de una dispersin

slida de G1 : aplicacin del diseo experimental
Miguel Angel Cabrera Prez, Luis Amador Morales,* Osvaldo Norman Montenegro, Madaisy Cueto
i Snchez y Libia Eva Gonzlez Torres .
Centro de Bioactivos Qumicos, Universidad Central de Las Villas, Carretera a Camajuan km 5 11., Cdigo Postal 54830,
Santa Clara, Villa Clara, -Centro de Ensayos Clnicos . Instituto de Ciencias Mdicas de Villa Clara, Cuba .
Recibido : 18 de noviembre de 1999 .

Aceptado : 15 de mayo del 2000 .

Palabras clave, absorcin intestinal, sacos evertidos in vitro, tensoactivos, diseo experimental .
Key words : intestinal absorption, in vitro everted sacs, surfactans, experimental design .

RESUMEN . Para estudiar la absorcin intestinal in vitro del G1

(bactericida- fungicida) a partir de una dispersin slida en PEG 6000, en
segmentos intestinales de ratas, se evalu una tcnica analtica
espectrofotomtrica a travs de un diseo experimental factorial 2 . Los
experimentos para la optimizacin de la tcnica analtica se realizaron por
el mtodo descrito por Wilson y Wiseman . Dos factores fueron analizados,
tiempo de agitacin (Ta) y de centrifugacin (Tc), No se apreciaron diferencias
significativas en la absorbancia de Gl entre los dos Ta ensayados (2 y 5 min) . El
anlisis estadstico evidenci que los niveles ptimos fueron Ta = 5 y Te =
2 min . La recuperacin alcanzada con los valores de Ta y Te establecidos
fue de un 95 % . Con el empleo de la tcnica in vitro de sacos intestinales
evertidos, se evalu la absorcin del GI-PEG 6000 en estmago, duodeno,
yeyuno e leon, sin diferencias en la capacidad absortiva . Para estudiar la
influencia de tensoactivos en la absorcin, el Solutoi, Tween-60 y Tween-80
fueron ensayados en segmentos duodenales . La efectividad en cuanto al
coeficiente de permeabilidad aparente fue Tween-60 > Solutol > Tween-80 .
Finalmente, se evalu el Tween-60 en todo el tracto inrtestinal y se compar con los resultados obtenidos sin tensoactivo . No se encontraron diferencias significativas en la absorcin . Los valores del coeficiente de permeabilidad para el Gl en presencia y ausencia de tensoactivo fueron elevados . El
mecanismo de transporte del G1-PEG 6000 fue por difusin pasiva
transcelular.

ABSTRACT . In order to study the in vitro intestinal absorption of Gl (bacterial and fungi drug), in a solid dispersion (PEG 6000), in rat intestinal
segments, a spectrophotometric analytical technique through a 2 experimental design was evaluated . The experiments for the optimization of the
analytical technique were developed by a Wilson and Wiseman method . Two
factors were analyzed, shaking (Ta) and centrifugation times (Tc) . There
were remarkable differences in the absorbance of G1 between the two Ta
evaluated (2 and 5 min) . The statistical analysis showed that the best values were Ta = 5 and Tc = 2 min . The recuperation percentage result, with
the established Te and Ta values, was 95 % . Using in vitro everted intestinal sacs we evaluated the absorption of Gl-PEG 6000 in stomach, duodenum, jejunum and ileum, without remarkable differences among them . In
order to study the influence of surfactants in the absorption process Solutol,
Tween-60 and Tween-80 were studied in duodenal segments . The effectiveness orderwithregardstoapparentpermeabilitycoefficientsvaluesforGH
was Tween-60 > Solutol > Tween-80 . Finally, Tween-60 was evaluated in
the same intestinal tract and compared with the results obtained without
surfactant and there were not significative differences in the absorption .
The permeability coefficients with and without surfactants were high . The
transport mechanism of GI-PEG 6000 was by transcellular passive diffusion .

INTRODUCCION
El G1, 1-(5 bromofur-2-il)-2 bromo-2-nitroeteno, es un nitrovinilfurano con marcadas propiedades
bactericidas-fungicidas y sin potenciales riesgos genotxicos .' Su
escasa solubilidad acuosa y su velocidad de disolucin intrnseca estim
mada (14,34 mg/L), ha dado lugar a
la bsqueda
34 alternativas
/L)
lugar
gicas que mejoren su disolucin . En
este sentido, la obtencin de sistemas slidos dispersos en polietilenglicol 6000 (PEG 6000) ha brindado los mejores resultados .
Los modelos experimentales in
vitro, descriptivos de la absorcin in
vivo de frmacos, son valiosas herramientas en la estimacin del transporte biolgico de nuevas entidades
qumicas luego de su administracin
oral . ' Los sacos intestinales
evertidos de ratas es una de las tcnicas in vitro de particular utilidad
cuando la permeabilidad limita la
absorcin del frmaco o cuando la
absorcin limita la disponibilidad
sistmica del medicamento .'o, is.
Muchas veces la velocidad de disolucin de compuestos lipofilicos
pobremente solubles en agua, en los
fluidos del sitio de absorcin, es el
paso limitante en el proceso de absorcin . Los surfactantes pueden
influir en la absorcin de frmacos
liposolubles incrementando su
solubilidad aparente (como resultado de la solubilizacin micelar o por
reduccin del ngulo de contacto
entre el slido y el disolvente) y
con ello su velocidad de disolucin ." B

12

40

10- 2

14


Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol . 32, No . 1, 2001 .
Con el presente estudio nosotros
pretendemos inicialmente optimizar
una tcnica analtica espectrofotomtrica para su aplicacin en ensayos de absorcin intestinal in vitro
de una dispersin slida de G1 en
PEG 6000 y posteriormente, evaluar
la absorcin de este producto en varios segmentos del tracto gastrointestinal de la rata, as como la influencia de tres tensoactivos en el
proceso de absorcin intestinal .
MATERIALES Y METODOS
La dispersin slida de G1 al 30 %
en PEG 6000 (Fluka, Suiza) se prepar segn el mtodo de fusin? Con
vistas a la determinacin cuantitativa del G1 en las muestras intestinales, se desarroll una tcnica
espectrofotomtrica UV-VIS . Para
ello se realiz una curva de calibracin (n = 4) de G1 en n-hexano (BDH)
en el intervalo de 0,05 a 0,9 mg/mL,
y se midi la absorbancia del G1 en
un espectrofotmetro UVVIS (Ultraespec III, Pharmacia, LKB, Suecia)
a 360 nm .
Animales
En todos los ensayos in vitro se
utilizaron ratas Sprague-Dawley macho con un peso entre 350 y 370 g .
Las ratas se adaptaron durante una
semana alas condiciones del laboratorio, con temperaturas de (22 2) C
y una humedad de (75 5) % . En la
alimentacin se utiliz pienso estndar para ratas (Centro Nacional de
Produccin de Animales para el Laboratorio) . Durante este perodo los
animales tuvieron acceso al agua y
comida ad libitum . La alimentacin
fue retirada 18 h antes de comenzar
los ensayos .
Optimizacin de la tcnica espectrofotomtrica
Para el establecimiento de la tcnica analtica se desarroll un diseo experimental 22 considerndose
dos factores fundamentales, tiempo
de agitacin (Ta) y de centrifugacin
(Ib) en el intervalo de 2 y 5 min . Todos los factores se estudiaron a dos
niveles (etiquetados con los signos
- y +) y se realizaron tres rplicas
para obtener la estimacin de los
efectos simples y de la interaccin
doble .
Los experimentos para la optimizacin de la tcnica analtica se realizaron en tres ratas utilizando el
mtodo descrito por Wilson y
Wiseman . 19 Los animales fueron
anestesiados con ter dietlico

(AnalaR, BDH) . Posteriormente, se
les realiz una incisin abdominal .
1 0

El duodeno fue identificado, aislado,

lavado con disolucin Ringer Krebs
(pH = 7,4) y removido rpidamente .
Se dividi en tres partes que se mantuvieron inmersas en la disolucin
reguladora . Las fracciones fueron
evertidas con la ayuda de un aplicados Uno de los extremos de la fraccin de duodeno fue atado con hilo
de seda para formar un saco . Se introdujeron 0,5 mL de disolucin
Ringer en los sacos evertidos y se
cerraron . Los sacos llenos fueron
inmersos en recipientes de prueba
con 30 mL de una disolucin de dispersin (120 g/mL de Gl, en disolucin Ringer oxigenada, 5 % de CO . 95 % Oz) . El recipiente se coloc en
un bao provisto de termostato que
se mantuvo a (37 1) C . A los 30 min
toda la disolucin se colect del interior de los sacos . A las disoluciones serosales se les aadieron 0,5 mL
de n-hexano, se agitaron y centrifugaron a 3 000 r/min (tiempos seleccionados segn diseo) . Los sacos se
lavaron y se realiz nuevamente la
extraccin . Ambos sobrenadantes se
analizaron en el espectrofotmetro
UV-VIS a 360 nm .
Los resultados obtenidos para
los dos factores estudiados (Ta y Tc)
se analizaron mediante una prueba
ANOVA E Se realiz un anlisis de
contrastes mediante el establecimiento de los intervalos LSD (Least
Significative Difference) a travs del
paquete informtico estadstico
STATGRAPHICS PLUS para Windows V 2 .1 y un anlisis de residuos
y de efectos sobre la dispersin, utilizando los modelos propuestos por
Harvey."Con los tiempos de agitacin y centrifugacin ptimos se
determin el porcentaje de recuperacin de la tcnica analtica .
Determinacin del G1 en segmentosintestinales
Se prepararon sacos evertidos de
estmago, duodeno (seguido del ploro), yeyuno (5 cm despus del ligamento de Treitz) e leon (cerca del
orificio cecal) de cuatro ratas segn
la tcnica descrita anteriormente. La
disolucin serosal fue de 0,5 mL del
regulador salino para los tres segmentos intestinales y 1,5 mL para el
estmago . Las muestras en el sitio
serosal se colectaron cada 15 min durante una hora . El coeficiente de per
meabilidad aparente (Papp) para el
G1 en las diferentes condiciones experimentales fue calculado segn la
ecuacin siguiente : 13
Papp=

~dc
dt )

V
(Co A)

donde :
dC/dt cambio de concentracin por
unidad de tiempo (g/mL . s) .
V volumen del fluido serosal (mL) .
Co concentracin inicial de frmaco en el sitio mucosal (g/mL) .
A rea superficial de la membrana
intestinal (cm2 ) .
En los estudios para evaluar la
influencia de tensoactivos en la absorcin intestinal del G1 a partir de
su dispersin slida en PEG 6000 se
ensayaron el Solutol, Toreen 60 y
ltveen 80 . Para ello, se pesaron 4,3 mg
de Gl-PEG 6000, se humectaron con
300 mg de tensoactivo y se disolvi
en 100 mL del regulador salino . El
experimento se realiz en tres porciones de duodeno por rata (n = 3),
siguiendo el procedimiento citado
con anterioridad, y se calcul el
Papp . Luego se evalu la influencia
del lixeen 60 en la absorcin del Gi
disperso en PEG 6000 en las diferentes porciones del tracto gastrointestinal de cuatro ratas y se determin
el Papp .
Por ltimo, en un intento por esclarecer el mecanismo de transporte del Gl, se estudiaron las diferencias direccionales de la velocidad de
transferencia en segmentos duodenales del intestino de ratas (n = 3) . Una
vez extrado el duodeno se dividi en
tres fracciones, dos segmentos
evertidos y uno normal . Uno de los
sacos evertidos y el normal se colocaron en una disolucin salina con
la dispersin slida de GI (120 g/
mL) y se determin la concentracin
serosal y mucosal (interior del saco)
respectivamente . El otro saco evertido se coloc por 10 min en una disolucin de 10 mmol KCN, para envenenar los transportadores," y luego,
se continu con el mismo procedimiento de eversin y se calcul el
Papp para las diferentes condiciones experimentales, corrigiendo
los datos de concentracin de G1
sobre la base del factor de recuperacin .
El anlisis estadstico de los
datos se realiz por la prueba t de
Student a travs del programa
SPSS para Windows 95 y se consideraron diferencias significativas
cuando p < 0,05 .
RESULTADOS Y DISCUSION
Determinacin cuantitativa de G1
por Espectrofotornetra UV-VIS
La ecuacin de la curva de calibracin de la forma y = a + bx se
describe por a = 2,439 10 5 y b =
0,064 0 . El intercepto no difiere significativamente de cero . Los parametros de linealidad calculados para

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la curva de calibracin G1 en nhexano (Fig . 1) cumplen con los criterios de aceptacin establecidos (coeficiente de determinacin r 2 = 0,995 9,
desviacin estndar relativa de la
pendiente Sb = 0,97 % < 2 % y coeficiente de variacin de los factores de
respuesta CVf = 4,74 % < 5 %), pudiendo concluirse que la tcnica
espectrofotomtrica para la determinacin de G1 en estudios de absorcin intestinal y mecanismo de
transporte es lineal para los intervalos de concentraciones establecidos .
La tabla 1 muestra el diseo experimental utilizado (cuatro experiencias posibles : Ta = 2 y Te = 2 ;
Ta=5yPb=2 ; Ta =2yTc=5 ; Ta =5
y Te = 5, etiquetados el menor valor
como -1 y el mayor como 1), as como
los resultados observados en los
doce ensayos (rplicas) . Los tiempos
de agitacin y centrifugacin seleccionados fueron 2 y 5 min, pues a
tiempos superiores a los 5 min, no
se observaron variaciones significativas en la absorbancia (estudios preliminares) .
Segn los resultados de la prueba ANOVA F (verificando efectos
sobre la media) (Tabla 2), se observ
que el factor tiempo de agitacin
tuvo un efecto significativo sobre la
media de la absorbancia . Se corrobor que a mayor tiempo de agitacin mayor valor de absorbancia
(Fig . 2) . El tiempo de centrifugacin
no present un efecto significativo,
lo cual permiti considerar cualquiera de sus dos niveles . En la tabla 2 se
observa que la interaccin no es significativa .
En los resultados de la prueba
ANOVA F (verificando efectos sobre
la dispersin) no se not ningn
efecto simple significativo, aunque
s se observ que la interaccin entre los factores era significativa (Tabla 3) . Se observ que la combinacin tiempo de agitacin a nivel (+)
y tiempo de centrifugacin a nivel
(-) produce una reduccin sensible
en la varianza de la variable absorbancia (Fig . 3) .
De forma general, se constat
que los niveles ptimos de los factores son tiempo de agitacin (nivel +)
y tiempo de centrifugacin (nivel -),
ya que a estos niveles la media no se
afectaba y la varianza disminua sensiblemente . En el anlisis de los residuos de los modelos no se observ
la presencia de algn dato anmalo .
El anlisis del porcentaje de recuperacin, obtenido con los Ta y Tc establecidos, mostr un valor de (95,09
93) % .

.
Absorban

0 .8
Concentracin (p9/ml)

Fig. 1 . Curva de calibracin de Gl en n-hexano en el intervalo de concentracin de

0,05 a 0,9 mg/mL .

Tabla 1 . Valores de absorbancia obtenidos en el diseo factorial 2 2 .

Parmetros
Absorbancia (Rplicas)
3
Ta
Tic
1
2
Media DE
-1
-1
0,033
0,022
0,037
0,031 0,008
1

-1

0,034

0,033

0,036

0,034 ! 0,002

-1

0,030

0,021

0,031

0,027 0,005

0,039

0,044

0,057

0,047 x 0,009

Tabla 2 . Anlisis del efecto sobre la media de la absorcin (Prueba ANOVA F) .

P
Erente
Suma
Grados
Cuadrado Relacin-F
de variacin de cuadrados de libertad
medio
Efectos
5,102
0,037 3
principales
4,575 10 1
2
2,287 10 4
Ta
3,967 10'
1
3,967 10 4
8,849
0,017 7
Tc

Factor
de interaccin
Ta - Tc
Error
experimental
TOTAL

6,07510'

6,075 . 10a

1,355

0,277 9

1,841 10 4

1
1

1,841
1,841

4,108
4,106

0,077 3

1,841 10'
3,587 10 4

4,483 10"

0,001

11

10'
10 4

0,077 3

Absorbancia ( 10-')
48

40

36
32
28
24
1

Fig. 2. Intervalos LSD para el factor

sobre ta media, en la absorbancia ,

tiempo de agitacin en

Determinacin de G1 en segmentos
intestinales
Se observ una gran variabilidad
en el coeficiente de permeabilidad
para el Gl, en ausencia de tensoactivo, para cada segmento intestinal
(Tabla 4), la cual pudiera estar dada
por los bajos valores de concentracin del G1 alcanzados luego de su

Ta

et

anlisis

de

los efectos

paso a travs del tejido intestinal

y a la tcnica de medicin utilizada, aunque se apreci una gran variabilidad en estos tipos de estudio . Del anlisis comparativo de
los valores de Papp para cada segmento del tracto utilizado (estmago, duodeno, yeyuno e leon) no se
obtuvieron diferencias significati-


Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol . 32, No . 1, 2001 .
Tabla 3 . Anlisis del efecto sobre la dispersin de la absorcin (Prueba ANOVA F) .
ELente
de variacin
Efectos
principales
Ta

Suma
Grados
de cuadrados de libertad

Te
Factor
de interaccin
Ta -Tc
Error
experimental
TOTAL

Cuadrado
medio

Relacin-F

1,126
0,861

2,940
2,250

0,110 3
0,172 0

2,253
0,861

1,391

1,391

3,631

0,093 2

2,383
2,383

6,221
6,221

0,037 3

2,383
2,383

3,064
7,70

0,383

11

0,037 3

Log r'
-3 .7
-4 .1
.4 .7
-5 .2
-5 .7
-6 .1
-6 .7
Ta
TI'.

Fig . 3. Internados LSD para la interaccin entre Los factores tiempo de agitacin y de
centrifngacti(5n, en el anlisis de los efectos sobre la dispersin, en la absorbancia

Tabla 4 . Valores del coeficiente de permeabilidad aparente (Papp) en diferentes regiones intestinales de ratas
con y sin tensoactivo .
Regin

Papp
010 1 cm/s)
Sin
Con
tensoactivo tensoactivo
(Tween-60)

Estmago

1,87 = 1,12

2,01 = 0,77

Duodeno

2,38 = 1,79

1,69 0,48

Yeyuno

2,24 2,10

0,57 0,30

Ileon

1,96 z 1,31

0,98 0,25

Los resultados son expresados como la

Media DE de cuatro experimentos .

Tabla 6 . Transporte de la dispersin

slida de G1 en PEG 6000 a travs de
sacos intestinales evertrdos de duodeno, bajo diferentes condiciones experimentales .
Condiciones
experimentales
Control (evertido)

Papp
( 10' cm/s)
2,66 2,18

No evertido-

3,09 x 2,01

Evertido (KCN) 6

1,19 = 0,08

Transporte serosal a mucosal , b Superficie mucosal del saco pie-tratada con

KCN por 10 min . Los resultados son expresados como la Media - DE de tres
experimentos .

12

Tabla 5 . Valores del coeficiente de permeabilidad aparente del Gl-PEG 6000

en duodeno de ratas, en presencia de
tensoactivos .
Tensoactivo
Solutol

Papp
10 4 cm/s)
0,86 0,23

TWeen-60

1,69 0,48

TWeen-80

0,63 0,03

Los resultados son expresados como la

Media DE de tres experimentos .

vas, lo que es indicativo de que el

transporte del G1 ocurre con la misma intensidad a travs de cada porcin .
Aunque la antomo-fisiologa del
estmago y el intestino delgado difieren, por ser el primero un rgano
donde las paredes no estn especializadas para la absorcin y poseer el
segundo vellosidades intestinales
que favorecen el contacto del G1 con
la mucosa, la similitud del Papp del
frmaco entre ambos pudiera atribuirse a la considerable lipofilidad
del Gl . Adems para frmacos que
sean cidos dbiles (como el Gl) la
forma no ionizada de la molcula
debe verse favorecida bajo las condiciones estomacales (pH = 1,2 a 3),
las cuales incrementan la absorcin
del frmaco .

Para evaluar la influencia de tensoactivos en la absorcin del G1 . en

duodeno de ratas, se utiliz el
Solutol, el T\veen-60 y el Tuteen-80 .
Al procesar estadsticamente los
resultados del coeficiente de permeabilidad aparente se obtuvieron
diferencias medianamente significativas entre Solutol-Tween-60 (p =
0,054) y Tuteen-80-Tuteen-60 (p =
0,058) (Tabla 5) . Estos resultados llevaron a seleccionar el Tuteen-60, debido a que su coeficiente de permeabilidad aparente era superior, lo
que aportaba el criterio de una mayor influencia en el proceso de absorcin .
En relacin con los resultados
sobre la influencia del Tuteen-60 en
la absorcin intestinal del G1 disperso en PEG 6000 (Tabla 4) los coeficientes de permeabilidad aparente
resultaron similares en todos los segmentos analizados del tracto gastrointestinal, en comparacin con los
de los segmentos del tracto sin
tensoactivo . La comparacin entre
ambos grupos no mostr diferencias
significativas .
De estos resultados se pudo inferir que la similitud entre los valores del Papp pudiera estar relacionado con la cantidad de tensoactivo
utilizado en la humectacin de la
dispersin . slida (concentracin
supramicelar) .
El efecto de los tensoactivos sobre la polaridad de la membrana
debe ser visto como un fenmeno
gradual o progresivo, que se incrementa en la medida que la concentracin luminal del tensoactivo aumenta, independientemente de su
naturaleza, sus caractersticas y su
concentracin micelar crtica . Se ha
demostrado que el efecto del
tensoactivo sobre la polaridad de la
membrana, se debe a su accin directa sobre la barrera lipoidal, por lo
que es razonable asumir que la permeabilidad de compuestos muy
lipfilos (G1), a travs de la bicapa
lipdica, se ve disminuida a medida
que el tensoactivo se incrementa en
el medio, siendo esto mucho ms
marcado aconcentracionessupramicelares .
Se pudo apreciar, a travs del valor de Papp, que para las diferentes
condiciones establecidas en la determinacin del mecanismo de transporte, el G1 parece atravesar la membrana intestinal del duodeno con relativa facilidad (Tabla 6) . Los Papp
obtenidos fueron elevados, tpicos
de principios activos fcilmente
absorbibles," aunque presentaron
gran variabilidad, principalmente, el

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control evertido y el duodeno no
evertido . El coeficiente de permeabilidad para el control y el segmento
evertido sometido a un tratamiento
previo con KCN, con el objetivo de
envenenar los transportadores de
membrana, fue similar y no significativo desde el punto de vista estadstico . Los resultados anteriores
permiten inferir que no existen diferencias direccionales en el transporte de Gl a travs de la membrana lipdica y que este proceso ocurre fundamentalmente por difusin
pasiva transcelular.
CONCLUSIONES
Se comprob que la tcnica espectrofotomtrica para la determinacin de Gl en estudios de absorcin
intestinal y mecanismo de transporte es lineal para los intervalos de concentracin establecidos . El coeficiente de permeabilidad del G1 resulta elevado (10 4 cm/s), lo cual es
propio de frmacos liposolubles bien
absorbidos . Adems, la presencia de
un tensoactivo a concentraciones
supramicelares no incrementa el
coeficiente de permeabilidad . El mecanismo de absorcin es por difusin
pasiva transcelular.
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