706563

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
LUCIANA MOREIRA MARAMALDO COSTA
ESTUDO DO PERFIL ANTIAGREGANTE PLAQUETRIO DE UMA

NOVA SRIE DE DERIVADOS N-ACILIDRAZNICOS OTIMIZADOS A
PARTIR DO PROTTIPO LASSBio-129
RIO DE JANEIRO
2008
ii
Luciana Moreira Maramaldo Costa

Dissertao de Mestrado apresentada ao

Programa de Ps-Graduao em Cincias
Farmacuticas, Faculdade de Farmcia,
Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como requisito parcial obteno do ttulo de
Mestre em Cincias Farmacuticas.
Orientador: Prof Dr Ana Lusa Palhares de Miranda
Rio de Janeiro
2008
iii
Luciana Moreira Maramaldo Costa

Dissertao de Mestrado apresentada ao

Programa de Ps-Graduao em Cincias
Farmacuticas, Faculdade de Farmcia,
Universidade Federal do Rio de Janeiro,
como requisito parcial obteno do ttulo de
Mestre em Cincias Farmacuticas.
Aprovada em:
_______________________________________________________
(Ana Lusa Palhares de Miranda, Faculdade de Farmcia, UFRJ)
_______________________________________________________
(Fernanda Carla Ferreira de Brito, Instituto Biomdico, UFF)
_______________________________________________________
(Andr Lopes Fuly, Instituto de Biologia, UFF)
_______________________________________________________
(Suzana Guimares Leito, Faculdade de Farmcia, UFRJ)
iv
FICHA CATALOGRFICA
Costa, Luciana Moreira Maramaldo.

Estudo do Perfil Antiagregante Plaquetrio de uma
Nova Srie de Derivados N-Acilidraznicos Otimizados a
partir do Derivado LASSBio-129 / Luciana Moreira
Maramaldo Costa. Rio de Janeiro: Faculdade de
Farmcia/ UFRJ, 2008.
xvi, p., il., tab.
Dissertao (Mestrado) Universidade Federal do Rio de
Janeiro, Faculdade de Farmcia, Programa de PsGraduao em Cincias Farmacuticas, Rio de Janeiro,
2008.
Orientador: Ana Lusa Palhares de Miranda
1. Agregao plaquetria
Desagregao plaquetria
2. Antiplaquetrios
I. Ttulo.
3.
Este trabalho foi realizado no Laboratrio de Avaliao e Sntese de

Substncias Bioativas (LASSBio) Faculdade de Farmcia UFRJ, sob a
orientao da professora Dr. Ana Lusa Palhares de Miranda.
vi
O pessimista se queixa do vento; o

otimista espera que ele mude; o realista
ajusta as velas do barco.
William George Ward
vii
minha av, companheira e amiga, Leopoldina

Sampaio Moreira, por seu exemplo de vida e
obstinao e por seu amor incondicional. Por ter
sido porto seguro durante toda minha vida
acadmica.
Essa
conquista
tambm
sua.
viii
AGRADECIMENTOS
professora Dr Ana Lusa Palhares de Miranda, pela amizade e confiana. Por

me trazer de volta s atividades acadmicas.
Aos professores Dr. Eliezer J. Barreiro, Dr. Carlos Alberto Manssour Fraga e Dr
Ldia M. Lima, pelo acolhimento, pelas discusses e valiosas contribuies a este
trabalho.
Aos professores Dr Nelilma Romeiro e Dr. Carlos Maurcio Santanna, pelo

incentivo e pelas contribuies a este trabalho.
Ao professor Dr. Marcelo de Pdula, membro da Comisso de Acompanhamento,

pela ateno e contribuies a este trabalho.
banca examinadora, por aceitarem o convite e pelas contribuies que faro a

este trabalho.
Me. Ana Paula Cunha Rodrigues, que sintetizou os compostos objetos de

estudo deste trabalho, por ter me confiado a avaliao farmacolgica desses.
Aos amigos Bruna Lima, Cleverton Kleiton (KC) e Leandro Louback, pelo apoio
fundamental na parte metodolgica, pelas discusses e pelo auxlio nas anlises
estatsticas; e acima de tudo, pelo carinho e amizade.
Aos amigos Ewerton (Eiton), Dudu, Daniel Ig, Marina Martins, Paula, Milla, Thas
e Thiago, pelo auxlio nas atividades do laboratrio. Por tornarem a rotina mais
simples e alegre.
Aos
amigos
doutores
Jorge,
Fernanda,
Josiane
Joslia,
brilhantes
farmacologistas, pelo exemplo de dedicao e obstinao.
Aos amigos Mes. Cludia Ormelli, Kelly Cristine e Paulo Henrique, pelo ensino
das metodologias do laboratrio, por todo apoio e pacincia durante a iniciao
cientfica.
ix
Aos amigos do LASSBio: Alexandra Lopes, Aline Guerra, Andria, Ariane, Arthur
Kmmerle, Carla, Carolina vila, Carolina Duarte, verton Dandrea, Fabrcio,
Fernando Rodrigues, Guilherme Barroso, Maria Letcia, Marina Amaral, Nailton,
Raquel Lopes, Renata Lacerda, Rodolfo Maia, Thase Martins e Uros Laban, pelo
incentivo, apoio nas discusses SAR, pela convivncia harmoniosa.
Prof Carla Hollandino e s suas alunas Gleice, Vnia Buco, Camilla Siqueira e
Luciana, pela disponibilidade e auxlio nas dvidas.
Aos meus irmos e fs, Tatiana e Thadeu, pela amizade, por me apoiarem e
incentivarem sempre; e aos meus pais, Jos Estevam e Luci Moreira, que
sempre me incentivaram ao estudo.
A Alan Dias, companheiro e amigo, por estar sempre ao meu lado, por seu amor
e dedicao.
amiga Aline Dias, pelo incentivo e auxlio na formatao do texto.
Aos rgos de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento (CNPq - Proc.

CNPq 420015/05-1), Programa de Ncleos de Excelncia (PRONEX) e
Fundao de Apoio Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ - Proc.
FAPERJ 171.532/2006)
A todos os voluntrios que doaram sangue para execuo dos ensaios de

agregao plaquetria.
RESUMO
Os eventos isqumicos cardiovasculares representam a principal causa de

morte e invalidez em todo o mundo. Nesse sentido, a agregao plaquetria um
dos principais eventos envolvidos nos acidentes agudos isqumicos. Por outro lado,
os agentes antiplaquetrios disponveis no mercado tm eficcia insatisfatria, o que
evidencia a importncia da identificao de novos prottipos para a terapia
antiplaquetria.
Inserido em um grupo de pesquisas que trabalha no planejamento,
desenvolvimento e avaliao farmacolgica de substncias inditas candidatas a
prottipos de frmacos, o presente trabalho descreve o estudo das atividades
antiagregantes e desagregantes plaquetrias de uma srie de novos compostos
planejados a partir da modificao estrutural do prottipo LASSBio-129, um
antiagregante plaquetrio anteriormente desenvolvido no Laboratrio de Avaliao e
Sntese de Substncias Bioativas (LASSBio). Foi realizado o estudo da atividade
antiagregante plaquetria de 15 novos compostos N-acilidraznicos em plasma rico
em plaqueta de coelhos frente aos diferentes agonistas da agregao plaquetria.
Os compostos mais ativos foram submetidos a estudos de potncia, atravs dos
quais foram identificados compostos com atividade otimizada, destacando-se
LASSBio-1215, que apresentou valores de CI50 na agregao induzida por colgeno
e cido araquidnico na ordem de 4,5 M e 0,7 M, respectivamente. O composto
LASSBio-1215 foi capaz de inibir a agregao plaquetria induzida por colgeno e
ADP em plaquetas humanas. Sua ao sobre o metabolismo do cido araquidnico
(AA) foi confirmada atravs da inibio da formao TXA2, principal metablito do AA
nas plaquetas.
xi
O composto LASSBio-1215 foi capaz de desfazer os agregados plaquetrios

formados em plaquetas de coelho estimuladas por diversos agonistas e em
plaquetas humanas estimuladas por ADP, caracterizando seu perfil desagregante
plaquetrio. Estudos qualitativos sobre o envolvimento de nucleotdeos cclicos na
reverso da agregao plaquetria foram conduzidos e mostraram que as aes
antiagregante e desagregante plaquetrias exibidas por esse composto envolvem a
regulao dos nveis intraplaquetrios do GMPc.
Palavras-chave: plaqueta, N-acilidrazonas, antiagregante plaquetrio, desagregante

plaquetrio, LASSBio-1215.
xii
ABSTRACT
Ischemic cardiovascular events represent the leading cause of mortality and

morbidity worldwide, and platelet aggregation and thrombus formation are the main
effectors of acute arterial ischemic events. Although antiplatelet therapy is the
cornerstone of antithrombotic treatment of ischemic cardiovascular disorders,
available antiplatelet agents have less than satisfactory efficacy; thus, the
identification of novel potential target candidates for antiplatelet therapy shoud be
highly pursued.
In the scope of a research group that aims the planning, development and
parmacological evaluation of new drug leads, this work describes the evaluation of
the anti-aggregating properties of a new series of compounds developed as
structural modification of the lead compound LASSBio-129, previously described as a
potent anti-aggregating agent.
Antiplatelet profile of 15 new componds was monitored in rabbit platelet rich
plasma induced by several agonists. Potency of the most active compounds was
determined and identified those with optimized antiplatelet activity.
LASSBio-1215 exhibited the best performance, with IC50 values of 4,5 M in
the aggregation assay induced by collagen and 0,7 M in the assay induced by
aracdonic acid. This compound was able to inhibit platelet aggregation induce by
collagen and ADP in human platelets. Its activity on the aracdonic acid cascade was
confirmed by its ability to inhibit the production of aracdonic acids main metabolite in
platelet, TXA2.
xiii
LASSBio-1215 was also able to revert platelet aggregation in rabbit PRP

induced by several agonists and in human PRP induced by ADP, which
characterized
its
disaggregating
profile.
Qualitative
studies
concerning
the
involvement of cyclic nucleotides in the reversion of platelet aggregation were carried

out and showed that anti-aggregating and disaggregating properties involve
regulation of GMPc intracellular levels.
Keywords: platelet, N-acylhydrazones, antiplatelet, aggregation, disaggregation,

LASSBio 1215.
xiv
SUMRIO
INTRODUO .....................................................................................................1
1.1
A PLAQUETA ...............................................................................................2
1.1.1
Morfologia Plaquetria ...........................................................................2
1.1.2
Funo Plaquetria e Vias de Sinalizao Celular ................................5
1.2
1.1.2.1
Via dos Fosfolipdeos de Inositol ....................................................6
1.1.2.2
Metabolismo do cido Araquidnico (AA) ......................................7
1.1.2.3
on clcio (Ca2+)..............................................................................8
1.1.2.4
Nucleotdeos Cclicos .....................................................................9
AGONISTAS DA AGREGAO PLAQUETRIA .......................................10
1.2.1
Colgeno .............................................................................................10
1.2.2
Difosfato de Adenosina (ADP) .............................................................11
1.2.3
Fator de Ativao Plaquetria (PAF) ...................................................12
1.2.4
Trombina..............................................................................................12
1.3
FISIOPATOLOGIA PLAQUETRIA ............................................................13
1.3.1
Trombose.............................................................................................16
1.4
TERAPIAS ANTIPLAQUETRIAS..............................................................19
1.5
JUSTIFICATIVA ..........................................................................................22
OBJETIVOS .......................................................................................................26
MATERIAL E MTODOS...................................................................................27
3.1
SUBSTNCIAS, REAGENTES E SOLVENTES .........................................27
3.2
SOLUES ................................................................................................28
3.3
MONITORIZAO DA AGREGAO PLAQUETRIA..............................31
3.3.1
Mtodo turbidimtrico ..........................................................................31
3.3.2
Amostras de sangue ............................................................................32
3.3.3
Obteno do PRP e do PPP................................................................33
3.3.4
Agonistas da Agregao......................................................................33
3.3.5
Contagem de Plaquetas ......................................................................34
3.3.6
Estudo da agregao plaquetria em plaqueta lavada ........................34
3.3.7
Estudo indireto da atividade inibidora de fosfodiesterases em plaqueta
humana lavada...................................................................................................35
xv
3.3.8
Estudo do efeito da inibio da guanilato ciclase estimulada por NO na
agregao plaquetria em PRP citratado de coelhos e humano .......................35

3.3.9
Estudo do efeito da inibio da adenilato ciclase na agregao
plaquetria em PRP citratado de coelhos e humano .........................................36

3.3.10
Estudo do efeito da inibio de PKA na agregao plaquetria em PRP
de coelhos e humano .........................................................................................36
3.3.11
Estudo da agregao plaquetria em sangue humano total................36
3.3.12
Estudo da secreo plaquetria atravs da medida da luminescncia37
3.4
DOSAGEM DE TXB2 EM SANGUE HUMANO ...........................................37
3.5
ANLISE ESTATSTICA.............................................................................38
RESULTADOS E DISCUSSO .........................................................................39

4.1
ESTUDO DE TRIAGEM DA ATIVIDADE ANTIAGREGANTE
PLAQUETRIA DOS NOVOS DERIVADOS N-ACILIDRAZNICOS ANLOGOS

AO LASSBio-129 ...................................................................................................39
4.1.1
Avaliao dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria
(AP) induzida por AA (200 M) em PRP citratado de coelhos ...........................39

4.1.2
induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP citratado de coelhos..........................39

4.1.3
induzida por ADP (5 M) em PRP citratado de coelhos.....................................42

4.1.4
induzida por U46619 (3 M) em PRP citratado de coelhos ...............................42

4.1.5
Avaliao dos derivados N-Acilidraznicos na agregao plaquetria
induzida por PAF (1 M) em PRP citratado de coelho.......................................42

4.1.6
Avaliao dos derivados N-Acilidraznicos na agregao plaquetria
induzida por trombina (0,5 UI/ml) em plaqueta de coelho lavada ......................45

4.2
ESTUDOS DE POTNCIA .........................................................................47
4.2.1
Determinao da potncia dos derivados N-acilidraznicos na
agregao plaquetria induzida por AA (200 M) em PRP citratado de

coelhos...............................................................................................................47
4.2.2
Determinao da potncia dos compostos N-acilidraznicos na
agregao plaquetria induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP citratado de

coelhos................................................................................................................51
xvi
4.3
ESTUDO DA RELAO ESTRUTURA x ATIVIDADE DOS DERIVADOS N-
ACILIDRAZNICOS..............................................................................................54
4.4
ESTUDO DA AO DOS COMPOSTOS N-ACILIDRAZNICOS EM
PLAQUETAS HUMANAS ......................................................................................59

4.4.1
Efeito dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria
induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP humano citratado ..............................59

4.4.2
Efeito dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria
induzida por ADP (3 M) em PRP humano citratado .........................................60

4.4.3
4.5
Avaliao dos derivados N-acilidraznicos em sangue humano total..62
ESTUDO DO MECANISMO DE AO DOS COMPOSTOS N-
ACILIDRAZNICOS..............................................................................................63
4.5.1
Efeito dos derivados N-acilidraznicos na formao de TXB2 .............63
4.5.2
Estudo de Secreo Plaquetria atravs da medida de luminescncia

..............................................................................................................64
4.6
ATIVIDADE DESAGREGANTE PLAQUETRIA DOS COMPOSTOS N-
ACILIDRAZNICOS..............................................................................................65
4.6.1
Reverso da agregao plaquetria e desagregao em PRP de
coelho.................................................................................................................65
4.6.2
Efeito desagregante em PRP humano.................................................68
4.6.3
Estudo do efeito de LASSBio-1215 no balano de nucleotdeos cclicos

..............................................................................................................72
4.6.3.1
Efeito da dideoxiadenosina (DDA) [100 M] na inibio da
agregao plaquetria promovida por LASSBio-1215 (100 M) na AP induzida

por induzida por colgeno 5 g/ml em PRP citratado de coelho. ...................72
4.6.3.2
Efeito do KT-5720 (5 M) na inibio da agregao plaquetria
induzida por colgeno 5 g/ml promovida por LASSBio-1215 (100 M) em

PRP citratado de coelho e humano. ...............................................................73
4.6.3.3
Avaliao do efeito do ODQ (10 M) na inibio da agregao
plaquetria promovida por LASSBio-1215 (100 M) na AP induzida por

colgeno 5 g/ml em PRP citratado de coelho e humano.............................74
4.6.3.4
Avaliao indireta da atividade inibidora de fosfodiesterases em
plaqueta humana lavada ................................................................................76
xvii
4.6.3.5
Efeito de LASSBio-1215 na presena de zaprinast na agregao
plaquetria induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP humano citratado........79

5
CONCLUSES ..................................................................................................81
PERSPECTIVAS................................................................................................82
REFERNCIAS..................................................................................................83
xviii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Ocluso de artria por formao do trombo plaquetrio. ..............................1

Figura 2 A- Megacaricito: clula poliplide e extenses pr-plaquetrias; B e C:
plaqueta e seu contedo citoplasmtico. ....................................................................3
Figura 3 Formao de TXA2 a partir do metabolismo do cido araquidnico e seus
mecanismos de sinalizao intracelular. .....................................................................8
Figura 4 Modulao de PDE3 e PDE2 por GMPc ....................................................10
Figura 5 Micrografia eletrnica da plaqueta em seu formato discide (A), ativada e
aderida (B), aps a secreo do contedo granular (C)............................................14
Figura 6 Formao do trombo plaquetrio e hemostasia. ........................................15
Figura 7 Ativao plaquetria mediada por colgeno e fator de von Willebrand:
captura, adeso e liberao de mediadores..............................................................17
Figura 8 A. Principais agonistas da agregao plaquetria e seus respectivos
receptores. B. Interao plaqueta-plaqueta atravs da formao de pontes cruzadas
mediadas pelo fibrinognio ligado s integrinas IIb3 de plaquetas adjacentes.......18
Figura 9 Principais terapias antiplaquetrias e seus alvos na plaqueta. ..................21
Figura 10 Perfil farmacolgico dos compostos N-acilidraznicos e seus derivados Nmetilados. ..................................................................................................................23
Figura 11 Modificao estrutural de LASSBio-129 atravs das estratgias de
hibridao, simplificao molecular, restrio conformacional e bioisosterismo .......24
Figura 12 Srie vinloga e seus respectivos compostos N-metilados........................25
Figura 13 Srie metileno aminas cclicas .................................................................25
Figura 14 Registro do aumento da transmitncia de luz pelo mtodo turbidimtrico32
Figura 15 Curvas concentrao X efeito (% inibio agregao plaquetria) dos
derivados LASSBio-129, LASSBio-1003, LASSBio-1215 e LASSBio-1220 na
agregao plaquetria induzida por AA (200 M) em PRP de coelho ......................48
derivados LASSBio-129, LASSBio-1222 e LASSBio-1223 na agregao plaquetria
induzida por AA (200 M) em PRP de coelho...........................................................49
agregao plaquetria induzida por AA (200 M) em PRP de coelho ......................50
xix

agregao plaquetria induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP de coelho.............52
agregao plaquetria induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP de coelho.............53
Figura 20 Compostos de potncia elevada - potncias entre 0,7 M e 8 M...........54
Figura 21 Compostos de potncia moderada: potncias entre 23 M e 47 M .......55
Figura 22 Reverso da AP promovida por LASSBio-1215 (100 M) comparada
LASSBio-1003 frente ao ADP em PRP de coelhos...................................................55
Figura 23 Reverso da AP promovida por LASSBio-1215 (100 M) comparada
LASSBio-1220 frente ao U46619 em PRP de coelhos..............................................55
Figura 24 Efeito desagregante plaquetrio do composto LASSBio-1215 (100 M)
adicionado 1 min aps do agente agregante (U46619 3 M) em PRP coelhos. .......66
Figura 25 Efeito desagregante plaquetrio do composto LASSBio-1215 (300 M)
adicionado no momento de agregao mxima induzida por AA (200 M) em PRP
de coelhos..................................................................................................................66
Figura 26 Efeito desagregante do composto LASSBio-1215 (300 M) e DMSO (1%)
na agregao plaquetria induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP de coelhos. .....67
Figura 27 Efeito desagregante plaquetrio do composto LASSBio-1215 e DMSO na
agregao plaquetria induzida por ADP (3 M) em PRP Humano..........................69
Figura 28 Efeito desagregante plaquetrio dos compostos LASSBio-1276 (300 M)
e LASSBio-1003 (300 M) na agregao plaquetria induzida por ADP (3 M) em
PRP Humano. ...........................................................................................................70
Figura 29 Compostos furilidraznicos com atividade quelante de Ca2+ ....................71
Figura 30 Efeito da inibio da formao de AMPc pelo DDA (100 M) na inibio
da agregao plaquetria promovida por LASSBio-1215. .......................................73
Figura 31 Efeito da inibio da formao de GMPc pelo ODQ (10 M) na inibio
da agregao plaquetria promovida por LASSBio-1215 em PRP de humano. .......75
Figura 32 Efeito desagregante de LASSBio-1215 na presena de ODQ .................76
Figura 33 Resposta plaquetria no estudo indireto da atividade inibidora de PDE3 77
Figura 34 Resposta plaquetria no estudo indireto da atividade inibidora de PDE2 78
xx
LISTA DE GRFICOS
Grfico 1 - Efeito dos compostos N-acilidraznicos mais ativos na agregao

plaquetria induzida por PAF 1 M em PRP de coelhos; e trombina 0,5 UI/ml em
plaqueta de coelhos lavada.......................................................................................45
Grfico 2 - Inibio da agregao plaquetria induzida por ADP 3 M em PRP
humano citratado.......................................................................................................61
xxi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Contedo das trs diferentes subpopulaes de grnulos plaquetrios ..4
Tabela 2 - Efeito dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria induzida
por cido araquidnico (200 M) em PRP citratado de coelho .................................40
Tabela 3 - Efeito dos compostos na agregao plaquetria induzida por colgeno (5
g/ml) em PRP citratado de coelho...........................................................................41
Tabela 4 - Efeito dos compostos na agregao plaquetria induzida por ADP (5 M)
em PRP citratado de coelho......................................................................................43
Tabela 5 - Efeito dos compostos na agregao plaquetria induzida por U46619 (3
M) em PRP citratado de coelho ..............................................................................44
Tabela 6 Compostos selecionados para estudos de potncia ...............................46
Tabela 7 Potncia (CI50) dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria
induzida por AA (200 M) em PRP citratado de coelho ............................................47
induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP citratado de coelho...................................51
Tabela 9 Tabela comparativa da atividade antiagregante plaquetria dos derivados
N-acilidraznicos metilados e no-metilados (100 M) na AP induzida por colgeno
(5 g/ml) e AA (200 M) em PRP de coelho .............................................................56
Tabela 10 Efeito dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria
induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP humano ....................................................59
induzida por ADP (3 M) em PRP humano...............................................................61
Tabela 12 Efeito dos compostos em sangue total humano estimulado por colgeno
(20 g/ml) ..................................................................................................................62
Tabela 13 Efeito dos derivados N-acilidraznicos sobre a produo de TXA2 em
PRP humano estimulado por AA (500 M). ..............................................................64
Tabela 14 Efeito de LASSBio-1215 sobre a agregao plaquetria induzida por
colgeno (5 g/ml) na presena de zaprinast (100 M) em PRP humano ................79
xxii
LISTA DE ABREVIATURAS
AA - cido araquidnico
AAS cido acetilsaliclico
ADP difosfato de adenosina
AP agregao plaquetria
ATP trifosfato de adenosina
AINE antiinflamatrio no-estereoidal
AMPc monofosfato cclico de adenosina
Ca2+ - on clcio
COX ciclooxigenase
DAG 1,2 diacilglicerol
DDA - didesoxiadenosina
DMSO dimetilsulfxido
EDTA cido etilenodiaminotetraactico
EHNA - eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil) adenina
EIA ensaio imunoenzimtico
fvW fator de von Willebrand
GC guanilato ciclase
GMPc monofosfato cclico de guanosina
GP glicoprotena
IL interleucina
IP3 trifosfato de inositol
NAH - N-acilidrazona
NO - xido ntrico
ODQ - 1H-(1,2,4)-oxadiazolo[4,3a]quinoxalin-1-ona
xxiii
OMS organizao mundial de sade

P receptor purinrgico
PAF fator de ativao plaquetria
PAR receptor ativado por protease
PDE fosfodiesterase
PG prostaglandina
PGHS prostaglandina endoperxido sintase
PGI2 prostaciclina
PIP2 bisfosfato de inositol
PKA protena cinase A
PKC protena cinase C
PKG protena cinase G
PLA2 fosfolipase A2
PLC fosfolipase C
PPP plasma pobre em plaqueta
PRP - plasma rico em plaquetas
SNP nitroprussiato de sdio
SUS sistema nico de sade
TP receptor de tromboxana A2
TXA2 - tromboxana A2
TXB2 tromboxana B2
TXS tromboxana sintase
INTRODUO
As desordens isqumicas cardiovasculares continuam a representar a

principal causa de morte e invalidez em todo o mundo: aproximadamente 30% do
nmero total de mortes em 2005, segundo dados da Organizao Mundial de Sade
(OMS).
No Brasil, em 2004, 20% do total de mortes foram atribudos s doenas
cerebrovasculares e cardiovasculares, conforme dados do Sistema nico de Sade
(SUS) (MINISTRIO DA SADE, 2006).
As plaquetas, clulas sangneas envolvidas na manuteno da hemostase,
exercem uma funo essencial no desenvolvimento de eventos isqumicos agudos
coronarianos e cerebrovasculares e esto criticamente envolvidas no processo de
formao da aterosclerose (GAWAZ, 2006). O acmulo de plaquetas no local de
ruptura de uma placa aterosclertica ou no local de uma leso vascular o evento
chave no desenvolvimento da trombose arterial (Figura 1).
Adeso
plaquetria
Trombo
plaquetrio
Placa de
ateroma
Figura 1 Ocluso de artria por formao do trombo plaquetrio. STROKECENTER

(2008)
1.1
A PLAQUETA
1.1.1 Morfologia Plaquetria
As plaquetas so as menores clulas do sangue. So fragmentos anucleados de

megacaricitos da medula ssea e possuem um tempo de vida de aproximadamente
10 dias. Durante a megacariocitopoiese, o megacaricito sofre endomitose. Uma vez
que a clula poliplide atinge a maturao, ela forma extenses pr-plaquetrias a
partir das quais as plaquetas so liberadas (ITALIANO & SHIVDASANI, 2003)
(Figura 2 A).
Apesar de anucleadas, as plaquetas so clulas altamente organizadas e
ricas em diferentes organelas, como mitocndrias viveis, glicognio e pelo menos
trs tipos de grnulos morfologicamente diferentes que estocam diferentes tipos de
constituintes: os grnulos alfa (-grnulos), os grnulos densos e os lisossomas
(RENDU & BROHARD-BOHN, 2001) (Figura 2 B e C).
Os grnulos densos estocam ons bivalentes e molculas pequenas no
proticas, como o difosfato de adenosina (ADP), o trifosfato de adenosina (ATP),
serotonina e pirofosfato, que so secretadas para recrutar outras plaquetas e
exercem funes centrais na amplificao da ativao e agregao plaquetrias,
assim como na modulao do endotlio vascular e da funo leucocitria. Os
grnulos alfa contm molculas de adeso importantes para as interaes entre a
plaqueta e outras plaquetas, clulas sangneas e tecidos. Contm ainda fatores
mitognicos, protenas plasmticas e fatores relevantes para a coagulao e
fibrinlise. Os grnulos lisossmicos contm glicosidases, proteases e protenas
catinicas com atividade bactericida. As enzimas hidrolticas liberadas digerem
material dos agregados plaquetrios circulantes (Tabela 1).
Figura 2 A- Megacaricito: clula poliplide e extenses pr-plaquetrias; B e C:

plaqueta e seu contedo citoplasmtico. Adaptado de ITALIANO& SHIVDASANI
(2003)
As plaquetas apresentam um complexo citoesqueleto, consistindo de

microtbulos e de sistema tubular denso, que exercem importante papel na ativao
plaquetria, secreo granular e na retrao do cogulo (RENDU & BROHARDBOHN, 2001).
As plaquetas carreiam alguns componentes especficos atravs de todo o
organismo. Na circulao, elas so reativas a vrios estmulos e liberam o material
contido em seus grnulos. Essa reao de secreo um passo importante na
hemostase primria. A energia e os mensageiros necessrios para a reatividade
plaquetria so fornecidos pela mitocndria e pelo sistema tubular denso. Cada
populao de grnulos tem propriedades especficas relacionadas tanto com a
estrutura quanto com o contedo liberado (RENDU & BROHARD-BOHN, 2001).
Tabela 1 - Contedo das trs diferentes subpopulaes de grnulos plaquetrios

Adaptado de ZARBOCK et al.(2007)
GRNULOS
DENSOS
GRNULOS ALFA
LISOSSOMAS
Nucleotdeos
Adenina: ATP, ADP
Guanina: GTP, GDP
Aminas
Serotonina
Histamina
Ctions bivalentes
Molculas de adeso
P-selectina (CD62P)
Molcula 1 de adeso plaqueta-clula endotelial (PECAM1/CD31)
Glicoproteina IIb/IIIa (GP IIb/IIIa, integrina IIb3,
CD41/CD61)
Fator von Willebrand (fvW)
Trombospondina-1 (TSP-1)
Vitronectina, Fibronectina
Fatores Mitognicos
Fator de crescimento derivado da plaqueta (PDGF)
Fator de crescimento do endotlio vascular (VEGF)
Fator de crescimento transformador (TGF-)
Fatores de coagulao
Fibrinognio, plasminognio, Protena S, Cininognios
Fatores V, VII, XI, XIII
Inibidores de protease
Inibidor C1
Ativador Inibidor-1de plasminognio
Inibidor da via do fator tecidual (TFPI)
Glicosidases
Proteases
Protenas catinicas
1.1.2 Funo Plaquetria e Vias de Sinalizao Celular
A funo plaquetria controlada por dois tipos de agonistas, que exercem

efeitos excitatrios e inibitrios.
Os agonistas excitatrios ao interagirem com seus receptores promovem uma
seqncia de eventos, entre eles:
- a mudana de forma da plaqueta;
- a exposio do receptor de fibrinognio GP IIb-IIIa (integrina IIb3) e
aumento da sua afinidade pelo ligante;
- agregao e liberao dos grnulos densos, resultando na amplificao da
ativao plaquetria devido liberao de ADP;
- liberao dos grnulos alfa, resultando na estabilizao das pontes de
fibrinognio entre as plaquetas e conseqente irreversibilidade da agregao.
Apesar de todas as repostas serem desencadeadas pela elevao da
concentrao do Ca2+ intracelular, muitos agonistas no conseguem reproduzir
totalmente esses eventos. So considerados agonistas fracos aqueles que
promovem apenas as duas primeiras respostas. Os agonistas intermedirios so
aqueles com a capacidade de induzirem os cinco primeiros eventos. Apenas os
agonistas capazes de estimular a liberao das hidrolases cidas so considerados
agonistas fortes.
Os agonistas que exercem efeitos inibitrios agem diminuindo essas
respostas atravs da estimulao da adenilato ciclase, gerando o segundo
mensageiro 3, 5-monofosfato de adenosina cclico (AMPc).
Os efeitos excitatrios e inibitrios de ambos agonista ocorrem via ocupao
de receptores acoplados protena G (HOURANI & CUSACK, 1991).
Vrios receptores para ligantes biolgicos de relevncia farmacolgica foram

identificados na superfcie plaquetria, incluindo receptores de ligantes excitatrios
(epinefrina, ADP, serotonina, fator de ativao plaquetria (PAF), tromboxana A2
(TXA2), vasopressina, trombina) e de ligantes inibitrios (adenosina, prostaglandina
D2 (PGD2), prostaciclina (PGI2) (HERD & PAGE, 1995).
Os receptores utilizam duas vias de sinalizao principais: a via do inositol 1,
4, 5-trifosfato (IP3) e do 1, 2-diacilglicerol (DAG), derivados da hidrlise enzimtica
dos fosfolipdeos de inositol (PIP2) pela fosfolipase C (PLC); e a via do cido
araquidnico (AA), liberado da membrana a partir da ao da fosfolipase A2 (PLA2).
1.1.2.1
Via dos Fosfolipdeos de Inositol
IP3 e DAG causam importantes respostas intracelulares induzindo alteraes

em protenas alvo tanto diretamente quanto indiretamente pela ativao de protenas
cinases. IP3 libera Ca2+ dos estoques intracelulares, ativando diversas enzimas
dependentes de Ca2+, como a cinase de cadeia leve de miosina, relacionada
mudana de forma da plaqueta e ativando a protena cinase C (PKC) dependente de
Ca2+, envolvida na regulao da agregao e secreo. DAG ativa protena cinase C
(PKC), responsvel pela fosforilao de diversas protenas (KROLL & SCHAFER,
1995).
1.1.2.2
Metabolismo do cido Araquidnico (AA)
O cido araquidnico (AA) liberado dos fosfolipdeos de membrana pela

ao da fosfolipase A2 (PLA2). A enzima ciclooxigenase (COX), tambm conhecida
por prostaglandina endoperxido sintase (PGHS), metaboliza o AA e gera a
prostaglandina H2 (PGH2). Nas plaquetas, a isoforma predominante da enzima COX
a COX-1, e o principal prostanide formado a tromboxana A2 (TXA2), sintetizada
pela ao da enzima tromboxana sintase (TXS) sobre PGH2. A TXA2, um potente
agente pr-agregante e vasoconstrictor, estimula, de forma autcrina e parcrina, o
receptor especfico (TP) na superfcie plaquetria, acoplado protena Gq, que ativa
fosfolipase C (PLC) e mobiliza Ca2+ intracelular (Figura 3). A regulao negativa
realizada pela prostaciclina (PGI2), principal prostanide secretado pelas clulas
endoteliais. Esse prostanide se liga ao receptor IP plaquetrio, acoplado protena
Gs, e promove o aumento da concentrao intracelular de AMPc, antagonizando a
resposta agregatria e inibindo a trombose. A prostaciclina se liga tambm aos
receptores IP das clulas da musculatura vascular lisa, inibindo a contrao do vaso.
A sntese desse prostanide pela via COX exerce importante funo no controle da
hemostasia vascular e da trombose (SIMMONS et al., 2004; NAKAHATA, 2008).
Antagonista TP
Fosfolipdeos
cido Araquidnico
Inibidor de COX
Resposta Fisiolgica
Inibidor de TXS
Agregao plaquetria
Figura 3 Formao de TXA2 a partir do metabolismo do cido araquidnico e seus

mecanismos de sinalizao intracelular. Adaptado de NAKAHATA (2008)
1.1.2.3
on clcio (Ca2+)
O Ca2+ exerce uma funo chave em vrias funes plaquetrias. Todos os

agonistas excitatrios da plaqueta, exceto a epinefrina, induzem o aumento das
concentraes citoslicas de Ca2+, tanto a partir da sua mobilizao dos estoques
internos (sistema tubular denso) quanto a partir do aumento do influxo de Ca2+ do
meio extracelular. O aumento das concentraes intracelulares de Ca2+ causa
ativao plaquetria, mudana de forma da plaqueta e liberao de seu contedo
granular (AUTHI, 1993; HOURANI & CUSACK, 1991).
1.1.2.4
Nucleotdeos Cclicos
Agonistas plaquetrios como a prostaciclina (PGI2), prostaglandina E1 (PGE1)

e prostaglandina D2 (PGD2), que aumentam os nveis de AMPc intracelulares, so os
mais potentes inibidores da ativao plaquetria. Essas substncias se ligam a
receptores acoplados protena G estimulatria (Gs), que estimula adenilato ciclase
e leva ao aumento do AMPc intracelular. Os efeitos inibitrios do AMPc so devido
fosforilao de protenas chave pela protena cinase dependente de AMPc (PKA).
Uma das etapas de inibio pelo AMPc inclui a inibio da ativao da PLC (SIESS
et al., 1993).
Os nveis de monofosfato cclico de guanosina (GMPc) na plaqueta so
controlados pela ao da guanilato ciclase solvel que ativada por xido ntrico
(NO). No entanto, os nveis celulares de nucleotdeos cclicos no so apenas
regulados pelas enzimas que os sintetizam (adenilato e guanilato ciclases), mas
tambm pelas enzimas que os degradam, representadas pela famlia das
fosfodiesterases (PDEs) (WALTER et al.,1993).
As plaquetas em repouso apresentam um balano equilibrado da formao e
hidrlise de AMPc de forma a alcanar nveis intracelulares suficientes para impedir
a ativao plaquetria em condies fisiolgicas normais. Isto implica que as
fosfodiesterases (PDEs), ao controlarem a hidrlise de AMPc, exercem um efeito
regulatrio na ativao plaquetria, mesmo na ausncia de agonistas que estimulam
a adenilato ciclase.
As plaquetas contm pelo menos trs tipos de PDEs: PDE2 estimulada por
GMPc, PDE3 inibida por GMPc, ambas utilizam AMPc e GMPc como substratos, e
PDE5, que hidrolisa exclusivamente GMPc. Existe uma importante relao entre as
vias de sinalizao dos dois nucleotdeos cclicos, uma vez que nveis elevados de
10
GMPc exercem efeito inibitrio sobre PDE3, aumentando, conseqentemente, os

nveis de AMPc, e exercem efeito estimulatrio sobre PDE2, reduzindo os nveis de
AMPc (FEIJGE et al., 2004) (Figura 4).
PDE5
GMPc
intraplaquetrio
PDE2
PDE3
AMPc >>>GMPc
AMPc e GMPc
Figura 4 Modulao de PDE3 e PDE2 por GMPc
1.2
AGONISTAS DA AGREGAO PLAQUETRIA
1.2.1 Colgeno
O colgeno o componente mais trombognico da matriz subendotelial. Ele

se liga a seus receptores especficos na superfcie plaquetria, GPVI e GPIa-IIa
(integrina 21) para promover a adeso, ativao e agregao plaquetria no local
da leso vascular. No entanto, a interao das plaquetas com o colgeno bem
mais complexa do que uma simples interao ligante-receptor (SURIN et al., 2007).
A ativao plaquetria induzida por colgeno pode ser dividida em trs etapas
principais:
- interao das plaquetas com o complexo formado entre o colgeno e o fator
de von Willebrand (fvW), que ativa PLC e leva ao aumento do Ca2+ intracelular;
- liberao do contedo granular (grnulos densos e grnulos alfa);
11
- exposio e ativao do receptor GPIIb-IIIa (integrina IIb3), levando

ativao das plaqueta adjacentes para formao do trombo plaquetrio (SURIN et
al., 2007).
1.2.2 Difosfato de Adenosina (ADP)
O difosfato de adenosina (ADP) foi reconhecido como indutor da agregao

plaquetria no incio da dcada de 1960. Embora seja um fraco agonista plaquetrio,
ele exerce uma funo chave na agregao plaquetria porque, uma vez secretado
dos grnulos densos, amplifica a ativao plaquetria induzida por outros agonistas,
inclusive pelos agonistas fracos como: serotonina, epinefrina e quimiocinas
(GACHET, 2001).
Estudos bioqumicos, clnicos e farmacolgicos levaram proposta de um
modelo de trs receptores purinrgicos que contribuem separadamente para o
complexo processo da agregao plaquetria induzida por ADP:
- o receptor ionotrpico P2X1, responsvel pelo rpido influxo de Ca2+ para o
citosol, que interage principalmente com ATP;
- o receptor metabotrpico P2Y1, acoplado protena Gq, que regula a PLC e
os eventos dependentes de Ca2+ e inicia a mudana de forma da plaqueta (shape
change);
- o receptor P2Y12, acoplado protena Gi, que leva subseqente inibio
da adenilato ciclase, regulao da PI3-cinase - responsvel pela amplificao da
agregao iniciada por outros agonistas e pelo prprio ADP, e exposio da
integrina IIb3 (CATTANEO & GACHET, 2001).
A secreo plaquetria e a agregao secundria normalmente observadas
aps estimulao de plaquetas humanas com ADP so causadas pela formao de
12
TXA2, que requer a coativao de ambos receptores P2Y1 e P2Y12 e a sinalizao

externa promovida pela interao de IIb3 com o fibrinognio (JIN et al., 2002).
1.2.3 Fator de Ativao Plaquetria (PAF)
O PAF um potente agente agregante plaquetrio. Ele promove a mudana

de forma da plaqueta, agregao e liberao do contedo granular. Em plaquetas
humanas, a liberao do contedo granular depende do metabolismo do AA. O PAF
induz o metabolismo dos fosfolipdeos de inositol, a mobilizao de Ca2+ e inibe a
adenilato ciclase. Ele liberado das plaquetas ativadas e as ativa, participando do
complexo sistema de amplificao e sinergismo caracterstico da resposta
plaquetria (HOURANI & CUSACK, 1991).
1.2.4 Trombina
A serina protease trombina um potente ativador plaquetrio e dispara sua

sinalizao, em parte, atravs dos receptores ativados por protease ligados
protena G (PARs). Estes receptores convertem um evento de clivagem proteoltica
extracelular em um sinal transmembranar. Quatro receptores PARs distintos foram
identificados at o momento. As plaquetas humanas expressam PAR1 e PAR4.
PAR1 medeia respostas plaquetrias rpidas em baixas concentraes de trombina,
enquanto PAR4 ativado apenas em altas concentraes (SAVAGE et al., 2001;
HAMILTON, 2008).
Os receptores PARs, acoplados protena Gq, ativam PLC levando ao
aumento de Ca2+ e ativao de PKC. O aumento do Ca2+ regula muitos eventos que
13
levam agregao plaquetria, inclusive a ativao da PLA2 pela via da protena

cinase ativada por mitgeno (RUGGERI, 2002).
Alm de ativar as plaquetas atravs da clivagem de seu receptor PAR, a
trombina ainda cliva a GPV do complexo GPIb-IX-V, o que permite a sua ligao
GPIb, processo que resulta na ativao plaquetria (WAGNER & BURGER, 2003).
A trombina (fator IIa da cascata de coagulao) tambm responsvel pela
converso do fibrinognio em fibrina, via final da cascata de coagulao (KAHN et
al., 1998; SAVAGE et al., 2001).
1.3
FISIOPATOLOGIA PLAQUETRIA
As plaquetas esto envolvidas na hemostase e na inflamao. Sob condies

fisiolgicas, elas circulam em um estado quiescente, protegidas da ativao precoce
por mediadores inibitrios liberados das clulas endoteliais intactas, como o xido
ntrico (NO), prostaciclina (PGI2) e a adenosina originada da ao da ectoADPase
(CD39) sobre o ADP extracelular (ZARBOCK et al., 2007).
A matriz subendotelial uma superfcie altamente reativa para as plaquetas.
A adeso das plaquetas s protenas de matriz subendotelial resulta na sua rpida
ativao.
Durante a ativao, as plaquetas alteram sua topografia, passando de um
formato discide para um formato esfrico com emisso de longas extenses
dendrticas que facilitam a adeso (Figura 5). O citoplasma, rico em actina e miosina,
permite essa mudana de forma. A adeso das plaquetas ativadas ao local da leso
vascular se torna estvel, e ento ela promove a expanso de sua superfcie sobre a
rea lesada para formar um pseudo-endotlio, altamente reativo para o recrutamento
de novas plaquetas circulantes e para a formao do agregado plaquetrio. Este
14
processo no importante apenas na hemostase primria e secundria, uma vez

que, quando descontrolado, pode levar formao de trombos oclusivos. Esses
trombos se formam nos locais de ruptura de uma placa aterosclertica, resultando
nos acidentes isqumicos cerebrovasculares e cardiovasculares (DOPHEIDE et al.,
2001).
Em resposta a uma leso vascular, alteraes no fluxo sangneo ou a um
estmulo qumico, as plaquetas apresentam trs respostas funcionais: adeso,
secreo e agregao (Figura 6).
Figura 5 Micrografia eletrnica da plaqueta em seu formato discide (A), ativada e

aderida (B), aps a secreo do contedo granular (C). AUSTRALIAN CENTER
FOR BLOOD DISEASES (2008)
As plaquetas estimulam a ativao local de fatores de coagulao plasmtica,

levando gerao de uma rede de fibrina que refora o agregado plaquetrio.
A trombose caracterizada pela formao indesejada de um tampo
hemosttico (trombo), que difere estruturalmente do cogulo por apresentar uma
estrutura bem definida. A localizao do trombo caracteriza dois tipos de processos
fisiopatolgicos: a trombose arterial e a trombose venosa. Na trombose arterial, o
trombo cresce de maneira desordenada, dificultando a passagem do fluxo
sangneo, podendo provocar a ocluso da artria, resultando em necroses
isqumicas, infarto do miocrdio e aterosclerose. Na trombose venosa, a cauda
15
trombtica possui maior rigidez, o que facilita sua fragmentao. Ao atingirem vasos
de menor calibre, os fragmentos causam obstruo, promovendo embolias,
principalmente a pulmonar (HAMPTON & PRESTON, 1997).
LESO VASCULAR
HESMOSTASE
Captura e
translocao
Agregao
estvel
Formao
trombo
Adeso
Secreo
Protenas expostas
no local da leso
Figura 6 Formao do trombo plaquetrio e hemostasia. Adaptado de MONASH

UNIVERSITY (2008)
cada vez mais evidente que as plaquetas no exercem apenas funes

importantes na hemostasia e trombose, mas tambm esto envolvidas no
desenvolvimento de doenas vasculares aterosclerticas. Durante o processo de
adeso, as plaquetas se ativam e liberam vrias substncias mitognicas e
inflamatrias no microambiente, alterando as propriedades quimiotticas, adesivas e
proteolticas das clulas endoteliais. Estas alteraes induzidas pela plaqueta no
fentipo endotelial promovem quimiotaxia, adeso e transmigrao de moncitos
para o stio inflamatrio. A citocina IL-1 foi identificada como o principal mediador
da ativao das clulas endoteliais induzida pela plaqueta (WEBER, 2005; GAWAZ,
2006).
16
1.3.1 Trombose
Uma leso vascular severa acarreta a ruptura da integridade do endotlio e a

exposio da matriz subendotelial, que inclui protenas de adeso como o colgeno
e o fator de von Willebrand (fvW).
O fator de von Willebrand, previamente produzido e liberado pelo endotlio ou
adsorvido do plasma sobre o tecido exposto, crucial para adeso plaquetria, em
particular nos vasos com alta tenso de cisalhamento, como as artrias e as
arterolas. Ele se liga ao seu receptor glicoproteico GP Ib-IX-V na superfcie
plaquetria e estabelece uma ligao transiente que reduz a movimentao da
plaqueta (rolamento) e facilita a sua ativao. Aps a captura da plaqueta, uma
rpida estabilizao da adeso necessria para que ocorra a formao do trombo.
Este processo inicialmente mediado pela interao do colgeno com o receptor
glicoprotico GPVI e com a integrina 21 (GPIa-IIa), receptor membro da famlia das
imunoglobulinas expresso na superfcie plaquetria (Figura 7) (WAGNER &
BURGER, 2003).
A gerao de sinais intracelulares a partir da interao do colgeno com GPVI
e do fvW com GPIb converte as integrinas 1 e 3 ao seus estados de alta afinidade e
induz a sntese de tromboxana A2 (TXA2) e a secreo dos grnulos plaquetrios,
com a conseqente liberao de agonistas solveis, como ADP, serotonina,
epinefrina. O acmulo de ADP e TXA2 liberados resulta na ativao das demais
plaquetas circulantes que no esto em contato com as protenas da matriz
subendotelial expostas no local da leso vascular, amplificando o sinal e resultando
no crescimento do trombo. A ao desses agonistas promove a exposio e o
aumento da afinidade da integrina IIb3. Em contrapartida, a adeso mediada por
essa integrina fortalece as interaes do colgeno com seu receptor GPVI, levando
17
ao aumento da sinalizao, regulao das integrinas, liberao de mediadores e

desenvolvimento da atividade pr-coagulante (NIESWANDT & WATSON, 2003).
captura
ativao
repouso
ativada
colgeno
firme adeso
repouso
ativada
fator de von Willebrand
Figura 7 Ativao plaquetria mediada por colgeno e fator de von Willebrand:

captura, adeso e liberao de mediadores. Adaptado de NIESWANDT & WATSON
(2003)
As integrinas so reconhecidas como a principal classe de receptores de
superfcie que medeiam a adeso estvel das clulas hematopoiticas em alta
tenso de cisalhamento. So protenas heterodimricas que consistem de
subunidades e . Esto presentes na superfcie da maioria das clulas em uma
conformao de repouso que tem baixa afinidade pelo seu ligante natural, mas
podem ser convertidas a um estado de alta afinidade atravs da sinalizao interna
gerada pela interao de outros receptores de superfcie com seus ligantes
(NIESWANDT & WATSON, 2003).
Quando as plaquetas so ativadas por seus agonistas atravs de seus
receptores especficos, a conformao da integrina IIb3 alterada aumentando sua
afinidade para seus principais ligantes: fibrinognio, fator de von Willebrand e
fibronectina
A interao do complexo IIb3-fibrinognio/fibronectina/fvW com a
18
integrina IIb3 de outra plaqueta ativada adjacente promove a interao cruzada

plaqueta-plaqueta (SIMS et al.,1991; RUGGERI, 2002) (Figura 8).
Ativao da integrina IIb3 e sua ligao ao fibrinognio, via final comum
ativao promovida por todos os agonistas plaquetrios, apenas o incio do
processo de agregao plaquetria, uma vez que essas interaes induzem uma
transduo de sinal que essencial para as mudanas na organizao do
citoesqueleto e da agregao plaquetria (ISENBERG et al. 1987).
A
Trombina
Adrenalina FIbrinognio
SInalizao
Externa
Interna
Inativo
Ativo
Colgeno
Matriz extracelular
IIb3 inativado
IIb3 ativado
Receptores de Colgeno
Estvel
Transiente
Fluxo
Transiente
Estvel
Fibrinognio
Fibras de Colgeno
Figura 8
A. Principais agonistas da agregao plaquetria e seus respectivos
receptores. B. Interao plaqueta-plaqueta atravs da formao de pontes cruzadas

mediadas pelo fibrinognio ligado s integrinas IIb3 de plaquetas adjacentes.
Adaptado/Retirado de RUGGERI (2002)
19
1.4
TERAPIAS ANTIPLAQUETRIAS
At o momento, nenhum frmaco utilizado na terapia antiplaquetria

suficientemente potente, seguro e ativo por via oral para a preveno da trombose
arterial. As terapias mais comumente utilizadas cido acetilsaliclico (AAS),
clopidogrel, tirofibano - apresentam uma ou mais limitaes, que incluem: pouca
eficcia, risco significativo de hemorragias, irritabilidade gstrica, resistncia ao
frmaco ou a via de administrao exclusivamente parenteral (Figura 9)
(HAMILTON, 2008).
O AAS inibe irreversivelmente a enzima cicloxigenase, impedindo a formao
de TXA2 nas plaquetas ativadas. Ele continua sendo a terapia padro nos eventos
isqumicos agudos e na preveno secundria. Alguns estudos sugerem um
aumento de eventos cardiovasculares em indivduos que demonstraram resistncia
ao AAS (BHATT & TOPOL, 2003; HAMILTON, 2008).
Outra importante classe de inibidores da agregao plaquetria representam
os antagonistas do receptor purinrgico P2Y12. A tienopiridina ticlopidina um prfrmaco com alta biodisponibilidade oral que inibe irreversivelmente esse receptor.
Assim como o AAS, possui um curto tempo de meia-vida com uma longa durao de
ao. No entanto, os efeitos adversos associados, como o desconforto
gastrointestinal e, mais gravemente, o surgimento de neutropenia e trombocitopenia,
limitaram sua utilizao clnica. O clopidogrel, outro composto da classe das
tienopiridinas, um agente antitrombtico cuja aplicao clnica est bem
estabelecida nas sndromes coronarianas agudas e nas intervenes coronarianas
percutneas. O clopidogrel um pr-frmaco com lento incio de ao, e exibe
eficcia semelhante a do AAS na preveno secundria ao infarto. Sua utilizao em
combinao com o AAS tem apresentado eficcia superior, o que se justifica pela
20
ao desses frmacos em mecanismos antiplaquetrios distintos (GOODMAN, 2006;

MICHELSON, 2008; HAMILTON, 2008).
A classe de inibidores da integrina IIb3, receptor do fibrinognio e do fvW,
age inibindo a via final comum na agregao plaquetria. A ao desses frmacos
bloqueia a agregao plaquetria induzida por qualquer agonista e, por isso, essa
classe constituda pelos antiplaquetrios mais potentes disponveis atualmente,
como o tirofibano, abciximabe e a eptifibatida.
algumas
limitaes,
principalmente
em
Apesar disso, eles apresentam
relao
via
de
administrao,
exclusivamente parenteral devido baixa biodisponibilidade oral, e induzem taxas

elevadas de sangramento clinicamente relevantes e trombocitopenia (HAMILTON,
2008).
A elevao dos nveis intracelulares de AMPc e GMPc um dos mecanismos
mais potentes de inibio da agregao plaquetria. Esses agentes podem interferir
com todas as vias conhecidas da agregao plaquetria, assim como com a
secreo de grnulos. O principal estmulo endgeno da adenilato ciclase a
prostaciclina, enquanto o xido ntrico (NO) um potente estimulador da guanilato
ciclase (SCHWARZ et al., 2001).
Outra abordagem para promover o aumento dos nveis de nucleotdeos
cclicos baseada na inibio de fosfodiesterases (dipiridamol, milrinona, cilostazol).
Embora o dipiridamol no seja utilizado na terapia antiplaquetria, recomendado
seu uso em combinao com varfarina para profilaxia ps-operatria primria de
tromboembolismo
em
pacientes
com
vlvulas
cardacas
protticas.
Mais
recentemente, o inibidor seletivo de PDE3 (cilostazol) tem sido utilizado na clnica

para o tratamento da claudicao intermitente, doena aterosclertica dos vasos
perifricos. A utilizao clnica desses inibidores, especialmente em combinao
21
com baixas doses de agentes que elevam os nveis de nucleotdeos cclicos, poderia
ser bastante til em situaes em que se deseja a inibio especfica da funo
plaquetria, sem apresentar efeitos sobre a musculatura lisa (SCHWARZ et al,
2001).
Uma vez que as terapias disponveis se apresentam insuficientes para o
controle efetivo dos eventos vasculares, tanto a descoberta de novos alvos
teraputicos como a de frmacos que atuem em mais de um alvo teraputico,
constituem-se abordagens importantes para o desenvolvimento de novos agentes
antiplaquetrios.
O
OH
Inibidoresda
da
Inibidores
formaode
deTXA
TXA2:2:
formao
AAS
AAS
O
O
Antagonistas
Antagonistas
PAR1:
PAR1:
SCH530348,E5555
E5555
SCH530348,
AAS
N
S
Antagonistas
Antagonistas
P2Y12:
P2Y12:
Clopidogrel
Clopidogrel
prasugrel
prasugrel
Cl
Clopidogrel
Inibidoresde
de
Inibidores
PDE:
PDE:
Dipiridamol
Dipiridamol
Cilostazol
Cilostazol
AMPc GMPc
PDE
O
O
Fibrinognio
N
H
AMP GMP
N
N N
Cilostazol
Fibronectina
Inibidoresde
de
Inibidores
integrina:
integrina:
Tirofiban
Tirofiban
Abciximab
Abciximab
Inibidoresde
de
Inibidores
adesoplaquetria
plaquetria
adeso
OH
HN
Colgeno
fvW
O
O
HN
O
S
O
Tirofibano
Figura 9 Principais terapias antiplaquetrias e seus alvos na plaqueta. Adaptado de

MACKMAN (2008).
22
1.5
JUSTIFICATIVA
Os derivados N-acilidraznicos (NAH) so bastante conhecidos por

apresentarem atividade biolgica em diferentes alvos farmacolgicos, uma vez que
possuem uma subunidade estrutural mnima capaz de fornecer pontos ligantes para
mais de um tipo de biorreceptor, cuja seletividade pode ser modulada pela adequada
introduo de subunidades farmacofricas auxiliares (FRAGA & BARREIRO, 2006).
Ormelli (1999), em sua dissertao de mestrado, demonstrou que o composto
3,4-metilenodioxibenzoil-2-furilidrazona, LASSBio-129, apresentava uma potente
atividade antiagregante plaquetria.
Kmmerle (2005) props a N-alquilao dos prottipos LASSBio-129 e
LASSBio-294, resultando na obteno dos compostos N-metilados LASSBio-1003 e
LASSBio-785 (Figura 10), respectivamente, visando adequar a relao entre a
potncia e a seletividade nos modelos farmacolgicos avaliados. A N-alquilao
resultou no aumento da potncia vasodilatadora, como ilustrado na Figura 10.
Posteriormente, Brito (2005), em sua tese de doutorado, demonstrou que a
N-alquilao dos compostos tienilacilidraznicos planejados a partir da modificao
no prottipo LASSBio-294 levou obteno de compostos com potente ao
antiagregante plaquetria e potencial efeito antitrombtico.
Inserido no programa de pesquisa em Qumica Medicinal desenvolvido no
Laboratrio de Avaliao e Sntese de Substncias Bioativas (LASSBio) que
compreende o planejamento, a sntese e a avaliao das propriedades
farmacolgicas de substncias bioativas candidatas a prottipos de frmacos, trs
novas sries de compostos NAH foram sintetizadas a partir do prottipo LASSBio129.
23
O
O
O
N
LASSBio 129
LASSBio 1003
Potente antiagregante plaquetrio, possvel

ao sobre a cascata do AA
(ORMELLI, 1999)
Potente ao vasodilatadora
(KMMERLE, 2005)
LASSBio 294
Potente agente cardaco inotrpico positivo
Ao vasodilatadora
Ao analgsica e antiagregante plaquetria
(ZAPATA-SUDO et al., 2003;SILVA et al.,
2002; MIRANDA et al.,2002)
LASSBio 785
Potente ao vasodilatadora e antiagregante
plaquetria, inibio da formao de TXA2 e modulao
de nucleotdeos cclicos
CI50: AA = 0,3 M Colgeno = 0,9 M
(KMMERLE, 2005; BRITO, 2005)
PDE ?
Figura 10 Perfil farmacolgico dos compostos N-acilidraznicos e seus derivados

N-metilados.
Essas sries foram estruturalmente planejadas explorando modificaes na

posio 5 do anel furnico, a N-metilao do nitrognio amdico e a introduo de
unidades vinlogas, visando otimizar as propriedades antiagregantes plaquetrias do
prottipo LASSBio-129 (RODRIGUES, 2008).
Os compostos LASSBio-1214, LASSBio-1215, LASSBio-1216, LASSBio-1221,
LASSBio-1222 e LASSBio-1223 foram planejados por hibridao molecular e
simplificao molecular entre o prottipo LASSBio-129 e o derivado hidantonico
dantroleno, um bloqueador da liberao de Ca2+ do retculo sarcoplasmtico que
apresenta o grupamento acilidrazona em sua estrutura (WARD, CHAFFMAN &
SORKIN, 1986) (Figura 11).
O planejamento dos compostos LASSBio-1217, LASSBio-1218, LASSBio1220 e LASSBio-1276 baseou-se na estratgia de homologao da cadeia lateral
ligada ao C-2 do anel furnico, com o objetivo de avaliar a eventual influncia do
aumento desta cadeia no perfil antiplaquetrio desses anlogos (Figura 12).
24
Os compostos LASSBio-1219, LASSBio-1267, LASSBio-1268 e LASSBio1275 foram planejados com o intuito de se obter compostos provavelmente mais
hidrossolveis em relao ao prottipo LASSBio-129 e analisar os efeitos estricos e
fsico-qumicos na agregao plaquetria (Figura 13).
Finalmente, a N-alquilao presente nos compostos LASSBio-1215, LASSBio1220, LASSBio-1221, LASSBio-1222, LASSBio-1276 foi realizada para se avaliar a
influncia do grupo metila no perfil de bioatividade destes compostos, assim como a
importncia da restrio conformacional do grupo N-acilidrazona (Figuras 11, 12 e
13).
O
O
O
HN
N
O
NO2
LASSBio-129
Dantroleno
Hibridao Molecular
O
O
O
N
H
NO2
NO 2
LASSBio-1221
LASSBio-1216
Restrio
conformacional
Simplificao Molecular
O
O
O
N
H
NO 2
NO2
LASSBio-1214
Restrio
conformacional
LASSBio-1215
Bioisosterismo
O
O
O
O
N
H
Br
Br
O
LASSBio-1223
LASSBio-1222
Restrio
conformacional
Figura 11 Modificao estrutural de LASSBio-129 atravs das estratgias de

hibridao, simplificao molecular, restrio conformacional e bioisosterismo
(RODRIGUES, 2008)
25
O
O
LASSBio-129
Restrio
conformacional
O
O
O
N
H
LASSBio-1217
LASSBio-1220
O
O
O
N
H
NO2
NO2
LASSBio-1218
LASSBio-1276
Figura 12 Srie vinloga e seus respectivos compostos N-metilados (RODRIGUES,

2008)
S
N
O
O
N
H
LASSBio-1219
N
H
LASSBio-1267
O
N
O
O
N
H
LASSBio-1268
O
O
N
H
LASSBio-1275
Figura 13 Srie metileno aminas cclicas (RODRIGUES, 2008)
26
OBJETIVOS
Avaliar o perfil da atividade antiagregante plaquetria das novas sries de

compostos N-acilidraznicos furnicos modificados a partir do prottipo LASSBio129 (Anexo I).
Realizar o estudo de triagem da srie de compostos frente aos
principais agonistas da agregao plaquetria AA, colgeno, ADP,
U46619, PAF e trombina, em plaquetas de coelho e identificar os
compostos mais ativos.
Determinar a potncia dos compostos selecionados.
Estudar a ao dos compostos em plaquetas humanas.
Avaliar os efeitos sobre a produo de metablitos da cascata do AA.
Estudar os possveis mecanismos de ao dos compostos mais ativos:
estudo funcional sobre fosfodiesterases (PDEs), participao de
nucleotdeos cclicos e receptores de adenosina.
Estudar a relao entre a estrutura qumica e a atividade observada para
os compostos.
27
3.1
MATERIAL E MTODOS
SUBSTNCIAS, REAGENTES E SOLVENTES
Substncia
Fonte
cido Acetilsaliclico
Synth
cido Araquidnico, sal sdico, 99%
SIGMA
cido ctrico
Grupo Qumica
cido etilenodiaminotetraactico (EDTA)
SIGMA
cido Sulfrico
Synth
Adenosina
SIGMA
Albumina srica bovina (BSA)
SIGMA
lcool Etlico absoluto
Merck
Bicarbonato de Sdio (NaHCO3)
Vetec
Citrato trissdico
Qumica Moderna
Cloreto de Magnsio (MgCl . 6 H2O)
Grupo Qumica
Cloreto de Potssio (KCl)
MERCK
Cloreto de Sdio (NaCl)
Synth
Colgeno de tendo de Aquiles de boi, tipo I, insolvel
SIGMA
Dideoxiadenosina (DDA)
SIGMA
Difosfato de Adenosina (ADP)
SIGMA
Dimetilsulfxido (DMSO)
SIGMA
EHNA [eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil) adenina]
SIGMA
Formaldedo
Synth
28
Fosfato de potssio monobsico (KH2PO4)
Vetec
Fosfato dibsico de sdio (Na2HPO4 . 12 H2O)
Grupo Qumica
Glicose
Vetec
HEPES cido[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfnico]
SIGMA
Indometacina
Merck
Kit de EIA de TXB2
Amershan
KT-5720
SIGMA
Luciferina-Luciferase
SIGMA
Milrinona
SIGMA
Nitroprussiato de sdio (SNP)
SIGMA
ODQ (1-H-[1,2,4]oxadiolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona)
SIGMA
Trifosfato de adenosina (ATP)
SIGMA
Trombina
SIGMA
U46619
SIGMA
Zaprinast
SIGMA
3.2
SOLUES
Soluo EDTA 0,08M

EDTA
2,336 g
H2O destilada q.s.p.
100 ml
Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 0,1M
29
Soluo Salina 0,9%

NaCl
0,9 g
100 ml
Soluo Salina 0,9% - Formol 1%

NaCl
0,9 g
Formaldedo
1 ml
100 ml
Soluo de Citrato de Sdio 3,8%

Citrato de sdio
3,8 g
100 ml
Tampo Tyrode para Lavagem de Plaquetas

NaCl
7,83 g
NaHCO3
1,01 g
KCl
0,22 g
Na2HPO4 . 12 H2O
0,06 g
MgCl2 6 H2O
0,20 g
HEPES
2,38 g
Glicose
0,90 g
BSA
0,3 g/100 ml
pH
7,4
100 ml
30
Soluo de ACD
Citrato trissdico
2,5 g
cido ctrico
1,37 g
Glicose
2,0 g
100 ml
Soluo de colgeno 0,05%

A partir da soluo estoque, preparada na concentrao de 0,25% em cido
actico 3%, mantida entre 2-8C, preparada uma di luio em soluo salina para
obter concentrao final de 0,05%.
Soluo de cido Araquidnico 40 mM

O sal sdico de AA adquirido comercialmente (Sigma A8798) foi
ressuspendido em etanol absoluto para preparar uma soluo estoque de
concentrao 40 mM. Foram preparadas alquotas em tubos eppendorf e
armazenadas a -20C.
Soluo de Difosfato de Adenosina 0,4 mM

O ADP foi solubilizado em gua destilada e armazenado em soluo estoque
na concentrao de 20 mM a -20C. A cada experiment o, uma nova soluo de ADP
na concentrao de 0,4 mM era preparada utilizando gua destilada como diluente.
31
Soluo de U46619 0,4 mM

A soluo comercial de U46619 tem como solvente o acetato de metila. O
solvente foi removido por secagem em atmosfera de nitrognio. Em seguida,
adicionou-se etanol absoluto para obter uma soluo estoque de 0,4 mM. Alquotas
foram preparadas e armazenadas a -20C.
3.3
MONITORIZAO DA AGREGAO PLAQUETRIA
3.3.1 Mtodo turbidimtrico
A atividade antiagregante plaquetria dos compostos foi determinada in vitro

em plasma rico em plaquetas (PRP) citratado de coelhos e humano atravs do
mtodo turbidimtrico descrito por Born & Cross (1962), monitorada em um
agregmetro Chrono-Log modelo 560-CA. Esse mtodo consiste na monitorao da
agregao plaquetria atravs da transmitncia de luz. Um feixe de luz de
comprimento de onda 240 nm atravessa o PRP, suspenso opaca de plaquetas
correspondendo a 0% de transmitncia, que aps a adio do agente agregante
torna-se
progressivamente
translcida
proporcionalmente
formao
dos
agregados, permitindo maior passagem de luz e conseqente aumento da

transmitncia. O aparelho calibrado para que o PRP corresponda a 0% de
transmitncia e o plasma pobre em plaquetas (PPP) corresponda a 100% de
transmitncia (Figura 14). Os registros da agregao foram obtidos atravs do
software AggroLink v. 5.1.
A agregao plaquetria foi registrada at atingir o mximo de agregao e
durante, no mximo, 5 minutos aps a adio dos agonistas. A agregao
plaquetria foi expressa em percentual de agregao para os agonistas AA, ADP e
32
U46619, e em velocidade de agregao (inclinao da reta tangente curva de

transmitncia de luz) para o colgeno.
Alquotas de PRP (300 l) foram acondicionadas em cubetas siliconizadas e
incubadas a 37C sob agitao de 1200 rpm por um pe rodo mnimo de 1 minuto.
As substncias teste e o veculo empregado (DMSO) foram pr-incubados por
5 minutos antes da adio do agente agregante. A concentrao de DMSO na
amostra no ultrapassou o limite de 1%. As amostras foram analisadas em duplicata
e foram realizados no mnimo de 3 experimentos independentes para cada
substncia.
MTODO PTICO
AGONISTA
Figura 14 Registro do aumento da transmitncia de luz pelo mtodo turbidimtrico

descrito por BORN & CROSS (1962).
3.3.2 Amostras de sangue
Os procedimentos experimentais obedeceram aos princpios ticos da

manipulao animal, seguindo as normas para a prtica didtico-cientfica da
vivisseco de animais de acordo com a lei n 11.79 4 de 08 de outubro de 2008
(BRASIL, 2008).
Foram utilizados coelhos albinos de ambos sexos mantidos no Biotrio do
Laboratrio de Avaliao e Sntese de Substncias Bioativas (LASSBio) da
33
Universidade do Brasil, com livre acesso gua e rao, em condies de

temperatura ambiente variando entre 22 e 26C, com ciclo de claro e escuro de 12h.
Foram utilizados coelhos albinos de ambos sexos, pesando entre 2,5 e 3,5
kg. O sangue foi puncionado da artria central da orelha em citrato de sdio 3,8% na
proporo de 1:9 (V/V).
Plaquetas humanas foram obtidas de voluntrios adultos, saudveis, de
ambos sexos, na faixa etria de 21 a 35 anos, sem uso de medicamentos ou outras
substncias que pudessem interferir no experimento pelo perodo mnimo de 15 dias.
O sangue foi coletado por puno venosa da veia braquial mdia, com auxlio de
scalp 21 e seringa de 20 ml, em citrato 3,8% ou ACD (ensaio com plaquetas
lavadas), na proporo de 9 volumes de sangue para 1 volume de citrato ou ACD.
Todas as amostras de sangue humano empregadas nos estudos foram obtidas de
indivduos voluntrios doadores que assinaram consentimento informado sobre a
utilizao do material doado. No foi realizado qualquer tipo de estudo clnico.
3.3.3 Obteno do PRP e do PPP
Para todas as espcies, o PRP foi obtido por centrifugao a 500 x g por 10
minutos temperatura ambiente. A separao do plasma foi realizada com cuidado
a fim de evitar ativao plaquetria. O PPP foi obtido por centrifugao do sedimento
a 2.000 x g, por 10 minutos, temperatura ambiente.
3.3.4 Agonistas da Agregao
Foram utilizados como agonistas da agregao plaquetria:
34
- Em PRP de coelhos: AA (200 M), colgeno (5 g/ml), ADP (5 M) e

U46619 (3 M).
- Em PRP humano: AA (500 M), colgeno (5 g/ml), ADP (3 M).
As concentraes dos agonistas escolhidas foram as concentraes capazes
de induzir a agregao plaquetria submxima.
Durante o experimento, os
agonistas foram mantidos a 0C.

3.3.5 Contagem de Plaquetas
Uma alquota de 20 l de PRP foi diluda em 980 l de soluo salina-formol
1%. A contagem foi realizada em Cmara de Neubauer e a leitura em microscpio
ptico Olympus, modelo BX 40, aumento de 100x. As suspenses de plaquetas de
coelho e humanas foram utilizadas nas concentraes mdia de 600.000
plaquetas/l e 300.000 plaquetas/l, respectivamente.
3.3.6 Estudo da agregao plaquetria em plaqueta lavada
O sangue foi coletado em 1 volume de ACD para 9 volumes de sangue,

centrifugado por 10 minutos a 500 x g para remoo dos eritrcitos. O PRP foi
centrifugado ento a 2000 x g por 12 minutos para obteno do pellet plaquetrio. O
sobrenadante foi descartado e as plaquetas suspensas em tampo Tyrode de
lavagem. Realizou-se nova centrifugao, descarte do sobrenadante e as plaquetas
foram novamente suspensas no tampo Tyrode. O experimento de agregao foi
realizado utilizando o tampo Tyrode como 100% de transmitncia.
Procedeu-se a agregao conforme descrito em 3.3.1 empregando-se a
trombina 0,05 UI/ml como agente agregante.
35
3.3.7 Estudo indireto da atividade inibidora de fosfodiesterases em plaqueta

humana lavada
A atividade qualitativa sobre a inibio de PDE foi avaliada indiretamente

utilizando plaqueta humana lavada estimulada por trombina 0,5 UI/ml na presena
ou ausncia do doador de xido ntrico, SNP (10 M) e inibidor de PDE3 (milrinona
100 M), monitorada atravs de mtodo turbidimtrico conforme descrito na seo
3.3.1. Os compostos foram avaliados entre 100-300 M, pr-incubados por 1 minuto
com SNP ou SNP + milrinona antes da adio de trombina. O registro da agregao
foi realizado por 2 minutos (DICKINSON et al., 1997).
3.3.8 Estudo do efeito da inibio da guanilato ciclase estimulada por NO na

agregao plaquetria em PRP citratado de coelhos e humano
inibidor
da
guanilato
ciclase
estimulada
por
NO,
ODQ,
1-H-
[1,2,4]oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-1-ona, foi incubado na concentrao de 10 M por

5 minutos em PRP humano ou de coelhos e, posteriormente, foram adicionados os
compostos teste na concentrao de 100 M, incubados por mais 5 minutos. O
colgeno (5 g/ml) foi empregado como agonista da agregao plaquetria,
monitorada conforme descrito na seo 3.3.1 (JANG et al., 2002). O composto SNP
foi utilizado como controle positivo (10-100 M).
36
3.3.9 Estudo do efeito da inibio da adenilato ciclase na agregao

plaquetria em PRP citratado de coelhos e humano
O inibidor de adenilato ciclase, 2, 5 dideoxiadenosina (DDA), foi incubado na

concentrao de 100 M por 5 minutos em PRP de coelhos e, posteriormente, foram
adicionados os compostos teste na concentrao de 100 M, incubados por mais 5
minutos. O colgeno (5 g/ml) foi empregado como agonista da agregao
plaquetria, monitorada conforme descrito na seo 3.3.1. O inibidor da agregao
plaquetria adenosina, agonista do receptor A2A acoplado protena Gs, foi utilizado
como controle positivo (JANG et al., 2002).
3.3.10 Estudo do efeito da inibio de PKA na agregao plaquetria em PRP

de coelhos e humano
O inibidor de PKA, KT-5720, foi incubado na concentrao de 5 M por 5

minutos e, posteriormente, foram adicionados os compostos teste na concentrao
de 100 M e incubados por mais 5 minutos. O colgeno (5 g/ml) foi empregado
como agonista da agregao plaquetria, monitorada conforme descrito na seo
3.3.1. O nitroprussiato de sdio (SNP), doador de xido ntrico, foi utilizado como
controle positivo (LI et al., 2003).
3.3.11 Estudo da agregao plaquetria em sangue humano total
A agregao plaquetria em sangue humano total foi realizada atravs do

mtodo de impedncia. A impedncia foi medida em sangue diludo em soluo
fisiolgica (NaCl 0,9%) na proporo 1:1 atravs do uso de eletrodos apropriados. O
37
colgeno (20 g/ml) foi empregado como agonista e o registro da impedncia feito
em /min (CARDINAL & FLOWER, 1980).
3.3.12 Estudo da secreo plaquetria atravs da medida da luminescncia

(FEINMAN et al., 1977)
A reao de secreo plaquetria foi medida atravs da quantificao do ATP

secretado por luminescncia empregando-se o reagente luciferina-luciferase. O
reagente adicionado suspenso de plaquetas quatro minutos antes da adio do
agonista (colgeno 5 g/ml). A luciferina/luciferase reage com o ATP liberado a partir
dos grnulos de estocagem, degradando-o em AMP, com emisso de ftons de
energia (luminescncia). A intensidade de luminescncia previamente calibrada na
presena de uma concentrao de 2 nM de ATP, estabelecendo um ganho no
aparelho que permite o registro da luminscncia em torno de 50%. Os resultados de
secreo foram obtidos atravs da seguinte relao:
nM ATP secretado = luminescncia do ensaio/ganho do ensaio x ganho do

padro/luminescncia do padro x nM ATP padro
3.4
DOSAGEM DE TXB2 EM SANGUE HUMANO
Foi procedido o ensaio de agregao plaquetria em PRP humano citratado

conforme descrito na seo 3.3.1 e empregando-se o AA como agonista na
concentrao de 500 M concentrao capaz de produzir agregao paquetria
38
submxima em plaquetas humanas. Aps 5 minutos da adio de AA, a reao de

formao de TXB2 foi interrompida pela adio de indometacina 10 M e EDTA 2
mM. O plasma foi ento centrifugado a 6.000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante
recolhido e armazenado entre 2-8C para posterior d osagem de TXB2. A dosagem
foi realizada por kits de ensaio imunoenzimtico, conforme orientao do fabricante.
As amostras foram lidas em espectrofotmetro no comprimento de onda de 450 nm.
3.5
ANLISE ESTATSTICA
Todos os resultados foram analisados por ANOVA One Way seguido do teste
de Dunnet ou pelo teste t de Student, ambos testes para um nvel de significncia
de *p<0,05. Os resultados foram expressos em mdia erro padro da mdia
utilizando o programa Prisma Plot verso 4.0. Os valores de CI50 (concentrao da
substncia inibitria que produz 50% de inibio da resposta) foram obtidos atravs
de regresso no linear.
39
4.1
RESULTADOS E DISCUSSO
ESTUDO DE TRIAGEM DA ATIVIDADE ANTIAGREGANTE PLAQUETRIA

DOS
NOVOS
DERIVADOS
N-ACILIDRAZNICOS
ANLOGOS
AO
LASSBio-129
4.1.1 Avaliao dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria

(AP) induzida por AA (200 M) em PRP citratado de coelhos
Os compostos LASSBio-129, LASSBio-1003, LASSBio-1215, LASSBio-1217,

LASSBio-1220, LASSBio-1221, LASSBio-1222, LASSBio-1223 e LASSBio-1276, na
concentrao de 100 M, foram capazes de inibir significativamente a agregao
plaquetria (AP) induzida por AA (Tabela 2). Cinco dos compostos LASSBio-1220,
LASSBio-1222, LASSBio-1223, LASSBio-1003 e LASSBio-1276 - inibiram a
agregao em 100%. o frmaco dantroleno, prottipo utilizado no planejamento
estrutural, no apresentou atividade inibitria.

induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP citratado de coelhos
Os compostos LASSBio-1215, LASSBio-1220, LASSBio-1222, LASSBio1223, LASSBio-1003 e LASSBio-1276, na concentrao de 100 M, inibiram
significativamente a AP induzida por colgeno de 50-76% (Tabela 3).
Todos os seis compostos ativos frente a esse agonista tambm inibiram a
agregao plaquetria induzida por AA, o que sugere que o mecanismo de inibio
40
possa estar relacionado cascata do AA, j que a formao de TXA2 uma via
comum ao de ambos agonistas.
Tabela 2 - Efeito dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria induzida
por cido araquidnico (200 M) em PRP citratado de coelho
Substncia (100 M)
% Agregao
%Inibio
AA 200 M
70,1 3,9
60,7 6,0
14,0 n.s.
LASSBio-129
16,9 12,4
72,1**
LASSBio-1003
0,0 0,0
100**
LASSBio-1214
61,0 13,7
-0,5 n.s.
LASSBio-1215
4,3 3,0
93,0**
LASSBio-1216
69,8 6,2
-14,9 n.s.
LASSBio-1217
15,7 11,0
74,1**
LASSBio-1218
53,8 19,4
11,4 n.s.
LASSBio-1219
56,3 19,3
7,2 n.s.
LASSBio-1220
0,0 0,0
100**
LASSBio-1221
28,5 11,6
53,0*
LASSBio-1222
0,0 0,0
100**
LASSBio-1223
0,0 0,0
100**
LASSBio-1267
49,4 13,2
18,6 n.s.
LASSBio-1268
61,7 4,1
-1,6 n. s.
LASSBio1275
58,0 4,9
4,5 n.s.
LASSBio-1276
0,0 0,0
100**
Dantroleno
62,3 4,4
-2,6 n.s.
DMSO
Resultados expressos em mdia erro padro; n = nmero de experimentos independentes; n.s. =

no significativo; *p<0,05, **p<0,01 (ANOVA oneway; Dunnet test). Substncias foram incubadas com
o PRP 5 min antes da adio do agonista. #A concentrao de veculo nas amostras no excedeu 1%.
41
Tabela 3 - Efeito dos compostos na agregao plaquetria induzida por colgeno (5

g/ml) em PRP citratado de coelho
Substncia (100 M)
% Agregao/minuto
%Inibio
Colgeno 5 g/ml
58,5 4,1
62,0 1,6
5,9 n.s.
LASSBio-129
55,0 3,5
11,3 n.s.
LASSBio-1003
31,2 3,2
49,6**
LASSBio-1214
60,0 4,6
3,2 n.s.
LASSBio-1215
15,0 2,9
75,8**
LASSBio-1216
53,5 3,7
13,7 n.s.
LASSBio-1217
51,0 1,0
17,7 n.s.
LASSBio-1218
60,7 2,5
2,1 n.s.
LASSBio-1219
47,8 6,7
22,9 n.s.
LASSBio-1220
17,5 5,4
71,7**
LASSBio-1221
48,1 5,2
22,4 n.s.
LASSBio-1222
19,2 5,9
69,0**
LASSBio-1223
18,5 6,0
70,2**
LASSBio-1267
57,7 3,0
6,9 n.s.
LASSBio-1268
63,5 1,0
-2,4 n.s.
LASSBio1275
60,7 2,9
2,1 n.s.
LASSBio-1276
27,8 2,6
55,2**
Dantroleno
74 5,1
-19,3 n.s.
DMSO
Resultados expressos em mdia erro padro; n = 3 (nmero de experimentos independentes); n.s.

= no significativo; **p<0,01 (ANOVA oneway; Dunnet test). Substncias foram incubadas com o PRP
5 min antes da adio do agonista. #A concentrao de veculo nas amostras no excedeu 1%.
42

induzida por ADP (5 M) em PRP citratado de coelhos
Os derivados LASSBio-1215 e LASSBio-1276, na concentrao de 100 M,

foram os nicos capazes de inibir significativamente a agregao induzida por ADP,
embora esta inibio tenha se apresentado de forma mais moderada comparada
com os agonistas anteriores (Tabela 4).

induzida por U46619 (3 M) em PRP citratado de coelhos
Nenhum dos compostos foi capaz de inibir a agregao plaquetria induzida

pelo anlogo de PGH2, U46619, agonista do receptor TP, na concentrao de 100
M (Tabela 5).
4.1.5 Avaliao dos derivados N-Acilidraznicos na agregao plaquetria

induzida por PAF (1 M) em PRP citratado de coelho
Os derivados mais ativos foram avaliados na concentrao de triagem (100

M) frente ao PAF. No foi observado efeito antiagregante plaquetrio significativo
(Grfico 1A).
43
Tabela 4 - Efeito dos compostos na agregao plaquetria induzida por ADP (5 M)

em PRP citratado de coelho
Substncia (100 M)
% Agregao
%Inibio
57,9 4,5
54,5 1,9
5,8 n.s.
LASSBio-129
46,8 3,3
14,1 n.s.
LASSBio-1003
53,3 3,1
2,2 n.s.
LASSBio-1214
46,2 2,4
15,2 n.s.
LASSBio-1215
40,5 2,0
25,7*
LASSBio-1216
48,9 4,4
10,3 n.s.
LASSBio-1217
46,0 0,6
15,6 n.s.
LASSBio-1218
44,5 4,1
18,3 n.s.
LASSBio-1219
45,8 3,0
15,9 n.s.
LASSBio-1220
55,3 1,5
1,4 n.s.
LASSBio-1221
49,5 1,1
9,2 n.s.
LASSBio-1222
44,3 8,4
18,7 n.s.
LASSBio-1223
46,3 2,3
15,0 n.s.
LASSBio-1267
55,0 1,3
0,0 n.s.
LASSBio-1268
57,8 3,4
0,0 n.s.
LASSBio1275
50,3 0,9
7,7 n.s.
LASSBio-1276
42,2 3,5
22,6*
ADP 5 M
DMSO
Dantroleno
No realizado

no significativo; *p<0,05 (ANOVA oneway; Dunnet test). Substncias foram incubadas com o PRP 5
min antes da adio do agonista. # A concentrao de veculo nas amostras no excedeu 1%.
44
Tabela 5 - Efeito dos compostos na agregao plaquetria induzida por U46619 (3

M) em PRP citratado de coelho
Substncia (100 M)
% Agregao
%Inibio
60,0 1,8
8,3 n.s.
LASSBio-129
65,0 2,0
6,7 n.s.
LASSBio-1003
60,0 8,4
3,3 n.s.
LASSBio-1214
56,0 5,2
6,7 n.s.
LASSBio-1215
52,0 2,8
13,3 n.s.
LASSBio-1216
44,0 6,3
26,7 n.s.
LASSBio-1217
54 ,0 6,9
10,0 n.s.
LASSBio-1218
53,0 5,1
11,6 n.s.
LASSBio-1219
52,0 2,6
13,3 n.s.
LASSBio-1220
49,0 4,0
18,3 n.s.
LASSBio-1221
62,0 3,0
3,3 n.s.
LASSBio-1222
52,0 5,5
13,3 n.s.
LASSBio-1223
53,0 4,6
11,7 n.s.
LASSBio-1267
58,0 0,0
3,3 n.s.
LASSBio-1268
70,0 2,6
16,7 n.s.
LASSBio1275
59,0 7,2
1,7 n.s.
LASSBio-1276
47,0 14,0
21,7 n.s.
DMSO
Dantroleno
No realizado

no significativo; *p<0,05 (ANOVA oneway; Dunnet test). Substncias foram incubadas com o PRP 5
min antes da adio do agonista. # A concentrao de veculo nas amostras no excedeu 1%.
45
4.1.6 Avaliao dos derivados N-Acilidraznicos na agregao plaquetria

induzida por trombina (0,5 UI/ml) em plaqueta de coelho lavada
Tendo em vista a relevante atividade antiagregante plaquetria observada em

PRP de coelhos, os compostos mais ativos (100 M) foram avaliados em plaqueta
lavada de coelhos frente trombina 0,5 UI/ml. Nenhum dos compostos apresentou
atividade relevante frente a esse agonista (Grfico 1B).
PAF 1 M
Trombina 0,5UI/ml
100
80
% Agregao
80
60
40
60
40
20
20
Compostos 100 uM
0.
5U
Tr
om
bi
na
PA
F
1u
M
LA D
SS M S
LA B O
SS io 1
LA Bio 29
SS 12
LA Bio 15
SS 12
LA Bio 20
SS 12
LA Bio 22
SS 12
LA Bio 23
SS 10
0
B
io 3
12
76
I/m
LA D l
M
S
S
LA SB O
SS io 1
LA Bio 29
SS 12
LA Bio 15
SS 12
LA Bio 20
SS 12
LA Bio 22
SS 12
LA Bio 23
SS 10
0
B
io 3
12
76
% Agregao
100
Compostos 100 uM
Grfico 1 Efeito dos compostos N-acilidraznicos mais ativos na agregao

plaquetria induzida por PAF 1 M em PRP de coelhos; e trombina 0,5 UI/ml em
plaqueta de coelhos lavada. n = 3 experimentos independentes.
Os estudos de triagem permitiram a seleo de um grupo de oito compostos

que apresentaram atividade significativa na agregao induzida por AA e de seis
compostos ativos na agregao induzida por colgeno. A potente atividade desses
compostos frente a esses dois agonistas aponta para um mecanismo de ao sobre
a cascata do AA, uma vez que ambos ativam a plaqueta por uma via comum que
envolve a participao de metablitos do AA (KARNIGUIAN et al.,1990). A atividade
antiagregante plaquetria dos derivados N-acilidraznico se d, possivelmente, pela
46
inibio da enzima COX-1, principal isoforma encontrada na plaqueta, e/ou pela

inibio da enzima tromboxana sintase. A ao inibitria sobre o receptor de TXA2,
TP, pode ser excluda, uma vez que os compostos foram incapazes de inibir a AP
induzida pelo agonista desse receptor, U46619. Alm disso, em PRP de coelhos, a
agregao induzida por ADP no majoritariamente dependente da formao de
TXA2 e os compostos da srie no apresentaram atividade inibitria da agregao
induzida por esse agonista. Da mesma forma, a inatividade frente aos demais
agonistas cujas vias de sinalizao so independentes do metabolismo do AA,
reforam essa hiptese.
Os compostos mais ativos (Tabela 6) foram selecionados para os estudos de
potncia. Esses estudos permitiro identificar possveis diferenas na atividade
observada resultantes das modificaes estruturais propostas.
Tabela 6 Compostos selecionados para estudos de potncia
Compostos
O
LASSBio-1003
LASSBio-1221
O
O
NO2
LASSBio-1222
O
N
H
LASSBio-1223
Br
O
N
H
Br
O
O
O
O
N
LASSBio-1220
NO2
O
N
LASSBio-1217
LASSBio-1215
O
N
LASSBio-1276
O
O
NO2
47
4.2
ESTUDOS DE POTNCIA
4.2.1 Determinao da potncia dos derivados N-acilidraznicos na agregao

plaquetria induzida por AA (200 M) em PRP citratado de coelhos
Depois de identificados os compostos mais ativos frente aos principais

agonistas da agregao plaquetria, foi iniciado o estudo de determinao de suas
potncias (CI50) na agregao induzida por AA em PRP citratado de coelhos (Tabela
7; Figuras 15-17).
Os compostos foram testados individualmente em concentraes crescentes
de 0,3 M, 1 M, 3 M, 10 M, 30 M, 100 M e 300 M.

induzida por AA (200 M) em PRP citratado de coelho
Compostos
CI50 (M)
LASSBio-129
30,1 (29,8 30,4)
LASSBio-1003
1,2 (0,4 3,4)
LASSBio-1215
0,7 (0,6 1,1)
LASSBio-1217
47,4 (43,8 51,3)
LASSBio-1220
1,7 (0,9 3,1)
LASSBio-1221
29,6 (27,6 31,7)
LASSBio-1222
2,0 (1,9 2,2)
LASSBio-1223
7,9 (6,2 10,2)
LASSBio-1276
23,2 (23,1 23,4)
Resultados de CI50 com intervalo de confiana de 95% do valor de CI50. n= nmero de experimentos
independentes. Substncias foram incubadas com o PRP 5 min antes da adio do agonista
48
LASSBio-129
100
N
H
80
% Inibio
O
O
60
40
30,1 M
20
CI50 = 30,1 M
-6
-5
-4
L o g [L AS S B io 12 9] M
-3
LASSBio-1003
100
% Inibio
O
O
80
60
40
20
0
CI50 = 1,2 M
-7
-6
-5
Log [LASSBio 1003] M
LASSBio-1215
O
O
NO 2
% In ibio
100
80
60
40
20
0
CI50 = 0,7 M
-7
-6
-5
-4
L og [L AS S B io 12 15] M
LASSBio-1220
O
O
CI50 = 1,7 M
% Inibio
100
80
60
40
20
0
-7
-6
-5
-4

agregao plaquetria induzida por AA (200 M) em PRP de coelho
49
LASSBio-129
100
N
H
% Inibio
O
O
80
60
40
30,1 M
20
0
CI50 = 30,1 M
-6
-5
-4
-3
LASSBio-1222
O
O
Br
O
% Inibio
100
80
60
40
20
0
CI50 = 2,0 M
-7
-6
-5
-6
-5
-4
LASSBio-1223
O
O
N
H
Br
O
% Inibio
100
80
60
40
20
0
CI50 = 7,9 M

derivados LASSBio-129, LASSBio-1222 e LASSBio-1223 na agregao plaquetria
induzida por AA (200 M) em PRP de coelho
50
LASSBio-129
100
N
H
% Inibio
O
O
80
60
40
30,1 M
20
0
CI50 = 30,1 M
-6
-5
-4
-3
LASSBio-1276
O
O
NO2
% Inibio
100
80
60
40
23,2 M
20
0
CI50 = 23,2 M
-6
-5
-4
-3
LASSBio-1217
100
N
H
% Inibio
O
O
80
60
40
47,4 M
20
0
CI50 = 47,4 M
-6
-5
-4
-3
LASSBio-1221
O
O
NO 2
% Inibio
100
80
60
40
20
0
CI50 = 29,6 M
-6
-5
-4

agregao plaquetria induzida por AA (200 M) em PRP de coelho
51
4.2.2 Determinao
da
potncia
dos
compostos
N-acilidraznicos
na
agregao plaquetria induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP citratado

de coelhos
Foi realizado estudo da potncia antiagregante plaquetria dos compostos

mais ativos frente ao colgeno em PRP citratado de coelhos atravs da
determinao das respectivas CI50 (Tabela 8; Figuras 18 e 19).
Os compostos foram testados individualmente em concentraes crescentes
de 0,3 M, 1 M, 3 M, 10 M, 30 M, 100 M e 300 M.

induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP citratado de coelho
Compostos
CI50 (M)
LASSBio-129
156,1 (114,4-212,9)
LASSBio-1003
8,2
(6,0 11,1)
LASSBio-1215
4,5
(3,9 5,1)
LASSBio-1220
6,1
(4,3 8,5)
LASSBio-1222
6,0
(4,9 7,4)
LASSBio-1223
47,7
(39,7 57,3)
LASSBio-1276
41,2
(32,7 51,7)
Resultados de CI50 com intervalo de confiana de 95% do valor de CI50. n= no. de experimentos
independentes. Substncias foram incubadas com o PRP 5 min antes da adio do agonista.
52
LASSBio-129
100
N
H
% Inibio
O
O
80
60
40
20
0
CI50 = 156,1 M
-6
-4
Log [LASSBio 129] M
LASSBio-1003
100
% Inibio
O
O
80
60
40
20
CI50 = 8,2 M
0
-6
-4
LASSBio-1215
100
NO 2
% Inibio
80
60
40
20
CI50 = 4,5 M
0
-8
-6
-4
LASSBio-1220
100
% Inibio
80
60
40
20
CI50 = 6,1 M
0
-8
-6
-4

agregao plaquetria induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP de coelho
53
LASSBio-129
100
N
H
% Inibio
O
O
80
60
40
20
CI50 = 156,1 M
0
-6
-4
Log [LASSBio 129] M
LASSBio-1222
100
Br
O
% Inibio
80
60
40
20
CI50 = 6,0 M
0
-6
-4
LASSBio-1223
100
N
H
Br
O
% Inibio
80
60
40
20
CI50 = 47,7 M
0
-6
-4
LASSBio-1276
100
CI50 = 41,2 M
NO2
% Inibio
80
60
40
20
0
-6
-4

agregao plaquetria induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP de coelho
54
4.3
ESTUDO DA RELAO ESTRUTURA x ATIVIDADE DOS DERIVADOS NACILIDRAZNICOS
Buscando identificar os compostos mais ativos da srie e compreender o

perfil de atividade frente s modificaes estruturais propostas, foram iniciados os
estudos de potncia.
Com base nos estudos de potncia, podemos identificar dois grupos de
derivados de acordo com a ordem de grandeza da potncia (CI50) apresentada
frente ao AA: o primeiro grupo, formado pelos compostos LASSBio-1215, LASSBio1220,
LASSBio-1222,
LASSBio-1223
LASSBio-1003
(Figura
20),
que
apresentaram valores de CI50 entre 0,7 M e 8 M; e o segundo grupo, formado

pelos compostos LASSBio-1217, LASSBio-1221 e LASSBio-1276 (Figura 21), que
apresentaram valores de CI50 entre 23 M e 47 M.
O
O
N
H
LASSBio-129
O
O
O
N
NO 2
O
LASSBio-1003
LASSBio-1215
Br
O
O
O
O
LASSBio-1222
O
N
N
H
Br
O
LASSBio-1220
LASSBio-1223
Figura 20 Compostos de potncia elevada - potncias entre 0,7 M e 8 M
55
O
O
NO2
NO 2
LASSBio-1276
LASSBio-1221
O
N
H
LASSBio-1217
Figura 21 Compostos de potncia moderada: potncias entre 23 M e 47 M
O primeiro grupo apresentou atividade otimizada em relao ao seu prottipo

LASSBio-129.
A introduo do grupo metila no nitrognio amdico da acilidrazona
representou um importante incremento da atividade antiagregante plaquetria, o que
pode ser observado se comparamos as atividades de todos os compostos metilados
da srie em relao a seus anlogos no metilados (Tabela 9). Esses resultados
corroboram aqueles observados na potencializao da atividade antiagregante
plaquetria de derivados tienilacilidraznicos atravs da introduo de substituintes
no N-amdico do grupamento N-acilidrazona (KMMERLE, 2005; BRITO, 2005).
A introduo de substituintes na posio 5 do anel furnico, com exceo dos
substituintes bromo e nitro, representou uma perda significativa da atividade, a
exemplo de LASSBio-1216 e LASSBio-1221, com substituinte p-nitrofenila, e de
LASSBio-1219,
LASSBio-1267,
LASSBio-1268
LASSBio-1275,
com
as
subunidades metileno amina cclica (Tabela 9). Analisando a potncia do derivado

LASSBio-1215 (CI50 = 0,7 M frente ao AA e 4,5 M frente ao colgeno), podemos
observar que a introduo do grupamento nitro (NO2) conferiu a este o dobro da
potncia em relao ao seu anlogo no substitudo, LASSBio-1003 (CI50 = 1,2 M
frente ao AA e 8,2 M frente ao colgeno).
56
Tabela 9 Tabela comparativa da atividade antiagregante plaquetria dos derivados

N-acilidraznicos metilados e no-metilados (100 M) na AP induzida por colgeno
(5 g/ml) e AA (200 M) em PRP de coehos.
%
Inibio
AA Col
Composto
LASSBio-129
LASSBio-1003
O
O
O
N
H
72,1 11,3
100
49,6
LASSBio-1214
LASSBio-1215
O
O
O
N
H
n.s.
NO 2
n.s.
NO 2
93,0 75,8
LASSBio-1216
LASSBio-1221
O
O
%
Inibio
AA Col
Composto
N
H
NO 2
n.s.
n.s.
O
O
NO 2
53,0
n.s.
100
69,0
100
71,7
100
55,2
n.s.
n.s.
18,6
n.s.
LASSBio-1223
LASSBio-1222
O
O
O
N
H
100
Br
O
70,2
Br
LASSBio-1217
LASSBio-1220
O
O
O
N
H
74,1
n.s.
LASSBio-1218
LASSBio-1276
O
O
O
N
H
NO 2
11,4
n.s.
NO 2
LASSBio-1219
LASSBio-1268
O
O
O
N
H
n.s.
n.s.
O
O
N
H
LASSBio-1275
LASSBio-1267
S
N
N
O
O
O
N
H
11,8
n.s.
O
O
O
N
H
57
Por outro lado, a introduo do tomo bromo, presente em LASSBio-1223,

significou um importante aumento da atividade observada, uma vez que este
composto foi o anlogo no metilado mais potente da srie, sendo sua potncia
comparvel dos compostos N-metilados na agregao plaquetria induzida por AA
(Tabela 7). Vale a pena ressaltar que na srie de compostos tienilacilidraznicos, o
composto bromo-substitudo, LASSBio-789 (CI50 = 3,1 M frente ao AA e 3,4 M
frente ao colgeno), tambm representou incremento de atividade antiagregante
plaquetria em relao ao seu prottipo no substitudo, LASSBio-294 (CI50 = 15,3
M frente ao AA e 18,3 M frente ao colgeno) (BRITO, 2005).
Pode-se inferir que, na inibio da agregao plaquetria induzida por AA, a
introduo do substituinte bromo representa um incremento de atividade to
importante quanto a N-metilao em relao ao prottipo, sugerindo que este tomo
esteja conferindo molcula propriedades diferentes que otimizam seu perfil
antiagregante plaquetrio. Sabe-se que os grupos Br e NO2 exercem um efeito
retirador de eltrons sobre o anel heterocclico, sendo o grupo NO2 mais retirador
que o grupo Br. No entanto, esses substituintes se diferenciam bastante com relao
lipofilicidade (RODRIGUES, 2008), indicando provavelmente que o efeito
antiagregante plaquetrio deve estar mais provavelmente relacionado ao carter
lipoflico conferido pelo substituinte Br.
curioso notar que o derivado N-metilado com substituinte bromo, LASSBio1222, no apresentou atividade superior ao anlogo N-metilado no substitudo,
LASSBio-1003 (Tabela 7), o que sugere que as propriedades conferidas por essas
modificaes estruturais em diferentes regies da molcula no se somam, ou seja,
contribuem por mecanismos independentes e diferentes para o incremento da
atividade antiagregante plaquetria induzida por AA.
58
A estratgia de homologao parece no interferir na atividade antiagregante

plaquetria uma vez que os compostos vinlogos LASSBio-1220 e LASSBio-1217
no apresentaram incremento nem perda de atividade em relao a seus anlogos
no homologados LASSBio-1003 e LASSBio-129. A introduo do substituinte nitro
nos compostos homlogos representou perda de atividade, o que pode ser
observado nos derivados LASSBio-1276 e LASSBio-1218 quando comparados a
seus anlogos vinlogos LASSBio-1220 e LASSBio-1217, respectivamente.
Na agregao plaquetria induzida por colgeno, de forma anloga, tambm
se distingue dois grupos de derivados em funo da ordem de grandeza da potncia
observada. LASSBio-1003, LASSBio-1215, LASSBio-1220 e LASSBio-1222 (valores
de CI50 entre 4 M e 8 M) e LASSBio-1223 e LASSBio-1276 (valores de CI50 48 M
e 41 M, respectivamente). Todos os compostos apresentaram atividade otimizada
em relao ao prottipo LASSBio-129 frente a esse agonista. O composto LASSBio1223 foi menos ativo que seu anlogo N-metilado, indicando que, frente a esse
agonista, a contribuio do grupo metila mais importante do que a contribuio do
tomo bromo na posio 5 do anel furnico.
Os compostos LASSBio-1003 e LASSBio-1215 destacam-se, portanto, como
os mais ativos da srie.
A fim de melhor caracterizar o perfil de atividade da srie, os compostos mais
ativos foram estudados em plaquetas humanas induzidas por colgeno (5 g/ml) e
ao ADP (3 M).
59
4.4
ESTUDO
DA
AO
DOS
COMPOSTOS
N-ACILIDRAZNICOS
EM
PLAQUETAS HUMANAS
4.4.1 Efeito dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria

induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP humano citratado
Os compostos foram avaliados na agregao plaquetria induzida por

colgeno nas concentraes de 100 M e 300 M. Nenhum dos compostos foi
capaz de inibir significativamente a agregao plaquetria na concentrao de 100
M. Na concentrao de 300 M, os compostos LASSBio-1215, LASSBio-1223 e
LASSBio-1003 inibiram significativamente a agregao plaquetria em PRP humano
(Tabela 10).
induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP humano
Substncia
Colgeno 5 g/ml
#
% Agregao/
%
min
Inibio
[LASSBio] 100 M
%Agregao/
%
min
Inibio
[LASSBio] 300 M
111,3 4,7
111,5 8,5
125,8 9,9
107,5 11,5
DMSO
LASSBio-129
114,0 18,0
9,3 n.s.
102,5 7,5
4,7 n.s.
LASSBio-1003
91,3 18,2
27,4 n.s.
18,0 4,0
83,3*
LASSBio-1215
98,3 9,3
21,9 n.s.
28,5 7,5
73,5*
LASSBio-1220
122, 13,5
2,6 n.s.
92,0 9,0
14,4 n.s.
LASSBio-1222
120,5 13,5
4,2 n.s.
68,0 11,0
36,7 n.s.
LASSBio-1223
101,7 5,3
19,2 n.s.
59,5 11,5
44,7*
LASSBio-1276
113,0 11,9
10,1 n.s.
112,0 3,0
Resultados expressos em mdia desvio padro mdio; nmero de experimentos independentes = 3;

n.s. = no significativo; *p<0,05 (ANOVA oneway; Dunnet test). Substncias foram incubadas com o
PRP 5 min antes da adio do agonista. # A concentrao de veculo nas amostras no excedeu 1%.
60
4.4.2 Efeito dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria

induzida por ADP (3 M) em PRP humano citratado
Na agregao plaquetria induzida por ADP em plaquetas humanas,

observada uma segunda onda de agregao em funo da concentrao
empregada. Essa uma caracterstica da resposta desse agonista em PRP humano
e est relacionado formao de TXA2 (CAZENAVE et al., 1983). Essa segunda
onda de agregao completamente inibida pelo cido acetilsaliclico (AAS) e pela
indometacina.
A maioria dos derivados testados foi capaz de inibir completamente a
segunda onda da agregao plaquetria induzida por ADP em PRP humano. Os
derivados LASSBio-129 e LASSBio-1221 bloquearam parcialmente esse fenmeno
(Tabela 10, Grfico 2). Esse resultado indica uma possvel ao dessas substncias
sobre as enzimas da cascata do cido araquidnico responsveis pela formao de
TXA2, possivelmente COX-1, isoforma predominante na plaqueta, ou tromboxana
sintase (TXS). O derivado LASSBio-1276 no inibiu significativamente o fenmeno.
Nenhum dos compostos foi capaz de inibir significativamente a 1 onda da
agregao. Esses resultados sugerem que a ao antiagregante plaquetria dos
compostos provavelmente no envolve a inibio dos receptores purinrgicos P2Y1
e/ou P2Y12.
Cabe destacar a atividade dos derivados LASSBio-1215 e LASSBio-1223,
que inibiram significativamente a agregao induzida por ADP em torno de 40% e
30%, respectivamente, conferindo-lhes um perfil de atividade antiagregante
plaquetria superior, j que conseguem controlar a AP induzida por diferentes
agonistas em plaquetas humanas (Tabela 11, Grfico 2).
61

induzida por ADP (3 M) em PRP humano
Substncia
(100 M)
%
Agregao
%
Inibio
total
%
Inibio
1 onda
%
Inibio
2 onda
ADP 3M
64,0 4,4
69,3 7,8
53,0 5,5
23,5 n.s.
n.s
96,5*
LASSBio-129
58,0 6,0
16,2 n.s
n.s
41,7*
LASSBio-1003
52,5 6,0
24,5 n.s
n.s
96,1*
LASSBio-1215
42,5 3,8
38,6*
n.s
97,4*
LASSBio-1220
55,5 3,8
19,9 n.s
n.s
97,0*
LASSBio-1221
63,3 5,4
8,7 n.s
n.s
40,4*
LASSBio-1222
55,8 6,6
19,5 n.s
n.s
94,7*
LASSBio-1223
48,5 3,0
30,0*
n.s
88,3*
LASSBio-1276
69,0 7,6
0,4 n.s
n.s
22,4 n.s
DMSO
AAS
Resultados expressos em mdia desvio padro mdio; n = nmero de experimentos independentes;

n.s. = no significativo; *p<0,05 (ANOVA oneway; Dunnet test). Substncias foram incubadas com o
% de Agregao
100
Primeira Onda
Segunda Onda
75
50
25
A
A
S
B
LA io
SS 12
76
B
i
LA o 1
S S 22
1
LA Bio
SS
12
9
B
LA io
SS 12
20
B
LA io
SS 12
22
B
LA io
SS 10
03
B
LA io
1
SS
21
B
5
io
12
23
LA
SS
C
on
tr
ol
e
D
M
SO
Substncias a 100
M
Grfico 2
Inibio da agregao plaquetria induzida por ADP 3 M em PRP
humano citratado
62
4.4.3 Avaliao dos derivados N-acilidraznicos em sangue humano total

O efeito inibidor da formao de agregados/cogulos em sangue total sugere
um potencial antitrombtico. O efeito dos compostos na agregao plaquetria de
sangue humano total foi determinado atravs do registro da impedncia em
plaquetas estimuladas por colgeno (20 g/ml). Os compostos foram testados nas
concentraes de 100 M e 300 M. LASSBio-1003, LASSBio-1215 e LASSBio1223 inibiram significativamente a agregao na concentrao de 300 M. O AAS,
na concentrao de 100 M, tambm no foi capaz de inibir a agregao em sangue
total (Tabela 12).
Tabela 12 Efeito dos compostos em sangue total humano estimulado por colgeno
(20 g/ml)
Substncia
Impedncia
/min
%
Inibio
[LASSBio] 100 M
Impedncia
/min
%
Inibio
[LASSBio] 300 M
Colgeno 20 g/ml
9,9 1,0
11,3 1,2
DMSO#
6,7 0,2
8,4 0,9
AAS
28,7 n.s.
LASSBio-129
7,5 1,9
11,8 n.s.
LASSBio-1003
5,3 1,7
21,6 n.s.
4,5 0,6
46,5*
LASSBio-1215
5,4 1,7
19,9 n.s.
4,3 1,4
49,4*
LASSBio-1220
7,7 1,5
0,0 n.s.
7,5 0,1
11,2 n.s.
LASSBio-1222
6,2 1,8
7,5 n.s.
5,1 0,3
39,4 n.s.
LASSBio-1223
7,7 2,1
0,0 n.s.
4,9 0,3
42,9*
LASSBio-1276
6,5 1,6
3,5 n.s.
8,8 1,1
0 n.s.
Resultados expressos em mdia desvio padro mdio; nmero de experimentos independentes = 3;

n.s. = no significativo; *p<0,05 (teste t de Student no pareado). Substncias foram incubadas com a
amostra 5 min antes da adio do agonista. # A concentrao de veculo nas amostras no excedeu
1%.
63
Os resultados em plaquetas humanas permitiram a identificao de trs

compostos que foram ativos em todos os sistemas estudados: LASSBio-1003,
LASSBio-1215 e LASSBio-1223. Esses resultados apontam e demonstram o
potencial
desses
trs
derivados
como
novos
DE
AO
prottipos
de
substncias
antiagregantes plaquetrias.
4.5
ESTUDO
DO
MECANISMO
DOS
COMPOSTOS
N-
ACILIDRAZNICOS
4.5.1 Efeito dos derivados N-acilidraznicos na formao de TXB2
A fim verificar a provvel ao dos compostos sobre o metabolismo do AA,

foram conduzidos os estudos da produo de seu principal metablito na plaqueta, a
TXA2, atravs da dosagem de seu metablito estvel, a TXB2. Foram selecionados
para este estudo os compostos LASSBio-1003 e LASSBio-1215, devido potente
ao antiagregante apresentada tanto em plaquetas de coelho quanto em plaquetas
humanas, e o composto LASSBio-1276, que mesmo tendo inibido completamente a
agregao plaquetria induzida por AA em PRP de coelhos, no foi capaz de inibir a
segunda onda da agregao induzida por ADP em PRP humano. Os compostos
LASSBio-1003 e LASSBio-1215 inibiram em 100% a AP e inibiram significativamente
a produo de TXB2. O composto LASSBio-1276 inibiu em 100% a agregao
induzida por AA em PRP humano na concentrao de
300 M, sem contudo
interferir na formao de TXA2. Esse resultado corrobora o efeito observado em

plaqueta humana estimulada por ADP, sugerindo que LASSBio-1276 no exerce seu
efeito via inibio da COX-1 ou TXS (Tabela 13).
64
Tabela 13 Efeito dos derivados N-acilidraznicos sobre a produo de TXA2 em

PRP humano estimulado por AA (500 M).
Compostos
N TXB2 (pg/l plasma) % Agregao
AA (500 M)
41,92 4,25
39,35 5,41
6,1 n.s.
PRP
0,45 0,08
Indometacina (10 M)
0,42 0,15
99,0*
LASSBio-1003 (100 M) 3
3,30 2,24
92,1*
LASSBio-1215 (100 M) 4
4,18 1,01
90,0*
LASSBio-1276 (300 M) 5
35,42 7,81
15,5 n.s.
DMSO
% Inibio
Resultados expressos em mdia desvio padro mdio; n=nmero de experimentos independentes;

n.s. = no significativo; *p<0,05 (Oneway ANOVA, Dunnet test). Substncias foram incubadas com o
4.5.2 Estudo de Secreo Plaquetria atravs da medida de luminescncia
Foi utilizado PRP de coelho estimulado por colgeno 5 g/ml para determinar
o efeito dos compostos sobre a reao de secreo plaquetria. Nesse modelo, a
reao de secreo avaliada atravs da medida de luminescncia proporcional
liberao de ATP pelos grnulos plaquetrios, que reage com o marcador
luminescente luciferina-luciferase. Em ensaios preliminares todos os compostos
foram capazes de reduzir em mais de 50% a reao de secreo. Resultados
anteriores de nosso laboratrio mostram que o AAS e a milrinona tambm
apresentam esse efeito (BRITO, 2005).
65
4.6
ATIVIDADE DESAGREGANTE PLAQUETRIA DOS COMPOSTOS NACILIDRAZNICOS
4.6.1 Reverso da agregao plaquetria e desagregao em PRP de coelho.
Foi observado que o derivado LASSBio-1215 foi capaz de desfazer os

agregados plaquetrios formados na agregao plaquetria induzida por ADP, AA e
U46619 em PRP de coelhos, evidenciando um perfil desagregante plaquetrio. Essa
propriedade no foi observada em seu anlogo no nitrado, LASSBio-1003, nem no
derivado homlogo, LASSBio-1220, sugerindo que esse efeito possa ser
dependente da presena do substituinte nitro na posio 5 do anel furnico (Figuras
22 e 23) .
O
O
O
O
LASSBio-1220
LASSBio-1003
O
O
NO 2
LASSBio-1215
Figura
22
promovida
Reverso
por
da
LASSBio-1215
AP
LASSBio-1215
Figura 23 Reverso da AP promovida

por
LASSBio-1215
(100
M)
(100 M) comparada LASSBio-
comparada LASSBio-1220 frente ao
1003 frente ao ADP em PRP de
U46619 em PRP de coelhos.
coelhos.
Figura representativa de 3 experimentos.
Figura
experimentos.
representativa
de
66
A fim de melhor investigar a propriedade desagregante de LASSBio-1215, foi

realizado ensaio adicionando o composto (100 M) aps a induo da agregao
plaquetria em diferentes tempos: 1 minuto aps (Figura 24) e no momento da
agregao mxima observada (Figura 25). Em ambos casos foi observada reduo
da transmitncia de luz, caracterizando um fenmeno de desagregao.
Aumentando a concentrao do composto, observou-se aumento da velocidade de
desagregao e reverso total do agregado plaquetrio (Figura 25).
LASSBio-1003
LASSBio-1215
DMSO
LASSBio-1215
Figura
23
Efeito
desagregante
Figura
24
Efeito
desagregante
plaquetrio do composto LASSBio-
plaquetrio do composto LASSBio-
1215 (100 M) adicionado 1 min aps
1215
do agente agregante (U46619 3 M)
momento
em PRP coelhos.
induzida por AA (200 M) em PRP de
Figura representativa de 3 experimentos.
(300
coelhos.
M)
de
Figura
adicionado
agregao
representativa
no
mxima
de
experimentos.
Na agregao induzida por colgeno, o composto LASSBio-1215 (300 M)

produziu um pequeno efeito desagregante plaquetrio, no sendo capaz, no entanto,
de reverter completamente a agregao plaquetria, como foi observado com os
outros agonistas (Figura 26).
67
DMSO
LASSBio 1215
Figura 25 Efeito desagregante do composto LASSBio-1215 (300 M) e DMSO (1%)

na agregao plaquetria induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP de coelhos.
A agregao se torna irreversvel pela estabilizao da interao plaquetafibrinognio, que envolve a liberao dos constituintes dos grnulos plaquetrios
(HASKEL & ABDSCHEIN, 1989).
Assim, a reversibilidade da agregao s possvel enquanto no houver
secreo completa dos grnulos plaquetrios. Uma vez que agonistas fortes como o
colgeno e a trombina so capazes de induzir a completa secreo granular, podese sugerir porque o composto no foi to efetivo na desagregao frente ao
colgeno. A pequena reverso observada provavelmente devida aos agregados
plaquetrios que no foram suficientemente ativados para secretarem o contedo de
seus grnulos.
68
4.6.2 Efeito desagregante em PRP humano
Foi avaliada a propriedade desagregante plaquetria dos compostos em PRP

humano frente aos principais agonistas da agregao. O composto LASSBio-1215
no foi capaz de promover desagregao dos agregados plaquetrios induzidos por
colgeno (5 g/ml), U46619 (3 M) e AA (500 M), mesmo na concentrao de 300
M.
Na agregao induzida por ADP (3 M), o composto teste ou o veculo foram
adicionados antes do incio da segunda onda de agregao (mximo de agregao
da primeira onda), conforme protocolo descrito por Moser (2003), ou aps ser
atingido o mximo de agregao da segunda onda (HASKEL & ABDSCHEIN, 1989).
O composto LASSBio-1215 reverteu em aproximadamente 80% a agregao
plaquetria quando adicionado ao final da primeira onda (Figura 27 A). Quando
adicionado ao final da segunda onda, o composto foi capaz de reverter apenas
parcialmente a agregao (em torno de 10%) (Figura 27 B). Como, nessa fase, a
reao de secreo j ocorreu, os agregados plaquetrios formados so estveis, o
que impossibilita sua desagregao.
A
fim
de
observarmos
uma
possvel
contribuio
da
inibio
da
ciclooxigenase para o efeito desagregante plaquetrio, foi realizado o mesmo ensaio

na presena de AAS (300 M) aps atingir o mximo de agregao. O AAS tambm
no foi capaz de reverter a segunda onda da agregao plaquetria.
Em baixas concentraes de ADP (1-2 M), quando se observa agregao
reversvel, LASSBio-1215 foi capaz de diminuir a agregao mxima, reduzir o
tempo para se atingir o nvel mximo de agregao e o tempo necessrio para
ocorrer desagregao completa.
69
B
DMSO
LASSBio
1215
LASSBio
-1215
DMSO
LASSBio
LASSBio 1215
1215
LASSBio
-1215
DMSO
DMSO
Figura 26 Efeito desagregante plaquetrio do composto LASSBio-1215 e DMSO na

agregao plaquetria induzida por ADP (3 M) em PRP Humano. A: Adio do
composto (300 M) ou veculo (1%) ao final da primeira onda da agregao. B:
Adio do composto (300 M) ou veculo (1%) aps o mximo da segunda onda de
agregao.
Os compostos LASSBio-1003 e LASSBio-1276 promoveram uma modesta

desagregao quando adicionados ao final da primeira onda de agregao (Figura
28), perfil desagregante similar ao observado por Dominguez-Jimnez e cols. (1999)
nos antiinflamatrios no esterides piroxicam e meloxicam na AP induzida por ADP
em PRP humano.
No mesmo trabalho, Dominguez-Jimnez e cols. (1999) observaram que
alguns frmacos antiinflamatrios no esterides (AINEs) alm de inibirem a
agregao plaquetria eram capazes de acelerar a desagregao plaquetria por
um mecanismo independente da via ciclooxigenase, envolvendo provavelmente a
inibio da ativao da integrina IIb3. Este poderia ser um possvel mecanismo de
ao da atividade desagregante observada para esses compostos.
70
LASSBio-1276
LASSBio-1003
Figura 27 Efeito desagregante plaquetrio dos compostos LASSBio-1276 (300 M)

e LASSBio-1003 (300 M) na agregao plaquetria induzida por ADP (3 M) em
PRP Humano. Adio dos compostos ao final da primeira onda de agregao.
Haskel & Abdschein (1989) demonstraram que o antagonista de integrina

IIb3, RGDY, pode induzir a desagregao plaquetria in vitro de forma
concentrao e tempo dependente. Seus resultados mostram que a extenso e
velocidade da desagregao promovida pelo antagonista diminuem conforme
aumenta o tempo em que ele adicionado. Em seus experimentos, quando o
antagonista foi adicionado 1 minuto aps o agonista (ADP 18 M), foi observado
90% de desagregao, e quando o antagonista foi adicionado 5 minutos aps, a
desagregao foi de 40%. Em trabalho mais recente, Moser e cols. (2003)
demonstraram a desagregao promovida pelos antagonistas da integrina IIb3
abciximabe, tirofibano e eptifibatide, adicionados quando era observada 50% da
agregao mxima esperada.
Os derivados N-acilidraznicos furnicos apresentaram comportamento
semelhante ao dos antagonistas de integrina IIb3, o que pode indicar que o
mecanismo de desagregao envolva o desligamento do fibrinognio com a
71
integrina, possvel somente antes da ocorrncia da reao de secreo plaquetria,

que pode ocorrer por mecanismos distintos, no apenas pelo antagonismo do
receptor. Segundo Haskel & Abdschein (1989) essa fase da agregao pode ser
revertida por EDTA, que desloca o fibrinognio da integrina, mas no pode ser
revertida pelos inibidores de ciclooxigenase, corroborando a idia de que a inibio
da cascata do cido araquidnico no o nico mecanismo de ao envolvido nas
propriedades inibitrias de LASSBio-1215 sobre a plaqueta.
No se pode deixar de considerar uma possvel ao de LASSBio-1215 sobre
o on Ca2+, uma vez que Todeschini e cols. (1996) e Ormelli (1999) demonstraram
que os derivados furnicos LASSBio-2 e LASSBio-160 (Figura 29) apresentam efeito
quelante sobre esse on. Esse poderia ser um possvel mecanismo de ao
desagregante para LASSBio-1215, semelhante ao que se observa para o EDTA.
NO2
N
N
N
N
H
N
LASSBio-2
N
H
LASSBio-160
Figura 28 Compostos furilidraznicos com atividade quelante de Ca2+
Por outro lado, Maayani e cols. (2001a) postulam a hiptese de que

agregao e desagregao so dois processos ativos concorrentes, exemplificados
pela resposta da plaqueta ao ADP. Esses autores propem que a ocupao dos
receptores de ADP, P2Y1 e P2Y12, rege a cintica da resposta plaquetria in vitro
atravs de um ajuste no balano entre agregao e desagregao, sendo a
desagregao um processo atenuado pela ocupao dos receptores P2Y12. Em
outro trabalho, seu grupo mostra que, tanto a ticlopidina quanto o clopidogrel so
72
capazes de acelerar a reverso da resposta agregante plaquetria frente ao ADP em

indivduos tratados (MAAYANI et al., 2001b).
Agentes que aumentam os nveis intracelulares de nucleotdeos cclicos como
a prostaciclina, a milrinona (inibidor de PDE3) e o nitroprussiato (doador de xido
ntrico) tambm so capazes de promover a desagregao plaquetria.
Brito (2005) demonstrou em sua tese de doutorado que os derivados
tienilacilidraznicos promovem o aumento dos nveis de GMPc e modulam a
produo de nucleotdeos cclicos intraplaquetrios. Tais resultados suscitaram a
realizao de um estudo qualitativo sobre a participao destes nucleotdeos nas
atividades antiagregante e desagregante plaquetrias do derivado LASSBio-1215.
4.6.3 Estudo do efeito de LASSBio-1215 no balano de nucleotdeos cclicos
4.6.3.1
Efeito da dideoxiadenosina (DDA) [100 M] na inibio da agregao

plaquetria promovida por LASSBio-1215 (100 M) na AP induzida
por induzida por colgeno 5 g/ml em PRP citratado de coelho.
Foi utilizado um inibidor de adenilato ciclase, a DDA, para avaliar se o efeito

de LASSBio-1215 sobre a plaqueta seria dependente da formao de AMPc pela
ativao da enzima adenilato ciclase, como ocorre com os agonistas inibitrios
PGD2, PGI2 e com a adenosina ao interagir com seu receptor A2A, acoplado
protena Gs. O efeito inibitrio observado pela ao desse ltimo no seu receptor
abolido na presena do inibidor da adenilato ciclase (Figura 30 B) [JANG et al.,
2002).
73
A DDA no interferiu no efeito antiagregante plaquetrio do composto

LASSBio-1215 (100 M) (Figura 30 A), o que sugere que a sua ao plaquetria
no est associada ao aumento de AMPc via estimulao de adenilato ciclase.
A
DDA 100 M +
Adenosina 10 M
LASSBio-1215
100 M
DDA 100 M +
LASSBio-1215
100 M
Adenosina
10 M
Figura 29 Efeito da inibio da formao de AMPc pelo DDA (100 M) na inibio

da agregao plaquetria promovida por LASSBio-1215. Ao inibitria de LASSBio1215 (100 M) na presena de DDA (A). Ao inibitria da adenosina (10 M) na
presena de DDA (B)
4.6.3.2
Efeito do KT-5720 (5 M) na inibio da agregao plaquetria

induzida por colgeno 5 g/ml promovida por LASSBio-1215 (100 M)
em PRP citratado de coelho e humano.
Foi utilizado o composto KT-5720, um inibidor seletivo de protena cinase A

(PKA), para avaliar a relevncia dessa via de sinalizao sobre os efeitos
antiagregante e desagregante plaquetrios observados em LASSBio-1215. O
composto KT-5720 no foi capaz de reverter a inibio da agregao plaquetria
produzida por LASSBio-1215 (100 M) tanto em plaquetas de coelho quanto em
plaquetas humanas.
74
O papel da PKA, efetora da sinalizao celular mediada por AMPc, na

agregao plaquetria envolve a inibio tanto da sinalizao do Ca2+ quanto da
ativao da integrina IIb3 (CAVALLINI et al., 1996; SMITH & SCOTT, 2006). Caso
o efeito inibitrio do composto envolvesse o aumento dos nveis intracelulares de
AMPc, o efeito inibitrio seria revertido na presena do inibidor, o que no foi
observado.
O conjunto desses resultados sugere que a ao desagregante plaquetria
promovida por LASSBio-1215 no envolve o aumento da concentrao intracelular
de AMPc.
4.6.3.3
Avaliao do efeito do ODQ (10 M) na inibio da agregao

plaquetria promovida por LASSBio-1215 (100 M) na AP induzida
por colgeno 5 g/ml em PRP citratado de coelho e humano
O composto ODQ, um inibidor de guanilato ciclase sensvel ao NO, foi

utilizado a fim de avaliar se o efeito de LASSBio-1215 sobre a plaqueta seria
dependente da formao de GMPc.
O SNP um doador de NO que estimula a guanilato ciclase, levando a um
aumento dos nveis intracelulares de GMPc (DUNKERN & HATZELMANN, 2005).
Seu efeito inibitrio sobre a agregao plaquetria foi revertido na presena de
ODQ.
Curiosamente, na presena de ODQ, o efeito inibitrio de LASSBio-1215 foi
potencializado, em vez de revertido (Figura 31 B). O mesmo resultado foi obtido em
PRP humano (Figura 31 A).
75
importante ressaltar que, nesses experimentos, observamos tambm que o

efeito desagregante tanto do SNP quanto o de LASSBio-1215 (Figura 31 A e B) foi
inibido na presena de ODQ, sugerindo que, em ambos casos, o efeito
desagregante parece ser mediado pelo aumento dos nveis de GMPc intracelulares.
A
SNP 30 M +
ODQ 10 M
LASSBio-1215
100 M
SNP 30 M
LASSBio-1215
100 M + ODQ 10 M
Figura 30 Efeito da inibio da formao de GMPc pelo ODQ (10 M) na inibio

da agregao plaquetria promovida por LASSBio-1215 em PRP de humano. Ao
inibitria do SNP (30 M) na presena de ODQ (A). Ao inibitria de LASSBio-1215
(100 M) na presena de ODQ (B).
Para confirmar esta hiptese, realizamos o ensaio de desagregao do
composto LASSBio-1215 sozinho e na presena de ODQ. Na presena do inibidor
de guanilato ciclase, o efeito desagregante foi abolido (Figura 32).
76
LASSBio-1215
100 M
LASSBio-1215
100 M +
ODQ 10 M
Figura 31 Efeito desagregante de LASSBio-1215 na presena de ODQ
4.6.3.4
Avaliao indireta da atividade inibidora de fosfodiesterases em

plaqueta humana lavada
Tendo em vista os resultados obtidos com o ODQ, demonstrando que, em

baixas concentraes de GMPc, o composto LASSBio-1215 teve seu efeito inibitrio
potencializado, e considerando que a enzima PDE3 ativada por baixas
concentraes desse nucleotdeo cclico, foi iniciado o estudo qualitativo da
atividade inibidora de PDE3, conforme protocolo descrito por DICKINSON et
al.(1997).
Essa atividade foi avaliada indiretamente utilizando plaqueta humana lavada
estimulada por trombina (0,5 UI/ml) na presena ou ausncia do nitroprussiato de
sdio (SNP), doador de NO, e milrinona (inibidor de PDE3), e monitorada atravs do
mtodo turbidimtrico descrito na seo 3.3.1.
Nesse modelo, inibidores de PDE3 que inibem completamente a agregao
plaquetria perdem seu efeito inibitrio na presena de baixas concentraes de
77
SNP. Tal efeito explicado pelo fato de que o aumento de GMPc intraplaquetrio
promovido por concentraes sub-timas de NO, gerado por concentraes de SNP
insuficientes para promover inibio completa da agregao plaquetria, levam
inibio da PDE3 e ativao de PDE2, ocorrendo um balano e controle fino dos
nveis destes nucleotdeos. Sendo assim, inibidores de PDE3 que sozinhos inibem
completamente a agregao plaquetria induzida por trombina, como a milrinona, na
presena de SNP so incapazes de promover esse efeito (Figura 33). A reverso da
inibio produzida por um inibidor de PDE3 neste caso se d pela ativao da
PDE2. Por outro lado, a ativao de PDE2 faz com que inibidores dessa enzima,
como o EHNA [eritro-9-(2-hidroxi-3-nonil) adenina], normalmente incapazes de inibir
a agregao plaquetria, passem a exibir essa propriedade na presena do doador
de NO em baixas concentraes (Figura 34).
SNP
(baixas concentraes)
+
TROMBINA
MILRINONA
+
TROMBINA
MILRINONA
+
TROMBINA
+
SNP
No ocorre
inibio da AP
Inibio
da AP
No ocorre
inibio da AP
Figura 32 Resposta plaquetria no estudo indireto da atividade inibidora de PDE3
O mesmo protocolo foi realizado para a avaliao do efeito antiplaquetrio de

LASSBio-1215 na presena e na ausncia de SNP. A ao inibitria de LASSBio1215 no foi alterada pela presena de SNP, indicando que, provavelmente, seu
78
mecanismo de ao no envolva a inibio de PDE3, sem contudo descartarmos a

possibilidade de uma ao em PDE2, que dever ser investigada.
SNP
+
TROMBINA
EHNA
+
TROMBINA
EHNA
+
TROMBINA
+
SNP
No ocorre
inibio da AP
No ocorre
inibio da AP
Inibio
da AP
Figura 33 Resposta plaquetria no estudo indireto da atividade inibidora de PDE2
Tais resultados combinados aos obtidos com o estudo do envolvimento de

AMPc, somam evidncias de que a atividade de LASSBio-1215 est mais
possivelmente relacionada com a modificao dos nveis de GMPc intraplaquetrios.
Para confirmar essa possibilidade, observamos o comportamento do
composto frente ao zaprinast, inibidor de PDE5, enzima especfica para esse
nucleotdeo cclico (HASLAM et al., 1999).
79
4.6.3.5
Efeito de LASSBio-1215 na presena de zaprinast na agregao

plaquetria induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP humano
citratado.
Foi observado o efeito de LASSBio-1215 na presena de zaprinast, um

inibidor de PDE5, sobre agregao plaquetria induzida por colgeno 5 g/ml em
PRP humano. Os inibidores de PDE5 sozinhos no afetam a agregao plaquetria
in vitro, mas potencializam os efeitos inibitrios do xido ntrico (DUNKERN &
HATZELMANN, 2005).
O zaprinast (100 M) sozinho no foi capaz de inibir a agregao plaquetria
induzida por colgeno 5 g/ml em PRP humano. No entanto, foi capaz de
potencializar o efeito inibitrio de LASSBio-1215 sobre a agregao plaquetria
(Tabela 14).
Tabela 14 Efeito de LASSBio-1215 sobre a agregao plaquetria induzida por

colgeno (5 g/ml) na presena de zaprinast (100 M) em PRP humano
Composto
%agregao
% Inibio
DMSO
Zaprinast (100 M)
LASSBio-1215 (100 M)
Zaprinast (100 M)+ LASSBio-1215(100 M)
4
4
4
4
110
112
98,3
32
0
21,9
70,9*
Tais resultados sugerem que o mecanismo de ao do composto LASSBio1215 envolve a formao de GMPc. Essa hiptese pode ser confirmada atravs da
dosagem do GMPc formado.
Os possveis mecanismos evolvidos incluem: a
ativao da guanilato ciclase, possivelmente atravs do aumento da disponibilidade

de NO intracelular, o que poder ser investigado indiretamente atravs da dosagem
de nitrito formado e/ou utilizando ferramentas farmacolgicas, como o seqestrador
80
de NO, PTIO (fenil-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-xido); e a inibio das

PDEs 2 e/ou 5, uma vez que descartamos, pelo ensaio qualitativo, uma possvel
ao sobre PDE3.
A busca por novos frmacos que possam agregar potncia e eficcia aos
diversos distrbios cardiovasculares de grande interesse e muitos grupos de
pesquisa empenham esforos nesse sentido. A demonstrao da atividade
farmacolgica dos derivados N-acilidraznicos furnicos e sua possvel ao em
mais de um alvo na plaqueta, a inibio do metabolismo de AA e a modulao dos
nucleotdeos cclicos, confirmam esses derivados como potenciais agentes
antiplaquetrios.
81
CONCLUSES
O presente estudo permitiu identificar os derivados N-acilidraznicos furnicos

como potentes inibidores da agregao plaquetria.
Os derivados LASSBio-1003, LASSBio-1215, LASSBio-1222 e LASSBio-1223 se
mostraram como os mais promissores pois foram capazes de inibir a agregao
induzida por mais de um agonista de relevncia fisiolgica, sendo LASSBio-1215
e LASSBio-1003 os mais potentes da srie frente aos agonistas AA e colgeno.
Os compostos LASSBio-1003, LASSBio-1215 e LASSBio-1223 foram ativos em
plaquetas humanas, indicando um potencial antitrombtico.
O efeito antiplaquetrio de LASSBio-1003 e LASSBio-1215 envolve, em parte, o
bloqueio da produo de metablitos da cascata do AA , isto , TXA2
LASSBio-1215, alm de inibir a agregao plaquetria, apresentou efeito
desagregante. Esses efeitos parecem ser dependentes dos nveis de GMPc
intracelulares sem aparentemente dependerem dos nveis de AMPc.
Os estudos de SAR mostraram que A N-metilao dos compostos Nacilidraznicos se mostrou favorvel para a atividade antiagregante plaquetria;
que o substituinte bromo representa um incremento de atividade to importante
quanto a N-metilao e que a propriedade desagregante plaquetria de
LASSBio-1215 se deve introduo do substituinte nitro.
O conjunto de resultados mostra que as modificaes estruturais introduzidas no
composto prottipo LASSBio-129 levou obteno de novos compostos com
perfil antiplaquetrio otimizado.
82
PERSPECTIVAS
Investigar ao sobre PDE2 atravs de ensaio qualitativo indireto.
Realizar ensaio de dosagem de GMPc intraplaquetrio na plaqueta inibida por

LASSBio 1215, na presena ou no do doador de NO.
Investigar o envolvimento do NO na elevao dos nveis de GMPc

intraplaquetrios.
Realizar ensaio na presena de um inibidor de PKG, a fim de avaliar a

importncia dessa via de sinalizao celular para os efeitos antiagregantes e
desagregantes plaquetrios de LASSBio 1215.
Avaliao do potencial antitrombtico in vivo modelos de tempo de

sangramento e trombose.
Realizar ensaio de toxicidade celular.
83
REFERNCIAS
ANDREWS, R. K.; BERNDT, M. C. Platelet physiology and thrombosis. Thrombosis

Research, v. 114, p. 447-453, 2004.
AUSTRALIAN CENTER FOR BLOOD DISEASES. Thrombosis Research Unit, 2008.

Disponvel em: http://www.acbd.monash.org/research/thrombosis-research. Acesso
em 03/09/2008.
AUTHI, K. S. Ca2+ Homeostasis and Intracellular pools in Human Platelets. In:

Mechanisms of Platelet Activation and Control, Kalwnant S. Authi, Steve P.
Watson and Vijay V. Kakkar, New York, Plenum Press, p. 83, 1993.
BHATT, D. L.; TOPOL, E. J. Scientific and Therapeutic advances in antiplatelet

therapy. Nature Reviews Drug Discovery, v. 2, p. 15-28, 2003.
BRASIL. Lei n 11.794, de 8 de outubro de 2008. Dirio Oficial da Unio, Poder

Executivo, Braslia, DF, 9 out. 2008. Seo 1, p.1-2.
BORN, G. V. R., CROSS, M. J. The aggregation of blood platelets. J. Physiol., v.

168, p. 178, 1963.
BRITO, F. C. F. de. Estudo da atividade antiagregante plaquetria e mecanismo de

ao de compostos tienilacilidraznicos anlogos ao LASSBio-294. Tese (Doutorado
em Cincias Biolgicas - Farmacologia) Instituto de Cincias Biomdicas,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2005.
84
CARDINAL, D.C. & FLOWER, R. J. The Electronic Aggregometer: a Novel device for
assessing platelet behaviour in blood. J. Pharmacol. Methods., v.3, p. 135-138,
1980.
CATTANEO, M. ; GACHET, C. The platelet ADP receptors. Haematologica, v. 86, p.

346-348, 2001.
CAVALLINI, L.; COASSIN, M.; BOREAN, A.; ALEXANDRE, A. Prostacyclin and

sodium nitroprusside inhibit the activity of the platelet inositol 1,4,5- trisphosphate
receptor and promote its phosphorylation. J. Biol. Chem., v. 271, p. 5545-5551,
1996.
CAZENAVE, J. P., HEMMENDINGER, S., BERETZ, A., SUTTER-BAY, A., LAUNAY,

J. Platelet Aggregation: a Tool for Clinical Investigation and Pharmacological Study.
Methodology. Ann. Biol. Clin., v.41, p.167-179, 1984.
DICKINSON, N. T.; JANG, E. K.; HASLAM, R. J. Activation of cGMP-stimulated

phosphodiesterase by Nitoprusside limits cAMP accumulation in human platelets:
effects on platelet aggregation. Biochem. J., v. 323, p. 371-377, 1997.
DOMNGUEZ-JIMNEZ,
C.;
DAZ-GONZLEZ,
F.;
GONZLEZ-LVARO,
I.;
CESAR, J. M.; SNCHEZ-MADRID, F. Prevention of IIb3 activation by nonsteroidal antiinflammatory drugs. FEBS Letters, v. 446, p. 318-322, 1999.
85
DOPHEIDE, S. M.; YAO, C. L. and JACKSON, S. P. Dynamic aspects of platelet

adhesion under flow. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,
v. 28, p. 355-363, 2001.
DUNKERN, T. R. & HATZELMANN, A. The effect of Sildenafil on human platelet

secretory function is controlled by a complex interplay between phosphodiesterases
2, 3 and 5. Cell signaling, v. 17, p. 331-339, 2005.
FEIJGE, M. A.; ANSINKA, K.; VABSCHOONBEEK, K.; HEEMSKERK, J. W. M.

Control of platelet activation by cyclic AMP turnover and cyclic nucleotide
phosphodiesterase type-3. Biochemical Pharmacology, v. 67, p. 15591567, 2004.
FEINMAN, R. D.; LUBOWSKY, J.; CHARO, I.; ZABINSKI, M. P. The LumiAggregometer: a new instrument for simultaneous measurement of secretion and
aggregation by platelets. J. Lab. Clin. Med. , v. 90, p. 125-129, 1977.
FRAGA, C. A. M.; BARREIRO, E. J. Medicinal chemistry of N-acylhydrazones: New

lead-compounds of analgesic, anti-inflammatory and antithrombotic drugs. Current
Medicinal Chemistry, v. 13, n. 2, p. 167-198, 2006.
GACHET, C. ADP Receptors of platelets and their inhibition. Thromb. haemost., v.

86, p. 222-232, 2001.
GAWAZ, M. Platelets in the onset of atherosclerosis. Blood Cells, Molecules and

Diseases, v. 36, p. 206-210, 2006.
86
GRESELE P.; FALCINELLI, E.; MOMI, S. Potentiation and priming of platelet

activation: a potential target for antiplatelet therapy. Trends in Pharmacological
Sciences, v. 29, n. 7, p.352-360, 2008.
GOODMAN, L. S.; GILMAN, A.; BRUNTON, L.; LAZO, J. S.; PARKER, K. L. Blood
coagulationa and anticoagulant, thrombolytic and antiplatelet drugs. In: Goodman
and Gilmans the pharmacological basis of therapeutics, 11 ed., p. 1481-1484,
2006.
HASKEL, E. J. & ABENDSCHEIN, D. R. Deaggregation of human platelets in vitro by

an RGD analog antagonist of platelet glycoprotein IIb/IIIa receptors. Thrombosis
Research, n. 56, p. 687-695, 1989.
HAMILTON, J. R. Protease-activated receptors as targets for antiplatelet therapy.

Blood Reviews, doi:10.1016/j.blre.2006.06.002, 2008.
HAMPTON, K. K. & PRESTON, F. E. Bleeding disorders, thrombosis and

anticoagulation. British Med. J. , n. 314, p. 1026.
HASLAM, R. J.; DICKINSON, N. T.; JANG, E. K. Cyclic nucleotides and

phosphodiesterases in platelets. Thromb. Haemost., v. 82, p.412-423, 1999.
HERD, C.; PAGE, C. P. Do platelets have a role as inflammatory cells? In:

Immunopharmacology of Platelets, Michel Joseph, Academic Press, captulo 1 p.
1-20, 1995.
87
HOURANI, S.M. O. & CUSACK, N. J. Pharmacological Receptors on Blood Platelets.

Phramacological Reviews, v. 43, n. 3, p. 243-285, 1991.
ISENBERG, W. M.; McEVER, R. P; PHILLIPS, D. R.; SHUMAN, M. A.; BAINTON, D.

F. The platelet fibrinogen receptor: An immunogold-surface replica study of agonistinduced ligand binding and receptor clustering. J. Cell Biol. , v. 104, p. 1655-1663,
1987.
ITALIANO, J. E. & SHIVDASANI, R.A. Megakaryocytes and beyond: the birth of

platelets. Journal of Thrombosis and Haemostasis, v.1, p. 11741182, 2003.
JANG, E. K.; AZZAM, J. E.; DICKINSON, N. T.; DAVIDSON, L. M. M. AND HASLAM,

R. J. Roles for both cyclic GMP and cyclic AMP in the inhibition of collagen-induced
platelet aggregation by nitroprusside. British Journal of Haematology, v. 117, p.
664675, 2002.
JIN, J.; QUINTON, T. M.; ZHANG, J.; TIYYENHOUSE, S.E. AND KUNAPULI, S. P.
Adenosine diphosphate (ADP)-induced thromboxane A2 generation in human
platelets requires coordinated signaling through integrin IIb3 and ADP receptors.
Blood, v. 99, p. 193-198, 2002.
88
KAHN, M.L.; ZHENG, Y.W.; HUANG, W. A dual thrombin receptor system for platelet
activation. Nature, v. 394, p. 690-694, 1998.
KARNIGUIAN, A.; GRELAC, F.; LEVY-TOLEDANO, S.; LEGRAND, Y. J.; RENDU, F.

Collagen-induced platelet activation mainly involves the protein kinase C pathway.
Biochemical Journal, v. 268, n.2, p. 325-331, 1990.
KROLL, M. H.; SCHAFER, A.I. Analysis if kugabd-receptor interactions. In:

Immunopharmacology of Platelets, Michel Joseph, Academic Press, captulo 1 p.
31-33, 1995.
KMMERLE, A. E. Sntese de compostos cardioativos 1,3-benzodixolil-Nacilidraznicos planejados por otimizao estrutural do prottipo LASSBio-294.
Dissertao (Mestrado em Qumica Orgnica) Instituto de Qumica, Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2005.
LI, Z.; XI, X.; GU, M. A stimulatory rolo for cGMP dependent protein kinase in platelet
activation. Cell, v. 12, p. 77-86, 2003.
MAAYANI, S.; TAGLIENTE, T. M.; SCHWARZ, T.; MARTINELLI, G.; MARTINEZ, R.;
SHORE-LESSERSON,
L.
The
balance
of
concurrente
aggregation
and
deaggregation processes in platelets is linked to differential occupancy of ADP

receptor subtypes. Platelets, v. 12, p. 83-93, 2001a.
89
MAAYANI, S.; TAGLIENTE, T. M.; SCHWARZ, T.; CRADDOCK-ROYAL, B.;

ALCALA, C.; MARRERO, G.; MARTINEZ, R. Deaggregation is an integral
component of the response of platelets to ADP in vitro: kinetic studies of literature
and original data. Platelets, v. 12, p. 279-291, 2001b.
MACKMAN, N. Triggers, targets and treatments for thrombosis. Nature, vol. 451, p.
914-918, 2008.
MICHELSON, A.D. P2Y12 Antagonism. Promises and Challenges. Arterioscler.

Thromb. Vasc. Biol., v. 28, s33-s38, 2008.
MINISTRIO DA SADE. Painel de Indicadores do SUS, 2006. Disponvel em

http://www.saude.gov.br/indicadores/estatsticas. Acesso em 30/08/08.
MIRANDA, A. L. P.; LIMA, P. C.; TRIBUTINO, J. L. M.; MELO, P. A.; FERNANDES,

P. D.; CINTRA, W. M.; FRAGA, C. A. M.; BARREIRO, E. J. Anti-inflammatory,
analgesic and anti-platelet properties of LASSBio-294, a new thienylacylhydrazone
derivative. Abstracts du 6me Congrs Annuel de la Socit Franaise de
Pharmacologie, P296; Rennes, Frana, 2002.
MONASH UNIVERSITY. Platelet and Leucocyte Biology Laboratory, 2008.

Disponvel
em:
http://www.med.monash.edu.au/medicine/boxhill/research/blood-
platelet. Acesso em: 02/09/2008.
90
MOSER, M.; BERTRAM, U.; PETER, K.; BODE, C.; and RUEF, J. Abciximab,
eptifibatide, and tirofiban exhibit dose-dependent potencies to dissolve platelet
aggregates. J. Cardiovasc. Pharmacol., v. 41, p. 586-592, 2003.
NAKAHATA, N. Thromboxane A2: Physiology/pathophysiology, cellular signal

transduction and pharmacology. Pharmacology & Therapeutics, v. 118, p. 18-35,
2008.
NIESWANDT, B. & WATSON, S. P. Platelet-collagen interaction: is GPVI the central

receptor? Blood, v. 102, p. 449-461, 2003.
OBRIEN, J. J.; RAY, D. M.; SPINELLI, S. L.; BLUMBERG, N.; TAUBMAN, M. B.;
FRANCIS. C. W.; WITTLIN, S. D.; PHIPPS, R. P. The platelet as a therapeutic target
for treating vascular diseases and the role of eicosanoid and synthetic
PPAR ligands. Prostaglandins & other Lipid Mediators, v. 82, p. 68-76, 2007.
ORMELLI, C. B. Estudo do mecanismo de ao da atividade antiagregante

plaquetria
de
derivados
heterocclicos
arilidraznicos,
acilidraznicos
sulfonilarilidraznicos. Dissertao (Mestrado em Cincias Farmacuticas)

Faculdade de Farmcia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro,
1999.
PLATELET RESEARCH. Electron microscopy of platelet, 2005. Disponvel em:

http://www.platelet-research.org. Acesso em 03/09/2008.
91
RENDU, F.; BROHARD-BOHN, B. The platelet release reaction: granules

constituents, secretion and functions. Platelets, v. 12, p. 261273, 2001.
RODRIGUES, A. P. C. Otimizao Estrutural do Prottipo 2-furanil-1,3-benzodioxolilN-Acilidraznico LASSBio-129. Dissertao (Mestrado em Qumica Orgnica)
Instituto de Qumica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2008.
RUGGERI, Z. M. Plateles in atherothrombosis. Nature Medicine, v. 8, p. 1227-1234,

2002.
SANTOS-MARTNEZ , M. J.; MEDINA, C.; JURASZ, P.; RADOMSKI, M. W. Role of

metalloproteinases in platelet function. Thrombosis Research, v. 121, p. 535-542,
2008.
SAVAGE, B.; CATTANEO, M.; RUGGERI, Z. M. Mechanism of platelet aggregation.

Curr. Opin. Hematol., v. 8, p.270-276, 2001.
SCHWARTZ, U. R.; WALTER, U.; EIGENTHALER, M. Taming platelet with cyclic

nucleotides. Biochem. Pharmacol. , v. 62, p. 1153-1161, 2001.
SCRUTTON, M. C. The Platelet as a Ca2+-driven cell: mechanisms which may

modulate Ca2+-driven responses. In: Mechanisms of Platelet Activation and
Control, Kalwnant S. Authi, Steve P. Watson and Vijay V. Kakkar, New York,
Plenum Press, p. 2, 1993.
92
SIESS, W.; GRNBERG, B.; LUBER, K. Functional Relationship between cyclic

AMP-depndent protein phosphorylation and platelet inhibition. In: Mechanisms of
Platelet Activation and Control, Kalwnant S. Authi, Steve P. Watson and Vijay V.
Kakkar, New York, Plenum Press, p. 229, 231, 1993.
SILVA, G. A.; ZAPATA-SUDO, G.; KMMERLE, A. E.; FRAGA, C. A. M.;

BARREIRO, E. J.; SUDO, R. T. Synthesis and vasodilatory activity of new Nacylhydrazones derivatives designed as LASSBio-294 analogues. Bioorganic and
Medicinal Chemistry, v. 13, p. 3431-3437, 2005.
SIMMONS, D. L.; BOTTING, R. M.; HLA, T. Cyclooxygenase isozymes: the biology

of prostaglandin synthesis and inhibition. Pharmacological Reviews, v. 56, p. 387437, 2004.
SIMS, P. J.; GINSBERG, M. H.; PLOW, E. F.; SHATIL, S. J. Effect of platelet

activation on the conformation of the plasma membrane glycoprotein IIb-IIIa. J. Biol.
Chem., v. 266, p. 7345-7352, 1991.
SMITH, F. D. & SCOTT, J. D. Anchored cAMP signaling: Onward and upward A

short history of compartmentalized cAMP signal transduction. European Journal of
Cell Biology, v. 85, p. 585-592, 2006.
STROKECENTER.
Platelet
thrombus
formation.
http://www.strokecenter.org. Acesso em 02/09/2008.
Disponvel
em:
93
SURIN, W. R.; BARTHWAL, M. K.; DIKSHIT, M. Platelet collagen receptors,

signalling and antagonism: Emerging approaches for the prevention of intravascular
thrombosis. Thrombosis Research, doi: 10.1016/j.thromres.2007.10.005 (2007)
TODESCHINI, A. R.; MIRANDA, A. L. P.; BACHA, C. M.; BARREIRO, E. J. 2Pyrudylarylhydrazone derivatives, a new class of platelet aggregation inhibitors.
Braz. J. Med. Biol. Res., v. 29, p. 389, 1996.
WAGNER, D. D.; BURGER, P. C. Platelets in Inflammation and Thrombosis.
Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., v. 23, p. 2131-2137, 2003.
WALTER, U. EIGENTHALER,M. GEIGER, J. and REINHARD, M. Role of cyclic

nucleotide-dependent protein kinases and their common substrate VASP in the
regulation of human platelets. In: Mechanisms of Platelet Activation and Control,
Kalwnant S. Authi, Steve P. Watson and Vijay V. Kakkar, New York, Plenum Press,
p. 237-240, 1993.
WARD, A.; CHAFFMAN, M. O.; SORKIN, E. M. Dantrolene - a review of its

pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic use in malignant
hyperthermia, the neuroleptic malignant syndrome and an update of its use in muscle
spasticity. Drugs, v. 32, p. 130-168, 1986.
WEBER, C. Platelets and Chemokines in Atherosclerosis. Partners in Crime. Circ.

Res., v. 96, p. 612-616, 2005.
94
ZAPATA-SUDO, G.; SUDO, R. T.; MARONAS, P. A.; SILVA, G.; MOREIRA, R.;
AGUIAR, M. I. S.; BARREIRA, E. J. Thienylhydrazone derivative increases
sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in mammalian skeletal muscle. European
Journal of Pharmacology, v. 470, p. 79-85, 2003.
ZARBOCK, A.; POLANOWSKA-GRABOWSKA, R. K.; LEY, K. Platelet-neutrophilinteractions: Linking hemostasis and inflammation. Blood Reviews, v. 21, n. 2, p. 99111, 2007.

706563

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

706563

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

LUCIANA MOREIRA MARAMALDO COSTA

ESTUDO DO PERFIL ANTIAGREGANTE PLAQUETRIO DE UMA

Luciana Moreira Maramaldo Costa

ESTUDO DO PERFIL ANTIAGREGANTE PLAQUETRIO DE UMA

Dissertao de Mestrado apresentada ao

Orientador: Prof Dr Ana Lusa Palhares de Miranda

Luciana Moreira Maramaldo Costa

ESTUDO DO PERFIL ANTIAGREGANTE PLAQUETRIO DE UMA

Dissertao de Mestrado apresentada ao

Costa, Luciana Moreira Maramaldo.

Este trabalho foi realizado no Laboratrio de Avaliao e Sntese de

O pessimista se queixa do vento; o

minha av, companheira e amiga, Leopoldina

professora Dr Ana Lusa Palhares de Miranda, pela amizade e confiana. Por

Aos professores Dr Nelilma Romeiro e Dr. Carlos Maurcio Santanna, pelo

Ao professor Dr. Marcelo de Pdula, membro da Comisso de Acompanhamento,

banca examinadora, por aceitarem o convite e pelas contribuies que faro a

Me. Ana Paula Cunha Rodrigues, que sintetizou os compostos objetos de

farmacologistas, pelo exemplo de dedicao e obstinao.

amiga Aline Dias, pelo incentivo e auxlio na formatao do texto.

Aos rgos de fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento (CNPq - Proc.

A todos os voluntrios que doaram sangue para execuo dos ensaios de

Os eventos isqumicos cardiovasculares representam a principal causa de

O composto LASSBio-1215 foi capaz de desfazer os agregados plaquetrios

Palavras-chave: plaqueta, N-acilidrazonas, antiagregante plaquetrio, desagregante

Ischemic cardiovascular events represent the leading cause of mortality and

LASSBio-1215 was also able to revert platelet aggregation in rabbit PRP

involvement of cyclic nucleotides in the reversion of platelet aggregation were carried

Keywords: platelet, N-acylhydrazones, antiplatelet, aggregation, disaggregation,

Morfologia Plaquetria ...........................................................................2

Funo Plaquetria e Vias de Sinalizao Celular ................................5

Via dos Fosfolipdeos de Inositol ....................................................6

Metabolismo do cido Araquidnico (AA) ......................................7

Nucleotdeos Cclicos .....................................................................9

AGONISTAS DA AGREGAO PLAQUETRIA .......................................10

Difosfato de Adenosina (ADP) .............................................................11

Fator de Ativao Plaquetria (PAF) ...................................................12

FISIOPATOLOGIA PLAQUETRIA ............................................................13

SUBSTNCIAS, REAGENTES E SOLVENTES .........................................27

MONITORIZAO DA AGREGAO PLAQUETRIA..............................31

Mtodo turbidimtrico ..........................................................................31

Amostras de sangue ............................................................................32

Obteno do PRP e do PPP................................................................33

Contagem de Plaquetas ......................................................................34

Estudo da agregao plaquetria em plaqueta lavada ........................34

Estudo indireto da atividade inibidora de fosfodiesterases em plaqueta

Estudo do efeito da inibio da guanilato ciclase estimulada por NO na

agregao plaquetria em PRP citratado de coelhos e humano .......................35

Estudo do efeito da inibio da adenilato ciclase na agregao

plaquetria em PRP citratado de coelhos e humano .........................................36

Estudo do efeito da inibio de PKA na agregao plaquetria em PRP

de coelhos e humano .........................................................................................36

Estudo da agregao plaquetria em sangue humano total................36

Estudo da secreo plaquetria atravs da medida da luminescncia37

DOSAGEM DE TXB2 EM SANGUE HUMANO ...........................................37

RESULTADOS E DISCUSSO .........................................................................39

ESTUDO DE TRIAGEM DA ATIVIDADE ANTIAGREGANTE

PLAQUETRIA DOS NOVOS DERIVADOS N-ACILIDRAZNICOS ANLOGOS

Avaliao dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria

(AP) induzida por AA (200 M) em PRP citratado de coelhos ...........................39

Avaliao dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria

induzida por colgeno (5 g/ml) em PRP citratado de coelhos..........................39

Avaliao dos derivados N-acilidraznicos na agregao plaquetria