DIFERENCIACION MICROBIAL: MEDIO,

TINCION Y MICROSCOPIO.
Mdulo 2: Ejecuta mtodos de
anlisis cualitativos qumicos y
microbiolgicos con base a normas.
Submdulo 3: Ejecuta tcnicas de
identificacin fe anlisis de
microorganismos con base a
normas.
M.M. Acosta Bezada Jessica Alicia.

INTEGRANTES DEL EQUIPO# 1:

Amaro Av.
Ascencio Javier.
vila Isaas.
Campos Berenice.
De Santiago Ivn.
Espeleta Leslie.
Espinoza Leonardo.
Galaviz Dolores.

Ciudad Jurez, Chihuahua, a 20 de

Septiembre del 2016.
1

INDICE
INTRODUCCIN.......................................................................................................3
DESARROLLO..........................................................................................................4
IDENTIFICACION..................................................................................................4
Caractersticas microscpicas............................................................................4
Caractersticas macroscpicas..........................................................................4
CULTIVO................................................................................................................5
Medios de cultivo................................................................................................5
Requisitos de crecimiento..................................................................................6
MTODOS MOLECULARES DE IDENTIFICACIN BACTERIANA.................7
MTODOS PROTEMICOS DE IDENTIFICACIN BACTERIANA.................7
TINCIONES............................................................................................................8
Tincin de Gram.....................................................................................................8
Tincin de Wright.................................................................................................10
Tincin de Ziehl-Neelsen......................................................................................11
Tincin Negativa...................................................................................................13
Tincin De Azul Algodn De Lacto Fenol.............................................................14
MICROSCOPIO.......................................................................................................17
4.2-Partes del microscopio compuesto moderno................................................17
4.3.-Sistema mecnico del microscopio..............................................................18
4.4-Sistema ptico del microscopio.....................................................................20
4.5.-Sistema de iluminacin.................................................................................30
4.6.-Formacin de la imagen en el microscopio compuesto...............................36
CONCLUSIN GRUPAL.........................................................................................41
BIBLIOGRAFA........................................................................................................42

INTRODUCCIN.
Gracias a loa grandes progresos tecnolgicos para el estudio y desarrollo de la
microbiologa, se han establecido diferentes tcnicas para analizar el mundo
microscopio, algunas de las tcnicas es la elaboracin o la implementacin de
medios de cultivos que contiene diferentes sustancias que nos permiten identificar
y observar las diferentes bacteria que portan sustancias derivadas de nuestro
entorno, ayudndonos a comprender la causa de distintos fenmenos
inexplicables ante la vista del propio ser humano.
Un medio de cultivo es una solucin que cuenta con los nutrientes necesarios y las
condiciones ptimas para la creacin de bacterias, permitindonos analizar dichos
microorganismos extrados de una muestra de cualquier sustancia orgnica. es
utilizada para la identificacin de aquellos microorganismos que causan
fenmenos en nuestro entorno.
En microbiologa el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona
importante informacin para la identificacin temprana y definitiva de los
microorganismos.
En la valoracin de las muestras, es trascendente el poder de resolucin del
microscopio, el cual se define como la capacidad que posee un objetivo para
distinguir la distancia mnima entre dos puntos del objeto para que se puedan
visualizar como dos puntos separados. El poder de resolucin de un objetivo es el
responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de la imagen, y
depende de la longitud de onda () del haz de luz utilizado y de la apertura
numrica del objetivo empleado. El mximo poder de resolucin en un microscopio
de luz emitida es de 0.2 m, por lo que se requiere de una amplificacin entre
1000-1400x, mientras que el poder de resolucin del ojo humano es de
aproximadamente 0.2 mm.
Para aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han desarrollado tcnicas
tutoriales que destacan las caractersticas morfolgicas de los microorganismos.
Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo
de la microbiologa.

DESARROLLO.
IDENTIFICACION
Caractersticas microscpicas.
El estudio microscpico en fresco y tras tincin revela la forma, la manera de
agruparse, la estructura de las clulas y su tamao. Las tinciones son el primer
paso, y ocasionalmente el Nico, para la identificacin bacteriana.
Las tinciones ms utilizadas e imprescindibles son la del azul de metileno y la de
Gram. La tincin de Gram es, a menudo, la primera y nica herramienta de la que
nos servimos para hacer un diagnstico provisional en el proceso de identificacin
de la mayora de las bacterias teniendo en cuenta tambin el tipo de muestra y el
diagnstico presuntivo del proceso infeccioso.
Estos son algunos de los trminos utilizados para preparaciones tejidas:
- tincin: uniforme, irregular, unipolar, bipolar, etc.
forma: cocos, bacilos, cocobacilos, filamentosos, bacilos curvos, etc.
- cpsula: presente o ausente - endosporas: ovales, esfricas, terminales, su
terminales - tamao: cortos, largos, etc. - bordes laterales: abultados, paralelos,
cncavos, irregulares
- extremos: redondeados, puntiagudos - disposicin: parejas, cadenas, ttradas,
racimos, etc.
. - formas irregulares: variacin en forma y tamao, ramificados, fusiformes, etc.
En algunos casos, la informacin derivada de las tinciones puede comunicarse
inmediatamente al clnico, siendo de gran relevancia y utilidad como en tinciones
del LCR en el diagnstico de meningitis; tinciones de frotis uretrales en las
infecciones de trasmisin sexual, diagnstico de infecciones por Mocara spa. y
otros actinomicetos, etc.

Caractersticas macroscpicas.
Morfologa.
La morfologa de las colonias es fundamental en la identificacin preliminar y para
la diferenciacin de los microorganismos. Para la observacin morfolgica es
preferible examinar colonias de cultivos frescos crecidas en medios no selectivos.
En este paso de la identificacin es muy importante el aislamiento de las bacterias
en cultivo puro ya que esta debera estar compuesta por un solo tipo de
microorganismos y procedera de una nica clula. Las colonias de una nica
4

especie, cuando crecen en medios especficos y bajo condiciones idneas se

describen por sus caractersticas de tamao, forma, consistencia, y a veces por su
color.
El tamao de las colonias bacterianas es generalmente uniforme entre una misma
especie. Por ejemplo, las colonias de estreptococos tienen un tamao ms pequeo
que las de los estafilococos y las entero bacterias. La forma esta determinada por
los bordes y el grosor de la colonia. El borde puede ser liso o rugoso e irregular; la
colonia, abultada o plana. La textura de la colonia es tambin importante. Puede
variar desde seca a viscosa, con superficie lisa o granular. Algunos
microorganismos producen una colonia pigmentada, lo que puede ser de ayuda en
el proceso de identificacin (ejemplo: Pseudomonas aeruginosa (pigmento verde),
Serratia marcescens (pigmento rojo) aunque en una misma especie puede haber
cepas no pigmentadas.

CULTIVO
Medios de cultivo.
En los medios de cultivo las bacterias se multiplican y es necesario esperar al
menos 18-24 horas para visualizarlas. En trminos generales todas las bacterias
tienen unos requerimientos nutricionales imprescindibles para su crecimiento.
Necesitan una fuente de energa, una fuente de carbono, una fuente de nitrgeno,
algunas sales, oligoelementos y agua. Todos los medios de cultivo han de cumplir
como mnimo con estos requisitos, pero en muchas ocasiones se necesitan
adems otras sustancias adicionales como vitaminas, factores o aminocidos
esenciales.
a) Medios bsicos: son medios ricos en nutrientes que permiten el crecimiento de
la gran mayora de las bacterias. Se utilizan en la siembra primaria de las
muestras clnicas. Uno de los medios ms utilizados en los laboratorios es el agar
sangre.
b) Medios de enriquecimiento: estn desarrollados para recuperar bacterias
exigentes en sus requerimientos nutricionales. Se utilizan para bacterias que no
crecen en medios bsicos. Los ms utilizados suelen ser medios lquidos como ese
caldo de tioglicolato o el caldo cerebro corazn(BHI).
c) Medios selectivos: contienen sustancias como cloruro sdico a dosis elevadas,
citrato sdico, cristal violeta, sales biliares o antibiticos y antispticos que
fomentan el crecimiento de algunas bacterias y evitan el de otras. Son de gran
utilidad para el aislamiento bacteriano a partir de una poblacin bacteriana mixta.
d)Medios diferenciales: se utilizan para poner de manifiesto caractersticas
distintivas de las colonias. Son medios que distinguen entre distintos grupos
5

bacterianos en funcin casi siempre del color de sus colonias. Por ejemplo, el agar
MacConkey es un medio solido que permite el crecimiento de bacilos
gramnegativos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Los primeros
adoptan una coloracin rosada que la diferencia de los segundos. Los medios
diferenciales, adems, pueden poner de manifiesto mezclas y contaminaciones en
los cultivos.
e) Medios cromo gnico: en stos se incorporan sustancias cromo gnicas para
detectar distintas enzimas producidas por los microorganismos. Cuando la
bacteria produce el enzima, hidroliza el sustrato y se libera un compuesto cromo
gnico que adquiere un color intenso, dando color a la colonia. Estos enzimas
pueden ser especficas de un gnero, una especie o de un grupo reducido de
especies. En algunos casos la identificacin presuntiva de las bacterias aisladas
tiene una especificidad tan elevada que, en la prctica podra hacer innecesaria la
realizacin de pruebas confirmatorias.

Requisitos de crecimiento.
Atmsfera. Las bacterias se clasifican en funcin de sus requerimientos
atmosfricos:
- Aerobias estrictas, que crecen solo en presencia de oxgeno.
- Anaerobias estrictas, que solo crecen en ausencia de oxgeno.
- Facultativas, que crecen tanto en aerobiosis como en anaerobiosis.
- Microaeroflicas, que crecen mejor en una atmosfera con reducida concentracin
de oxgeno.
- Capnoflicas, que requieren CO2 adicional para crecer.
Temperatura. Se clasifican adems en funcin de la temperatura necesaria para
su crecimiento:
- Psicofsicas, pueden crecer a bajas temperaturas entre 2-5C (Optimo 10-30C).
- Mesoflicas, crecen a temperaturas entre 10- 45C (Optimo 30-40C).
-Termoflicas, crecen muy poco a 37C (Optimo 50-60C). La mayora de las
bacterias encontradas en muestras clnicas son misofilias.
Nutricin. El estudio de los requerimientos nutricionales de un microorganismo se
usa en la identificacin. Tal es el caso de la capacidad para crecer en medios
ordinarios, o con la adiccin de sangre, suero o glucosa. Tambin por la necesidad
de factores especficos de crecimiento como el factor X (hemina) y el factor V
(NAD) en el caso de Haemophilus spp.
6

MTODOS MOLECULARES DE IDENTIFICACIN BACTERIANA.

Se han utilizado una amplia variedad de genes como dianas moleculares en los
estudios taxonmicos o de filogenia en los distintos gneros y distintas especies
bacterianas, constituyendo el anlisis del ARNr 16S el marcador inicial y en
numerosas situaciones suficiente para realizar una identificacin precisa. Sin
embargo, en otras situaciones, la alta homologa gentica en determinados
gneros bacterianos o un reciente cambio en su asignacin taxonmica, no
permite utilizar el Armar 16S como para la identificacin a nivel de especie (o
incluso de gnero). En estos casos, puede recurrirse a otros genes dianas.

MTODOS PROTEMICOS DE IDENTIFICACIN BACTERIANA.

Las tcnicas de protenica abordan el estudio de este conjunto de protenas y el
ms usadas se basan en la electroforesis y en la espectrometra de masas.
Dependiendo del objetivo del estudio se pueden agrupar las tcnicas de protenica
en los siguientes grupos:
- Tcnicas empleadas para analizar globalmente la protena y separar sus
protenas. Entre ellas destacan la electroforesis bidimensional, DIGE
(electroforesis diferencial en gel), ICAT (marcaje isotpico diferencial) y Judit
(tecnologa de identificacin de protenas multidimensional).
- Tcnicas usadas para analizar individualmente las protenas. Con este objetivo
se utilizan distintos tipos de espectrometra de masas. Con ellas se obtiene la
huella peptdica que es el conjunto de fragmentos peptdicos que se obtienen tras
tratar una protena concreta con una proteasa determinada. Las proteasas son
enzimas que rompen los enlaces peptdicos de las protenas. Dependiendo del
enzima que se utilice para fragmentar la protena se obtienen diferentes huellas
peptdicas. Estas son caractersticas de cada protena. Actualmente hay
numerosas bases de datos que recogen las huellas peptdicas de multitud de
protenas conocidas. Estas bases de datos se pueden rastrear usando programas
bioinformticas para buscar la huella peptdica que corresponda con la de aquella
protena que se est estudiando y por tanto poder identificarla.
- Tcnicas que se usan para estudiar interacciones entre protenas, como los
sistemas ayeaste tao hbrido de alto rendimiento o la tcnica pago Desplaye. Esta
lima permite averiguar con qu protenas interacciona una protena problema o
sonda. Esta tcnica consiste en la expresin en la superficie de un fago de las
protenas que se quieren analizar.

TINCIONES
Las tinciones en microbiologa son las primeras herramientas que se utilizan en el
laboratorio para el diagnstico de las enfermedades infecciosas. Desde hace ms
de un siglo han ayudado a resolver problemas de etiologa microbiana. Hay una
gran variedad de tinciones, que se han ido desarrollando para la deteccin de los
diferentes agentes infecciosos en los que se incluyen bacterias, parsitos y
hongos. La tincin de Gram se considera bsica en la valoracin inicial de
muestras para anlisis bacteriolgico, mientras que la tincin de Wright se ocupa
para el diagnstico de enfermedades muy particulares en el rubro de la
parasitologa. Hay tcnicas tintoriales especficas de gran utilidad, como la tincin
de Ziehl-Neelsen, que se utiliza para el diagnstico de enfermedades crnicas
como la tuberculosis o la actinomicosis, o la tincin de azul de lactofenol, que
preserva e identifica a los componentes estructurales de los hongos. Las
diferentes tinciones en el laboratorio microbiolgico tienen una utilidad
fundamental para el diagnstico y tratamiento oportuno de mltiples patologas de
etiologa infecciosa.

Tincin de Gram
Esta tincin es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios
donde se manejan pruebas microbiolgicas. Es definida como una tincin
diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes
grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas. Fue desarrollada
por el cientfico dans Hans Christian Gram en 1884; hoy en da, sigue siendo una
de las tinciones ms utilizadas universalmente debido a lo econmico, sencillo y
eficaz que resulta. En microbiologa clnica resulta de gran utilidad, ya que a partir
de muestras clnicas directas provenientes de sitios estriles se puede saber de
manera rpida las caractersticas de la muestra y hacer una diferencia de los
potenciales microorganismos causantes de una infeccin. Los principios de la
tincin de Gram estn basados en las caractersticas de la pared celular de las
bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo.
La pared celular de las bacterias Gram negativas est constituida por una capa
fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias
Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano,
pero no cuentan con membrana celular externa; as pues, la composicin qumica
y el contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram
8

negativas y Gram positivas explica y determina las caractersticas tintoriales

(Figura 1). La tincin de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal
violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana.
Posteriormente, se coloca lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida
del cristal violeta por la formacin de un complejo cristal violeta yodo que satura
los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. En seguida, se coloca una
mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana y cierra los
poros de la misma, tambin destruye la membrana externa de las bacterias Gram
negativas debido a que sta es soluble a la accin de solventes orgnicos, como
la mezcla de alcohol acetona. Las bacterias Gram positivas, al contener una gran
cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras
que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de
peptidoglicano. Por ltimo, se coloca safranina, la cual funciona como un colorante
secundario o de contra tincin y sirve para teir las bacterias que no pudieron
retener el complejo cristal violeta-yodo. Hay bacterias de un mismo gnero que
pueden observarse en la misma muestra como Gram positivas y como Gram
negativas, a este evento se le llama tincin Gram variable secundaria a alteracin
en nutrientes, temperatura, pH o concentracin de electrolitos. No todas las
bacterias se pueden teir por esta tcnica, ya que carecen de pared celular
(microplasma) o su pared celular tiene una composicin qumica diferente
(micobacterias, que cuentan con una gran cantidad de cidos miclicos). Las
muestras tiles para su uso son lquidos estriles, biopsias para cultivo, abscesos,
hisopados, crecimiento de colonias aisladas en medios de cultivo. Las bacterias
Gram positivas se observan de color azul obscuro a morado, mientras que las
Gram negativas se observan de color rosa a rojo.

Tincin
de Wright
La
de
es

tincin
Wright
una
tcnica
que se
emplea

Ilustracin 1 Esquema de las diferencias estructurales entre bacterias Gram

Positivas y Gram Negativas

generalmente para la diferenciacin de elementos celulares de la sangre y es

clasificada como una tincin policromtica, dado que puede teir compuestos
cidos o bsicos presentes en una clula. Fue desarrollada por el patlogo James
Homer Wright en 1902 a partir de la modificacin de la ya existente tincin de
Romanowsky, utilizada para diferenciar elementos formes de la sangre. Esta
tincin tiene diversos usos en microbiologa; en la parasitologa, se le emplea en la
bsqueda de hematozoarios como Plasmodium spa. El reactivo de Wright est
compuesto por eosina y azul de metileno, cuando ste se oxida se conoce como
azur B a una concentracin de 0.8 g/L empleando como solvente alcohol metlico.
La eosina es un colorante cido que tiene afinidad por componentes alcalinos.
Existen dos compuestos conocidos como eosina y que estn intrnsecamente
relacionados: eosina Y, conocida tambin como tetrabromofluorescena o,
comnmente, eosina amarilla, y la eosina B, conocida como
dibromodinitrofluorescena o eritrosina B azulada. Ambos compuestos son
intercambiables, sin que sean notables las diferencias entre ellos en el resultado
de la tincin, por lo que la preferencia de una sobre otra no sigue un criterio
objetivo. A pesar de ello, la eosina
Y es la ms utilizada en procedimientos rutinarios. Es un compuesto cido cuya
propiedad est basada en su polaridad negativa, lo que le permite enlazarse con
constituyentes celulares de carga positiva; por esta razn, colorea componentes
citoplasmticos y se les conoce como acidfilos. La tonalidad resultante de la
tincin con eosina es rosada-anaranjada para citoplasmas, y rojo intenso en el
caso de los eritrocitos. El tpico color de los ncleos celulares, mayoritariamente
morado, se basa en la interaccin molecular entre eosina y un complejo azul de
metileno-DNA. La intensidad de la coloracin depende del contenido de azur B y
de la relacin con la eosina amarilla. El resultado de la tincin puede ser influido
por diferentes factores, como el valor del pH de los colorantes y de la solucin
amortiguadora, esto debido a que la tincin se funda menta en la relacin de las
caractersticas cido-base, y la variacin de estos factores podra cambiar las
caractersticas tintoriales de la muestra a teir al verse favorecida por
caractersticas ms cidas o bsicas.
Las muestras tiles para su uso son el frotis de sangre perifrica y frotis de mdula
sea. Los diferentes colores que se observan en la clula provocan el llamado
efecto Romanowsky, que tie de prpura a los ncleos y grnulos neutroflicos y
de color rosa al citoplasma. Los cidos nucleicos se tien de azul, permitiendo as
distinguir a los parsitos en el interior de los eritrocitos. Esta tincin es utilizada en
la bsqueda de Plasmodium spa. (En Mxico, principalmente, Plasmodium vivax),
Leihsmania spa., (principalmente Leishmania mexicana), Trypanosoma cruzii, y en
la bsqueda intencionada de filarias (Figura 3). En micologa esta tincin es de

10

gran ayuda en la bsqueda de Histoplasma capsulatum (hongo dimrfi co) en

extendidos de mdula sea.

Ilustracin 2 Fotomicrografia detrofozoitos jovenes de Plasmodium vivax

Tincin de Ziehl-Neelsen
La tincin de Ziehl-Neelsen es la tcnica comnmente usada en el diagnstico
rutinario de tuberculosis. Es una tcnica rpida, fcil y de bajo costo, lo que
permite que se pueda realizar en casi cualquier laboratorio clnico. Esta tincin
permite diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces de
resistir la decoloracin con alcohol-cido y aquellos que no lo son. La sensibilidad
de esta tincin para identificar bacilos cido-alcohol resistentes es del 74% y la
especificidad del 98%, teniendo un lmite de deteccin de 5,000-10,000 bacilos/ml
de muestra.
El agente etiolgico de la tuberculosis fue descrito por Heinrich Hermann Robert
Koch, quien, basndose en las caractersticas de las micobacterias, desarroll una
de las primeras tinciones utilizando azul de metileno seguido de la tincin de
Bismarck. Sin embargo, fueron los trabajos de Paul Ehrlich los que definieron la
resistencia a la decoloracin por alcohol-cido, y las ltimas modificaciones a la
tincin fueron realizadas por los cientficos alemanes Franz Ziehl y Karl Adolf
Neelsen. El gnero Mycobacterium es el nico miembro en la familia
Mycobacteriaceae y est relacionado con otros gneros que contienen cidos
miclicos (Gordonia, Tsukamurella y Rhodococcus), los cuales tambin pueden
ser teidos con esta tincin. La pared celular de las micobacterias es
extremadamente compleja en cuanto a su composicin bioqumica; dicha
caracterstica es la que se ha aprovechado para realizar la tincin de ZiehlNeelsen. La pared celular est compuesta por cido mesodiaminopimlico,
alanina, cido glutmico, glucosamida, cido murmico, arabinosa y galactosa
(Figura 4). Los cidos miclicos (70-90 nmeros de tomos de carbono) junto con
lpidos libres (ej. trealosa-6,6-dimicolato) proveen a la clula de una barrera
hidrofbica. Otros cidos grasos importantes son: ceras, fosfolpidos, cidos
11

micosricos y phtienoico. La tincin se basa en colocar carbol-fucsina y calentar la

preparacin ligeramente para solubilizar las ceras, lpidos y otros cidos grasos de
la pared celular para que permita el paso libre del colorante, el cual tiene una
enorme afinidad por los cidos miclicos presentes en la pared. Al enfriar con
agua, los componentes de la pared vuelven a solidificar, resistiendo la accin
abrasiva del alcohol-cido, y el azul de metileno se utiliza como contratincin
(Figura 5). Las muestras clnicas tiles para su uso son mltiples, como el lquido
cefalorraqudeo, lquido pleural, lquido sinovial, lquido pericrdico, biopsias para
cultivo, abscesos, aspirados, crecimiento de colonias aisladas en medios de
cultivo, expectoraciones, aspirados endotraqueales y lavados bronquioalveolares.
Una tincin positiva es aqulla en la que se observan bacilos cido-alcohol
resistente, los cuales son de color rojo fucsia. La evaluacin y reporte de las
laminillas se realiza de acuerdo al cuadro I.

Ilustracin 3 Fotomicrografia

Tabla 1Evaluacion

12

Tincin Negativa
La tincin negativa fue desarrollada originalmente para microscopia de luz con el
fin de rodear y delinear las bacterias no teidas u otros materiales biolgicos.
Utilizamos diferentes mtodos de tincin negativa para evaluar estructuras
individuales, tan pequeas como las vesculas sinpticas e incluso de gran
tamao, como los microorganismos unicelulares. Este mtodo es muy til, aunque
est limitado por la presencia de un fondo oscuro que no permitir la correcta
identificacin de forma ntida y detallada de los componentes de dichas
estructuras. En microbiologa, la tincin negativa proporciona un resultado
presuntivo de la presencia de Cryptococcus neoformans, microorganismo
causante de meningitis en pacientes con inmunosupresin, siendo la tcnica ms
utilizada para poner de manifiesto su cpsula. Este hongo presenta dos formas
durante su ciclo vital: una forma asexual y una forma sexual; en la primera se
presenta como levaduras encapsuladas que se reproducen por gemacin y puede
ser visualizada por medio de la tinta china. El principio es simple, ya que slo se
requiere depositar una gota de la muestra clnica sobre un portaobjetos,
posteriormente se coloca el colorante y se observa al microscopio sin necesidad
de fijacin, algunas estructuras difundirn el colorante y otras no, lo que permitir
un contraste de las estructuras observadas. Se han utilizado diferentes colorantes:
uno de ellos es la mencionada tinta china, la cual tie el fondo de la muestra de un
color oscuro y la cpsula del C. neoformans permanece sin teir. La principal
dificultad con la tincin negativa es que los microorganismos tienden a contraerse
durante el periodo de secado; para evitarlo, se ha optado por usar la tincin
negativa hmeda, en la cual los organismos se suspenden en una pelcula de tinta
china o mancha oscura y el contorno de la cpsula puede ser observado sin el
peligro de contraccin. Adems de ser una tcnica sencilla, es muy barata, ya que
no requiere equipos o material costoso para su realizacin. Pueden producirse
falsos positivos en presencia

Ilustracin 4
Preparacin de Cryptococcus neoformans en tinta china que revela la llamativa cpsula que circunda a las
levaduras de gemacin (aumento 40x)

13

De levaduras de los gneros Rhodotorula, Candida y otras especies de

Cryptococcus, igual que por artificios como los leucocitos. Es importante
diferenciar bien la levadura con doble pared refringente, con su cpsula, y siempre
hay que confirmar el diagnstico inicial con cultivo. En los pacientes con
diagnstico previo de criptococosis que se encuentren bajo tratamiento, es
probable que la cpsula no se observe, ya que el tratamiento antifngico est
dirigido hacia sta; sin embargo, pueden observarse estructuras levaduriformes.
Adems de proporcionar informacin temprana sobre un microorganismo
patgeno y propiciar as el inicio del tratamiento adecuado, se considera un
examen til para la monitorizacin del tratamiento y pronstico de los pacientes.
Se recomienda utilizar como control negativo una gota de tinta china y colocarle un
cubreobjetos; esto permitir discernir entre burbujas formadas al agregar el
cubreobjetos o el acmulo de partculas que podran crear una zona de
aclaramiento que pudiera confundir al realizar la revisin de las laminillas. Durante
el procedimiento de la tincin se deben tener precauciones, por lo que se debe
realizar en una campana de bioseguridad 2A. La muestra ms til para su
aplicacin es el lquido cefalorraqudeo, por la predisposicin que tiene este hongo
en los pacientes inmunosuprimidos para infectar el sistema nervioso central. La
cpsula aparece como un halo claro y ntido en torno a una levadura redonda,
delimitada por las partculas de carbn en suspensin coloidal de la tinta china,
exhibiendo un ntido contraste (Figura 6).

Tincin De Azul Algodn De Lacto Fenol.

El examen microscpico es de gran importancia en micologa para la observacin
de las diferentes especies de hongos de inters clnico. Se deben utilizar tinciones
que logren preservar la integridad de las estructuras fngicas. Para la correcta
identificacin de hongos de inters clnico, ya sea con fines de diagnstico o
estudios taxonmicos, es necesario observar las estructuras fngicas con una alta
calidad y contraste; para ello se utilizan diversos compuestos qumicos que
permitan la tincin entre la pared y el citoplasma de las clulas fngicas. La tincin
de azul algodn de lacto fenol no es considerada una tincin diferencial, sin
embargo, posee caractersticas tintoriales que permiten observar cada uno de los
componentes fngicos y apreciar fcilmente las estructuras para una adecuada
identificacin. El fenol inactiva las enzimas lticas de la clula e impide que sta se
rompa; de igual forma, destruye la flora acompaante e inactiva a la clula,
quitndole el grado de patogenicidad; adems, acta como mordiente cuando se
usa en combinacin con colorantes. El cido lctico preserva las estructuras
fngicas al provocar un cambio de gradiente osmtico con relacin al interior
fngico, lo que genera una pelcula protectora. El azul de algodn es un colorante
cido, que tie el citoplasma y la quitina presente en las clulas fngicas, mientras
que el glicerol mantiene hmeda la preparacin. Una vez preparado el colorante,
14

se debe colocar la muestra microbiolgica en un portaobjetos por medio de una

impronta (proceso en el cual se coloca una impresin de la muestra sobre una
estructura utilizando una cinta adhesiva transparente).
Preparacin de la impronta
1. Colocar el material necesario en la campana de Seguridad tipo 2A.
2. Seleccionar las colonias para realizar las improntas.
3. Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente Aproximadamente de 1 cm2
.4. Pegar los segmentos de cinta en un asa micolgica.
5. Poner una gota de azul de algodn en el portaobjetos.
6. Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte Superior de hongo.
7. Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodn y Poner otra gota de azul de
algodn.
8. Poner un cubreobjetos sobre la preparacin.
9. Observar en 40x.
Ver Figura 7.

Ilustracin 5 Representacin esquemtica de la preparacin de la

impronta para la observacin de hongos filamentosos (paso 3 a 9).

15

La manipulacin de los hongos fi lamentosos siempre debe llevarse a cabo en una

campana de seguridad tipo 2A, ya que la mayora de stos son patgenos, y
realizar una tcnica inadecuada puede poner en riesgo al personal. Cuando se
identifica que la presencia de un hongo filamentoso, se sugiere realizar el pase a
una placa en medio dextrosa Sabouraud, para poder realizar una mejor
manipulacin e identificar con mayor facilidad las caractersticas macroscpicas,
tanto en la parte anterior como posterior de la placa. Se debe realizar la impronta
con cuidado de no oprimir demasiado las estructuras, ya que se pueden daar.
Una vez hecha se debe realizar su pronta lectura, ya que en muchos casos la
formacin de esporas o conidios es muy importante para la identificacin, y en
ocasiones es difcil la observacin en cultivos viejos o demasiados jvenes. En
algunas ocasiones slo se llegan a observar hifas sin lograr definir otras
estructuras (cultivos jvenes, se observan micelios infrtiles), por lo que se
recomienda someter al hongo a condiciones donde no se favorezca su
crecimiento, como por ejemplo, el uso por corto tiempo de luz UV (para hongos
productores de pigmento) o la siembra en medios con pocos nutrientes, como
agar-agua, agar dextrosapapa, agar hojuelas de maz (cornmeal, en ingls), e
incluso utilizar un soporte de celulosa, como papel filtro estril, esto favorece la
conidiacin y esporulacin. Es de suma importancia apoyarse de un atlas
micolgico para la interpretacin microscpica. Muestras tiles para su uso son los
hongos fi lamentosos aislados en medios de cultivo. Las estructuras fngicas se
observarn de color azul sobre un fondo blanco (Figura 8).

Ilustracin 6 Fotomicrografa de hongos filamentosos con el mtodo de azul

algodn de lactofenol.Exserohilum sp. (izquierda); Mucor spa. (derecha) (aumento
40x).

16

MICROSCOPIO
4.2-Partes del microscopio compuesto moderno
El microscopio compuesto de uso comn tambin se conoce con el nombre
microscopio ptico en base a que sus propiedades derivan del empleo de lentes
pticas. Est constituido por cuatro grupos de dispositivos o sistemas articulados
de tal manera que garantizan un funcionamiento ptimo y ergonmico (19) (ver fig.
9):
Sistema mecnico: Conjunto de piezas que sirven de soporte a las lentes y
dems elementos (pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina, revolver,
tubo).
Sistema ptico: Conjunto de lentes responsables del poder de aumento y
resolucin (objetivos y ocular)
Sistema de Iluminacin: Elementos que producen las radiaciones (luz visible o
no) y transmiten, reflejan y regulan tanto la intensidad como la cantidad de rayos
que van a incidir sobre el espcimen (lmpara o fuente de iluminacin, espejo,
condensador y diafragma).
Accesorios: Son aditivos que permiten extender las capacidades del
instrumento (cmaras fotogrficas, de video, computadoras, accesorios para
dibujar, entre otros).

17

Figura 9.-Microscopio compuesto moderno con sus partes.

Modificado de District School Board

of Niagara (63)

4.3.-Sistema mecnico del microscopio

La parte mecnica del microscopio tambin se denomina montura y es de forma y
dimensiones muy variables, dependiendo del fabricante y el precio del
instrumento.
De manera general se describen modelos grandes, medianos y pequeos o
porttiles. Los modelos grandes poseen todos los aditamentos que garantizan un
trabajo profesional y permiten el intercambio de piezas y accesorios para realizar
los trabajos ms variados y su costo es el ms elevado. Los modelos medianos no
convienen a todo tipo de investigacin pero son ms prcticos puesto que su
precio es menor gracias a su construccin ms simple. Los microscopios porttiles
responden a necesidades ms restringidas y producen aumentos menores,
conviniendo para observaciones someras.
Toda montura, por complicada que sea posee los siguientes elementos: pie o
base, mecanismo de enfoque, la platina, el revlver y el tubo del ocular.

4.3.1- Pie o base

Generalmente en herradura o en Y, aunque tambin puede ser rectangular, con un
peso considerable que garantiza la estabilidad del instrumento. La base aloja la
18

fuente de iluminacin y puede contener un mecanismo para regular la intensidad

luminosa.
Sirve de soporte a una columna o brazo sobre el cual reposa el resto del aparato.
La columna puede ser inclinada; en su parte ms inferior se dispone el
condensador y la parte superior posee una cremallera que permite desplazar en
sentido vertical el condensador, la platina o el revlver y el tubo. Las ventajas que
procura el microscopio inclinado son mltiples y la posicin es ms confortable
para el observador (actividad que es muy incmoda cuando el tubo del
microscopio es vertical).

4.3.2.-Mecanismo de enfoque
Se logra desplazando en sentido vertical ya sea la platina donde se coloca el
espcimen o ya sea el revlver donde estn colocados los objetivos, de modo que
se pueda centrar el punto focal del objetivo que se est utilizando es ese
momento. Se logra mediante dos mecanismos, primero uno rpido del tornillo
macromtrico y segundo, otro lento del tornillo micromtrico.
La cremallera que permite el movimiento rpido del tornillo macromtrico posee
dientes que se engranan y producen un movimiento tosco para lograr un enfoque
aproximado. Se utiliza para enfocar con los objetivos de poco aumento y para
subirlos rpidamente con la finalidad de colocar o retirar de la platina el preparado
histolgico.
El tornillo micromtrico por el contrario posee una graduacin tal que cada divisin
de la rosca permite un movimiento vertical imperceptible en el orden de 0,001 mm.
Esta disposicin permite evaluar de manera aproximada el espesor de los objetos,
considerando el nmero de vueltas que realiza el tornillo al enfocar su parte ms
superficial y luego la ms profunda.
El movimiento del tornillo micromtrico tiene una extensin de 5mm
aproximadamente y est limitado. Permite un enfoque fino y se utiliza con los
objetivos de mayor aumento (11).

4.3.3.-La platina
Es el soporte horizontal donde se colocan las preparaciones histolgicas. Presenta
en el centro un orificio circular por donde pasa el rayo de luz producido por la
fuente luminosa y proveniente del condensador. Generalmente es de forma
cuadrada y posee un sistema de fijacin e inmovilizacin de la lmina porta-objeto

19

compuesto por pinzas o una pieza articulada que esta fija a otro dispositivo, el
carro.
Este dispositivo permite el examen metdico y completo de la preparacin al
proporcionar un desplazamiento hacia adelante o hacia atrs y de derecha a
izquierda y viceversa.
Otra pieza, el vernier (denominado as gracias al nombre de su inventor en 1631),
tambin llamado nonius, consiste en dos pequeas reglas graduadas en
milmetros cuya finalidad es la de obtener coordenadas aproximadas que sirven de
referencia para localizar una estructura determinada en la preparacin. En la
prctica, el uso del vernier no es frecuente, se hace un poco complicado anotar las
cifras y ms difcil an colocarlas en las reglas y localizar la estructura en cuestin.
Adems, estas cifras solo son vlidas para el microscopio en el cual se obtuvieron.
Hay otros procedimientos ms simples para tal fin (11, 64).

4.3.4.-El revlver
Considerado como un accesorio del tubo. Es un implemento muy importante que
permite el intercambio rpido de objetivos mediante un movimiento de rotacin. El
revlver est constituido por una semi-esfera que posee una serie de anillos en los
cuales van atornillados los objetivos. Esta pieza gira alrededor de un eje que est
colocado en la parte inferior del tubo. Puede ser de diversas formas y de igual
manera, alojar un nmero variable de objetivos (dos, tres, cuatro o ms).

4.3.5.-El tubo
Soporta la porcin ptica del microscopio. Es un cilindro hueco de longitud
variable, cuyo interior est pintado de negro mate y posee un diafragma para
impedir la formacin de reflejos y facilitar la observacin. El tubo puede ser doble y
alojar dos lentes oculares (microscopio binocular). En los modelos de
microscopios grandes destinados a la microfotografa, hay un tercer tubo
accesorio, generalmente ms largo y vertical que sirve para conectar una cmara
fotogrfica sin necesidad de lente ocular.

4.4-Sistema ptico del microscopio

Los microscopios modernos estn diseados para proporcionar imgenes
aumentadas y ntidas de los especmenes que se observan. Los componentes
pticos estn colocados en una base estable que permite un intercambio rpido y

20

un alineamiento preciso. El sistema ptico est constituido por dos juegos de

lentes: El objetivo y el ocular.

4.4.1.-Los objetivos
Representan el componente ptico ms importante del microscopio. Su principal
funcin consiste en colectar la luz proveniente del espcimen y proyectar una
imagen ntida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio.
Constituyen un sistema ptico formado por una o varias lentes, las cuales deben
estar centradas y los ejes pticos de cada una deben coincidir exactamente para
formar el eje ptico del sistema. Sus lentes estn hechas a partir de cristales
(espatos, fluorita, entre otros) con un alto grado de calidad y funcionamiento; su
precio depende del poder de aumento, resolucin y de la correccin de las
aberraciones. Muchos fabricantes elaboran objetivos que pueden ser
intercambiados y empleados en microscopios de otras marcas comerciales.
Clasificacin:
Tomando en cuenta el grado de correccin de las aberraciones hay dos categoras
de objetivos para el microscopio, los objetivos acromticos y los objetivos
apocromticos. En cada categora se distinguen an dos grupos, los objetivos
secos y los objetivos de inmersin (64, 65, 66):
Objetivos acromticos: Presentan correccin cromtica para la luz azul y roja.
Correccin de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con filtro de luz
de color verde y son ideales para microfotografa blanco y negro. Se asume que
un objetivo es acromtico cuando no posee ninguna denominacin.
Objetivos semi-apocromticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita.
Corrigen para el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La correccin de
esfericidad es para dos colores, el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz
blanca y estn mejor diseados para la microfotografa en colores.
Objetivos apocromticos: Poseen el ms alto nivel de correccin de aberraciones
y por ello, son ms costosos. Presentan correccin cromtica para cuatro colores
(azul oscuro, azul, rojo y verde); correccin de esfericidad para dos o tres colores.
Son los mejores objetivos para microfotografa y video a color. Debido a su alto
grado de correccin, estos objetivos poseen mayores aperturas numricas que los
acromticos y las fluoritas. Esto puede ser un inconveniente puesto que el campo
de observacin se presenta un poco curvo.

21

Los tres tipos de objetivos proyectan imgenes con cierta distorsin que se
manifiesta como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se denominan
plan-acromticos, plan-fluoritas o plan-apocromticos.
Objetivos secos y objetivos de inmersin:
Estos objetivos difieren entre s por la naturaleza del medio interpuesto entre el
cubre-objeto de la lmina histolgica y la lente frontal del objetivo. En los objetivos
secos el medio interpuesto es el aire cuyo ndice de refraccin (n=1) es muy
diferente del ndice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los
objetivos denominados de inmersin el medio que separa al cubre-objeto de la
lente frontal del objetivo es un lquido cuyo ndice de refraccin es lo ms prximo
al del vidrio. Este lquido puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor an aceite de
cedro, que posee un ndice de refraccin (n=1,515) casi idntico al del vidrio.
La ventaja de los objetivos de inmersin consiste en la disminucin o eliminacin
de la refraccin de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en consecuencia
la luminosidad de la imagen est aumentada, mientras que en los objetivos secos,
est disminuida. El empleo de la inmersin aumenta el ngulo de apertura del
objetivo y permite mayor resolucin gracias a la captura de una mayor cantidad de
rayos luminosos refractados (11, 64) y solo puede utilizarse con objetivos de
mayor aumento.

ptica finita y ptica infinita:

La microscopia de luz o fotnica ha experimentado cambios radicales en sus
sistemas pticos en los ltimos aos. El tubo que soporta tanto el revlver por un
extremo, como el ocular por el otro, se confeccionaba con una determinada
longitud y los fabricantes elaboraban objetivos que funcionaban para esa longitud
(longitud finita) que fue estandarizada a 160mm y en algunos casos (Leitz) a
170mm. En muchos modelos de microscopios modernos el tubo no es rectilneo y
los rayos de luz transmitidos desde el objetivo hacia el ocular son desviados por
prismas, especialmente en los microscopios trinoculares para fotografa. Emplear
objetivos diseados para una determinada longitud de tubo en otro microscopio
que no corresponda produce incremento en las aberraciones de esfericidad,
ocasionado por una longitud de tubo diferente.
Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes, espejos y
prismas que transmiten la luz desde el objetivo al ocular y actualmente casi todos
los fabricantes estn elaborando microscopios que puedan aceptar objetivos
diseados para realizar una correccin infinita. Tales objetivos proyectan una
imagen al infinito la cual es captada por otra lente que se introduce en el tubo y
que a su vez la proyecta al punto focal del ocular. Los objetivos con esta
correccin poseen el smbolo infinito grabado en la parte externa. Los sistemas
22

corregidos al infinito son significativos porque corrigen la aparicin de imgenes

fantasma que con frecuencia se observa en microscopios anteriores, no obstante
estos nuevos modelos son de mayor tamao (66) (fig. 10).

Figura 10.-Esquema que muestra el principio de los objetivos con correccin al

infinito. Modificado de Microscope objetives. Olympus Microscopy Resource Center (66).

Estructura de los objetivos:

Generalmente es un tubo cilndrico que contiene en su interior un revestimiento
anti-reflejos y las diversas lentes colocadas en serie y alineadas (fig. 11). En la
parte externa posee grabadas las especificaciones y caractersticas.

23

Figura 11.-Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromtico que contiene una lente
frontal y dos pares internos, (b) objetivo semi-apocromtico o fluorita, con cuatro
pares de lentes y (c) objetivo apocromtico que contiene un triplete, dos pares, un
menisco y una lente esfrica frontal. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (15).
Nomenclatura de los objetivos:
La identificacin de las propiedades individuales de los objetivos es posible
gracias a la nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las
especificaciones necesarias para su uso apropiado (11, 15). La minuciosa
informacin, generalmente en el idioma ingls, puede contener (fig. 12):
Nombre del fabricante: Casa comercial
Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0,5x hasta 200x
Correcciones pticas: Achro, Achromat (acromticos); Fluar, Neofluar (semiapocromticos); Apo (apocromticos); Plan, Plano (corrige curvatura de campo);
ICS (infinity corrected system), UIS (universal infinity system); N, NPL (normal field
o view plan); CF, CFI (chrome-free, chrome free infinity) y muchas otras
especificaciones cuya nomenclatura depende del fabricante.
Apertura numrica: Es un valor que indica el ngulo de apertura del cono
luminoso.
Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en
milmetros (160, 170, 220) o con el smbolo (8) para objetivos con correccin
infinita.
24

 Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm pero hay

diversos espesores lo cual produce aberraciones. Algunos objetivos poseen un
collar de correccin en las lentes internas para realizar la correccin y se
denominan CR, Corr, w/corr, o pueden tener una escala graduada mvil para el
ajuste.
Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del objetivo,
expresada en milmetros.
Propiedades pticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas condiciones
tienen resultados ptimos (para luz polarizada, contraste de fase, entre otros).
Rosca del objetivo: La mayora de objetivos estn estandarizados de acuerdo a
la Royal Microscopy Society para garantizar una compatibilidad universal y se
designan con las siglas RMS, sin embargo, algunos fabricantes tiene sus propias
dimensiones. El dimetro general es de 20mm, pero los objetivos Leica y Nikon
son de rosca ms amplia y slo funcionan en sus microscopios. M25 y M32
designan roscas de 25 y 32 mm respectivamente.
Medio de inmersin: Algunos objetivos ameritan el uso de medios de inmersin y
para ello se emplea un cdigo de colores o las abreviaciones Oil, Oel (aceite); HI
(homogeneous immersion); W, Water, Wasser (agua) y Gly (glicerol).
Cdigo de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos de
colores para facilitar la identificacin del aumento (ver tabla 1).

Figura 12.-Nomenclatura del objetivo. Las propiedades pticas especiales en este

objetivo denotan que puede emplearse en Interferencia de contraste diferencial
(DIC differential interference contrast) y la H significa que puede emplearse en

25

microscopios con platina caliente (heating stage).

Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical

Microscopy. (15).

Cdigo de color
de inmersin

Medio de inmersin

Negro

Aceite

Naranja

Glicerol

Blanco

Agua

Rojo

Especial o multiuso

Cdigo de color
de aumento

Aumento

Negro

1x, 2.5x

Marrn

2x, 2.5x

Rojo

4x, 5x

Amarillo

10x

Verde

16x, 20x

Azul turquesa

25x, 32x

Azul celeste

40x, 50x

Azul cobalto

60x, 63x

Blanco, crema

100x, 250x, 200x

Tabla 1.-Cdigos de color en los objetivos microscpicos.

Modificado de Davison M, Abramowitz

M. Optical Microscopy. (15).

4.4.2.-El ocular
El ocular (del latn oculus = el ojo) est formado por lentes que generalmente son
separadas por un diafragma, montadas en las extremidades de un cilindro que va
introducido en la parte superior del tubo. El ocular sirve para observar la imagen
real e invertida que produce el objetivo, ejerciendo dos funciones:
26

 Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con respecto

a la imagen del objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto. Posteriormente
el ojo endereza la imagen.
Aplana y aclara el campo ptico o plano circular en el que aparece el objeto.

La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento de la

imagen real del objetivo; la lente inferior tambin se denomina colectora y es la
que aplana y aclara el campo (fig. 13).

Clasificacin:
Oculares de Huygens: Empleados con los objetivos acromticos y formados por
dos lentes plano-convexas cuya convexidad est dirigida hacia el objetivo y el
diafragma se ubica entre ambas. Tambin denominado ocular negativo porque la
imagen se forma entre las dos lentes. Muy comn en modelos de microscopios
antiguos (11).
Oculares de Ramsden: Conocido como ocular positivo, formado por varias
lentes unidas entre s y colocadas por encima del diafragma. Generalmente
corrigen aberraciones y funcionan de manera ptima con los objetivos corregidos
al infinito (15).
Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de aumento
para los diversos colores (diferencia cromtica de aumento) que se aprecia en los
objetivos apocromticos. No tiene buen rendimiento con objetivos acromticos
secos.
Oculares de proyeccin: Posee una lente que permite la proyeccin de la imagen
en una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para dibujar o para
exhibicin (11).
Oculares aplanticos: Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente
plano y el poder de resolucin es igual tanto en el centro como en la periferia del
campo ptico (11).
Oculares peri-planticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce con
objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo Huygens pero
con una doble lente ocular (11).

27

Figura 13.-Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular compensador y

(c) ocular de Ramsden. Los oculares negativos (a y b) poseen el diafragma entre
las dos lentes (colectora y ocular) y los oculares positivos poseen el diafragma por
debajo de las lentes (c). Modificado de Digit Life (67).

Uno de los diseos de oculares ms avanzados es el ocular Periplan (38) (fig. 14)
que contiene siete lentes que corrigen las aberraciones cromticas, la curvatura de
campo y su empleo ptimo es en combinacin con objetivos de gran poder de
aumento.

Figura 14.-Diagrama de la constitucin del ocular Periplan. Es un ocular negativo.

Modificado de M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).

Los modelos de microscopios ms simples poseen un solo ocular (monooculares), sin embargo hay microscopios binoculares y algunos modelos ms
28

modernos son trinoculares, especiales para la microfotografa. Los binoculares

tienen los objetivos dispuestos con una inclinacin de 45 para realizar la
observacin cmodamente.

Campo del microscopio:

Se denomina campo del microscopio al crculo visible que se observa en el ocular.
Tambin podemos definirlo como la porcin del plano visible observado a travs
de las lentes. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir
que el campo es inversamente proporcional al aumento del microscopio. La forma
del campo est determinada por el diafragma fijo del ocular, que generalmente es
de forma circular, no obstante el campo puede ser cuadrado y esta forma es muy
til al realizar estudios de coprologa o hematologa, en donde se requiere
reconstruir la totalidad del campo de observacin de la preparacin, lo cual se
dificulta con un campo circular clsico al quedar zonas superpuestas (11).
El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo.
El valor de este aumento est inscrito en la superficie del ocular y generalmente es
de 10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x. Otro valor es el nmero de campo que consiste en
el dimetro en milmetros de la apertura fija del diafragma, la cual puede variar
desde 18mm hasta 26.5mm.
Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus
caractersticas:
UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio.
H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la observacin
microscpica.
K, C, comp: Para oculares compensadores.
Plan-comp: Objetivos que corrigen curvatura de campo y dan campos planos.

Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificacin o medicin de

estructuras del espcimen en estudio. En ciertos casos es relevante conocer el
nmero, tamao o dimensiones de las clulas y dems elementos del tejido.
Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza
circular de vidrio con una escala o gradilla (fig. 15), la cual aparece enfocada y
superpuesta a la imagen del espcimen al encontrarse en el plano de formacin
de la misma. Los oculares para la medicin poseen un mecanismo de enfoque
mediante rotacin. Se debe calibrar la escala de medicin del ocular con cada
objetivo que se use (15). En la actualidad se puede emplear algn software de
29

computacin para realizar mediciones sobre las imgenes digitales y obtener

datos muy precisos, no obstante, el mtodo ms econmico y de uso ms
generalizado es la medicin con los oculares.
En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa
(alambre, pestaa, cerda) denominada sealador, con la finalidad de indicar de
manera especfica alguna estructura en particular en el campo de observacin. El
sealador se aprecia como una lnea oscura que parte del borde del campo hacia
el centro del mismo.
Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por una
parte colocar los ojos a la distancia correcta de observacin y por otra, impedir la
formacin de reflejos luminosos que dificulten la visualizacin. Algunos
microscopios binoculares poseen un mecanismo de enfoque del ocular que ajusta
las dioptras en caso que el observador posea una disminucin de su agudeza
visual. El ajuste se realiza por separado tanto para el ojo derecho como para el
izquierdo; de igual manera se ajustan a la distancia interpupilar del observador
(usualmente entre 55 y 75 mm).

Figura 15.-Microfotografa de un frotis de sangre perifrica en la que se observa

un campo rectangular con una escala de divisiones precisas, que en este caso son
en el orden de 1/10 mm. Para determinar el tamao de una clula se cuenta el
nmero de divisiones que ocupa y la cifra se divide entre el aumento del objetivo
empleado, dando como resultado un valor que corresponde al tamao de la
misma. Si la clula mide 7 divisiones, corresponde a 7/10mm; si el aumento del
objetivo es 100x, se divide 0.7mm:100 = 0.007mm = 7m.

30

4.5.-Sistema de iluminacin
El sistema de iluminacin est constituido por las partes del microscopio que
producen o captan, reflejan y regulan la intensidad de la luz que se utiliza para la
observacin microscpica. Uno de los aspectos crticos a considerar en la
microscopa ptica es la fuente de luz que se emplea para iluminar el espcimen.
Si la muestra es iluminada de manera inadecuada, la calidad de la imagen que se
obtiene se ver afectada, aun cuando se disponga de un excelente sistema ptico.
La iluminacin ptima debe ser brillante, sin resplandores y en lo posible debe
dispersarse de manera uniforme en el campo de observacin.
Si se emplea luz visible (fotones) es usual que al microscopio se le denomine
fotnico. En sus inicios, la microscopa se practicaba con iluminacin por reflexin;
se utilizaba un espejo que se orientaba para recoger la luz solar o en su defecto,
luz artificial (la luz de una vela, mechero a gas, lmparas de aceite o petrleo) y la
desviaba hacia la preparacin. Este mtodo se mantuvo durante mucho tiempo, en
parte debido al lento perfeccionamiento de las bombillas incandescentes, que
consisten en un globo de cristal en el que se ha hecho el vaco y dentro del cual va
colocado un hilo de metal (platino, carbn, tungsteno, entre otros) que al paso de
una corriente elctrica se pone incandescente y sirve para alumbrar (50).
Con el uso de la bombilla elctrica se suprime este espejo y los microscopios
pueden utilizarse en cualquier lugar. Sin embargo, algunos modelos de
microscopios actuales, desde los ms sencillos y econmicos hasta los ms
sofisticados, an poseen un espejo que sirve para desviar la luz producida por la
bombilla, en el caso que sta no se encuentre alineada con la platina.
El sistema de iluminacin est constituido por la fuente de luz, el condensador y
un diafragma o iris. Como regla general, el sistema de iluminacin est colocado
debajo de la platina y la finalidad es de iluminar mediante luz transmitida. En la
mayora de los casos el estudio de las preparaciones histolgicas se hace por
transiluminacin. En otros casos muy especficos se emplea el mtodo de luz
reflejada, en el cual se ilumina la superficie del espcimen mediante epiiluminacion. La fuente de luz emite una radiacin que es recogida por un
dispositivo denominado condensador, que a su vez forma un cono luminoso
necesario para la visualizacin con objetivos de mayor aumento.

4.5.1.-Fuentes de luz
Aparte de la luz solar, empleada en microscopios sencillos con espejo, existen
numerosas fuentes de iluminacin artificial, tanto para la observacin rutinaria
como para la microfotografa. La luz artificial presenta numerosas ventajas tales
como la constancia, la uniformidad y la intensidad; adems es muy favorable para
los mayores aumentos. Existen varios tipos de fuentes de luz artificial:
31

 Bombillas de tungsteno y halgenas: La mayora de microscopios de luz estn

dotados de lmparas de este tipo cuyo poder oscila entre 10W y 100W. Se
emplean como fuentes principales o accesorias. Estas lmparas son radiadores
trmicos que emiten una luz continua en un espectro comprendido entre 300
1200 nm. Estn constituidas por un bulbo de cristal relleno de un gas inerte y un
filamento de tungsteno que es activado por una corriente elctrica produciendo
una importante cantidad de luz y calor. Varan mucho en tamao, diseo y forma
(68). Producen una luz blanca pero incrementan la intensidad del azul al rojo. La
luz puede ser muy brillante para la observacin y se reduce con filtros que
disminuyen la intensidad, denominados filtros de densidad neutra, disminuyendo la
intensidad sin alterar los colores. Tambin se emplean filtros de colores que
compensen el color rojo, de manera que se pueda observar la imagen del
espcimen sobre un fondo iluminado neutro, blanco y claro. El vidrio azul corrige el
tinte amarillo que tiene la luz incandescente y se obtiene una luz suave y
agradable que aumenta la definicin.
Lmparas de arco elctrico: Son lmparas que pueden contener gases (vapor de
mercurio, xenn o circonio) y son empleadas para proveer una luz monocromtica
con filtros apropiados, ideal para microfotografa en blanco y negro o a colores.
Tambin se utilizan en microscopios especiales (fluorescencia).
Lser: En los ltimos aos se ha incrementado el uso de lser (Light
Amplification by Stimulated Emission of Radiation, Amplificacin de Luz por
Emisin Estimulada de Radiacin) (42), que consiste en un dispositivo que genera
un haz de luz con caractersticas de tamao, coherencia, forma y pureza
controladas. El lser de argn es uno de los ms utilizados, cuya emisin est en
el orden de 488-514 nm. Su costo es muy elevado y se emplea principalmente en
microscopa confocal.
LED: De las siglas en ingls Light-Emitting Diode (diodo emisor de luz) es un
dispositivo emisor de luz con caractersticas muy prximas a la luz monocromtica
(espectro reducido). La luz se produce cuando una corriente elctrica pasa a
travs del material semiconductor (arseniuro de galio-aluminio) del que estn
hechos (69). Se utilizan en una amplia gama de artefactos y lmparas. En
comparacin con las bombillas incandescentes, son ms interesantes porque
permiten ahorro de energa con un mayor rendimiento lumnico. Para microscopa
se emplean LED de larga duracin que proveen una luz muy brillante y fra; esto
ltimo es una gran ventaja, puesto que no genera calor y la observacin es ms
cmoda para el usuario. En la actualidad se producen combinaciones de diodos
que emiten una luz blanca.

4.5.2.-Condensador
Es un dispositivo que tiene por finalidad formar conos luminosos grandes, con
aperturas mayores, necesarios para ver con los objetivos de mayor aumento. El
32

trmino condensador puede considerarse inadecuado, ya que no produce una

condensacin de los rayos luminosos, por el contrario, produce un aumento de la
seccin del cono luminoso (11) que a su vez forma una imagen ms clara.
El condensador est conformado por una o varias lentes situadas debajo de la
platina del microscopio, colocadas entre la fuente de luz y el espcimen. El primer
condensador que se fabric en 1838 (por Dujardin) posea tres lentes acromticas.
Al igual que en los objetivos, las lentes del condensador poseen poder de aumento
y tambin producen aberraciones, sin embargo, stas tambin pueden corregirse.
Tipos de condensadores de acuerdo al grado de correccin de aberraciones
pticas (15):
Condensador de Abbe: Es el ms simple, sin correccin de aberraciones y el
ms econmico. Compuesto de dos o ms lentes. Puede llegar a tener una
apertura numrica de 1.4 en modelos de tres lentes. Se emplea para observacin
de rutina y con objetivos de modesta apertura numrica y amplificacin. Una de
las ventajas es el amplio cono de iluminacin que puede producir.
Aplantico: Corrige aberraciones de esfericidad.
Acromtico: Corrige aberraciones cromticas. Contiene tres o cuatro lentes
corregidas para el azul y el rojo. Este condensador es til para observaciones de
rutina con objetivos secos y para microfotografa (blanco y negro o color).
Aplantico-Acromtico: Poseen el ms alto nivel de correccin y es el
condensador de eleccin para microfotografa a color con luz blanca. Puede
contener ocho lentes y su uso es ptimo con inmersin y objetivos de mayor
aumento.
El cono de luz que produce el condensador debe ajustarse de manera apropiada
para optimizar la intensidad y el ngulo de apertura. Cada vez que se cambia un
objetivo se debe realizar un ajuste para obtener el cono de luz conveniente a la
apertura numrica del nuevo objetivo. A menudo no es prctico utilizar el mismo
condensador para un amplio rango de objetivos (2x hasta 100x). Para objetivos de
bajo poder de aumento (menor a 10x) algunos condensadores poseen una lente
frontal adicional que es abatible. La altura del condensador es regulada mediante
un mecanismo activado con un tornillo que lo baja o lo sube, acercndolo o no a la
platina donde est colocado el espcimen (fig. 16).
Adems de los condensadores empleados en los microscopios de campo claro,
existe una variedad de modelos de condensadores especializados que se utilizan
en diferentes aplicaciones, cuya finalidad principal es el incremento del contraste
entre los detalles de la estructura del espcimen. Se han desarrollado
condensadores especiales para microscopa de campo oscuro, contraste de fase,
luz polarizada, contraste de interferencia diferencial.
33

Figura 16.-Condensador tipo Abbe y objetivo adaptado. Se observa un

condensador con dos lentes y el trazado del haz de luz en un microscopio
fotnico. El medio de inmersin, en este caso aceite, se puede colocar tanto entre
la lente frontal del condensador y el preparado histolgico como entre el preparado
y la lente frontal del objetivo. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy
Resource Center (15).

4.5.3.-Diafragma o iris
Es un dispositivo que se coloca inmediatamente debajo de la platina. Debe
permitir cambios en la apertura y con dimetros variables cuya finalidad es la de
obtener conos luminosos cada vez ms estrechos y eliminar los rayos de luz
sobrantes. Los primeros diafragmas consistan en un disco de metal con agujeros
de diferente dimetro, el cual se rotaba segn la necesidad. Estos discos fueron
substituidos por el iris, otro dispositivo ms elaborado y con un diseo que le
permite cambiar de dimetro. La apertura del diafragma se regula en relacin con
el tipo de objetivo que se est utilizando. El diafragma o iris est pintado de negro
con la finalidad de eliminar los rayos de luz reflejada que pueden interferir con la
iluminacin del objeto. (11, 70, 71). (fig. 17).

Figura 17.-Iris con mecanismo para variar la apertura.

Microscope (70).

34

Tomado de Cross M, Cole M. Modern

4.5.4.-Iluminacin Khler
La iluminacin es una variable crtica que hay que considerar al poner en
funcionamiento el microscopio. Con frecuencia el uso incorrecto de la iluminacin,
an en equipos sofisticados, conduce a la obtencin de imgenes defectuosas. El
espcimen debe ser iluminado mediante una fuente de luz artificial, la cual puede
producir artificios en la imagen que se observa.
En el ao 1893, el profesor August Khler propuso un mtodo de iluminacin para
optimizar la observacin microscpica y la microfotografa (15), que permite
aprovechar al mximo las capacidades de las lentes (objetivos) iluminando la
muestra en estudio con un campo de luz uniforme cuyo dimetro sea igual al del
rea de captura del objetivo. Los microscopios modernos estn diseados para
aplicar la iluminacin Khler y los requerimientos son (figs. 18 y 19):
Condensador que sube y baja para enfocar el cono de luz.
Bombilla con lente colectora.
Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la lmpara y un
diafragma de apertura, colocado debajo del condensador.

Figura 18.-Iluminacin Khler. Se debe iluminar el espcimen siguiendo el

esquema. La lmpara posee un filamento (S) incandescente cuya luz es captada
por la lente colectora L1 y regulada por el diafragma de campo D1. La imagen S
del filamento de la lmpara es proyectada al plano del segundo diafragma D2.
Este primer paso se realiza con D1 completamente abierto. La altura del
condensador L2 se regula de manera que su punto focal est en el plano D2. La
imagen del diafragma de campo D1 es proyectada en el plano de la preparacin
por el condensador. Tomado de Estudio de diafragmas de campo y apertura. Microscopio (72).

35

El condensador se desplaza verticalmente hasta obtener una imagen ntida del

diafragma de campo. La iluminacin ideal se consigue cundo el condensador se
encuentra lo ms cerca de la preparacin. El diafragma de campo regula el
dimetro de la apertura de la iluminacin y al cerrarlo se incrementan los
contrastes (15). Una vez ajustada la iluminacin Khler no se debe regular la
intensidad de la luz o el brillo bajando el condensador o cerrando la apertura de
diafragma-iris, por el contrario, se regula la intensidad de la lmpara mediante un
ajuste de voltaje.

Figura 19.-Trayectoria de la luz en la iluminacin Khler. Modificado de Davison M, Abramowitz

M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15 ).

4.6.-Formacin de la imagen en el microscopio compuesto

Con la finalidad de facilitar la comprensin de la propiedad de aumento que tienen
las lentes y en consecuencia el microscopio para observar objetos minsculos, es
necesario conocer algunos aspectos del fenmeno de la visin. El ojo humano
est constituido de tal manera que slo puede tener una visin clara cuando los
rayos luminosos incidentes son paralelos o ligeramente divergentes, debido a que
la retina requiere la participacin del cristalino para enfocar los rayos en su
superficie.
El lmite para visin cercana es la mnima distancia a la cual se puede observar
claramente un objeto; varia de un individuo a otro y se estima entre 15 y 25 cm (6
y 10 pulgadas respectivamente), depende de la edad y otros factores. El valor
considerado normal es de 25 cm. El tamao aparente de un objeto depende del
ngulo formado por dos lneas proyectadas desde el centro del ojo a las
extremidades de dicho objeto (fig. 20)

36

Figura 20. Las lneas dibujadas desde el ojo a A y R forman un ngulo, el cual es
dos veces ms grande que el ngulo de las lneas O-W. De igual manera, la
distancia del ojo a la flecha OW es dos veces la distancia del ojo a la flecha AR. La
flecha en AR aparece dos veces ms grande que la flecha en OW. Las
proporciones se mantienen al alejar o acercar la flecha. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its
History, Construction and Applications (73).

Este ngulo as formado se conoce como ngulo de visin o ngulo visual (73). La
utilidad de una lente convexa interpuesta entre el ojo y un objeto cercano consiste
en la reduccin de la divergencia de los rayos luminosos emanados del objeto, de
manera que puedan entrar al ojo en un estado de moderada divergencia, como si
emanaran de un objeto situado ms all del lmite de visin cercana y en
consecuencia se forma la imagen en la retina (fig. 21).

Figura 21. Diagrama que representa una lente bi-convexa cercana al ojo y a una
flecha pequea (objeto en estudio) cuyos conos dibujados representan parte de
los rayos de luz divergentes emanados de varios puntos. Los rayos emanados del
objeto muy cercano, al incidir en la pupila, son an tan divergentes que no
37

permiten formar una imagen enfocada en la retina; pero al pasar primero por la
lente son desviados para formar lneas casi paralelas que si pueden ser captadas
por el ojo si ste est a su vez muy cercano a la lente. Tomado de Hogg J. The Microscope: Its
History, Construction and Applications (73).

Esos rayos luminosos emanados del objeto cercano y desviados por la lente son
recibidos por el ojo como si fuesen emanados directamente por una flecha (objeto)
ms grande, aparentemente situada en el lmite de visin cercana del observador
(aprox. 25 cm del ojo). La diferencia de tamao entre la flecha real y la flecha
imaginaria estar determinada por el poder de aumento de la lente. La imagen
formada no es real, no puede ser proyectada en una pantalla o recogida en una
placa fotogrfica; es una imagen mental. Por esta razn la imagen se denomina
virtual y la distancia desde la lente hasta la imagen formada se denomina distancia
focal virtual (74,75).
Al interponer una lente bi-convexa entre un objeto y el ojo se incrementa el ngulo
de visin y en consecuencia el objeto se ver ms grande (fig. 22)

Figura 22. Sin la lente colocada en fg el ojo ver la flecha con el ngulo formado
por las lneas punteadas b y c, formando la imagen bc. Los rayos bf y cg
emanados de las extremidades de la flecha son refractados por la lente hacia el
ojo en direccin f y g, los cuales crean un ngulo visual mayor que hace que la
fecha se vea ms grande (d-e). Tomado de Hogg J. The Microscope: Its History, Construction and Applications
(73).

Lo que se conoce sobre las propiedades de las lentes permitir comprender el

principio del microscopio compuesto, denominado as, en oposicin a la lupa
(microscopio simple) en base a que est conformado por dos sistemas de lentes,
los cuales deben estar centrados, es decir, tener el mismo eje ptico. El primer
sistema, cercano al objeto en estudio, se denomina objetivo, posee una distancia
38

focal muy corta y es posible colocar el objeto un poco ms all de su punto focal
para obtener una imagen real, invertida y aumentada.
El sistema de lentes a travs del cual el observador examina se denomina ocular y
funciona como una lupa que aumenta la imagen real producida por el objetivo. La
distancia entre el ocular y el objetivo debe ser calculada de manera que la imagen
real obtenida por el objetivo se forme entre el ocular y su punto focal (11). El
aumento del microscopio depender en principio de la longitud focal del objetivo.
Mientras ms pequea sea esta longitud y el objeto se acerque al objetivo, ms
grande ser la imagen real. El aumento tambin depende de la distancia focal del
ocular y mientras ms corta sea esta, mayor ser el aumento (fig. 23).

Figura 23. Esquema simplificado que muestra el trayecto que siguen los rayos
emanados del espcimen en estudio y su paso a travs de las lentes objetivo y
ocular para la formacin de las imgenes. La flecha ab corresponde al espcimen,
que est colocado un poco por delante del foco (f) del objetivo, el cual forma una
imagen real, aumentada e invertida en ab. Esta imagen se forma por dentro del
foco (f ) de la lente ocular. El ojo del observador percibir a travs del ocular la
imagen virtual, aumentada y derecha ab de la imagen real ab.

39

40

CONCLUSIN GRUPAL.
Es importante conocer sobre este tema ya que conocemos la manera correcta de
como enumerar los mtodos para la identificacin microbiana y saber de una
manera especfica su aplicacin en distintas ocasiones como es la. Identificacin
microbiana y las sondas de ADN.
Tambin pudimos conocer las reas donde estas tcnicas son utilizadas.
Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiologa permiten el diagnstico
oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel
importante en la decisin del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas.
Se debe practicar la tincin adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en
sospecha y el tipo de muestra clnica. Las tinciones son herramientas elementales,
vigentes y de uso universal que coadyuvan al diagnstico microbiolgico.

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