1

2015

Tcnica histolgica
de rutina

Dra. Alicia Flamini Dr. Claudio Barbeito

Md. Vet. Fernando Andrs Laube

INTRODUCCIN
La Histologa estudia la estructura, la funcin y la composicin de los tejidos y rganos. El progreso de la
Histologa como ciencia est directamente relacionado con el desarrollo de instrumentos, tales como el
microscopio y las diferentes tcnicas de estudio, especialmente con la mejora de las coloraciones, las
tcnicas histoqumicas y ms recientemente la inmunohistoqumica, que posibilitan la localizacin precisa
en los tejidos de macromolculas especficas como de protenas, cidos nucleicos, por citar algunos
ejemplos.
La gran mayora de las estructuras que se analizan durante el curso de Histologa tienen un tamao inferior
al que el ojo humano puede ver, por lo que es necesario utilizar microscopios. Otro inconveniente es que
los tejidos u rganos deben ser preparados para esa observacin.
El siguiente material es una gua para que el estudiante se familiarice con los procedimientos que se llevan
a cabo en el laboratorio para obtener una preparacin histolgica que luego ser observada con el
microscopio ptico.

Qu es una preparacin histolgica y cmo se obtiene?

La muestra histolgica consiste en una seccin de algunos micrmetros (m) de grosor que se dispone
alojada entre dos vidrios: uno de cierto grosor denominado portaobjetos y otro muy fino llamado
cubreobjetos. Entre ambos la muestra preparada est lista para su observacin con el microscopio ptico.
Para poder observarla a travs del microscopio ptico est debe de ser "preparada". Es decir, pasar por una
serie de etapas conocidas bajo el nombre de tcnica histolgica.
El diagnstico histolgico o histopatlogico, as como la descripcin e interpretacin correcta del material
observado, dependen en buena medida de la calidad del corte observado. Por lo tanto, es indispensable
que la tcnica histolgica sea adecuada.

Se denomina TCNICA HISTOLOGICA al conjunto de procedimientos aplicados a un material biolgico

(animal o vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones ptimas para poder observar,
examinar y analizar sus componentes morfolgicos a travs de los microscopios pticos y electrnicos.

Cada uno de los pasos es importante per se y deben realizarse con cuidado. Del buen resultado que se
obtenga en cada uno de ellos, depender el resultado final: la preparacin histolgica. Para transformar el
material obtenido a partir de un ser vivo en una delgada lmina colocada sobre un portaobjetos se requiere
de la realizacin consecutiva de los siguientes procedimientos:
1.-Recoleccin u obtencin de la muestra.
2.-Fijacin
3.-Inclusin
4.-Corte
5.-Coloracin
6.-Montaje

1.-Recoleccin
Recoleccin u obtencin de la muestra.
Las muestras utilizadas para estudios histolgicos deben permitir la correcta representacin de las
caractersticas que posee el objeto de estudio en el animal vivo y entero. Un error en la toma de muestras
probablemente no pueda ser subsanado durante ninguna
ninguna de las etapas posteriores. Para obtener el
material de estudio, se pueden utilizar diferentes procedimientos:
1.BIOPSIA: cuando proviene de un organismo vivo (del griego bios: vida y opsis: visin).. Consiste en tomar
un fragmento de tejido u rgano de un ser vivo. Este procedimiento se realiza mediante una operacin
quirrgica y por lo general bajo anestesia del paciente.
2.NECROPSIA:las
las muestras se obtienen de seres recientemente muertos o sacrificados
sacrificados para un fin
determinado.
Una recoleccin adecuada del material requiere las siguientes condiciones:
Uso de instrumental apropiado.. Para obtener la muestra debe utilizarse un bistur con hoja nueva o una
hoja de afeitar en perfectas condiciones (Fig. 1).. Si se emplean tijeras, las mismas debern estar bien
afiladas y el corte debe realizarse sin ejercer presin que pueda lesionar o aplastar el tejido. No pueden
emplearse pinzas diente de ratn que lesionan los tejidos.

Siempre los cortes deben realizarse con material afilado para evitar la compresin y la consecuente
deformacin de los tejidos.
Pensemos que cualquier dao en la muestra tambin se magnificar cuando la observemos con el
microscopio.

Extraccin rpida.. Cuando se extraen varios

varios rganos, es conveniente tomar primero las muestras de
aquellos que sufren rpida autolisis
lisis (sistema nervioso) o putrefaccin (intestino). En general a las 2 horas
posmortem ya hay una prdida de componentes importantes de los tejidos.
Envo de muestras pequeas.. Es ventajoso trabajar con muestras de no ms de 1 cm3 de espesor
espesorpara que
la fijacin sea adecuada y facilite los pasos siguientes de la tcnica. Para casos especiales en los que se
requiera mayor tamao, por el tipo de estudio a realizar, se deben efectuar varias incisiones separadas
unas de otras por espacio de 1 cm. Esto permitir que el fijador penetre en todo el tejido. De no cumplir
dicho procedimiento, solo se fijarn las partes ms expuestas al lquido fijador y las zonas ms centrales
quedarn sin fijarse.

Figura 1. Muestra tomada de un testculo donde se observa la manera de seccionar el rgano.

Fijacin con Lquido de Bouin.http://markstechniques.blogspot.com.ar/2012/10/tecnica
http://markstechniques.blogspot.com.ar/2012/10/tecnica
http://markstechniques.blogspot.com.ar/2012/10/tecnica-histologica-derutina-para.html

A menor tamao de la muestra, se facilita el proceso de fijacin y mejoran los resultados

en las fases siguientes

Una vez extrada la muestra que se procesar, se coloca en cpsulas o cassetts ranurados (Fig. 2) que
permiten el paso de los lquidos y adems se pueden registrar con el nmero de protocolo, rgano u otro
dato que permita identificar el material que se procesa. Estas cpsulas con el tejido u rgano en el interior
se sumergen en el lquido fijador.

Figura 2. Cpsulas o cassetts. Comercialmente vienen en dos tamaos: A. altura 0,5 mm B. altura 1 mm.

2.-Fijacin
Tal como sucede con la toma de muestras, la fijacin constituye una etapa fundamental de la tcnica
histolgica, ya que los errores que en ella ocurran NO pueden ser subsanados. La fijacin tiene al menos 4
finalidades importantes:

Impedir las modificaciones post-mortem que pueda sufrir la clula (procesos autolticos).

Proteger al tejido del ataque bacteriano (putrefaccin).

Mantener la estructura de los rganos lo ms semejante posible a cmo eran en el sujeto vivo.

Mantener los componentes qumicos de los tejidos.
La fijacin puede realizarse por mtodos fsicos como la congelacin, las microondas o la desecacin. La
congelacin sirve como fijacin e inclusin a la vez, si bien se pierde calidad de la conservacin morfolgica,
se utiliza para muestras que requieren una observacin muy rpida como las biopsias hospitalarias y para la
conservacin de lpidos que se pierden en parte por la fijacin con formol y en especial cuando se realiza la
inclusin. La desecacin es la forma ms frecuente de fijar los extendidos de material como sangre,
exudados, hisopados, etc. El uso de microondas puede combinarse con algunos fijadores qumicos para
disminuir el tiempo de fijacin.
A continuacin nos referiremos exclusivamente a la fijacin qumica, la ms utilizada en la histologa
convencional.

La metodologa de la toma de la muestra, va a depender del tipo de fijacin a utilizar, de acuerdo a la

tcnica seleccionada podemos clasificar las fijaciones qumicas en:
Por inmersin: las muestras deben sumergirse dentro del recipiente que contiene el lquido fijador
inmediatamente despus de ser tomada. Para esto hay que tener algunas precauciones que se detallan a
continuacin:
- Proporcin del lquido fijador respecto al tamao de la muestra. Como regla general, la relacin debe ser
de 1/20, es decir que por cada parte de muestra debe haber 20 partes de fijador.
- El tipo de rgano a fijar(Fig. 3). Si lo que se quiere fijar es un rgano hueco, por ejemplo: intestino o
esfago, se debe atar en ambos extremos, inyectar el fijador en el interior y luego sumergir. Si se trata de
un rgano que por su constitucin flota, como el pulmn u rganos que contienen mucho tejido adiposo,
debe colocarse encima de ellos un algodn para que queden totalmente sumergidos en el frasco. En estos
casos si se colocan dentro de una cpsula se evita este paso, ya que por el mismo peso la cpsula quedar
en el fondo del recipiente.
- Tiempo que debe transcurrir en el fijador. En este caso depender del fijador utilizado. Para el caso del
formol, 18 a 24 horas de fijacin es suficiente, ya que si se deja menos tiempo subfija y ms no es adecuado
para realizar algunas tcnicas como las Inmunohistoqumicas.

Figura 3. Fotografa macroscpica de una necropsia donde se observan algunos rganos. De cada rgano se
extrae una pequea muestra (lado izquierdo de la imagen).
Por perfusin: la solucin fijadora se introduce a travs del sistema circulatorio accediendo a todas las
clulas del organismo gracias a la red de capilares. Mediante este mtodo se puede fijar un animal
completo introduciendo la solucin fijadora a travs del ventrculo izquierdo del corazn. Este
procedimiento se realiza luego de una anestesia general profunda. El fijador llegar a todas las clulas
irrigadas por la sangre bombeada por dicho ventrculo (mediante inyeccin del fijador en un vaso
sanguneo y circulacin con un equipo o bomba). Este procedimiento de fijacin es previo a la toma de la
muestra. Luego de finalizada la perfusin se extraen las muestras necesarias y se las coloca de igual forma
que en la tcnica de inmersin en un recipiente que contiene lquido fijador (Fig. 4).

Figura 4. Imagen tomada de: http://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/2-metodoshttp://mmegias.webs.uvigo.es/6

-fijacion.php

Existen muchos lquidos fijadores. Depende cuntos fijadores participen en la solucin se los puede
clasificar en:
Simples: estn formados por un solo agente activo. Tradicionalmente se los clasifico, segn su mecanismo
de accin, en oxidantes y reductores. Hoy se sabe que sus mecanismos de accin son ms variados y
complejos. Ejemplos: formol,
ormol, cido actico, cido pcrico, alcohol
al
etlico, cido smico.
Mezclas fijadoras: contienen ms de un fijador, buscando aprovechar las caractersticas ms ventajosas
de las distintas sustancias. Ejemplos: lquido
l
de Bouin, lquido de Zenker,, lquido de Helly.Por
Helly.
ejemplo la
mezcla o lquido
o de Bouin contiene cido pcrico, cido actico (que preserva muy bien cidos nucleicos) y
formol que es un mejor fijador de protenas).
Sin embargo, existe
xiste otra manera de clasificar los fijadores. Utilizando el criterio de la accin que tienen
sobre el tejido los fijadores se clasifican en desnaturalizantes y formadores de puentes cruzados (crosslinking). Los desnaturalizantes producen
roducen desnaturalizacin proteica
proteica por generar int
interacciones como
puentes de hidrgeno, puentes salinos e interacciones hidrofbicas
hidrofbicas que cambian la estructura terciaria y
cuaternaria de la protena, son ejemplos de los primeros el alcohol y la acetona. Los formadores de puentes
cruzados generan uniones covalentes entre aminocidos de distintas o de la misma protena,
protena, son ejemplos
de stos, los aldehedos
dos como las soluciones de formaldehdo y de glutaraldehdo(este
glutaraldehdo(este ltimo muy utilizado
para microscopa electrnica).

Algunas consideraciones sobre los fijadores

No existe un mtodo universal de fijacin, por lo que un agente fijador para un tejido puede no ser el
adecuado para otro.
No todos los fijadores conservan indefinidamente el tejido. La fijacin no equivale a conservacin tisular
en el tiempo.
Es intil realizar un estudio histolgico sobre un material con grandes defectos de fijacin.

Qu cualidades debe reunir un buen fijador?

Poder de penetracin en los tejidos, cuanto ms rpido penetren mejor se producir la fijacin. Esta es
una propiedad muy importante, ya que si el fijador tarda en penetrar la muestra sufrir putrefaccin y/o
autlisis en el centro. La penetracin del fijador sigue las leyes de la difusin, a medida que transcurre el
tiempo de contacto con el liquido fijador, la velocidad de penetracin disminuye progresivamente. Cada
fijador tiene un coeficiente de penetracin (distancia que penetra en una hora), que es mximo para el
bicromato de potasio y mnimo para el cido pcrico. Los fijadores requieren un tiempo para penetrar a los
tejidos y ms tiempo an para reaccionar con sus componentes, lo que es indispensable para que acten.
Capacidad de conservar las estructuras sin distorsionarlas (preservar la morfologa celular y tisular).
Capacidad de actuar como mordiente, esto significa que permita o favorezca reacciones posteriores entre
el tejido y los colorantes.
Preservar la composicin qumica.
Capacidad de endurecer los tejidos (aumentar la consistencia). Si bien es conveniente que el fijador
endurezca los tejidos no conviene que esto sea excesivo. El alcohol etlico es el fijador que mas endurece
los tejidos, seguido por el formol; la menor capacidad de endurecimiento la posee el cido pcrico.
Insolubilizar los componentes de la clula, as se evita la prdida de componentes durante el procesado.
Evitar retracciones. Estas pueden obedecer a causas osmticas.
Escasa toxicidad.
Bajo costo.

Efectos indeseables de algunos fijadores

-Retraen demasiado ocasionando muchos artefactos.
- Pueden precipitar en forma de cristales.
- Algunos son irritantes para la piel y las mucosas.
- Endurecen demasiado la muestra.
- Algunos pueden producir alteraciones tanto a nivel ultraestructural como molecular.
En la prctica, no existe el fijador ideal, por eso se desarrollaron las mezclas fijadoras con las que se
pretende reunir las mejores cualidades de diferentes fijadores.
Sin embargo, el formol es el fijador universal hace ms de 120 aos. En condiciones de pureza, el
formaldehido es un gas, por lo que se lo comercializa en una solucin al 40% m/v de agua, que recibe el
nombre de formol. Esta solucin a su vez se diluye en 9 partes de agua, esta es la llamada solucin
deformol al 10% (formalina) y es la que se utiliza para fijar los tejidos animales, de esta manera como
resultado de ambas diluciones la solucin de trabajo conocida como formalina es una solucin de
7

formaldehido al 4%. Como se mencion, el formaldehido acta formando puentes cruzados (cross-linking)
(
entre los aminocidos de las protenas. Esta solucin tiene varias de las ventajas enumeradas en prrafos
anteriores, por ese motivo es el fijador de eleccin para la mayora de los laboratorios, aunque por algunos
efectos txicos actualmente se estn buscando sustitutos como el glioxal, pero hasta el momento no se ha
logrado la misma calidad de preservacin morfolgica.
Para microscopaa electrnica el formol no permite una buena conservacin ultraestructural y se ssuele
utilizar el cido smico o el glutaraldehdo.

3.-Inclusin
El tejido u rgano ya fijado en cualquiera de los lquidos fijadores, an no ha quedado con una consistencia
suficientemente firme como para realizar cortes con el micrtomo,
micrtomo instrumento indispensable
spensable para realizar
cortes delgados para microscopa.. Algunos rganos quedan an muy blandos para ofrecer resistencia a la
navaja utilizada para cortar; otros rganos tienen cavidades y se deforman mucho al ser seccionados y
otros son tan pequeos que no podran ser recogidos despus de un corte delgado si no tuvieran un sostn
a su alrededor. Para poder superar todas estas desventajas, es necesario impregnar el tejido en un medio
que al solidificarse, permita darle mayor resistencia y se pueda seccionar fcilmente.
Existen varias sustancias capaces de dar soporte a los tejidos, sin embargo, ell medio ms utilizado en la
prctica diaria, por ser ms simple y dar buenos resultados, es la parafina.
Las parafinas son derivadas del petrleo, qumicamente son mezclas de hidrocarburos saturados y a veces
de ceras. En el comercio se expenden en panes o como perlas. A temperatura ambiente son slidas y de
color blanco semi-translcido
translcido (opalescentes) (Fig. 5).
5) El punto de fusin de las parafinas es variable y
depende de los hidrocarbuross que la componen. Justamente, la
la propiedad fsica que ms debe importarle
al histlogo es el punto de fusin de la parafina, lo cual va a indicar la dureza de la misma. Las parafinas que
se funden de 56 C a 58 C son convenientes
conveniente para la mayor parte de los rganos.
Otra propiedad de las parafinas es que son qumicamente neutras,, ventaja muy importante porque no
reaccionarn
narn con el tejido que se desea incluir. Otro atributo de las parafinas es que no son solubles en
agua, pero si son solubles en numerosos disolventes. Adems,
Adems su consistencia hace que sean fciles de
cortar con el micrtomo.

Figura 5. A. Parafina en bloque.

bloque B. parafina en forma de pellets o perlas.

Los tejidos tanto animales como vegetales contienen grandes cantidades de agua, tanto intracelular como
extracelular. Teniendo en cuenta que las parafinas son sustancias que no se mezclan con el agua, sta debe
ser eliminada del tejido antes de realizar la inclusin. El agua que se elimina ocupaba el volumen que luego
debe ser ocupado por parafina.

Deshidratacin
Una vez que el tejido est fijado, si se ha utilizado formol como lquido fijador, es conveniente antes de
comenzar el proceso de deshidratacin, realizar un lavado en agua corriente. El objeto de este lavado es
detener la accin del fijador y adems arrastrar todo resto o depsito del fijador que pueda quedar en el
tejido y que posteriormente impida una buena coloracin. Una vez lavada la pieza se comienza con la
deshidratacin.
El deshidratante ms utilizado es el alcohol etlico (etanol). Para realizar una buena deshidratacin se
prepara en el laboratorio una serie de recipientes que contengan alcoholes en una graduacin creciente.
Se comienza generalmente por un alcohol que contenga mucha agua como puede ser el alcohol 50 o 70,
luego se pasa a un alcohol de 96 y por ltimo al alcohol absoluto o alcohol 100. ste ltimo es totalmente
anhidro.

Cmo hay que deshidratar la muestra previa a la inclusin?

En cada uno de los alcoholes la muestra de tejido que se procese deber permanecer diferente tiempo
segn el tamao y el tipo de tejido. Por regla general en el primer alcohol (50 o 70) puede permanecer
varias horas o hasta el da siguiente. En el segundo alcohol (96) puede permanecer 1 o 2 horas y por
ltimo en el alcohol 100 entre a 1 hora. En cada caso, excepto en el alcohol 50 o 70, se hace ms de
un bao. La muestra luego de los pasajes sucesivos ya est deshidratada (Fig. 6).Los tejidos embrionarios y
fetales ms ricos en agua pueden requerir que la deshidratacin se inicie con un alcohol al 30%.

Figura 6. Imagen modificada de http://lahistotecadenico.blogspot.com.ar/2010/10/tecnica-histologica.html

Una vez que se retira del ltimo pasaje en el alcohol 100, la muestra ya est deshidratada. Sin embargo,
surge otro inconveniente: las parafinas no se pueden mezclar con el alcohol, por lo que hay que emplear
antes de realizar la inclusin un lquido intermediario, que sea miscible tanto con el alcohol como con la
parafina. Por lo general estos lquidos tambin son llamados aclarantes, ya que le otorgan una
transparencia caracterstica a la muestra cuando se encuentra bien deshidratada. Muchos compuestos
presentan estas caractersticas; ejemplos de ellos son el xilol, el benzol y el toluol. Generalmente el ms
utilizado en la prctica diaria es el xilol. Aqu, la permanencia de las muestras es corta y dura
aproximadamente 10 a 20 minutos, dependiendo el tamao. Una vez realizada la deshidratacin y el
aclarado se comienza con la inclusin en parafina. Dado que la venta de xilol est muy regulada por
utilizarse en la fabricacin de drogas ilegales y que tiene cierta toxicidad, actualmente se estn
comercializando preparaciones similares en calidad pero sin esas propiedades negativas.
Adems de otorgarle sostn a la muestra, la parafina debe ocupar los lugares donde antes de la
deshidratacin haba agua en el tejido. Para lograr esto se debe realizar previo a la inclusin definitiva un
paso previo denominado impregnacin. Por lo tanto, la inclusin queda dividida en dos etapas:
1. Impregnacin
2. Inclusin propiamente dicha
1. Las parafinas, por ser slidas a temperatura ambiente, deben licuarse para poder utilizarlas como medios
de inclusin. Este procedimiento se realiza en una estufa, la cual tiene un termmetro y una perilla para
regular la temperatura para llevarla al punto de fusin correcto de la parafina que se utilice (Fig. 7).
Se preparan 4 recipientes numerados: parafina I, II, II y IV, sta ltima permanecer totalmente limpia. En
cada bao de parafina la pieza deber estar sumergida por un tiempo variable que depender del tamao y
dems caractersticas del tejido. Una vez transcurrido el tiempo de los 3 baos, se considera que la muestra
ya est impregnada y en condiciones de ser incluida en forma definitiva.

Figura 7. Estufa a temperatura de 56 58 C con los recipientes de parafina.

2. Este paso consiste en formar un bloque de parafina que contenga la muestra procesada en el interior.
Para realizar esto, se pueden utilizar diferentes recipientes. El ms utilizado se forma con dos estructuras
metlicas en forma de L que se adaptan para formar un recipiente del tamao que se necesite. Estas se

10

denominan barras de Leuckart (Fig. 8 y 9). En su reemplazo tambin pueden utilizarse cajitas pequeas de
cartn, pequeas capsulitas de plstico o anillos de inclusin (Fig. 10).

parafina.php
Figura 8. Esquema modificado de: http://mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/3-parafina.php

Figura 9. Barras de Leukart.

Figura 10. A. Recipientes de plstico utilizados para la inclusin. B. Recipientes metli

metlicos.
C. Recipientes descartables.

Cerca de un mechero, se prepara

ra el recipiente elegido y se vuelca en su interior parafina limpia, sin
residuos y se coloca dentro de esta parafina an fundida el rgano o tejido que se proces. Se deja
solidificar a temperatura ambiente una vez que se logr la correcta inclusin. Este bloque, si bien es
resistente, debe ser montado sobre un taco de madera para poder ajustarlo al micrtomo. Este
procedimiento se denomina armado
rmado del taco. Para ello se preparan pequeos cuadrados de madera y se
cuenta adems con una esptula metlica (Fig. 11 A). Una vez desmoldado el bloque de parafina con la
muestra en su interior, se derrite un poco de parafina extra para adherir el bloque al taco de madera
utilizando la esptula caliente. De esta manera queda formado el taco, el cual
cu l ya est listo para ser cor
cortado
(Fig. 11 B).. En cada taco, se coloca el mismo nmero de identificacin que tena la cpsula
cpsula.
Otra posibilidad es formar el bloque con la muestra directamente en los recipientes de plstico como
muestra la figura 12.

Se observa el bloque de parafina con el tejido en su interior y el taco de madera que

Figura 11. A.Se
servir de soporte. B. Taco armado.

Figura 12. Otra manera de realizar el taco es utilizando las cpsulas de plstico. A. Vista inferior del taco. B.
Vista superior del taco en donde se observa en su interior el material incluido.
De esta manera queda formado el taco, el cu
cual ya est listo para ser colocado en el micrtomo y cortado.

4. Corte: microtoma
El taco formado debe ser colocado en un instrumento especial llamado micrtomo. Este es un instrumento
mecnico que tiene la propiedad de realizar cortes muy delgados (micrones) para permitir luego la
observacin microscpica.

En la actualidad se utilizan 3 tipos de micrtomos para microscopa ptica (Fig. 13), ellos son:
a) el micrtomo de congelacin
b) el micrtomo de rotacin o tipo Minot
c) el micrtomo de deslizamiento

Figura 13. A.Micrtomo de congelacin (criostato). B. micrtomo de deslizamiento. C.

Micrtomo de rotacin o tipo Minot.

El micrtomo para cortes de congelacin es muy utilizado para muestras en las que se desea preservar
aquellos componentes celulares que se perderan con la deshidratacin y en los casos en que se requieran
diagnsticos rpidos o de urgencia (ejemplo: biopsias intraquirrgicas). El funcionamiento es semejante al
tipo Minot pero se encuentra dentro de una cmara fra a -25C a 30C. El detalle de su uso escapa a los
objetivos de este curso.

El tipo Minot se caracteriza porque por su funcionamiento es ideal para realizar cortes seriados. Para
observar el funcionamiento del micrtomo de rotacin ver el video en el link:
https://www.youtube.com/watch?v=ml4fBEmH8Sg

El micrtomo de deslizamiento (Fig. 14) posee un mecanismo muy simple, y consiste en un riel por donde
se desplaza el soporte que contiene la navaja (2) que se desliza de adelante hacia atrs. Cada vez que la
navaja pasa por donde est colocado el taco (1), ste se eleva los micrones que se marcaron previamente
en el tornillo micromtrico (3).

13

Figura 14. Micrtomo de deslizamiento. 1. Porta taco o porta bloque. 2. Navaja. 3. Selector de micrones.

En las figuras 15 a 17 se muestra la secuencia de un corte en el micrtomo de deslizamiento.

Figura 15. Corte de 3 m de espesor (membrana casi transparente).

14

Figura 16. El corte es colocado en un bao de agua tibia para que se extienda. Una vez extendido se coloca
sobre el portaobjetos.

Figura 17. Cortes montados sobre el portaobjetos sin colorear. Imagen tomada de
de:
http://www.slideshare.net/andreasthefania/primera
http://www.slideshare.net/andreasthefania/primera-clase-de-histologia-tecnicas-histologicas
histologicas-ymicroscopio

5.-Coloracin
La observacin directa de los cortes tal como se retiran del bao trmico, slo nos permite diferenciar
estructuras con distinto ndice de refraccin. Sin embargo, los diferentes componentes de los seres vivos
tienen propiedades pticas muy semejantes, por lo que se dificulta su estudio.
estudio Laa finalidad de utilizar
coloraciones en los preparados histolgicos es poder contrastar y diferenciar estructuras que por lo general
no poseen color propio. Todos los tejidos poseen la propiedad de incorporar y fijar de modo variable
diversas sustancias coloreadas llamadas colorantes. Los colorantes son sustancias capaces de transmitir
color a otra a la que se unen, y esaa coloracin se mantiene tras el lavado ulterior.

Coloreando el corte, no solamente obtendremos lmites ms precisos, sino que aquellas sustancias con
igual ndice de refraccin, pero con diferente afinidad por los colorantes se distinguen fcilmente por sus
coloraciones.

Mecanismo de accin de los colorantes

Los colorantes por lo general son sales, originadas por la combinacin de un grupo bsico y otro cido. Cada
uno de estos grupos (bsico y cido) puede ser activo o incoloro.
Para que una sustancia sea llamada colorante debe poseer un grupo qumico llamado cromgeno, que
posee la capacidad de originar color. Algunos colorantes presentan tambin grupos auxocromos que le
permiten transferir color. Cualquier muestra procesada por la tcnica de inclusin en parafina, en general
admite muchas coloraciones, dentro de las que el histlogo o patlogo podr seleccionar segn su criterio
para realizar el/los diagnsticos.

Cundo un colorante es bsico o cido?

Cuando en la sal formada el grupo bsico es el coloreado (y por consiguiente activo) y el cido es incoloro,
resultan coloreados aquellos componentes cidos del tejido, y no coloreados los bsicos.
Cuando en la sal formada el grupo cido es el coloreado (y por consiguiente activo) y el bsico es incoloro,
resultan coloreados aquellos componentes bsicos del tejido, y no coloreados los cidos.
El colorante neutro es el que tiene ambos grupos coloreados. Los colorantes indiferentes, como las sales
de plata y oro, no poseen carcter cido ni bsico definido, sino que imparten color mediante
impregnacin. En realidad estos ltimos no son verdaderos colorantes porque lo que otorga color es un
metal precipitado sobre el corte pero sin reaccin qumica con los componentes tisulares.

Concepto de basofilia y acidofilia.

Basofilia
Se define como basofilia, a la afinidad de ciertas estructuras celulares y tisulares de naturaleza cida por
colorantes bsicos. Por ejemplo, el ncleo celular en donde se encuentran los cidos nucleicos ADN y ARN y
el citoplasma rico en ARN ribosomal de las clulas plasmticas y otras clulas secretoras de protenas, son
considerados basfilos.
Acidofilia o eosinofilia
Por el contrario, la acidofilia se define como la afinidad que poseen ciertas estructuras celulares y tisulares,
por lo general de naturaleza bsica por colorantes cidos. Por ejemplo, algunos grnulos secretorios y las
protenas citoplasmticas se comportan como bases al pH en el que se realiza la coloracin, por lo que son
afines al colorante cido y por lo tanto considerados acidfilos.
En el siguiente cuadro se resumen los conceptos previamente expuestos aplicados a la tcnica de
coloracin de rutina con hematoxilina y eosina:

16

Colorante

HEMATOXILINA

EOSINA

Composicin
qumica del
colorante
Bsico

cido

Colorea

Afinidad

Color

Ejemplos

(de la estructura)
Estructuras
cidas

Basfila

Azul-violeta

Ncleo
Rer

Estructuras
bsicas

Acidfila

Rosa

Citoplasma
Grnulos de
protenas

Figura 18. Acinos serosos del pncreas. Tcnica de coloracin hematoxilina y eosina.
A. Zona basfila del citoplasma. B. Ncleos basfilos. C. Zona acidfila del citoplasma.

Tcnica de Hematoxilina y Eosina

La Hematoxilina es un colorante bsico que se extrae de la madera del palo de Campeche
Haematoxyloncampechianum, un rbol originario de Mxico. La hematoxilina no es colorante por s misma,
sino que debe formar un compuesto oxidado: la hematena. La oxidacin qumica permite que se la pueda
usar inmediatamente luego de su preparacin. Para que la hematoxilina pueda colorear, se le agrega a la
solucin un mordiente como: aluminio, hierro, tungsteno o molibdeno.
La eosina es un colorante que otorga un color rosa, se disuelve en agua o alcohol y tiene un carcter cido,
por lo que se une a las estructuras bsicas (pH alto) de los tejidos.

17

Se debe recordar que hasta el momento se obtuvo una lmina muy delgada de parafina con el
tejido u rgano en su interior.
Adems que la condicin del tejido en esa lmina es deshidratada y que los colorantes son
soluciones acuosas o alcohlicas.

Procedimiento (Fig. 19)

1.-Desparafinar (xilol I xilol II)
2.- Hidratar (alcohol 100 - 96 - 70- agua destilada)
3.- Sumergir en Hematoxilina de Mayer (5 minutos)
4.- Virado en agua corriente
5.-Sumergir en Eosina (30 a 1)
6.- Deshidratacin (alcohol 96 I 96 II 100)
7.- Aclarar (xilol I Xilol II)
8.- Montar
Resultado: Estructuras basfilas: color azul-violceo (ej.: ncleo, ergastoplasma, cuerpos de Nissl, etc.).
Estructuras acidfilas: color rosado (ejemplo: citoplasma, glbulos rojos, secreciones, etc.).

Fig. 19. Batera de coloracin. Comienza en el recipiente superior izquierdo (verde), se contina con los
siguientes que contienen alcoholes en graduacin decrecientes hasta el primer colorante (Hematoxilina).
Luego del viraje en agua corriente se pasa al segundo colorante (Eosina) para luego deshidratar y concluir
con el aclarado (xilol).
18

6. Montaje final
Para la conservacin adecuada de los cortes coloreados es necesario cubrirlos con laminillas de vidrio de
0.1-0.2 mm de espesor, denominados cubreobjetos. Para adherir el cubreobjetos a la preparacin se
utilizan diferentes sustancias, de las cuales la ms empleada es el blsamo de Canad.
La metodologa es muy sencilla. Primero se coloca una o varias gotas del blsamo sobre el corte coloreado,
luego se adhiere el cubreobjetos realizando una leve presin sobre el mismo. Una vez distribuido el
blsamo sobre el corte se quita su exceso con xilol para finalmente llevarlo a una estufa de secado para su
endurecimiento (Fig. 20).

Figura 20. A. Se observa la colocacin de una gota de Blsamo de Canad. B. El cubreobjetos es

colocado por encima del blsamo.

19

Resultado final

Figura 21. Tejido conectivo. 40x. Tcnica de Hematoxilina y Eosina.

Las flechas azules sealan los ncleos (basfilos) y las flechas rojas sealan estructuras acidfilas
(citoplasma y fibras)

20

Artefactos producidos por errores en la tcnica

En los cortes histolgicos es comn encontrar algunos artefactos producto de errores cometidos en
alguno/s pasos de la tcnica. Dichos errores pueden producirse aun teniendo los cuidados necesarios en
cada uno de ellos. A continuacin se ejemplifican algunos de los artefactos ms frecuentes y que ayudarn
a reconocerlos como tales.

Figura 22.Surco de arrastre.Falla provocada por la navaja mal afilada (mellas de la navaja).

Figura 23. Pliegue. Se puede formar luego del corte para estirarlo o por desprendimientos durante la
coloracin.

Figura 24. Desprendimientos de tejido. Superposicin en el corte de pequeos desprendimientos de tejido.

Figura 25. Rotura del corte. Si el corte es delgado y las membranas tambin lo son, puede abrirse el tejido
produciendo separaciones.

22

Bibligrafa.
1. Bancroft J.D. BancroftsTheory and practice of histologicaltechniques. Editors: Suvarna S.K.; Layton
C.; Bancroft J.D. Seventh edithion. Churchill LivingstoneElseiver. 2013.
2. Brel A.; Christensen E.I.; Tranum-Jensen J.; Geneser K.Q. Editorial Mdica Panamericana. 4ta.
Edicin. 2015.
3. Erausquin J. Apuntes de Tcnica Histolgica. Editorial El Ateneo. Buenos Aires. 1932.
4. Instituto de Patologa de las Fuerzas Armadas de los Estados Unidos de Amrica (AFIP). Mtodos
Histotecnolgicos. Editores: Prophet E.B.; Mills B.; Arrington J.B. y Sobin L.H. Publicado por el
Registro de Patologa de los Estados Unidos de Amrica. Washington DC. 1995.
5. Junqueira L.C.U. y Junqueira L.M.M.S. Tcnicas Bsicas de Citologia e Histologia. Libraria Editora
Santos. So Paulo SP. 1983.
6. Martoja R.;Martoja M. Tcnicas de histologa animal. Editorial Toray-Masson. Barcelona. 1980.
7. Mowry J.F.A. and McManusR.W. Staining Methods: Histologic and Histochemical.
EditorialHarper&Row 1964.
8. Ross M.H.; Paulina W. Texto y Atlas Color con Biologa Celular y Molecular. Editorial Mdica
Panamericana. 6ta. Edicin. 2013.

23

24