UNIVERSIDAD DE LEN

FACULTAD DE BIOLOGA
Dpto. de Biologa Celular y Anatoma

VALORACIN DE LA CALIDAD ESPERMATICA

EN TRUCHA ARCO IRIS (Oncorhynchus mykiss):
APLICACIN DE UN TEST DE RESISTENCIA AL
CHOQUE HIPOSMOTICO

Felipe Martnez Pastor

Len, 1999

Memoria presentada por Felipe Martnez Pastor para optar al Grado de

Licenciado en Biologa

Len, diciembre de 1999

D. M PAZ HERREZ ORTEGA Y D. RAFAEL LVAREZ NOGAL,

profesores titulares del Departamento de Biologa Celular y Anatoma de la
Universidad de Len

CERTIFICAN

que la memoria con el ttulo VALORACIN DE LA CALIDAD

ESPERMATICA EN TRUCHA ARCO IRIS (Oncorhynchus mykiss):
APLICACIN DE UN TEST DE RESISTENCIA AL CHOQUE
HIPOSMOTICO elaborada por D. FELIPE MARTNEZ PASTOR, ha sido
realizada bajo su direccin y cumple las condiciones exigidas para optar al
grado de Licenciado en Biologa.

Len, de Diciembre de 1997

Fdo.: M Paz Herrez Ortega

Fdo.: Rafael lvarez Nogal

AGRADECIMIENTOS
Expreso mi ms sincero agradecimiento a todas aquellas personas gracias a las
cuales he podido realizar este trabajo.
A los Doctores Paz Herrez y Rafael lvarez, por su continua gua y acertados
consejos.
A Elsa, Mnica y Vanesa, por su valiosa ayuda, inestimable en la parte
experimental, y por sus nimos.
A Juan Pablo, por sus oportunas indicaciones sobre el formato de este trabajo.
A mis padres y hermanas, por el apoyo que siempre me han brindado.
Y, por supuesto, a todos aquellos que, de una forma u otra, se han interesado por
este trabajo.

Dedicado a
Justo y Dionisia,
mis primeros y
ms queridos maestros.

NDICE
1. INTRODUCCIN............................................................................................................. 1
1.1. Criopreservacin de espermatozoides.........................................................................1
1.2. La criopreservacin de espermatozoides en acuicultura.............................................3
1.3. Beneficios derivados de la criopreservacin de espermatozoides de peces................4
1.4. Preservacin de esperma a corto plazo .......................................................................6
1.5. Dinmica y problemas de la criopreservacin............................................................7
1.6. Los crioprotectores....................................................................................................10
1.7. Morfologa y fisiologa del espermatozoide de salmnidos .....................................14
1.8. El plasma seminal de salmnidos .............................................................................16
1.9. La motilidad del espermatozoide de salmnidos ......................................................17
1.10. El proceso de criopreservacin de esperma de salmnidos ....................................18
1.10.1. Extraccin del semen........................................................................... 19
1.10.2. Valoracin de la calidad seminal......................................................... 20
1.10.3. Dilucin del semen............................................................................... 24
1.10.4. Adicin de crioprotector ...................................................................... 26
1.10.5. Tiempo de equilibrado ......................................................................... 27
1.10.6. Congelacin y almacenamiento ........................................................... 28
1.10.7. Descongelacin.................................................................................... 29
1.10.8. Fecundacin artificial........................................................................... 29
2. OBJETIVOS.................................................................................................................... 33
3. MATERIALES Y MTODOS........................................................................................ 35
3.1. Animales ...................................................................................................................35
3.2. Recogida del semen y huevos ...................................................................................35

vii

3.3. Anlisis de los parmetros estndar del semen........................................................ 36

3.3.1. Motilidad ................................................................................................36
3.3.2. Densidad espermtica.............................................................................36
3.3.3. Medida del pH........................................................................................36
3.3.4. Osmolaridad ...........................................................................................37
3.4. Dilucin del semen................................................................................................... 37
3.5. Tiempo de equilibrado.............................................................................................. 37
3.6. Congelacin del semen............................................................................................. 37
3.7. Descongelacin......................................................................................................... 37
3.8. Aplicacin de los test hipoosmticos y tincin de las muestras............................... 38
3.9. Anlisis de las muestras por citometra de flujo....................................................... 39
3.10. Evaluacin de la fertilidad...................................................................................... 40
3.11. Anlisis estadsticos................................................................................................ 41
4.RESULTADOS.................................................................................................................43
4.1. Datos obtenidos........................................................................................................ 43
4.1.1. Semen fresco ..........................................................................................43
4.1.2. Semen criopreservado ............................................................................48
4.2. Comparacin semen fresco - criopreservado ........................................................... 48
4.3. Tratamientos hipoosmticos..................................................................................... 49
4.3.1. Comparacin de grupos..........................................................................49
4.3.2. Anlisis de regresin clulas permeables-tiempo...................................49
4.4. Anlisis de correlacin............................................................................................. 53
5. DISCUSIN ....................................................................................................................55
5.1. Parmetros estndar y fertilidad ............................................................................... 55
5.2. Tratamientos hipoosmticos..................................................................................... 60
6. CONCLUSIONES ...........................................................................................................69

viii

7. BIBLIOGRAFA............................................................................................................. 71
8. TABLAS .......................................................................................................................... 85

ix

1. INTRODUCCIN
La disminucin de la temperatura ralentiza las reacciones qumicas, lo que hace del
fro un excelente conservante. Hoy en da, la criopreservacin es (aparte de la liofilizacin,
de aplicacin ms limitada) el mtodo ms eficaz de conservar muestras biolgicas
indefinidamente. Por debajo del punto de transicin cristalina (-139C para el agua pura) se
considera que la actividad bioqumica es nula, as que, en estas condiciones, el nico dao
posible es el producido por la radiacin de fondo (Ashwood-Smith, 1986). Las muestras
criopreservadas en nitrgeno lquido (-196C) conservan su viabilidad durante un perodo
de tiempo que ha sido calculado entre 200 y 32.000 aos (Ashwood-Smith, 1980;
Whittingham, 1980; Stoss y Donaldson, 1982; Leung, 1991; Leung y Jamieson, 1991).
Desgraciadamente, las tcnicas de criopreservacin se han visto limitadas hasta el
momento a la conservacin de microorganismos, clulas aisladas y algunos tejidos simples
(gametos, embriones, sangre, mdula sea, piel, cartlago) (Constanzo et al., 1995; Zhang
y Tiersch, 1995). La criopreservacin de rganos y sistemas complejos es una meta para la
que an queda mucho camino.

1.1. Criopreservacin de espermatozoides

La criopreservacin de gametos es uno de los campos que ms ha prosperado
dentro de la criobiologa. No en vano, el primer tipo celular en ser criopreservado con xito
fue el espermatozoide (Polge et al., 1949). Desde su aparicin, la criopreservacin ha sido
objeto de un inters creciente, no slo con el propsito de una mejor comprensin de los
procesos bsicos de la vida, sino por la necesidad de aprovechar ms eficazmente los
recursos naturales (Erdahl y Graham, 1978, 1980a, 1980b). Una gran parte de la
produccin animal de los pases desarrollados depende de programas de inseminacin
artificial, los cuales pueden llevarse a cabo gracias a la criopreservacin y almacenamiento
de semen de diferentes variedades interesantes econmicamente (Steyn et al., 1985;
Piironen, 1994).
Adems de su aplicacin en la produccin animal, estas tcnicas estn permitiendo
la creacin de bancos de germoplasma para salvaguardar la diversidad gentica y conservar
especies amenazadas o en peligro de extincin (Wildt, 1989; Ballou, 1992; Van der Walt et
al., 1993). Actualmente, los zoolgicos mantienen un nmero de especies que es

Introduccin

claramente insuficiente. Adems, las poblaciones de zoolgicos y parques naturales se

enfrentan a los problemas derivados de la endogamia y la prdida de variabilidad gentica
debido a su pequeo tamao. La posibilidad de criopreservar semen, huevos y embriones
permite contar de una forma sencilla y barata con una gran fuente de diversidad gentica,
que se puede conservar indefinidamente (Ballou, 1992).
No obstante, las muestras de esperma criopreservadas sufren una reduccin de su
fertilidad muy elevada, debido a la muerte celular y a los daos sufridos por las clulas
supervivientes (Curry y Watson, 1994).
Debido a su mayor importancia econmica, la mayor parte de la investigacin sobre
criopreservacin ha sido llevada a cabo en mamferos y ha ido paralela a los avances en
medicina reproductiva y en produccin animal (Barrat y Chauham, 1990; Niemann, 1991).
La criopreservacin se ha convertido en una herramienta muy importante en la mejora
gentica del ganado bovino, ovino y porcino. Sin embargo, slo en la criopreservacin de
esperma de toro se han conseguido datos de fertilidad similares a los del semen fresco.
Especialmente importante es la aplicacin en ganado lechero, que en algunos pases es casi
completamente dependiente de las tcnicas de inseminacin artificial (Herman, 1981;
Marshall, 1990). En el caso de seres humanos, se han producido tambin avances muy
importantes en este campo, motivados fundamentalmente por la creacin de bancos de
esperma. Gracias a la criopreservacin de las muestras, stas pueden ser guardadas por
largos perodos de tiempo (lo cual es forzoso cuando hay que esperar para comprobar la
ausencia de VIH, si trata de pacientes que van a someterse a vasectoma o si se ha
diagnosticado una posible infertilidad futura, pero no obstante se desea tener descendencia)
(Gao et al., 1992; Curry y Watson, 1994).
La inseminacin artificial y la criopreservacin de esperma han sido mucho menos
estudiadas y aplicadas en otros grupos de vertebrados. En aves slo se utilizan a gran
escala en pavos y en algunas gallinas de cra intensiva (Bellagamba et al., 1993). Apenas
hay trabajos en reptiles y anfibios. La situacin es distinta para los peces, ya que la
inseminacin artificial es una prctica ampliamente extendida en acuicultura y se estn
realizando grandes esfuerzos para conseguir tcnicas de criopreservacin adecuadas
(Marshall, 1990).

Introduccin

1.2. La criopreservacin de espermatozoides en acuicultura

La acuicultura es una rama de la agricultura relativamente joven en cuanto a
desarrollo cientfico y tecnolgico. La gran cantidad de especies aprovechables, la alta
productividad de los peces comparados con mamferos y aves y el expolio progresivo de
los caladeros de pesca la hacen sumamente atractiva. En consecuencia, se ha producido un
aumento considerable en el nmero de trabajos relacionados con este campo.
La inseminacin artificial y la conservacin de gametos han sido posiblemente los
avances ms interesantes conseguidos en acuicultura (Serantes et al., 1987; Herrez et al.,
1993). En 1953 se public el primer trabajo sobre la criopreservacin con xito de
espermatozoides de telesteo (Blaxter, 1953). Desde entonces, las investigaciones sobre el
tema se han multiplicado (Rana, 1995c). Hasta la fecha, se ha conseguido criopreservar
con xito los espermatozoides de ms de 50 especies de peces de agua dulce y marinos
(Rana, 1995a).
La mayor parte de los trabajos y protocolos de criopreservacin se refieren a
experiencias con semen de salmnidos, ciprnidos y tilapias (Rana, 1995a, c). Por
desgracia, los esfuerzos dedicados a investigacin no se han visto recompensados con su
aplicacin prctica. Esto se debe a varias razones:

La mayor parte de los trabajos publicados son de tipo experimental y se

requiere an realizar la adaptacin de las tcnicas para su utilizacin a gran
escala.

Los resultados obtenidos son altamente variables (Piironen, 1993; Rana, 1995a;
Maisse, 1996).

Es difcil comparar e interpretar los resultados, debido al gran nmero de

factores evaluados en los experimentos (diluyentes, crioprotectores, tasa de
dilucin, velocidades de congelacin y descongelacin, mtodos de evaluacin
de la calidad del semen, etc.) (Rana, 1995).

Hay gran variabilidad entre especies, poblaciones e individuos (Bolla et al.,

1987; Cognie et al., 1989). Adems, pueden encontrarse grandes diferencias
para un mismo individuo en diferentes perodos de tiempo (Rana, 1995c).

Introduccin

No existen apenas estudios citofisiolgicos en los que se analice en profundidad

el efecto de la criopreservacin sobre el esperma y que nos permitan conocer
los factores responsables de esta variabilidad.

No se ha desarrollado an un mtodo de valoracin seminal que nos permita

predecir la aptitud para la criopreservacin de una determinada muestra de
semen.

Por todo esto, hasta el momento no ha sido posible aplicar estas tcnicas
comercialmente (Lubzens et al., 1997).

1.3.

Beneficios

derivados

de

la

criopreservacin

de

espermatozoides de peces
No obstante, la preservacin de espermatozoides puede proporcionar numerosas
ventajas a la acuicultura, de las que ya goza la ganadera, adems de ayudar a la
preservacin de la biodiversidad acucola. Entre estas ventajas cabe destacar:

La acuicultura debe disponer de programas fiables para la cra selectiva de

individuos con determinadas caractersticas, a fin de asegurar su aceptacin por
el mercado (Erdahl y Graham, 1978; Cheregini et al., 1997). Para el correcto
desarrollo de estos programas, sera de gran ayuda el disponer de bancos de
esperma donde almacenar el semen de los individuos ms adecuados.

Se abrira la posibilidad de introducir genes de poblaciones salvajes o en

cautividad en otras poblaciones, aun si los perodos de desove no coinciden
(Erdahl y Graham, 1978; Cloud et al., 1990). Tambin permitira solucionar el
problema que presentan aquellas especies en las cuales los machos y hembras
no liberan sus gametos en la misma poca si estn en cautividad (Chao et al.,
1986).

En los programas de seleccin gentica deben transcurrir varias generaciones de

seleccin hasta obtener el resultado deseado. Sin embargo, con frecuencia, los
cambios debidos al genotipo y al ambiente son confundidos. Esto es un gran
inconveniente, sobre todo cuando los animales tienen un ciclo vital largo. Si se
criopreserva semen de los animales originales se pueden realizar, muchas
generaciones ms tarde, retrocruzamientos para analizar la descendencia (Rana,
1995c).

Introduccin

Puede evitarse el exceso de machos con el que se encuentran muchas

piscifactoras tras la poca de desove (Erdahl y Graham, 1978. Hay que apuntar
que los machos son econmicamente mucho menos productivos que las
hembras y que la manutencin de reproductores en la poca infrtil puede
suponer un coste considerable (Serantes et al., 1987).

Por otra parte, la disponibilidad continua de gametos es importante en

acuicultura (Van der Bank y Steyn, 1992). Las reservas de semen
criopreservado pueden paliar las consecuencias de una posible falta de machos
en el momento decisivo (Cloud et al., 1990; Lubzens et al., 1993). En el caso de
especies protndricas sera interesante criopreservar el semen producido por los
animales en la primera poca de su vida para fecundarlos tras su transformacin
a hembras .

Las propiedades organolpticas de la carne de los peces suelen empeorar con la

maduracin sexual. Esto ha provocado una seleccin de los animales hacia una
maduracin ms tarda, lo cual acarrea una disminucin en la disponibilidad de
gametos. En el caso de peces que ya de forma natural tardan aos en madurar,
el inconveniente es mucho mayor. Estos problemas podran minimizarse
contando con oportunas reservas de semen criopreservado (Fish Farmer, 1995;
Rana, 1996c).

Es posible criopreservar semen de muchos machos y utilizarlo segn el historial

sanitario de cada animal, seleccionando as los individuos ms sanos y
protegiendo a las piscifactoras de epidemias (Cloud et al., 1990). Por otra
parte, tras una epidemia puede recurrirse a las reservas criopreservadas para
evitar la recurrencia de la enfermedad (Rana,1995c).

El transporte de semen criopreservado entre piscifactoras es mucho ms

sencillo y seguro que el transporte de animales vivos. No slo por los
inconvenientes propios de la acomodacin de los animales en los vehculos
(depsitos con agua, control de las condiciones del agua, oxigenacin, etc.) y
del estrs ocasionado a los propios animales (que puede tener fatales
consecuencias), sino tambin por la posibilidad de trasladar enfermedades de
unas instalaciones a otras (Lubzens et al., 1993).

Introduccin

El paso de animales por aduana puede acarrear muchos problemas, que no

suelen presentarse en el caso del semen criopreservado.

Pueden crearse autnticos bancos de genes, de gran inters para mantener la

diversidad gentica y salvaguardar tanto variedades comerciales como
poblaciones naturales (Rana y McAndrew, 1989; Palmer et al., 1993; Cierszko
et al., 1995; McAndrew et al., 1995). Los bancos genticos vivos, compuestos
por animales en cautividad, no ofrecen ni garantas de estabilidad gentica en el
tiempo ni son representativas de la diversidad gentica de la especie. En el caso
de peces, el problema es importante, ya que suelen tener ciclos de vida cortos,
por lo que en poco tiempo las poblaciones se enfrentan con las consecuencias
de la consanguinidad, deriva gentica y efecto de fundador. Con la
criopreservacin de germoplasma (gametos y embriones), de la que est
especialmente desarrollada la criopreservacin de espermatozoides, ambas
condiciones pueden cumplirse. Si no hasta el grado ideal que podra desearse, s
mucho ms satisfactoriamente que con los bancos vivos. La gran ventaja de los
bancos de germoplasma consiste en que el nmero efectivo de la poblacin
puede aumentarse enormemente sin grandes costes econmicos o de espacio
(Piironen, 1993; Bromage, 1995; Rana, 1995c).

1.4. Preservacin de esperma a corto plazo

Ciertamente, buena parte de estos beneficios se alcanzan con la conservacin a
corto plazo del esperma, en condiciones que no requieren su congelacin (Weitze y
Petzoldt, 1992). Con tcnicas sencillas puede mantenerse semen viable durante tiempo
limitado, que muchas veces es suficiente para planificar el programa reproductor, para su
transporte o cuando es necesario cruzar variedades con diferentes periodos de desove
(Bykhatipoglu y Holtz, 1978; Hulata y Rothbard, 1979; Rana, 1995c). Varios
experimentos han demostrado que los espermatozoides de peces pueden mantenerse
viables si el esperma es diluido en un medio adecuado, se mantiene bien oxigenado y a una
temperatura baja. Sin embargo, las condiciones varan bastante entre diferentes especies
(Cheregini et al., 1997). El tiempo que los espermatozoides permanecen viables en estas
condiciones es tambin muy variable, tanto entre especies como entre individuos de la
misma especie, abarcando de das a meses (Bykhatipoglu y Holtz, 1978; Marshall, 1990;
Billard et al., 1996).

Introduccin

Sin embargo, cuando se quiere conservar espermatozoides a largo plazo, es

necesario recurrir a la criopreservacin en nitrgeno lquido.

1.5. Dinmica y problemas de la criopreservacin

Cuando disminuye la temperatura, una clula comienza a sufrir cambios, an antes
de llegar al punto de congelacin del medio. El conjunto de alteraciones sufridos por una
clula al caer la temperatura bajo su rango normal se agrupa bajo la denominacin de
choque fro (Watson y Morris, 1987; Critser y Gilmore, 1995). La magnitud del dao
sufrido por la clula depende de la temperatura normal de crecimiento de la clula, la
temperatura alcanzada, la velocidad de enfriamiento, el tiempo que permanece en la nueva
temperatura, el estado inicial de la clula y la composicin del medio (especialmente en lo
que respecta a la presencia de agentes crioprotectores).
Se ha comprobado que el choque fro provoca desorganizacin, cambios de
permeabilidad y daos morfolgicos en las membranas celulares, desorganizacin del
citoesqueleto, alteraciones metablicas, desnaturalizacin de protenas y degradacin del
ADN (Hamamah et al., 1990; Hazel, 1995).
Los espermatozoides de animales poiquilotermos que viven en ambientes fros no
sufren las alteraciones propias del choque fro al bajar la temperatura hasta cerca de 0C,
como es el caso de los salmnidos (Labb et al., 1996).
Sin embargo, la mayor parte de los daos se producen en las etapas de congelacin
y descongelacin. Los procesos biofsicos subyacentes a estas etapas no han sido an
completamente dilucidados.
Cuando una clula es congelada, su destino depende de la nucleacin de los
cristales de hielo que se forman al bajar la temperatura (Fahy, 1995). Si la nucleacin es
extracelular, la clula pierde gran parte de su agua antes de que se congele y
frecuentemente sobrevive. Si la nucleacin ocurre tambin en el interior celular, los
cristales de hielo causan grandes daos que generalmente conducen a la muerte celular.
Una tercera posibilidad es que no ocurra nucleacin. Entonces la clula y el medio pasan a
un estado vtreo, fenmeno denominado vitrificacin. En estas condiciones, la clula suele
sobrevivir.
Para comprender cmo pueden darse estos tres casos hay que considerar las
condiciones del medio extracelular e intracelular en cuanto a la nucleacin. El medio

Introduccin

extracelular suele contener nucleadores heterogneos, que actan de iniciadores para la

formacin de cristales de hielo. En cambio, el medio intracelular carece de tales sustancias,
al menos de naturaleza tan activa como las extracelulares. Por tanto, al disminuir la
temperatura, el medio extracelular se congela primero. La membrana plasmtica acta
como barrera, impidiendo, si las condiciones son favorables, el crecimiento de los cristales
de hielo hacia el interior celular (Parks y Graham, 1992).
La deshidratacin celular que sufren las clulas al ser congeladas se debe a dos
razones. En primer lugar, la presin de vapor del hielo formado en el exterior es mucho
menor que la presin de vapor del agua lquida del interior celular. Se crea as una
diferencia de potencial qumico a favor del hielo en formacin. Esta es una de las causas (y
la ms importante) de que el agua intracelular salga y contribuya al crecimiento de los
cristales de hielo. Otra razn es que el hielo extracelular es una fase pura de la que no
entran a formar parte los solutos del medio. El medio extracelular pierde agua y aumenta
su concentracin de solutos, lo cual arrastra agua intracelular por smosis. Cuando el
sistema llega al equilibrio, la clula se encuentra prcticamente deshidratada, por lo que no
se forma hielo en el interior celular. El agua que queda dentro de las clulas es la fraccin
asociada a los grupos polares de las molculas orgnicas, denominada agua no congelable,
y que, al menos en parte, no es retirada por este proceso (Crowe et al., 1990; Steponkus et
al., 1995).
Esto es lo que ocurre si la velocidad de congelacin es relativamente lenta. Pero si
la velocidad de congelacin es rpida, la clula no se deshidrata con la suficiente rapidez.
Entonces, se forman cristales de hielo en el interior celular debido a agentes nucleadores
intracelulares, por nucleacin homognea (sin necesidad de tales agentes) o por el
crecimiento del hielo extracelular a travs de la membrana plasmtica. Como se ha dicho
antes, la formacin de hielo intracelular disminuye dramticamente las posibilidades de
supervivencia de una clula (Parks y Graham, 1992; Fahy, 1995; Franks, 1985).
As, velocidades de enfriamiento bajas favorecen la supervivencia celular. Sin
embargo, la clula puede an sufrir daos debido al efecto salino (Mazur, 1970; Franks,
1982; Chao et al., 1986). Este efecto aparece al cambiar la composicin del medio, tanto
externo como interno, debido a la deshidratacin celular y a la congelacin del agua
exterior. Esto se traduce en precipitacin de sales y cambios en el pH.

Introduccin

Al contrario que en los dos casos anteriores, la vitrificacin consiste en solidificar

la muestra sin que ocurra realmente congelacin. Esto se consigue utilizando altas dosis de
crioprotectores, de manera que la temperatura de nucleacin disminuya y la temperatura de
transicin al estado vtreo aumente. No se produce nucleacin de hielo, sino que el sistema
pasa al estado vtreo. Este mecanismo es importante para conservar sistemas complejos,
como rganos. Sin embargo, el tiempo de almacenamiento de una muestra vitrificada es
limitado, ya que este estado es inestable y tiende a cristalizar con el tiempo (Fahy, 1995).
En la criopreservacin de esperma se intenta conseguir la mxima supervivencia
celular utilizando velocidades de congelacin que eviten tanto la formacin de hielo
intracelular como el efecto salino. Por tanto, las velocidades empleadas son un
compromiso entre las demasiado rpidas (que causan cristalizacin intracelular de hielo) y
las demasiado lentas (que someten a las clulas a una exposicin larga al efecto salino)
(Mazur, 1984; Franks, 1985; Duncan y Watson, 1992).
La descongelacin es otra etapa crtica, ya que al elevarse la temperatura las clulas
son sometidas de nuevo al efecto salino y a un proceso de rehidratacin, por un proceso
inverso al de la congelacin. Al descongelarse el medio, el agua tiende a entrar en las
clulas debido a que su potencial qumico aumenta en el exterior (Curry y Watson, 1994).
Si la velocidad de descongelacin es demasiado lenta, las clulas sufren un efecto salino
prolongado, e incluso puede darse la recristalizacin intracelular de hielo (Piironen, 1994;
Lahnsteiner et al., 1996d). Si es demasiado rpida, las clulas sufren los efectos de un
entorno sbitamente hipoosmtico. Sin embargo, se considera que, si una muestra es
congelada a una velocidad adecuada, el efecto de la velocidad de descongelacin no es
demasiado importante.
Todos estos acontecimientos, tanto en la congelacin como en la descongelacin,
tienen lugar en un rango de temperaturas que suele situarse entre los 15 y los 60C. El
almacenamiento en nitrgeno lquido no causa daos per se (Ashwood-Smith, 1980;
Whittingham, 1980; Stoss y Donaldson, 1982; Mazur, 1985; Leung, 1991; Leung y
Jamieson, 1991; Piironen, 1993).
Los daos sufridos por las membranas celulares son los ms importantes, en cuanto
a los efectos letales y subletales para las clulas criopreservadas (Stoss y Donaldson, 1982;
Billard, 1983; Lahnstiner et al., 1992; Mazur, 1985; Rana, 1995c). La naturaleza de estos
daos es muy variada, y se deben al flujo de agua a travs de las membranas, a la

Introduccin

deshidratacin celular, a los cambios de volumen celular, a las transiciones de fase de los
lpidos de membrana, a la variacin en la concentracin de solutos y a la presencia de hielo
intracelular. Estas alteraciones se traducen en cambios morfolgicos (rupturas,
vesiculaciones, fusiones, etc.), as como funcionales (prdida de permeabilidad selectiva,
desorganizacin de la disposicin de lpidos y protenas, desnaturalizacin de protenas,
etc.) (Holth y North, 1988; Hinkovska-Galcheva, 1989; Hofmo y Berg, 1989; Crowe et al.,
1990; Biongi et al., 1992; Gwo y Arnold, 1992; Parks y Graham, 1992; Mrin et al.,
1993; Roquebert y Bury, 1993; Burh et al., 1994; Labb et al., 1995a; 1996; Mediavilla,
1995; Mediavilla et al., 1995; Steponkus et al., 1995; Gilmore et al., 1996; Herrez et al.,
1996; Lahnsteiner et al., 1996a; Yoon et al., 1997; Mller et al., 1999). En el
espermatozoide, cuya funcionalidad depende enormemente del buen estado de su
membrana plasmtica y de la correcta distribucin en ella de lpidos y protenas, semejante
deterioro resulta nefasto. Otros daos importantes son el deterioro de la mitocondria y
alteraciones en la cromatina (Gwo y Arnold, 1992; Lahnsteiner et al., 1992b; Mediavilla,
1995; Mediavilla et al., 1995).

1.6. Los crioprotectores

Para reducir el efecto fatal de estos daos se utilizan agentes crioprotectores. La
importancia de estas sustancias es tal que sin ellas la criopreservacin de clulas vivas sera
casi imposible. Precisamente, el xito del experimento de Polge et al. en 1949 se debi a la
utilizacin de glicerol como agente crioprotector. Desde entonces, el progreso de las
tcnicas de criopreservacin ha estado ntimamente ligado al descubrimiento y desarrollo
de nuevos crioprotectores. Debido a que el efecto de un crioprotector depende mucho de la
especie a tratar, se ha llevado a cabo una bsqueda continua de sustancias crioprotectoras y
su ensayo con las diferentes especies de inters.
Estas sustancias forman un conjunto muy heterogneo, y sus mecanismos de accin
no han sido dilucidados completamente (McAndrew et al., 1995). Son clasificados en dos
grupos, los que atraviesan membranas fosfolipdicas y los que no las atraviesan. En el
primer grupo se encuentran el glicerol, el dimetilsulfxido (DMSO), la dimetilacetilamida
(DMA), el propano-1,2-diol, el metanol y otros (Ogier er al., 1997). En el segundo estn
diversos glcidos sencillos, aminocidos y polmeros como la polivinilpirrolidona (PVP)
(Zell, 1978; Anchordoguy, 1987; Crowe et al., 1990). Adems de los crioprotectores,
existen sustancias conocidas como agentes estabilizadores de membranas, que incluyen a

10

Introduccin

varios tipos de sustancias lipdicas y proteicas (De Leeuw et al., 1993). La discriminacin
entre crioprotectores y estabilizadores de membranas se debe a que en un principio se
distingua entre sustancias que impedan la formacin de hielo y sustancias que protegan
membranas. Actualmente se sabe que la proteccin de membranas es una de las principales
propiedades de casi todos los crioprotectores.
Los crioprotectores que atraviesan membranas actan tanto sobre la superficie
externa de la clula como en su interior. Una caracterstica comn a todos ellos es que se
trata de molculas anfipticas, lo cual les permite atravesar las membranas e interaccionar
de diversas maneras con diferentes molculas. Uno de sus efectos crioprotectores es el de
disminuir la temperatura de nucleacin del hielo, evitando que se formen cristales de hielo
dentro de la clula antes de que est suficientemente deshidratada (McGann et al., 1987;
Gwo y Arnold, 1992; Fahy, G. M., 1995). Sin embargo, este efecto no parece tan
importante como se crey en un principio, ya que se ha comprobado que en muchos casos
tan slo una pequea proporcin del crioprotector logra penetrar en las clulas (Stoss y
Donaldson, 1982; Leung, 1991; Piironen, 1993, 1994). Ms significativa parece ser la
proteccin que otorgan a las membranas celulares. Esta proteccin se debe a la interaccin
con los grupos polares de los fosfolpidos (Anchordoguy et al., 1991). Los crioprotectores
reemplazan el agua alrededor de estos grupos polares, minimizando varios de los efectos
nocivos asociados a la deshidratacin extrema de las membranas durante la congelacin, y
disminuyen la temperatura de transicin de fase de los fosfolpidos, reduciendo as la
desorganizacin derivada de los cambios entre la fase cristalina lquida y de gel de los
diferentes tipos de lpidos de membrana al disminuir y aumentar la temperatura
(Anchordoguy et al., 1991; Labb et al., 1995a, 1996; Yoon et al., 1997). Tambin
estabilizan las protenas, evitando su desnaturalizacin (Arkawa et al., 1990; Crowe et al.,
1990).
Los crioprotectores que no atraviesan membranas actan principalmente
estabilizando la membrana plasmtica. Los polmeros actan aumentando la viscosidad del
medio segn disminuye la temperatura, evitando as la salida demasiado rpida del agua de
las clulas. Sin embargo, su eficacia es bastante discutida (De Leeuw et al., 1993). En
cuanto a los glcidos, su mecanismo crioprotector se basa en el establecimiento de puentes
de hidrgeno entre sus grupos hidroxilo y los grupos polares de los fosfolpidos, aunque las
interacciones hidrofbicas parecen ser importantes (Anchordoguy, 1987). Esto tiene
consecuencias similares a las citadas para los crioprotectores que atraviesan membranas:

11

Introduccin

sustitucin del agua y disminucin de la temperatura de transicin de fase (Crowe et al.,

1988; Goodrich y Baldeschwieler, 1991; De Leeuw et al., 1993; Labb et al., 1995a; Yoon
et al., 1997). Generalmente se utilizan disacridos, como la sacarosa y la trehalosa, ya que
dan mejor resultado que los monosacridos (Anchordoguy et al., 1987; Strauss et al.,
1986). Los glcidos sencillos tienen tambin la capacidad de estabilizar protenas en el
proceso de criopreservacin. Propiedades crioprotectoras similares se atribuyen a varios
aminocidos (Anchordoguy, 1987; Crowe et al., 1990; Kruuv y Glofcheski, 1992) y
polioles (Molinia et al., 1994).
Los agentes estabilizadores de membranas pueden considerarse realmente como
crioprotectores que no atraviesan membranas. La eficacia de la yema de huevo en la
proteccin de esperma refrigerado de mamfero fue descrita hace ms de 60 aos (Phillips,
1939). Posteriormente, se comprob que los fosfolpidos de la fraccin de lipoprotenas de
baja densidad de la yema estabilizan membranas celulares, aunque el mecanismo exacto no
ha sido descubierto (Pace y Graham, 1974; Watson y Martin, 1975; Watson, 1981;
Cookson et al., 1984; Parks y Graham, 1992; De Leeuw et al., 1993; Demianowicz y
Strzezek, 1996). Sucesivos experimentos han desvelado que diversas preparaciones
lipdicas tienen efectos similares.
La yema de huevo ha sido empleada eficazmente en la ganadera bovina y ovina
como crioprotector, aunque no ha dado buenos resultados en la porcina (Chauhan y Anand,
1990; Karabinus et al., 1991; Demianowicz y Strzezek, 1996). Se sabe tambin que
algunos componentes no bien conocidos de la yema pueden perjudicar la calidad del semen
(Watson y Martin, 1973, 1976; Bedford et al., 1995).
Los liposomas sintticos compuestos por un solo tipo de lpido, como la lecitina, no
han dado tan buenos resultados como la yema de huevo. La razn estriba, seguramente, en
la gran diversidad de fosfolpidos presentes en las lipoproteinas de la yema de huevo, y
posiblemente tambin en el componente proteico, que puede tener importancia en la
interaccin con la membrana del espermatozoide (Watson, 1981). Sin embargo, liposomas
construidos con diversos fosfolpidos en determinadas proporciones han dado resultados
similares a los de yema de huevo. Distintos tipos de fosfolpidos pueden ser utilizados,
adems, para proteger diferentes tipos de membranas o diferentes dominios dentro de la
misma membrana (Parks y Graham, 1992).

12

Introduccin

El mecanismo de accin de estos lpidos sobre las membranas es poco conocido,

aunque se han propuesto varias hiptesis, algunas de ellas claramente contrapuestas (De
Leeuw et al., 1993; Jeyendran et al., 1995). Por una parte, se ha postulado que los
liposomas aportaran fosfolpidos o colesterol a la membrana. Por otra parte, se apunta que
la interaccin entre las partculas lipdicas y la membrana es la causa de la proteccin
(Foulkes, 1977; Quinn et al., 1980).
Las protenas han sido propuestas tambin como agentes estabilizadores de
membranas. Las fuentes de protena utilizadas para este fin han sido la albmina srica
bovina (BSA), concentrados proteicos de soja como la promina D, y la leche en polvo
(Stoss y Holtz, 1983a; Karabinus et al., 1991; De Leeuw et al., 1993; Correa y Zavos,
1996). Mientras que la promina D ha dado buenos resultados, (Coulter y Foote, 1975) la
BSA ha tenido un xito parcial como protector de membranas (Holtz y North, 1988),
aunque se ha sugerido una accin sinrgica bastante importante si se combina con
liposomas. Parece que las protenas podran intervenir favorablemente en la interaccin de
los liposomas con la membrana del espermatozoide (Watson, 1981).
Hay que destacar que estas sustancias suelen comprometer la viabilidad celular, y
buena parte de ellas tiene efectos txicos claros. Curiosamente, muchas de ellas, como es
el caso del DMSO, son altamente txicas a temperatura ambiente (desnaturalizan protenas
y desestabilizan membranas fosfolipdicas), pero tienen el efecto contrario cuando se
encuentran a baja temperatura. Esto se debe a su condicin de molculas anfipticas, ya
que el carcter hidrofbico se potencia al aumentar la temperatura y se reduce al disminuir
sta (Arakawa et al., 1990; Crowe et al., 1990; Anchordoguy et al., 1991, 1992). La
solucin a estos problemas consiste en utilizar sustancias que neutralicen su toxicidad o en
la retirada de los crioprotectores inmediatamente despus de descongelar (Baxter y Lathe,
1971; Fahy, 1983, 1984).
Dependiendo de su modo de accin, puede ser aconsejable la utilizacin de mas de
un crioprotector durante la congelacin. As, se ha propuesto que el glicerol, el DMSO y la
sacarosa estabilizan membranas mediante interacciones con los grupos polares de los
fosfolpidos. Sin embargo, mientras que los efectos del DMSO y la sacarosa son aditivos,
no ocurre lo mismo cuando se prueban a la vez el glicerol y la sacarosa (considerando slo
el efecto sobre las membranas). El DMSO interacciona con los fosfolpidos mediante
interacciones electrostticas ms que estableciendo puentes de hidrgeno, como ocurre con
la sacarosa y el glicerol. Al actuar en el mismo nivel, el glicerol y la sacarosa compiten y

13

Introduccin

no se obtiene un efecto aditivo (Ogier et al., 1997). En general, puede decirse que
utilizando dos o ms crioprotectores con propiedades diferentes se refuerza el efecto
crioprotector. Es decir, hay una combinacin sinrgica en la accin crioprotectora (De
Leeuw et al., 1993).
Hay que destacar tambin la existencia de lneas de investigacin concentradas en
el estudio y aplicacin de los llamados pptidos y glicoprotenas anticongelantes
(Rubinsky et al., 1992; Payne et al., 1994; Constanzo et al., 1995). Estas molculas son
sintetizadas por peces y anfibios de hbitats muy fros, los cuales pueden soportar bajas
temperaturas evitando la congelacin de sus fluidos internos o desencadenando una
congelacin controlada, sin sufrir dao celular. La utilizacin de estas molculas en la
criopreservacin podra solucionar muchos de los problemas con los que nos enfrentamos
en la actualidad (Rubinsky et al., 1991a, b).

1.7. Morfologa y fisiologa del espermatozoide de salmnidos

Los espermatozoides son clulas altamente especializadas, cuya funcin es la de
transportar una versin haploide del genoma de un macho hasta el huevo, que alberga una
versin haploide del genoma de una hembra de la misma especie.
Las diferentes especies de vertebrados siguen un patrn similar en la estructura de
sus espermatozoides. Externamente presentan tres partes diferenciadas: cabeza, regin
media y cola. La cabeza contiene el ncleo haploide, con la cromatina altamente
condensada. La regin media encierra una o ms mitocondrias, los centriolos y la base del
flagelo. La cola est formada por el resto del flagelo. Todo el conjunto est rodeado por la
membrana plasmtica (Koch y Lambert, 1990).
Los espermatozoides de los telesteos tienen una estructura de tipo primitivo,
aunque existe una gran diversidad morfolgica (Billard, 1990a; Koch y Lambert, 1990;
Mattei, 1991; Billard et al., 1995a). Dependiendo de la familia o especie se encuentran
diferencias en la forma de la cabeza, insercin del flagelo y estructura interna. Esta
variabilidad ha resultado tener un gran valor filogentico y taxonmico (Jamieson, 1991;
Mattei, 1991; Gwo et al., 1993).
Una caracterstica que comparten invariablemente todas las especies de telesteos
es la ausencia de acrosoma o de una estructura similar. El espermatozoide alcanza la

14

Introduccin

membrana del huevo a travs de un orificio que atraviesa sus cubiertas externas (corion), el
micropilo (Billard et al., 1995a).
La produccin de espermatozoides es altamente variable entre grupos, de 1011
clulas ao -1 kg peso corporal-1 a 108 clulas da -1 g de testculo -1. El tamao del
testculo suele ser un buen indicador de la actividad de la espermatognesis. La
concentracin espermtica es tambin muy alta, de 106 a 1010 clulas/ml de semen (Billard,
1990a; Billard et al., 1995a). Los salmnidos tienen espermatognesis estacional,
concentrada en el invierno. Para la trucha arco iris, la produccin de espermatozoides es de
1010 clulas ao -1 g de testculo -1 y la densidad espermtica se sita entre 1011 y 1010
clulas/ml de semen. La produccin de esperma es de 3 a 10 ml por kg de peso del animal
(Piironen y Hyvrinen, 1983b; Piironen, 1994; Suquet et al., 1994). Hay que tener en
cuenta que, a lo largo de la estacin reproductora, la produccin de espermatozoides y su
calidad pueden variar bastante para un mismo animal. La variabilidad es tambin muy
grande entre distintos animales (Legendre y Billard, 1980; Piironen y Hyvrinen, 1983b;
Piironen, 1994; Billard et al., 1995a). Por lo tanto, estos valores deben ser considerados
como simples aproximaciones.
El espermatozoide de las especies de la familia Salmonidae presenta una estructura
microscpica similar a la del modelo general para telesteos. La cabeza tiene forma
ovoidal aplastada lateralmente, con unos 2,5 m de longitud y de 1,5 a 2 m de dimetro.
El ncleo presenta una cavidad posterior que aloja el par de centriolos y la porcin ms
proximal del flagelo (Billard, 1983; Radziun y Tomasik, 1985; Lahnsteiner et al., 1992a;
Mediavilla, 1995).
Las mitocondrias se encuentran fusionadas alrededor de la regin proximal del
flagelo (Lahnsteiner et al., 1992a). Entre la mitocondria y el axonema hay una
invaginacin de la membrana plasmtica que forma el llamado canal citoplsmico,
frecuente en telesteos con fecundacin externa (Koch y Lambert, 1990).
La membrana plasmtica de los espermatozoides de salmnidos muestra relaciones
fosfolpidos:protenas y colesterol:protenas mucho ms altas que las encontradas en
mamferos, lo cual es comn en los telesteos. Por el contrario, la relacin
colesterol:fosfolpidos es mucho menor (Labb y Loir, 1991), como ocurre con la
generalidad de los peces de agua dulce. Este ltimo dato es crucial en cuanto a la
criopreservacin, ya que la resistencia de una membrana celular depende en gran parte de

15

Introduccin

su contenido en colesterol. Los espermatozoides de los mamferos y de los peces marinos

soportan mejor el proceso de criopreservacin debido al mayor contenido en colesterol de
sus membranas plasmticas (aunque las investigaciones al respecto son contradictorias)
(Drokin y Fkopeika, 1992; Gwo et al., 1993; Labb y Maisse, 1996). Se ha comprobado
adems que la alimentacin y las condiciones del entorno influyen claramente en la
composicin de la membrana plasmtica de los espermatozoides, y, por lo tanto, en su
aptitud para la criopreservacin (Baynes y Scott, 1982; Watanabe et al., 1984; Labb et al.,
1995b; Rana, 1995c; Tsvetkova et al., 1995; Labb y Maisse, 1996).
Varios estudios han revelado una clara regionalizacin de la membrana plasmtica
de los espermatozoides de salmnidos. Se han localizado glicoprotenas de membrana en
dominios concretos de sta, que frecuentemente coinciden con la clasificacin morfolgica
(cabeza, zona media y cola). Esta regionalizacin sugiere una especializacin funcional de
cada dominio (Herrez y Labb, 1997; Quintans, 1997). Se sabe que al menos dos
protenas de membrana son exclusivas de este tipo celular. Una de ellas se encuentra en la
regin de la cabeza, y se la ha relacionado con la interaccin del espermatozoide con la
membrana del huevo (Trummel et al., 1992; Beck et al., 1995).

1.8. El plasma seminal de salmnidos

En los salmnidos, el espermatocrito suele estar alrededor del 20% del volumen
total del semen (Piironen y Hyvrinen, 1983b; Piironen, 1985; Suquet et al., 1994). El 80%
restante lo constituye el fluido o plasma seminal, cuya funcin es la de proporcionar un
microambiente adecuado para el espermatozoide. Inhibe su motilidad, colabora en su
maduracin, preserva su capacidad para fertilizar el huevo y proporciona las sustancias
necesarias para su metabolismo. Este fluido es formado en el testculo y en el espermiducto
(Piironen, 1994). Su composicin es claramente distinta de la de la sangre, por lo cual se
ha propuesto la existencia de una barrera hemato-testicular en los telesteos, encargada de
sintetizar y controlar el flujo de sustancias hacia la luz de los conductos seminferos, y
cuyo funcionamiento estara bajo control hormonal (Marshall, 1986; Steyn y Van Vuren,
1986; Miura et al., 1992).
El plasma seminal de los salmnidos tiene como caracterstica ms sobresaliente su
alto contenido en K+, importante inhibidor de la motilidad de sus espermatozoides. Otros
componentes inicos son Na+, Mg2+, Ca2+ y Cl-. Entre los componentes orgnicos se
encuentran glucosa, fructosa, cido ctrico, glicerol, aminocidos, lpidos, protenas

16

Introduccin

(algunas con actividad enzimtica) y algunas vitaminas (Piironen, 1985, 1994; Piironen y
Hyvrinen, 1983b; Maisse et al., 1988; Billard et al., 1995a). El contenido en fructosa del
plasma seminal de salmnidos (y de los telesteos en general) es mucho menor que el
encontrado en mamferos. El cido ctrico tiene un importante papel, ya que acta de
quelante de Mg2+ y Ca2+, iones inductores de la motilidad (Piironen, 1994). Los lpidos son
utilizados tanto para el metabolismo respiratorio del espermatozoide como para la sntesis
de membranas (Watanabe et al., 1984). Buena parte de las protenas del plasma seminal
estn relacionadas con protenas sricas. Lipoprotenas del tipo HDL han sido detectadas
en el esperma de salmnidos, y se especula sobre su papel en el correcto mantenimiento de
las membranas de los espermatozoides (Loir et al., 1990).
El pH del plasma seminal de la trucha arco iris es ligeramente bsico, entre 7,5 y
8,5. Su osmolaridad oscila entre 200 y 300 mOsm/kg (Piironen, 1994; Suquet et al., 1994).
La composicin del plasma seminal es altamente variable, dependiendo del
momento de la estacin reproductora y entre individuos (Piironen y Hyvrinen, 1983b;
Piironen, 1985).

1.9. La motilidad del espermatozoide de salmnidos

La capacidad de movimiento es una caracterstica tpica y esencial de los
espermatozoides. Los espermatozoides de los salmnidos son inmviles en los testculos,
incluso aunque sean diluidos en un medio inductor de la motilidad. En un proceso
controlado hormonalmente, el fluido seminal se enriquece en HCO3 - y disminuye su pH
cuando atraviesa el espermiducto. Esto provoca un aumento del AMPc intracelular, que
permite la adquisicin del potencial necesario para desarrollar motilidad (Morisawa y
Morisawa, 1985, 1988; Miura et al., 1992).
Sin embargo, los espermatozoides maduros de los salmnidos siguen siendo
inmviles mientras se hallen en un medio similar al del fluido seminal. Para los
espermatozoides de los peces marinos y muchos de agua dulce, como los ciprnidos, la
seal iniciadora de la motilidad es un cambio en la osmolaridad del medio, producido al ser
eyaculados (Morisawa et al., 1983b; Kobayashi, 1993; Chauvaud et al., 1994; Morisawa,
1994; Krasznai et al., 1995). En el caso de los salmnidos, la motilidad se inicia al
disminuir la concentracin de K+ del medio. Como se ha sealado arriba, los
espermatozoides permanecen inmviles en los espermiductos porque el fluido seminal es
rico en K+. La cada en la concentracin de K+ provoca la hiperpolarizacin de la

17

Introduccin
membrana plasmtica y la apertura de canales de Ca2+ dependientes de voltaje. El Ca2+ del
medio extracelular penetra en la clula, producindose un aumento del nivel de AMPc, que
activa una quinasa dependiente de AMPc. sta fosforila a una tirosina quinasa, la cual
fosforila una protena de 15 KDa llamada fosfoprotena iniciadora de la motilidad (MIPP),
fundamental para la activacin del axonema (Morisawa et al., 1983a; Morisawa y Hayashi,
1985; Tanimoto y Morisawa, 1988; Cosson et al., 1989; Billard, 1990a; Billard, 1990b;
Morisawa, 1994; Billard et al., 1995a; Gagnon, 1995). Otros factores pueden intervenir en
el inicio de la motilidad de los espermatozoides de los salmnidos, como la concentracin
de H+, Ca2+ y Na+ y la osmolaridad del medio. Concentraciones altas de Ca2+ o Na+
disminuyen el efecto inhibidor del K+, mientras que pH cidos u osmolaridades muy altas
inhiben la motilidad (Billard y Cosson, 1992).
La duracin de la motilidad en salmnidos es muy escasa. Apenas 60 segundos, de
los que slo la mitad son de movimiento rectilneo y progresivo, es decir, adecuado. Esto
se debe a que la actividad mitocondrial no puede compensar la energa consumida por el
batido flagelar, de manera que este cesa cuando se consumen las reservas de ATP
acumuladas durante la maduracin (Christen et al., 1987; Billard, 1990a, b, 1992; Billard
et al., 1995a; Rana, 1995a).

1.10. El proceso de criopreservacin de esperma de salmnidos

Cuando se propone un protocolo de criopreservacin seminal todos los pasos deben
ir encaminados hacia un nico objetivo: preservar la viabilidad de los espermatozoides de
la muestra. Alcanzar esta meta es complicado, debido a la gran cantidad de variables
implicadas en el proceso. Todos los protocolos comparten una serie de pasos:

18

Extraccin del semen

Valoracin de la calidad seminal

Dilucin del semen

Adicin de crioprotector

Equilibrado

Congelacin y almacenamiento

Descongelacin

Fecundacin artificial

Introduccin

A continuacin se ofrece una sntesis de estos pasos en el caso de los telesteos, y

especialmente de los salmnidos, haciendo especial referencia a la valoracin de la calidad
seminal.

1.10.1. Extraccin del semen

Este es el primer paso obligado en todo proceso de fecundacin artificial. Cuando
se trata de salmnidos puede optarse por uno de estos dos mtodos: el ordeo o la
canulacin.
El ordeo consiste en la extraccin del esperma simplemente por presin del
abdomen del macho y recogida del semen a medida que sale por el poro urogenital
(Marshall, 1990). Este mtodo tiene varios inconvenientes, sobre todo debido a la
contaminacin por agua, heces, orina y moco. Esto puede paliarse en parte teniendo a los
animales en ayunas, vaciando previamente la vejiga y secando el abdomen (Billard, 1990a;
Rana, 1995a). An as, el semen suele contaminarse, generalmente con orina. La dilucin
del semen por agua u orina altera su composicin inica, lo cual provoca la activacin de
la motilidad espermtica. Como se dijo antes, la duracin de la motilidad til de los
espermatozoides de los salmnidos es de apenas 30 segundos tras la activacin, por lo que
los espermatozoides que se activen en cualquier paso del protocolo sern intiles en el
momento de la inseminacin.
El otro mtodo, la canulacin, se basa en la utilizacin de una cnula, que es
introducida a travs del poro urogenital del animal hasta uno de los espermiductos. Con
una ligera presin del abdomen, el semen sale por la cnula. As se minimiza el riesgo de
contaminacin del esperma.
Los animales suelen ser anestesiados (Billard et al., 1995a). La manipulacin de los
animales, especialmente el secado, debe ser realizada con cuidado, ya que se elimina la
capa de moco protectora y se expone la piel a abrasiones e infecciones (Billard, 1990a).
Se ha comprobado experimentalmente la existencia de diferencias significativas
entre ambas tcnicas (Rana, 1995a; Quintans, 1997). El mtodo de extraccin por cnula
parece ser el ms adecuado en investigacin (Quintans, 1997), ya que se registran menos
alteraciones en la composicin del plasma seminal y un menor nmero de espermatozoides
activados antes de tiempo.

19

Introduccin

El semen debera ser congelado con la mayor prontitud posible tras su recogida,
para evitar una posible disminucin de la fertilidad. Con la misma finalidad, durante todo
el proceso se deben mantener las muestras cerca de 0C (Stoss y Holtz, 1983a; Holtz, 1993;
Piironen, 1994; Rana, 1995c).

1.10.2. Valoracin de la calidad seminal

El propsito de este paso es el de averiguar la calidad del semen, tanto fresco como
criopreservado, de manera que se pueda predecir su fertilidad probable y su aptitud para
sufrir el proceso de la congelacin y, de esta forma, descartar las muestras poco adecuadas
para la inseminacin y la criopreservacin. En teora, las tcnicas orientadas a esta labor
deberan ser sencillas, rpidas y fiables. Sin embargo, ninguna de las tcnicas empleadas
hasta ahora es completamente satisfactoria, y en la prctica suele recurrirse
simultneamente a varias de ellas para determinar la calidad de una muestra. No obstante,
la gran variabilidad de resultados tras la congelacin, que se refleja en la bibliografa,
puede deberse en gran parte a que no existe un mtodo adecuado de valoracin y seleccin
de muestras.
La medida de la motilidad espermtica es el mtodo ms utilizado. Generalmente se
hace una estimacin global de la motilidad, dando una calificacin arbitraria a cada
muestra (McNiven et al., 1992; Billard et al., 1995a). Tambin se recurre al porcentaje de
clulas mviles (Ciereszko y Dabrowski, 1994; Billard et al., 1995a, b; Lahnsteiner et al.,
1996b), a la velocidad de las clulas (Lahnsteiner et al., 1996b), a la duracin del
movimiento con desplazamiento (Billard et al., 1995a), a la duracin total, incluso sin
desplazamiento (Linhart y Kvasnicka, 1992; Billard et al., 1995a; Suquet et al., 1992), o a
la observacin de otras caractersticas del movimiento (Billard et al., 1995a, b).
Tambin se utiliza la concentracin espermtica (Munkittrick y Moccia, 1984;
Serantes et al., 1987; Ciereszko y Dabrowski, 1994), la osmolaridad y el pH de la muestra
(Erdahl y Graham, 1978; Scott y Baynes, 1980; Maisse et al., 1988; Aas et al., 1991;
Lahnsteiner et al., 1996b) y la composicin del plasma seminal (Erdahl y Graham, 1978;
Schmehl et al., 1987; Yoo et al., 1987; Maisse et al., 1988; McNiven et al., 1992;
Lahnsteiner et al., 1996b; Glogowski et al., 1996, 1997b).
Sin embargo, la relacin entre estos parmetros y la fertilidad de una muestra es
dudosa, con opiniones diversas segn autores (Legendre y Billard, 1980; Stoss y Holtz,
1983a; Piironen, 1987; Billard, 1988; Billard, 1990a; Gwo et al., 1993; Herrez et al.,

20

Introduccin

1993; Piironen, 1994; Babiak et al., 1995; Ohta et al., 1995b; Rana, 1995b; Glogowski et
al., 1996, 1997b; Lahnsteiner, 1996c). La opinin general es que todas estas tcnicas,
incluso empleadas complementariamente, permiten apreciar slo parcialmente la calidad
seminal de una muestra. Por lo tanto, no constituyen mtodos fiables para predecir la
fertilidad seminal.
Debido al su poco xito, se ha investigado otro tipo de tcnicas, que se utilizan en
mamferos y comienzan a experimentarse en peces. Como se ha dicho antes, las
membranas sufren diversas alteraciones durante el proceso de criopreservacin. Conocer
su estado antes y despus de este proceso es importante, ya que del estado de las
membranas celulares depende en gran medida el metabolismo, la motilidad y la integridad
del ADN del espermatozoide. Ms an, la membrana plasmtica interviene en la fusin
con el gameto femenino. No slo es necesario que las membranas estn completas, sino
que sean bioqumicamente activas (Correa y Zavos, 1994). Por lo tanto, se han propuesto
diferentes tcnicas para determinar la integridad y funcionalidad de las membranas
espermticas.
Un grupo de estas tcnicas se basa en la utilizacin de colorantes fluorescentes que
tien clulas u orgnulos dependiendo del estado de sus membranas. Un grupo de estos
(naranja de acridina, bromuro de etidio, ioduro de propidio, coloracin de Hoescht) no
penetra a travs de membranas intactas, por lo que slo se tien las clulas con la
membrana plasmtica daada. Otros colorantes (como la carboxifluorescena) tien las
clulas cuya membrana plasmtica est fsicamente intacta. Las muestras tratadas con estos
colorantes son examinadas con un microscopio de fluorescencia, cuantificando la
proporcin de clulas teidas. Esto ha sido aplicado con xito en mamferos y aves (Bilgili
y Renden, 1984; Biligli et al., 1985; Austin et al., 1990; Harrison y Vickers, 1990; Den
Daas, 1992; Correa y Zavos, 1994; Valcrcel et al., 1994; Althouse y Hopkins, 1995) y
recientemente se ha comenzado a utilizar en telesteos (McNiven et al., 1992; Gallant et
al., 1993; Herrez et al., 1996; Cabrita et al., 1998).
Otro mtodo para evaluar la integridad de la membrana plasmtica es la
cuantificacin de la actividad de diversas enzimas en el plasma seminal. Una alta actividad
de determinadas enzimas (-D-glucuronidasa, lactato deshidrogenasa, fosfatasa cida,
adenilato kinasa) ha sido relacionada con su liberacin del interior celular, revelando la
existencia de clulas cuya membrana est daada (Ciereszko y Dabrowski, 1995;
Lahnsteiner et al., 1996b).

21

Introduccin

Una segunda caracterstica de la membrana plasmtica que interesa estudiar es su

funcionalidad. Para ello se desarroll el test hipoosmtico (HOS test: hipoosmotic swelling
test) (Jeyendran et al., 1984). Este test se basa en la cuantificacin de las alteraciones
morfolgicas que sufren las clulas en un medio hipoosmtico. Si la membrana plasmtica
es funcional, una clula aumentar de tamao en una proporcin inversa a la osmolaridad
del medio (se dice entonces que es reactiva al test), pero si no lo es, no modificar su
volumen en la solucin hiposmtica. De esta manera, se ha podido relacionar la fertilidad
de muestras de semen con el porcentaje de clulas que resultan reactivas al test (Den Daas,
1992; Engel y Petzoldt, 1994; Correa y Zavos, 1994, 1996; Correa et al., 1996; Donoghue
et al., 1996; Esteves et al., 1996). Las clulas reactivas pueden detectarse mediante
microscopa ptica, pero frecuentemente se utilizan contadores electrnicos (coulter
counter) capaces de determinar tanto el nmero de clulas de una muestra como su
volumen individual (Paulenz et al., 1995). Esta tcnica ha sido empleada con semen de
mamfero y hay varios trabajos que se refieren a su utilizacin con semen de peces. En este
ltimo caso su empleo es ms complicado, ya que las clulas reactivas aumentan su
volumen en una proporcin muy pequea, por lo que no son fcilmente identificables a
microscopa ptica (Malejac et al., 1990; Cabrita, 1997; Cabrita et al., 1997; Cabrita et al.,
1999a).
En estudios previos realizados por nuestro equipo, Cabrita (1997) dise un nuevo
test que permite valorar la funcionalidad de la membrana plasmtica en espermatozoides
de trucha arco iris. Este test tambin informa de la resistencia de la membrana al choque
hiposmtico, pero en vez del tamao celular, analiza la supervivencia a lo largo del tiempo
en soluciones de diferente osmolaridad. Las clulas que presentan una membrana ntegra,
pero cuya funcionalidad est comprometida, pueden comportarse normalmente en
condiciones fisiolgicas, pero mueren en condiciones de estrs, como la fecundacin o la
criopreservacin. Durante la aplicacin del test, la muestra de semen se diluye en
soluciones de distinta osmolaridad, de manera que las clulas sufren un choque osmtico.
Se aade un colorante vital fluorescente que tie las clulas con la membrana plasmtica
daada y se examina la muestra con un microscopio de fluorescencia a distintos tiempos
tras la dilucin. Las clulas que sufren daos subletales o funcionales son puestas en
evidencia, ya que son mucho menos resistentes al estrs osmtico.
La valoracin de la funcionalidad de la membrana plasmtica es un factor que no se
ha tenido en cuenta hasta ahora para valorar la calidad seminal en peces, pero que puede

22

Introduccin

estar muy relacionado con la capacidad de las clulas para resistir el proceso de
congelacin y, por tanto, podra ser un parmetro que nos indicara si una muestra seminal
es o no apta para la ser criopreservada. Adems, teniendo en cuenta que en los peces de
agua dulce la fecundacin tiene lugar en un medio hiposmtico, puede tener tambin una
importancia capital para predecir la fertilidad de una muestra de semen fresco, ya que
previsiblemente aquellos espermatozoides cuya membrana no resista el estrs osmtico, no
sern capaces de fertilizar el huevo. No se han realizado sin embargo, los estudios que nos
permitan conocer si el porcentaje de clulas resistentes al test hiposmtico es o no un
ndice con valor predictivo.
El test de resistencia al choche hiposmtico, realizado en principio con microscopa
de fluorescencia, ha sido posteriormente adaptado para su lectura con citmetro de flujo
(Cabrita et al., 1999b). De esta forma su utilizacin es rpida y sencilla ya que la
citometra es un mtodo preciso y rpido para cuantificar las clulas marcadas en una
muestra de semen.
Bsicamente, la citometra de flujo permite analizar clulas mediante un rayo lser.
Las clulas son arrastradas por una corriente de lquido y obligadas a pasar de una en una
frente al lser. Cuando una clula intercepta al haz del lser, parte de la radiacin atraviesa
la clula y parte es dispersada. Un fotomultiplicador recoge la luz que no ha sufrido
desviacin, denominada FSC (forward scattered light), y otro recoge la luz que ha sido
desviada 90, denominada SSC (side scattered light). La seal FSC informa sobre el
tamao de la partcula, mientras que la seal SSC informa sobre su estructura interna
(complejidad).
Ms informacin puede obtenerse de la muestra analizada si se utilizan colorantes
fluorescentes. Un sistema de filtros y fotomultiplicadores permite la deteccin de luz
fluorescente a determinadas longitudes de onda, emitida por los colorantes al ser excitados
por el lser. De esta manera, pueden diferenciarse clulas por muchas otras caractersticas
adems de su tamao y estructura (Ericsson et al., 1989; Tiersch et al., 1989; Thomas y
Garner, 1994; Krasznai et al., 1995; Johnson et al., 1996).
La gran ventaja de la citometra de flujo es la gran velocidad de anlisis de las
muestras. Con la microscopa de fluorescencia un observador debe gastar varias horas para
examinar algunos miles de clulas. Generalmente slo se examinan unos cientos de clulas
por muestra, lo cual compromete la repetibilidad de los experimentos. Un citmetro de

23

Introduccin

flujo puede examinar miles de clulas en unos pocos segundos, lo cual asegura una validez
estadstica muy superior (Johnson et al., 1996). Adems, los datos son transmitidos a un
sistema informtico, lo cual facilita sobremanera su manipulacin e interpretacin, tanto
numrica como grfica.
La aplicacin de la citometra de flujo al estudio de clulas espermticas se remonta
a mediados de los aos 70 (Gledhill, 1976). A partir de entonces, han aparecido numerosos
trabajos en los cuales la citometra de flujo ha sido empleada para el estudio de semen de
mamferos y aves (Garner et al., 1986; Ericsson et al., 1989; Karabinus et al., 1991; Gao et
al., 1992; Span y Evenson, 1993; Thomas y Garner, 1994; Donoghue et al., 1996;
Johnson et al., 1996). Ms recientemente, estos conocimientos han sido trasladados
tambin al campo de la acuicultura (Mrin et al., 1993; Kawamura et al., 1995; Krasznai
et al., 1995; Ogier et al., 1996, 1997; Cabrita et al., 1999b).
Teniendo en cuenta el estado actual de conocimientos que ha sido expuesto,
debemos considerar que, hasta el momento, el nico parmetro fiable para la valoracin de
la calidad seminal en peces es la fertilidad de la muestra (Billard et al., 1995a). Para
cuantificarla, el semen es mezclado con huevos y activado. La fertilidad se calcula por el
porcentaje de huevos que llegan a determinado estado de desarrollo o a la eclosin, o el
porcentaje de larvas que sobreviven hasta la etapa en que comienzan a alimentarse (Billard
et al., 1995a). Sin embargo, es necesario esperar a la incubacin de los huevos, los cuales
deben ser mantenidos en un medio adecuado mientras tanto. Adems, los resultados
dependen de la calidad de los huevos empleados.
Debido a los inconvenientes de espacio y tiempo que supone la prueba de fertilidad,
se ha de continuar investigando para conseguir una tcnica que permita predecir en poco
tiempo la fertilidad de muestras de semen de peces.

1.10.3. Dilucin del semen

El significado de este paso es el de optimizar el volumen de semen y proporcionar a
las clulas un microambiente adecuado con vistas al proceso de criopreservacin. La
solucin en la que se va a diluir la muestra de semen debe mantener las clulas vivas pero
inmviles (Scott y Baynes, 1980; Stoss, 1983) y aumentar el volumen final de lquido
seminal, pero sin afectar a la capacidad fecundante por unidad de volumen.

24

Introduccin

Un diluyente adecuado para el semen de salmnidos debe reunir los siguientes

requisitos (Graham, 1978):

Su composicin electroltica y presin osmtica deben ser similares a las del

plasma seminal.

Tiene que mantener la actividad metablica de las clulas, proporcionando una

fuente de energa (opcional).

Debe tener propiedades quelantes, tamponantes (para salmnidos, con un pH entre

6 y 8) y ser estable a la degradacin.

Puede incluir un agente antibitico para evitar el crecimiento de bacterias y hongos

(opcional) (Scott y Baynes, 1980; Stoss, 1980, 1983; Leung y Jamieson, 1991;
Jenkins y Tiersch, 1997).

Debe incorporar al menos un agente crioprotector (si se va a refrigerar o congelar).

Debe asegurar la inmovilidad de los espermatozoides, mediante una osmolaridad

adecuada y las concentraciones necesarias de K+ y Ca2+ (Stoss y Holtz, 1983b;
Erdahl et al., 1987).
Se ha ideado una gran cantidad de diluyentes para semen de peces (Scott y Baynes,

1980; Leung y Jamieson, 1991; McAndrew et al., 1995). Algunos diluyentes propuestos
para salmnidos son:

Mounib (1978) (Baynes y Scott, 1987; Cloud et al., 1990; Piironen, 1993).

#6 (Erdahl y Graham, 1980a; Erdahl et al., 1984; Erdahl et al., 1987; Gallant et al.,
1993; Herrez et al., 1993; Mediavilla, 1995; Mediavilla et al., 1995; Herrez et al.,
1996).

Horton y Ott (1976) (McNiven et al., 1993)

Bykhatipoglu y Holtz (1978) (Bykhatipoglu y Holtz, 1978; Stoss y Holtz,

1981; Schmidt-Baulain y Holtz, 1989).

Lahnsteiner (1995) (Lahnsteiner et al., 1995, 1996b)

Glucosa 0,3 M (Piironen y Hyvrinen, 1983a; Chao et al., 1986; Piironen, 1993;
Glogowski et al., 1997a).

Glucosa 0,6 M (Holtz, 1993).

25

Introduccin

Muchos diluyentes estn basados en la compleja composicin del plasma seminal,

aunque diluyentes simples (bsicamente, diluciones de glucosa en agua) han dado muy
buenos resultados (Rana, 1995c).
La tasa de dilucin de semen en el diluyente debe ser aquella que proporcione el
mayor aumento de volumen sin disminuir la fertilidad. Se considera que el semen fresco de
un macho puede fecundar los huevos de decenas de hembras si es correctamente diluido
(Stoss y Holtz, 1981; Billard, 1990a). En salmnidos, la relacin semen:diluyente puede
situarse entre 1:1 y 1:9 sin que haya diferencias significativas (Bykhatipoglu y Holtz,
1978). Diluciones elevadas disminuyen la motilidad, supervivencia y fertilidad, mientras
que diluciones demasiado bajas no proporcionan las ventajas deseadas (Erdahl y Graham,
1987). Generalmente, las proporciones utilizadas se encuentran entre 1:1 y 1:4 (Erdahl et
al., 1984; Wheeler y Thorgaard, 1991; Scott y Baynes, 1980; Piironen, 1994). En el caso
de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), la mejor opcin parece ser 1:3 (Legendre y
Billard, 1980; Holtz, 1993).

1.10.4. Adicin de crioprotector

En la criopreservacin del semen de telesteos se utiliza una gran cantidad de
crioprotectores (Rana, 1995c). Destacan varios crioprotectores que penetran membranas:
glicerol, metanol, dimetilsulfxido (DMSO), dimetilacetilamina (DMA), etc.
El glicerol es aplicado en numerosas especies de peces, pero es inadecuado para
muchos salmnidos (Erdahl y Graham, 1980b; Piironen y Hyvrinen, 1983a; Erdahl et al.,
1984; Yoo et al., 1987; Piironen, 1987, 1993; Herrez et al., 1993, 1996; Lahnsteiner et al.,
1995). Para gran parte de las especies de salmnidos, el DMSO es considerado un buen
crioprotector (Erdahl y Graham, 1978, 1980a; Scott y Baynes, 1980; Stoss y Holtz, 1981,
1983b; Erdahl et al., 1984; Maunkittrick y Moccia, 1984; Chao et al., 1987; Gallant et al.,
1991; Ciereszko et al., 1993; Herrez et al., 1993, 1996; Lahnsteiner et al., 1995;
Mediavilla, 1995; Mediavilla et al., 1995; Glogowski et al., 1996; Cabrita, 1997; Cabrita et
al., 1997; Cabrita et al., 1998, 1999b). Tambin han sido propuestos el etilenglicol (Erdahl
y Graham, 1978; Erdahl y Graham, 1980a), DMA (McNiven et al., 1993; Cabrita et al.,
1999b) y metanol (Lahnsteiner et al., 1996d).
La concentracin del crioprotector es un factor importante, con el fin de evitar sus
efectos txicos sin perder sus propiedades protectoras (Fahy, 1986). A altas

26

Introduccin

concentraciones el efecto crioprotector no compensa el dao producido por toxicidad

(Stoss y Holtz, 1983b; Erdahl et al., 1984).
En Oncorhynchus mykiss se han obtenido los mejores resultados con DMSO a una
concentracin final de alrededor del 7% (Stoss y Holtz, 1983b; Erdahl et al., 1984).
Los crioprotectores que no atraviesan membranas, especialmente los glcidos y la
yema de huevo, se han utilizado extensamente en criopreservacin de semen de
salmnidos. El poder de los glcidos queda demostrado con la existencia de muchos
diluyentes que se basan principalmente en soluciones de glucosa en agua (ver dilucin del
semen) (Wheeler y Thorgaard, 1991). Por otra parte, la sacarosa ha probado ser un buen
crioprotector (Maisse, 1994; Lahnsteiner, 1996c).
La presencia de yema de huevo en el diluyente, cuya eficacia ha sido comprobada
en mamferos, aumenta significativamente la fertilidad del semen criopreservado de
muchos peces, aunque depende del diluyente empleado y de la especie. Numerosos
experimentos en salmnidos y otros telesteos han dado resultados positivos, pero es
necesario conocer mejor las interacciones entre los componentes de la yema con los
espermatozoides y huevos (Alderson y Macneil, 1984; Baynes y Scott, 1987; Wheeler y
Thorgaard, 1991; Piironen, 1993, 1994; Babiak et al., 1995; Cabrita, 1997; Cabrita et al.,
1997; 1998).
Algunos autores han resaltado la importancia de algunas protenas, como la
promina D de soja, en la crioproteccin del esperma de salmnidos (Bykhatipoglu y
Holtz, 1978). La utilidad de la albmina srica bovina, en cambio, es discutible (Stoss y
Holtz, 1983a; Billard, 1988; Lahnsteiner et al., 1992a; Lahnsteiner, 1996c).
Frecuentemente se recomienda combinar diferentes crioprotectores, ya que, como
hemos mencionado, pueden tener efectos sinrgicos (Bykhatipoglu y Holtz, 1978; Stoss
y Holtz, 1983a; Cognie et al., 1989; Lahnsteiner et al., 1995; Conget et al., 1996;
Glogowski et al., 1997a).

1.10.5. Tiempo de equilibrado

Cuando se utilizan crioprotectores que penetran a travs de membranas, debe
dejarse un tiempo de reposo entre la adicin del crioprotector al semen diluido y la
congelacin (Grout y Morris, 1987). El tiempo de equilibrado asegura que el crioprotector
penetre en las clulas, aunque debe ser lo ms breve posible, con el fin de reducir sus

27

Introduccin

efectos txicos. En trabajos sobre salmnidos, se utilizan generalmente tiempos de

equilibrado de 30 a 60 minutos (Herrez et al., 1993). Sin embargo, varios autores opinan
que tiempos de equilibrado tan largos son innecesarios, e incluso perjudiciales (Stoss y
Holtz, 1983; Gallant et al., 1993; Lahnsteiner et al., 1994; Piironen, 1994; Mediavilla,
1995; Conget et al., 1996). El tiempo de equilibrado depende tanto de la especie utilizada
como de las condiciones experimentales, especialmente del tipo de diluyente (Rana et al.,
1990; Rana, 1995c).

1.10.6. Congelacin y almacenamiento

La congelacin de las muestras de semen puede ser efectuada de diversas formas.
En la congelacin en pellets, se depositan de 0,05 a 0,2 ml de muestra directamente sobre
un bloque de hielo seco (-79C) hasta su total congelacin (Holtz, 1993; Piironen, 1993).
Otra opcin es la congelacin en recipientes, ya sean pajuelas de plstico o
ampollas de vidrio (Erdahl y Graham, 1978, 1980a; Erdahl et al., 1984; Chao et al., 1987;
Wheeler y Thorgaard, 1991; Lahnsteiner et al., 1995; Rana, 1995a). En este caso, las
pajuelas o ampollas se llenan y se congelan por contacto con hielo seco, por vapores de
nitrgeno lquido (alrededor de 100C, dependiendo de la altura sobre la superficie del
lquido), o mediante biocongeladores programables, que permiten la utilizacin de rampas
de congelacin (Cognie et al., 1989; Chao et al., 1986; Maisse, 1994; Ohta et al., 1995a;
Rana, 1995a; Conget et al., 1996). Las pajuelas son preferibles a las ampollas, ya que
permiten congelar ms uniformemente todo el volumen de semen que contienen (Piironen,
1994).
La congelacin en pellets es muy utilizada en salmnidos (Bykhatipoglu y Holtz,
1978; Erdahl y Graham, 1978, 1980a; Stoss y Holtz, 1981; Hiromi et al., 1995; Ohta et al.,
1995a; Rana, 1995a), aunque las pajuelas presentan las ventajas de poder congelar un
volumen mayor de semen por unidad y de ser ms cmodas de manipular (Lahnsteiner et
al., 1995).
Es preferible congelar las muestras lo ms pronto posible tras la recoleccin, para
evitar prdidas de fertilidad (Scott y Baynes, 1980; Stoss, 1983; Schmidt-Baulain y Holtz,
1989; Leung y Jamieson, 1991). En salmnidos se han obtenido buenos resultados tanto
con pellet como con pajuelas, aunque hay discrepancias dependiendo de los diferentes
trabajos (Erdahl et al., 1984).

28

Introduccin

La velocidad a la que disminuye la temperatura de la muestra hasta que sta se

encuentra completamente congelada constituye uno de los factores ms importantes a tener
en cuenta para conseguir una supervivencia elevada (Franks, 1985; Grout y Morris, 1987).
Para semen de salmnidos se han propuesto muchas velocidades distintas, desde 10 a
160C/minuto (Scott y Baines, 1980; Alderson y Macneil, 1984; Billard, 1990a; Hiromi et
al., 1995; Rana, 1995c; Conget et al., 1996; Lahnsteiner et al., 1996d)
Despus de la etapa de congelacin, las muestras suelen guardarse en nitrgeno
lquido hasta el momento de su utilizacin.

1.10.7. Descongelacin
A efectos prcticos, se considera que si la velocidad de congelacin ha sido
adecuada, la velocidad de descongelacin es menos significativa (Graham y Crabo, 1979;
Grout y Morris, 1987).
Generalmente, se acepta que la descongelacin rpida da mejores resultados de
viabilidad espermtica (Mazur, 1977; Graham y Crabo, 1979; Piironen, 1987; Rana,
1995c; Marshall, 1990; Lahnsteiner et al., 1996d). sta suele realizarse en una solucin
adecuada, en el caso de los pellets (Stoss y Holtz, 1981; Piironen, 1994), o en agua, si se ha
almacenado en pajuelas o ampollas (Marshall, 1990). La temperatura utilizada vara de 0C
a 40C, segn autores (Erdahl y Graham, 1978; Stoss y Holtz, 1981; Billard, 1990a; Young
et al., 1992; Holtz, 1993; Piironen, 1994; Lahnsteiner et al., 1995, 1996d; Rana, 1995a). El
tiempo de descongelacin debe ser breve, ya que un calentamiento de la muestra ya
descongelada es perjudicial (Lahnsteiner et al., 1996d).
Debido al deterioro que se produce en el proceso de congelacin/descongelacin es
recomendable utilizar el semen inmediatamente despus de su descongelacin (Stoss y
Holtz, 1981; Wheeler y Thorgaard, 1991).

1.10.8. Fecundacin artificial

Los huevos utilizados para la fecundacin artificial son extrados por ordeo de
hembras anestesiadas, tomando las mismas precauciones que en el caso del semen para
evitar contaminacin. Para ensayos de fertilizacin, se recomienda mezclar huevos de tres
hembras por lo menos, a fin de disminuir la variabilidad debida a diferencias entre lotes de
huevos (Rana, 1995a).

29

Introduccin

Tradicionalmente se han utilizado dos mtodos en la fecundacin artificial de

huevos de peces, denominados mtodo seco y mtodo hmedo. El mtodo seco consiste en
el mezclado de semen y huevos, los cuales se dejan un tiempo en reposo. Despus se aade
agua para activar a los espermatozoides (Piironen, 1993). En el mtodo hmedo, el agua se
vierte inmediatamente despus de aadir el semen (Scott y Baynes, 1980; Marshall, 1990).
Desde un principio, el mtodo seco proporcion mejores resultados que el mtodo
hmedo, ya que el tiempo de contacto entre gametos es mayor (Billard, 1978). Sin
embargo, actualmente se prefiere el mtodo hmedo. Una de las principales razones para
este cambio viene dado por el desarrollo de soluciones activadoras. La utilizacin de estas
soluciones con el mtodo hmedo resulta ms eficaz que el empleo del mtodo seco, y se
necesita menos cantidad de semen (Billard, 1977a, b; Marshall, 1990).
Las soluciones activadoras son disoluciones acuosas de diversas sales, sustancias
tamponadoras y sustancias estimuladoras de la motilidad (Linhart et al., 1987; Sheerer y
Thorgaard, 1989, 1991; Steyn et al., 1989; Brown y Shrable, 1995; Rana, 1995c;
Lahnsteiner et al., 1996a). Su composicin inica y osmolaridad son las adecuadas para
espermatozoides y huevos, aunque estn exentas del ion potasio, que, como ya se dijo
antes, es el responsable del mantenimiento de la inmovilidad espermtica. En el caso del
esperma criopreservado, la utilizacin de estas soluciones en vez de agua es an ms
ventajoso, ya que estos espermatozoides son ms sensibles al choque osmtico que los no
criopreservados (Piironen, 1994; Cabrita, 1997; Cabrita et al., 1997, 1998).
Un detalle importante en la fecundacin es la relacin espermatozoides:huevos. Los
huevos de los salmnidos requieren un gran nmero de espermatozoides por unidad, entre
10.000 y 1.000.000, segn la calidad del semen y distintos autores (Billard, 1990a, 1992),
para conseguir un ndice de fecundacin alto. Esto se debe a la escasa probabilidad
individual que posee un espermatozoide para fecundar un huevo. Un espermatozoide de
salmnido recorre como mximo 3 mm durante los 30 segundos que suele durar su
movimiento progresivo, mientras que el huevo puede llegar a medir 6 mm de dimetro.
Hay un solo punto de entrada al huevo, el micropilo, que se cierra al entrar en contacto con
el agua (Billard, 1990a). Tampoco hay que olvidar que el agua es un medio hostil para los
gametos (Billard, 1978, 1992).
Debido al elevado nmero de daos letales y subletales que se producen en el
proceso de criopreservacin (Billard, 1983; Mediavilla, 1995; Mediavilla et al., 1995), es

30

Introduccin

necesario aumentar de 10 a 100 veces la cantidad de semen empleado, para compensar la

disminucin de la fertilidad (Legendre y Billard, 1980; Piironen, 1994; Herrez et al.,
1996; Quintans, 1997).
As, en fecundaciones con semen fresco de salmnidos han sido propuestas
relaciones de 103 a 106 espermatozoides/huevo (Erdahl y Graham, 1987; Billard, 1988,
1992; Ciereszko y Dabrowski, 1994; Lahnsteiner et al., 1996d), mientras que con el semen
congelado se recomiendan de 106 a 107 espermatozoides/huevo (Stoss y Holtz, 1981;
Piironen, 1987; Lahnsteiner et al., 1995, 1996a). Sin embargo, un nmero excesivo de
espermatozoides por huevo puede resultar en porcentajes de fertilidad engaosamente altos
(Legendre y Billard, 1980; Stoss y Holtz, 1981a; Cabrita et al., 1999a).

31

2. OBJETIVOS
Encontrar un mtodo sencillo, rpido y fiable para predecir la fertilidad de una
muestra de semen, es necesario para realizar con garantas los procesos de inseminacin
artificial y de criopreservacin seminal. En acuicultura hay un gran nmero de tcnicas
para evaluar la calidad seminal, pero su correlacin con la fertilidad de la muestra es muy
escasa.
Actualmente, se estn desarrollando varias tcnicas orientadas hacia la evaluacin
del estado de la membrana plasmtica. Una de las ms recientes es la desarrollada por
Cabrita (1997), basada en el estudio de la funcionalidad de la membrana mediante la
aplicacin de tratamientos hipoosmticos. El uso de los tratamientos hipoosmticos
permite cuantificar el porcentaje de clulas con daos subletales que se encuentran en una
muestra. Estas clulas pueden aparecer como viables con otros mtodos, pero fallar en la
fecundacin del huevo. Al someter a las clulas de una muestra a un choque hipoosmtico,
las ms dbiles sufren daos en su membrana y son entonces teidas por un colorante
fluorescente que no atraviesa las membranas intactas. Puede suponerse que el porcentaje
de clulas permeables al colorante tenga relacin con la fertilidad de la muestra, ya que el
estado de la membrana plasmtica es fundamental en el proceso de fecundacin.
El objetivo de este trabajo es examinar el comportamiento de los espermatozoides
de Oncorhinchus mykiss en diversas soluciones hipoosmticas y evaluar el poder
predictivo de este test sobre la fertilidad del semen, tanto fresco como criopreservado.
En este trabajo se utilizar la citometra de flujo para examinar las muestras, ya que
permite analizar una gran cantidad de clulas en muy poco tiempo, discriminando
eficazmente aquellas que han sido marcadas.

3. MATERIALES Y MTODOS

3.1. Animales
En este trabajo fueron utilizados 21 ejemplares machos y 15 ejemplares hembras de
trucha arco iris (Oncorhinchus mykiss, Walbaum, 1792), de alrededor de 3 aos de edad.
Los animales fueron adquiridos en la piscifactora Las Zayas (Velilla de la Valduerna,
Len). Durante el desarrollo de los estudios, machos y hembras fueron mantenidos
separadamente en tanques cuadrangulares de 2 m3 de capacidad cada uno y con flujo
continuo de agua no clorada a una temperatura de alrededor de 12 C.
Los gametos se obtuvieron al final del invierno (entre los meses de Febrero y
Marzo). Las muestras de semen fueron identificadas mediante letras, de la A a la U.

3.2. Recogida del semen y huevos

Antes de cualquier manipulacin, los animales se anestesiaron mediante inmersin
en cubetas de agua con 0,2 g/l de metiltricana (MS-222, Sandoz). Una vez utilizados, los
animales se recuperaban en agua sin anestsico.
Para extraer el semen se utiliz la tcnica de canulacin. Una vez que el animal
quedaba anestesiado, era extrado del bao con anestesia y colocado sobre una toalla
hmeda. La zona urogenital era lavada y secada cuidadosamente para evitar contaminacin
con agua o anestsico. El animal era colocado sobre su zona dorsal y se apretaba
ligeramente el vientre para extraer orina o heces que pudieran contaminar la muestra de
semen. La extraccin de semen propiamente dicha se efectuaba introduciendo una cnula
sanitaria de plstico (3 mm total) por el poro urogenital. Una vez localizado uno de los
espermiductos se apretaba ligeramente la zona ventral del animal. El semen de cada macho
era recogido en un frasco para cultivos celulares de 20 ml, debidamente identificado como
correspondiente a un macho determinado. Todas las muestras fueron mantenidas sobre
hielo para conservar su contenido alrededor de 4 C.
Los huevos fueron obtenidos mediante masaje abdominal de las hembras. La rutina
fue la misma que con los machos en cuanto a anestesia, manipulacin y precauciones para
evitar contaminacin de los huevos. La extraccin de los huevos se efectu sujetando al
animal en posicin vertical y masajeando su abdomen de arriba hacia abajo. Los huevos

Materiales y Mtodos

fueron recogidos en bandejas de plstico sobre hielo, desechndose aquellos que

presentaban mal aspecto.
Todos los experimentos siguientes, a excepcin de los realizados con semen
criopreservado, fueron realizados inmediatamente despes de la recogida de gametos.

3.3. Anlisis de los parmetros estndar del semen

Los parmetros estndar de cada muestra (motilidad, densidad espermtica, pH y
osmolaridad) fueron determinados inmediatamente despus de la extraccin.

3.3.1. Motilidad
La motilidad se evalu mediante el mtodo de Billard (1992). Con un capilar se
deposit 1 l de semen, diluido en proporcin 1:3 en diluyente para esperma (Tabla I),
sobre un portaobjetos. El semen fue activado con 19 l de solucin activadora de
movilidad DIA 532 (Tabla II). Inmediatamente despus de su activacin, las muestras eran
observadas con un microscopio ptico (400 aumentos), dndose a cada una calificacin de
0 a 5, dependiendo del porcentaje de espermatozoides que presentaban movimiento
progresivo (0 - 0% espermatozoides mviles; 1 - 20% espermatozoides mviles; 2 - 40%
espermatozoides mviles; 3 - 60% espermatozoides mviles; 4 - 80% espermatozoides
mviles; 5 - 100% espermatozoides mviles).

3.3.2. Densidad espermtica

Para la determinacin de la densidad espermtica se utiliz una cmara de
Neubauer, previa dilucin del semen 1:1000 en diluyente de esperma. Las lecturas se
efectuaron utilizando un microscopio ptico de contraste de fases a 400 aumentos. Para
cada muestra se contaron las clulas de 16 celdas pequeas en tres campos distintos. La
concentracin espermtica se calcul a partir de la media del nmero de clulas en los tres
campos, teniendo en cuenta que el volumen de una celdilla es de 2,510-4 mm3 .

3.3.3. Medida del pH

Se utiliz un medidor de pH adecuado para muestras pequeas (Micro pH2000,
CRISON), utilizando 50 l de muestra para la medicin.

36

Materiales y Mtodos

3.3.4. Osmolaridad
Las mediciones de osmolaridad se realizaron con osmmetro crioscpico Osmomat
030 (GONOTEC), calibrado con agua destilada (0 mOsm/kg). Cada muestra fue medida
por triplicado, utilizando 50 l de semen cada vez.

3.4. Dilucin del semen

A partir del diluyente de semen se prepararon dos variantes (a las que se referir
desde ahora como solucin A y solucin B):
Solucin A: diluyente con 10% v/v de yema de huevo (Merck)
Solucin B: diluyente con 4 g/l de albmina srica bovina (BSA)
Justo antes de diluir las muestras se aadi DMSO hasta una concentracin final
del 7%. Las muestras de semen se diluyeron 1:3 en cada una de estas soluciones
(semen:solucin).

3.5. Tiempo de equilibrado

Las muestras destinadas a criopreservacin se dejaron a 4 C durante 30 minutos
antes de congelarlas. Se consideraron estos 30 minutos como tiempo de equilibrado.

3.6. Congelacin del semen

Para congelar y almacenar el semen se utilizaron pajuelas de plstico de 0,25 ml de
capacidad. El llenado de las pajuelas se efectu en una cmara frigorfica a 4C. Una vez
llenas, las pajuelas fueron selladas con poliacrimilato, se secaron cuidadosamente y se
introdujeron en un biocongelador programable Bioplanner. La velocidad de congelacin
programada fue de -20C/min. Cuando se alcanzaron los -100C, las pajuelas fueron
sumergidas en nitrgeno lquido (-196C). Despus fueron almacenadas en tanques llenos
de nitrgeno lquido, hasta el momento de su utilizacin.

3.7. Descongelacin
Las pajuelas se descongelaron por inmersin en agua a 25 C durante 30 segundos.
Luego fueron secadas cuidadosamente, se cortaron los extremos y el semen se recogi en
tubos Eppendorf sobre hielo, para mantener las muestras cerca de 4C.

37

Materiales y Mtodos

3.8. Aplicacin de los test hipoosmticos y tincin de las

muestras
Se aplicaron varios test hipoosmticos para analizar la funcionalidad de la
membrana plasmtica de los espermatozoides y la evolucin de la viabilidad celular a lo
largo del tiempo. Se prepararon cuatro soluciones de NaCl en agua destilada, con
concentraciones 5,56 mM, 55,55 mM, 111,08 mM y 166,63 mM. Las osmolaridades de
estas soluciones fueron de 10, 100, 200 y 300 mOsm/kg, respectivamente. Hasta el
momento de su utilizacin las soluciones permanecieron congeladas a 20 C.
Para realizar los test se llenaron tubos de polipropileno para citometra de flujo con
10 ml de cada solucin. A tiempo 0 se aadieron 10 l de muestra de semen y 10 l de
ioduro de propidio a cada tubo, homogeneizando bien la mezcla. Las muestras as
preparadas se analizaron mediante citometra de flujo a tiempos 30, 2, 5, 10, 15 y 30.
Se denomin tratamiento a la combinacin de una solucin hipoosmtica y un tiempo,
resultando as 24 tratamientos por muestra.
El ioduro de propidio es un agente intercalante fluorescente, con una alta afinidad
por el ADN. Debido a que no atraviesa membranas biolgicas, tie el ncleo nicamente

Figura 1. Grficos de adquisicin y de anlisis de datos del citmetro de flujo, creados con el
programa de adquisicin y anlisis de datos CellQuest (v. 1). A la izuierda se encuentra el grfico
de adquisicin, utilizado para descartar del anlisis las partculas que no eran espermatozoides. Las
partculas detectadas por el citmetro de flujo se representan en un grfico de puntos, segn sus
seales SSC y FSC. Se indican en rojo los puntos correspondientes a espermatozoides, que son
encuadrados en la regin R1 para ser analizados en el grfico de anlisis de datos, a la derecha. El
resto de puntos corresponden a residuos y son rechazados. En el grfico de anlisis de datos se
representan las partculas de la regin R1 segn sus seales FL2 y FSC. Se crearon otras dos
regiones para separar las clulas con alta fluorescencia (R2), correspondientes a clulas permeables
al ioduro de propidio, y las partculas con baja fluorescencia (R3), correspondientes a las clulas no
permeables. La informacin estadstica de estas dos regiones se recogi en tablas de datos creadas
ad hoc.

38

Materiales y Mtodos

de las clulas que tienen la membrana plasmtica daada, de manera que las clulas
permeables a esta sustancia se consideran no viables. La solucin de ioduro de propidio
utilizada en estos experimentos se prepar mezclando 10 l de ioduro de propidio 0,5
mg/ml (MERCK) con 100 l de PBS 0,1 M.

3.9. Anlisis de las muestras por citometra de flujo

Las muestras fueron analizadas con un citmetro de flujo FACSort (BECTON
DICKINSON), equipado con un lser de argn Cryonics de 15 mW, refrigerado por aire y
operando a una longitud de onda de 488 nm (Figura 2). La emisin fluorescente roja del
ioduro de propidio fue recogida por el canal fotodetector FL2, compuesto por un filtro
585/42 band pass y un fotomultiplicador R1477. La seal SSC fue detectada por un

FILTRO
530/30

DIVISOR
DEL HAZ
ESPEJO DICROICO
560 short pass

FMT R1477

DETECTOR
FSC

CANAL FL1

ESPEJO DICROICO
640 long pass

LENTES

DETECTOR SSC
FMT 1P28
CLULA
DE FLUJO

FILTRO 650
long pass
FMT R1477

FILTRO 585/42
band pass
FMT R1477
CANAL FL2

MUESTRA
LSER DE
ARGN
488 nm

CANAL FL3

ORDENADOR
(CELL QUEST v. 1)

Figura 2. Esquema del funcionamiento del citmetro de flujo empleado en los experimentos. Se
utiliz la informacin proporcionada por los canales FSC, SSC y FL2 para su posterior tratamiento
informtico. Los trminos long pass, short pass y band pass indican que el filtro o espejo
correspondiente permite el paso de luz de longitud de onda mayor, menor o comprendida entre,
respectivamente, los nmeros indicados (en nanmetros). FMT = fotomultiplicador.

39

Materiales y Mtodos

fotomultiplicador 1P28. La velocidad de flujo se fij en la mxima proporcionada por el

aparato (607 l/min). Se analizaron 10000 clulas por muestra. Los datos fueron
digitalizados y transferidos a un ordenador Macintosh provisto del software de adquisicin
y anlisis de muestras CellQuest (v. 1). Se cre un grfico de adquisicin de datos en el
que se representaron las partculas detectadas segn las seales FSC y SSC (Figura 1,
izquierda). Se delimit dentro de este grfico una regin que recoga los puntos que
correspondan a espermatozoides (aproximadamente, seal SSC entre 10 y 1000 unidades
y seal FSC entre 100 y 10000 unidades). El resto de las partculas detectadas se
consideraron residuos. Las partculas recogidas en la regin citada se representaron en otro
grfico, segn las seales FSC y FL2 (Figura 1, derecha). Se delimitaron dos regiones, una
de ellas agrupando a las partculas con alta fluorescencia (clulas permeables al ioduro de
propidio) y otra agrupando a las partculas con baja fluorescencia (clulas no permeables).
A partir de aqu, a las clulas marcadas con ioduro de propidio sern llamadas clulas
permeables. Se consideraron clulas permeables aquellas cuya seal FL2 fue superior a,
aproximadamente, 30 unidades.

3.10. Evaluacin de la fertilidad

Para las pruebas de evaluacin de la fertilidad se mezclaron los huevos de 3 o 4
hembras y se llenaron placas de Petri con unos 100 huevos cada una. Las pruebas de
evaluacin de la fertilidad se llevaron a cabo utilizando el mtodo hmedo. El semen se
verti sobre los huevos, cuidando de que quedase homogneamente distribuido.
Inmediatamente se aadieron 10 ml de solucin activadora DIA 532 y se removieron
suavemente con plumas de ave para asegurar el mezclado sin causar daos. Despus de
permanecer 10 minutos en reposo, se lavaron con agua no clorada para retirar los restos de
semen y se pasaron a un recipiente de red plstica, que fue colocado en un incubador
vertical para salmnidos.
Todos los ensayos de fecundacin se realizaron por duplicado, utilizando 2 placas
por animal y tratamiento (semen fresco, semen congelado diluido en A y semen congelado
diluido en B). Para los clculos posteriores se utilizaron las medias de estos duplicados.
En las fecundaciones con semen fresco se utilizaron 250 l de semen por placa. En
el caso de las fecundaciones con semen congelado se utiliz el contenido de 2 pajuelas
(500 l) por placa.

40

Materiales y Mtodos

Los huevos se mantuvieron en oscuridad, con un flujo de agua constante de 2,5

l/min y a una temperatura de 10 C. La fertilidad se defini como la relacin entre el
nmero de huevos que haban alcanzado el estado de ojo (pigmentacin ocular aparente) al
cabo de 4 semanas y el nmero total de huevos del recipiente.

3.11. Anlisis estadsticos

El anlisis estadstico se realiz con el paquete informtico SPSS para
WINDOWSTM (v. 5.0.1). En todos los test se tom un nivel de confianza del 95%,
considerndose como resultado estadsticamente significativo aquel con p<0,05
(probabilidad de que la hiptesis comprobada no sea correcta).
Los datos porcentuales fueron normalizados mediante transformacin angular con
la frmula A=seno -1(P1/2 ), donde P es un valor de probabilidad (entre 0 y 1).
Las comparaciones entre varios grupos se realizaron mediante ANOVA de una va,
recurrindose al test no paramtrico de la H de Kruskal-Wallis cuando no se dieron las
condiciones de normalidad u homocedasticidad. Cuando se encontraron diferencias
significativas entre los grupos se efectu el test de comparaciones mltiples de StudentNewman-Keuls para determinar entre qu grupos haba diferencias.
Para los anlisis de correlacin de variables se utiliz el coeficiente de Pearson. Las
variables que mostraron una correlacin estadsticamente significativa fueron estudiadas
mediante regresin lineal.
En los casos en que se sospech una relacin no lineal entre dos variables, se
emple el mtodo de regresin no lineal de Levenberg-Marquardt para estimar los
parmetros del modelo analizado.

El esquema del diseo experimental aqu descrito se encuentra en la Figura 3.

41

Materiales y Mtodos

Huevos

Semen
(canulacin)

ANLISIS DE LOS
PARMETROS
ESTNDAR

Soluciones
hipoosmticas

Osmolaridad
pH
Densidad
espermtica

1010mOsm/kg
mOsm
100
100mOsm/kg
mOsm
200mOsm/kg
mOsm
200
300 mOsm
300 mOsm/kg

Motilidad

Tiempos

Dilucin 1:3
Solucin A
(Yema)

Solucin B
(BSA)

Pruebas de
fertilidad

Adicin de DMSO
DMSO

30" 2' 5' 10' 15' 30'

Tiempo de equilibrado

Descongelacin

Becton
D ickinson

Congelacin en pajuelas
hasta -100 C
Anlisis por citometra
de flujo

Almacenamiento en
nitrgeno lquido (-196 C)

Figura 3. Esquema del diseo experimental descrito en Materiales y Mtodos.

42

4.RESULTADOS

4.1. Datos obtenidos

4.1.1. Semen fresco
Parmetros estndar:
Las muestras de semen obtenidas de los 21 machos mostraron resultados
heterogneos para los parmetros estndar (Tabla III). La motilidad fue el ms homogneo,
ya que todas las muestras obtuvieron una calificacin de 4 o 5, exceptuando un caso con
3,5 (muestra K).
La motilidad no ha sido tomada en consideracin para los clculos estadsticos,
debido a la poca precisin y a la subjetividad del mtodo empleado para determinarla. El
propsito de la determinacin de este parmetro fue el de descartar posibles muestras con
muy baja calidad.
La osmolaridad media fue de 301,19 mOsm/kg (Figura 4). El coeficiente de
variacin de 7,19% y la diferencia entre los valores mximo y mnimo, casi 100 unidades,
muestran

heterogeneidad

de

las

muestras respecto a este parmetro.

360
350
Osmolaridad (mOsm)

la

340
330
320

El pH de las muestras se situ, en

la mayora de los casos, cerca de la

310
300

neutralidad, ligeramente bsico, con 7,38

290
280

de media (Figura 5). Sin embargo, los pH

270
260
250
240

de algunas muestras resultaron ser cidos,

A B C D E F G H I J K L MN OP Q R S T U x
Animal

Figura 4. Representacin grfica de la

osmolaridad pH de cada una de las muestras
analizadas. La media y la desviacin estndar
son representadas por la ltima columna a la
derecha.

mientras

que

los

de

otras

fueron

claramente bsicos, siendo registrados un

valor mnimo de 6,20 y un mximo de
8,39. El coeficiente de variacin fue de
8,49%, similar al de la osmolaridad.

Resultados

Concentracin espermtica (clulas/ml)

9,0
8,5
8,0

pH

7,5
7,0
6,5
6,0
5,5
5,0

160x109
140x109
120x109
100x109
80x109
60x109
40x109
20x109
0x100

A B CDE FG H I J K L MNO PQ RS T U x

A B C D E F J K L Q R S T U x

Animal

Animal

Figura 6. Representacin grfica de la

densidad espermtica de cada una de las
muestras analizadas. La media y la desviacin
estndar son representadas por la ltima
columna a la derecha.

Figura 5. Representacin grfica del pH de

cada una de las muestras analizadas. La media
y la desviacin estndar son representadas por
la ltima columna a la derecha.

Se

obtuvo

un

valor

medio

de

densidad

espermtica

de

8,021010

espermatozoides/ml (Figura 6). La variabilidad entre muestras fue ms acusada en este

parmetro, con un coeficiente de variacin de casi 41%, registrndose valores extremos de
2,371010 y 1,561011 espermatozoides/ml. Este parmetro no pudo ser evaluado en 7
machos.
Fertilidad:
La fertilidad media del semen fresco fue de 67,46% (Tabla IV), con una desviacin
estndar de 23,6. El valor mximo obtenido fue 96,72%, mientras que el mnimo fue
31,67%.
Se ha visto que, en ocasiones, los duplicados correspondientes a cada muestra
difieren en 10 unidades porcentuales de diferencia o ms.
Tratamientos hipoosmticos:
Se analizaron muestras correspondientes a 16 machos. No obstante, se desecharon
los datos correspondientes a 6 de ellos, debido a problemas en la medicin. Por la misma
razn, algunos datos, correspondientes en su mayora a la medicin de 30 minutos, no
pudieron ser recogidos.
Las 10 muestras que se estudiaron fueron las correspondientes a los animales D, G,
I, J, L, N, Q, S, T y U (Figuras 8 y 8bis ).

44

Resultados

G
100

90

90

80

80

%Clulas
%Clulaspermeables
teidas

%Clulaspermeables
teidas
%Clulas

D
100

70
60
50
40
30

70
60
50
40
30

20

20

10

10

0
0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Tiempo (minutos)

Tiempo (minutos)

J
100

90

90

80

80

%Clulaspermeables
teidas
%Clulas

%Clulas
%Clulas
permeables
teidas

I
100

70
60
50
40
30

70
60
50
40
30

20

20

10

10

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

Tiempo (minutos)

N
100

90

90

80

80

%Clulas
%Clulas
permeables
teidas

100

70
60
50
40
30

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Tiempo (minutos)

%Clulas
teidas
%Clulas
permeables

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

70
60
50
40
30

20

20

10

10
0

0
0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Tiempo (minutos)

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Tiempo (minutos)

Figura 7. Representacin grfica de los resultados obtenidos por

citometra de flujo para cada animal analizado. Puede apreciarse
claramente el incremento en el porcentaje de clulas teidas al aplicar la
solucin 10 mOsm. En varios casos, la grfica no llega a los 15 o 30,
debido a que no se pudieron recoger los datos correspondientes a esos
tiempos. Las grficas correspondientes a los animales Q, S, T y U se
muestran en la Figura 7bis.

mOsm
1010mOsm/kg
100
mOsm
100 mOsm/kg
200
200
mOsm/kg
mOsm
300
mOsm/kg
300
mOsm

45

Resultados

S
100

90

90

80

80

%Clulas
teidas
%Clulas
permeables

%Clulas
permeables
%Clulas
teidas

Q
100

70
60
50
40
30

70
60
50
40
30

20

20

10

10
0

0
0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

100

100

90

90

80

80

%Clulas
teidas
%Clulas
permeables

%Clulas
%Clulas
permeables
teidas

70
60
50
40
30

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Tiempo (minutos)

Tiempo (minutos)

70
60
50
40
30

20

20

10

10
0

0
0

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Tiempo (minutos)

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Tiempo (minutos)

Figura 7 bis . Representacin grfica de los resultados obtenidos por

citometra de flujo para cada animal analizado (contina de la Figura 7).
Puede apreciarse claramente el incremento en el porcentaje de clulas
teidas al aplicar la solucin 10 mOsm. En varios casos, la grfica no llega
a los 15 o 30, debido a que no se pudieron recoger los datos
correspondientes a esos tiempos.

10mOsm/kg
mOsm
10
100
mOsm
100
mOsm/kg
200
200
mOsm/kg
mOsm
300
mOsm/kg
300 mOsm

Los resultados obtenidos con las soluciones 100 mOsm/kg, 200 mOsm/kg y 300
mOsm/kg fueron muy similares entre s (Tablas V, VI y VII; Figura 8). Se registr un
aumento, aparentemente lineal y no muy importante, en el porcentaje de clulas
permeables al ioduro de propidio, desde la primera medicin (30 segundos) hasta la ltima
(30 minutos). A los 30 segundos se detectaron muy pocas clulas permeables -ninguna
medicin llega al 5%-, con una media menor del 2% en los tres casos. A los 30 minutos el
mayor aumento se registra en la solucin 100 mOsm/kg (6,21% de diferencia entre
medias), alcanzando slo una muestra un valor mayor del 10% (animal T en soluciones
100 mOsm/kg y 200 mOsm/kg). La variabilidad entre diferentes machos no es muy

46

Resultados

100
90

%Clulas
permeables
% Clulas
teidas

80
70
60
50
40
30
20
10
0
1010mOsm/kg
mOsm

100
100mOsm/kg
mOsm

200
200mOsm/kg
mOsm

300
300mOsm/kg
mOsm

Tratamientos

Figura 8. Representacin grfica de las medias y desviaciones estndar de los

resultados obtenidos mediante citometra de flujo (porcentaje de clulas
permeables al ioduro de propidio), para cada uno de los diferentes tratamientos
aplicados. A la derecha se indica la clave de colores correspondiente a los cinco
tiempos de lectura de las muestras.

30"
2'
5'
10'
15'
30'

elevada dentro de cada tratamiento, ya que la mayora de las desviaciones estndar son
menores de 2,5, con un mximo de 3,15.
La solucin 10 mOsm/kg tiene un efecto radicalmente diferente (Tabla VIII; Figura
8). A los 30 segundos se detecta un porcentaje de clulas permeables sensiblemente mayor
(4,02% de media). En tiempos sucesivos, este porcentaje aumenta rpidamente (10,5% a
los 2 minutos y 37,77% a los 5 minutos) hasta estabilizarse a partir de los 10 minutos en
torno al 70%. La variabilidad entre diferentes animales para el mismo tiempo es muy
grande. Las desviaciones estndar para 30 segundos y 2 minutos son de 4,01 y 11,26,
respectivamente, pero llegan casi a 30 en el resto de los tiempos. Por ejemplo, los datos
obtenidos del macho J dan un 1,12% de clulas permeables a los 30 segundos y un 92% a
los 30 minutos, mientras que los del macho U dan un 5% y un 24,88% en los mismos
tiempos.

47

Resultados

4.1.2. Semen criopreservado

Fertilidad:
La fertilidad media de las muestras diluidas con la solucin A (yema de huevo) fue
de 28,89%, mientras que la de las muestras diluidas con la solucin B (BSA) fue de
24,86% (Tabla XIX). Las desviaciones estndar obtenidas para cada grupo fueron 15,83 y
12,61, respectivamente.
Las desviaciones estndar son algo menores que las correspondientes al semen
fresco, lo cual podra sugerir mayor homogeneidad. Sin embargo, las diferencias entre los
duplicados para una misma muestra son mayores que las encontradas en semen fresco.

4.2. Comparacin semen fresco - criopreservado

Se compararon los resultados obtenidos con semen fresco y con semen
criopreservado en cualquiera de las dos soluciones, para determinar posibles diferencias
entre ellos (Figura 9). La ANOVA de una va indic diferencias estadsticamente
significativas entre los tres grupos (p0,001). El procedimiento de comparaciones
mltiples de Student-Newman-Keuls (p0,05) revel que los dos grupos de semen
criopreservado tenan una fertilidad significativamente menor que la del semen fresco, pero
no se registraron diferencias entre ambos.

100
90
80
%Fertilidad

70
60
50
40
30
20
10
0
fresco

A huevo
yema de
Tratamientos
Tratamientos

BSA
B

s
Figura 9. Fertilidad media y desviaciones estndar correspondientes al semen fresco y
criopreservado utilizando yema de huevo (solucin A) y BSA (solucin B). La fertilidad del semen
fresco es significativamente mayor que la fertilidad de los dos grupos de semen criopreservado.

48

Resultados

4.3. Tratamientos hipoosmticos

4.3.1. Comparacin de grupos
Los datos obtenidos por citometra de flujo, correspondientes al porcentaje de
clulas permeables tras someter las muestras a 4 osmolaridades diferentes y 6 tiempos
distintos, fueron analizados de diferentes formas. Por una parte se compararon los
resultados de cada osmolaridad para cada uno de los diferentes tiempos. Posteriormente, se
compararon los resultados de cada tiempo para cada una de las diferentes osmolaridades.
El primer anlisis (Tabla X; Figura 10), no revel diferencias significativas entre
grupos en el tiempo 30. Sin embargo, en tiempos posteriores, el porcentaje de clulas
permeables en la solucin de 10 mOsm/kg result ser significativamente mayor al resto de
las osmolaridades. En ninguno de los tiempos se encontraron diferencias significativas
entre las muestras diluidas en solucin 100 mOsm/kg, 200 mOsm/kg y 300 mOsm/kg.
La comparacin entre tiempos (Tabla XI; Figura 11), revel la existencia de tres
periodos diferentes en la solucin 10 mOsm/kg, cada uno con porcentajes de clulas
permeables significativamente mayor que el anterior. El primer periodo corresponde a los
tiempos de 30 y 2, el segundo a los 5 y el tercero a 10, 15 y 30. En las otras
soluciones hiposmticas no se definen estos perodos. El caso ms homogneo es el de la
solucin 200 mOsm/kg, en el que slo hay diferencias significativas entre las clulas
permeables a 30 y 30.

4.3.2. Anlisis de regresin clulas permeables-tiempo

El propsito inicial de este anlisis fue el de determinar si el incremento en la
proporcin de clulas permeables en una solucin hipoosmtica dada tena una relacin
lineal con el tiempo o si se ajustaba a otro tipo de cintica.
Inicialmente se utilizaron las medias de cada tratamiento. Se encontr una relacin
lineal entre los valores medios del porcentaje de clulas permeables y el tiempo, para las
soluciones de 100 mOsm/kg, 200 mOsm/kg y 300 mOsm/kg, con un coeficiente de
determinacin (r2 ) de 0,8605, 0,7294 y 0,9524, respectivamente. Sin embargo, esta relacin
no fue significativa en el caso de la solucin 10 mOsm/kg (r2 =0,6117; p>0,05) (Tabla XII).

49

Resultados

30"

2'

100

70
60
50
40
30
20

70
60
50
40
30
20
10

0
10

100

200

300

10

Osmolaridad
Osmolaridad
(mOsm/kg)
(mOsm/kg)
Osmolaridad
(mOsm)

10'

100

100

90

90

80

80

%Clulas
%Clulaspermeables
teidas

%Clulaspermeables
teidas
%Clulas

70
60
50
40
30

100
200
Osmolaridad
(mOsm/kg)
Osmolaridad
(mOsm)

300

100

200

300

70
60
50
40
30

20

20

10

10
0

0
10

100

200

10

300

Osmolaridad
Osmolaridad
(mOsm/kg)
(mOsm)
Osmolaridad
(mOsm/kg)

Osmolaridad
(mOsm/kg)
Osmolaridad
(mOms)

30'

100

100

90

90

80

80

%Clulas
%Clulaspermeables
teidas

%Clulas
%Clulaspermeables
teidas

80

10

15'

90

80

%Clulas
%Clulaspermeables
teidas

%Clulas
%Clulaspermeables
teidas

90

5'

100

70
60
50
40
30

100

200

300

70
60
50
40
30

20

20

10

10

10

100

200

Osmolaridad
(mOsm/kg)
Osmolaridad
(mOsm)

300

10

Osmolaridad
(mOsm)
Osmolaridad
(mOsm/kg)

Figura 10. Representacin de los valores medios y desviaciones estndar correspondientes a los
datos obtenidos por citometra de flujo. Se comparan las osmolaridades dentro de cada tiempo. Las
diferencias significativas entre osmolaridades se sealan con letras, sobre el eje horizontal superior.
Hay diferencias significativas entre dos grupos si estos no comparten al menos una letra.

50

Resultados

100
100 mOsm/kg
mOsm

100

100

90

90

80

80

%Clulas
%Clulaspermeables
teidas

%Clulas
permeables
%Clulas
teidas

10
10 mOsm/kg
mOsm

70
60
50
40
30

c
a

c
b

d
b

30"

2'

5'

10'

15'

30'

70
60
50
40
30

20

20

10

10
0

0
30"

2'

5'

10'

15'

30'

Tiempo

Tiempo

200
200mOsm/kg
mOsm

b
a

b
a

b
a

b
a

300
300 mOsm/kg
mOsm a

100

100

90

90

80

80

%Clulas
permeables
%Clulas
teidas

%Clulaspermeables
teidas
%Clulas

70
60
50
40
30

b
a

b
a

b
a

2'

5'

10'

15'

30'

70
60
50
40
30

20

20

10

10

0
30"

2'

5'

10'

Tiempo

15'

30'

30"

Tiempo

Figura 11. Representacin de los valores medios y desviaciones estndar correspondientes a los
datos obtenidos por citometra de flujo. Se comparan los tiempos dentro de cada osmolaridad. Las
diferencias significativas entre tiempos se sealan con letras, sobre el eje horizontal superior. Hay
diferencias significativas entre dos grupos si estos no comparten al menos una letra.

Debido a la similitud de la grfica correspondiente a 10 mOsm/kg (Figura 7 y 7bis )

con la de una curva sigmoide, se sometieron los datos a un anlisis de regresin no lineal,
K
segn el modelo definido por la frmula y =
(n- rx)
1+ e
donde K es el valor de la asntota superior de la curva, n un nmero relacionado con su
punto de inflexin y r la tasa de incremento exponencial. En nuestro caso, la variable
independiente (x) es el tiempo en minutos, y la dependiente (y) el porcentaje de clulas
permeables.
La regresin no lineal devolvi los valores K=69,49, n=2,82 y r=0,59. El modelo,
69, 49
para los tratamientos 10 mOsm/kg qued y =
( 2 ,82 -0,59x)
1+ e
2
con un buen ajuste (r =0,9938; p0,05).

51

Resultados

Se comprob la validez del modelo (p0,05) para las medias de los tratamientos de
las otras tres osmolaridades. En los tres casos se obtuvo un ajuste significativo, con valores
de r2 mejores que los de la regresin lineal (Tabla XII; Figura 12).
Los anlisis de regresin se repitieron individualmente con los datos de cada animal
para comprobar la validez y el ajuste de los modelos. El modelo sigmoide tuvo mejores
resultados tanto en el nmero de casos vlidos como en los coeficientes de determinacin

y=

100
100 mOsm/kg
mOsm

69,4943
1+ e(0,5852- 2,8218x)

r2 =0,9662

100

10

90

80

%Clulas
permeables
%Clulas
teidas

%Clulas
%Clulas
permeables
teidas

10 mOsm/kg
10
mOsm

70
60
50
40
30
20
10

y=

r2 =0,9318

(0,9146-0,1214x)

7
6
5
4
3
2
1

0
0

10

15

20

25

30

10

Tiempo (minutos)

200
200mOsm/kg
mOsm

y=

15

20

25

30

Tiempo (minutos)

300
300mOsm/kg
mOsm

4,4566

r =0,8473

1 + e(0,2448 -0,1440x)

10

10

%Clulas
permeables
%Clulas
teidas

%Clulas
permeables
%Clulas
teidas

8,5452
1+ e

7
6
5
4
3
2
1

y=

11,2777
1+ e(1,3242-0,0598x)

r 2=0,9535

7
6
5
4
3
2
1

0
0

10

15

20

Tiempo (minutos)

25

30

10

15

20

25

30

Tiempo (minutos)

Figura 12. Ajuste de los datos obtenidos por citometra de flujo para el modelo sigmoide. Se
muestran las grficas resultantes del anlisis de regresin no lineal de los valores medios del
porcentaje de clulas permeables al ioduro de propidio en cada tratamiento. En cada grfica se ha
superpuesto la curva de regresin sobre los puntos correspondientes a los datos experimentales. En
la parte superior aparecen la ecuacin de la curva y su coeficiente de determinacin. La validez del
modelo fue comprobada en los cuatro casos (p0,05).

52

Resultados
hallados (Tabla XIII). En 26 de los 40 casos se obtuvo r2 >0,9 con el modelo sigmoide.
Slo en 5 ocasiones se encontr un valor menor de 0,7. En el modelo lineal (Tabla XVI),
se encontr r2 >0,9 en slo 9 casos y r2 <0,7 en 16 casos. El modelo sigmoide fue vlido en
todos los casos, mientras que el modelo lineal no lo fue en 17 casos.

4.4. Anlisis de correlacin

El objetivo de este anlisis fue la bsqueda de correlacin entre los resultados de
los tres experimentos de fertilidad (fresco, solucin A y solucin B) y los obtenidos del
anlisis de los parmetros estndar (excepto motilidad) y de la citometra de flujo.
Se encontraron pocas correlaciones lineales entre las diferentes variables, y los
coeficientes de determinacin mostraron un ajuste ms bien pobre en la mayora de los
casos. Los coeficientes de correlacin calculados son muy heterogneos, incluso con
signos diferentes para correlaciones que se supondran de igual signo.
No se encontr relacin lineal entre los resultados de fertilidad del semen fresco y
los parmetros estndar del semen (Tabla XV). En cambio, s que se encontr relacin
lineal positiva entre la fertilidad del semen criopreservado, tanto con la solucin A como
con la B, y el pH, aunque no muy importante (r2 =0,3390 y r2 =0,2548, respectivamente).
Tambin hay relacin lineal positiva entre la fertilidad del semen criopreservado con la
solucin A y la densidad espermtica (r2 =0,5160).
La matriz de correlaciones entre los resultados de fertilidad (Tabla XVI), muestra la
falta de relacin lineal entre la fertilidad del semen fresco y la del semen criopreservado.
Se encontr relacin lineal positiva entre la fertilidad del semen criopreservado con la
solucin A y la fertilidad del semen criopreservado con la solucin B (r2 =0,4976).
El anlisis de correlacin lineal entre la fertilidad y los resultados de la citometra
de flujo dio pocos resultados significativos. Para la solucin 10 mOsm/kg (Tabla XVII), se
encontr correlacin entre la fertilidad del semen fresco y el porcentaje de clulas
permeables a los 30 (r2 =0,7779; relacin lineal negativa). Tambin, aunque con peor
ajuste, hay relacin lineal positiva entre la fertilidad del semen criopreservado con la
solucin A y los datos de los tiempos 2 y 5 (r2 =0,4512 y r2 =0,4760, respectivamente).
Para la solucin 100 mOsm/kg (Tabla XVIII), se encontraron correlaciones
positivas entre la fertilidad del semen criopreservado con la solucin A y los tiempos 2,

53

Resultados
10 y 30 y entre la fertilidad del semen criopreservado con la solucin B y el tiempo 2 (r2
de 0,7536, 0,5845, 0,7274 y 0,6347, respectivamente).
Para la solucin 200 mOsm/kg (Tabla XIX) slo correlacion la fertilidad del
semen criopreservado con la solucin A y el tiempo 30 (r2 =0,6317; relacin positiva).
Para la solucin 300 mOsm/kg (Tabla XX) slo correlacion la fertilidad del semen
criopreservado con la solucin A y el tiempo 30 (r2 =0,4402; relacin negativa).
Debido a que la grfica de la
2

y=-48,8266*x +707,0589*x-2472,9765

r =0,4155

100

sugera una relacin cuadrtica, se llev

90

a cabo un anlisis de regresin no lineal

80
%Fertilidad fresco

fertilidad del semen fresco frente al pH

70

de los resultados de fertilidad del semen

60
50

fresco y criopreservado. El modelo

40

result vlido slo para el caso del

30
20

semen fresco (p<0,01; Figura 13). Sin

10
0
5,6 5,8 6,0 6,2 6,4 6,6 6,8 7,0 7,2 7,4 7,6 7,8 8,0 8,2 8,4 8,6 8,8
pH

Figura 13. Curva de regresin de los datos de pH

frente a los de fertilidad del semen fresco. Se han
superpuesto los puntos correspondientes a los
datos experimentales sobre la curva. En la parte
superior aparece la ecuacin de la curva y su
coeficiente de determinacin. Se comprob la
validez del modelo (p0,05).

54

embargo,
determinacin

el

coeficiente
no

fue

muy

de
alto

(r2 =0,4155). En la grfica obtenida se

observa un punto de inflexin a un pH
de 7,24.

5. DISCUSIN

5.1. Parmetros estndar y fertilidad

En la reproduccin de telesteos, la calidad de una muestra de semen ha sido
evaluada tradicionalmente mediante el anlisis de los llamados parmetros estndar. De
entre ellos, el ms utilizado ha sido la motilidad. Sin embargo, la fertilidad del semen
depende de numerosos factores, muchos de los cuales no estn relacionados directamente
con estos parmetros. Esto ha llevado a algunos autores a dudar de su utilidad (Stoss y
Holtz, 1983a; Piironen, 1987; Billard, 1990a; Gwo et al., 1993; Herrez et al., 1993;
Piironen, 1994; Babiak et al., 1995; Rana, 1995b).
Aunque otros autores han comprobado en peces la existencia de correlacin entre la
motilidad y la fertilidad del semen, tanto fresco como criopreservado (Moccia y
Munkittrick, 1987; Otha et al., 1995b; Lahnsteiner, 1996c), ste y otros parmetros no
pueden tomarse como indicadores totalmente fiables de la calidad seminal, ya que los
coeficientes de correlacin obtenidos no son muy altos, indicando la existencia de
variables que no son tenidas en cuenta. Por lo tanto, las estimaciones de calidad mediante
estos parmetros slo pueden ser parciales.
La determinacin de la motilidad en este trabajo no tena propsito predictivo de la
fertilidad, ya que el procedimiento empleado es altamente subjetivo y poco preciso. Su
utilidad fue la de identificar muestras de mala calidad, como indicador negativo (Stoss y
Holtz, 1983a). Como se ha visto, todas las muestras analizadas tuvieron buenos resultados
de motilidad, por lo que ninguna de ellas fue descartada para su posterior estudio.
El valor medio de la densidad espermtica es mayor que el registrado por otros
autores (Scott y Baynes, 1980; Piironen y Hyvrinen, 1983b; Piironen, 1994; Ciereszko y
Dabrowski, 1993, 1994; Suquet et al., 1994), los cuales le sitan en torno a 1010 clulas/ml.
Hay que tener en cuenta que estos trabajos se refieren a semen obtenido por ordeo, lo que
hace suponer que las muestras analizadas podran haber sido diluidas con orina (Quintans,
1997). As observamos que en estudios previos realizados en esta Universidad, en los que
se ha empleado la canulacin para la extraccin de semen, los resultados son similares a
los obtenidos en este trabajo (Quintans, 1997; Cabrita, 1997).

Discusin

La osmolaridad observada en nuestras muestras coincide con datos observados por

otros autores, cercanos a 300 mOsm/kg. Slo Piironen (1994) indica un valor de 200
mOsm/kg. Muchos de los datos existentes en la bibliografa se refieren a variedades
distintas de O. mykiss, por lo que las diferencias en ste u otros parmetros pueden
considerarse normales. Por otra parte, las diferencias se pueden atribuir tambin a la
contaminacin con orina de las muestras obtenidas por ordeo.
En cambio, el pH es el dato ms dispar, ya que la mayor parte de los trabajos
consultados dan valores medios en torno a 8, ms bsicos que el sealado aqu (Scott y
Baynes, 1980; Piironen y Hyvrinen, 1983b; Billard y Cosson, 1993; Ciereszko y
Dabrowski, 1993, 1994; Piironen, 1994; Suquet et al., 1994). Este dato es importante, ya
que parece que los espermatozoides requieren un pH bsico en los conductos seminales
para adquirir la capacidad de movimiento (Morisawa et al., 1988) y que un pH menor de
7,5 impide la motilidad (Billard y Cosson, 1993). En este trabajo, el valor medio obtenido
es de 7,38, con varias muestras muy por debajo de 7. Todas las muestras tenan buena
motilidad a pesar de todo. Posiblemente esto sea debido a que la variedad con la que se ha
trabajado est habituada a un ambiente distinto a las utilizadas por otros autores, y sea
tolerante a medios ms cidos, ya que Quintans (1997), trabajando con animales de la
misma zona, obtuvo tambin valores de pH bajos sin apreciar una disminucin en la
motilidad. En esta lnea, Mohr et al. (1985) sugieren que los peces que viven en aguas
cidas sufren un proceso de aclimatacin. En animales no aclimatados, la motilidad de sus
espermatozoides es nula a un pH bajo, pero si su hbitat se acidifica, ocurren adaptaciones
fisiolgicas poco conocidas, una de las cuales es el aumento de la tolerancia del esperma a
medios cidos, que se traduce en la adquisicin de motilidad a un pH menor.
La fertilidad es el nico ndice fiable de la calidad de una muestra de semen. Los
resultados de las pruebas de fertilidad para el semen fresco no fueron muy altos, ya que,
como media, menos del 70% de los huevos llegaron al estado de ojo. Esto podra deberse a
que las pruebas se realizaron hacia el final del perodo reproductor, cuando la calidad de
los huevos comienza a disminuir.
Durante el proceso de criopreservacin, los espermatozoides sufren numerosas
agresiones, lo cual causa una fertilidad menor despus de la descongelacin (Piironen,
1994; Herrez et al., 1996). En este trabajo, la fertilidad del semen fresco ha sido
claramente superior a la del semen criopreservado, cuya fertilidad media estuvo por debajo

56

Discusin

del 30%, tanto cuando se emple yema de huevo como BSA. La fertilidad del semen
fresco es ms del doble que la del semen criopreservado.
En cambio, no se han encontrado diferencias entre el uso de yema de huevo o BSA
como crioprotector. Varios autores han incrementado la fertilidad del semen
criopreservado de salmnidos utilizando yema de huevo en el diluyente (Alderson y
Macneil, 1984; Baynes y Scott, 1987; Cabrita, 1997; Cabrita et al., 1997). Sin embargo, a
veces la accin crioprotectora de la yema de huevo no revierte en una mejor fertilidad,
dependiendo de numerosos factores, como son el diluyente empleado, la especie o el
mtodo de criopreservacin (Piironen, 1993, 1994; Cabrita, 1998). Cabrita et al. (1998),
trabajando con la misma variedad de trucha arco-iris, observaron que la mayor proteccin
de la membrana plasmtica proporcionada por la yema de huevo, no se reflejaba en los
datos de fertilidad y sugirieron que, probablemente, la interaccin de la yema con
componentes del plasma seminal y con los huevos interfiere en el proceso de fertilizacin.
La BSA ha tenido menos xito en trabajos realizados con salmnidos. Se han
obtenido buenos resultados combinndolo con otros crioprotectores, como promina.
Aunque por s solo la BSA ofrece un buen grado de proteccin de las membranas, no se
observa una mejora significativa en la fertilidad respecto al semen no tratado con este
agente (Stoss y Holtz, 1983a; Billard, 1988; Lahnsteiner et al., 1992a; Lahnsteiner, 1996c,
Cabrita et al., 1999b).
Los resultados obtenidos en osmolaridad, pH, recuento espermtico y fertilidad han
sido, en general, muy diferentes de unas muestras a otras. Hay que tener en cuenta que esta
heterogeneidad se debe tanto a que las muestras se extrajeron de distintos machos, como a
que los experimentos se repartieron en varias fechas diferentes, aproximadamente entre el
15 de febrero y el 15 de marzo. Diversos autores indican la existencia de una gran
variabilidad entre los individuos de la misma especie a lo largo del perodo reproductor
(Legendre y Billard, 1980; Piironen y Hyvrinen, 1983b; Stoss y Holtz, 1983b; Piironen,
1994; Billard et al., 1995a). Asimismo, estos autores recomiendan recoger las muestras a
mediados del perodo reproductor y mezclar el semen de varios machos, con el fin de
reducir esta variabilidad. Las fechas de recogida citadas anteriormente pudieron ser, hasta
cierto punto, tardas. En el diseo experimental de este trabajo no se contempl la mezcla
de semen de varios machos para disminuir la variabilidad, ya que se requeran los datos de
individuos aislados para realizar los anlisis de correlacin. El hecho de que la calidad de
las muestras sea heterognea es beneficioso para realizar un estudio de este tipo. En el caso

57

Discusin

de los resultados de las fecundaciones hay que tener en cuenta, adems, la actuacin de dos
factores sobre los que se tiene poco control: la calidad de los huevos y la interaccin entre
gametos. La calidad de los huevos tambin vara mucho entre hembras y entre diferentes
fechas de extraccin.
Hay que incidir especialmente en la disimilitud entre los duplicados de los anlisis
de fertilidad. Estas diferencias son bastante considerables en algunos casos, sobre todo en
semen criopreservado. La causa es, posiblemente, la calidad variable de los huevos
utilizados y de las muestras de semen. En las fecundaciones se emplearon mezclas de
huevos de tres hembras distintas, para evitar en lo posible el efecto de la variabilidad entre
hembras (Rana, 1995a). Sin embargo, la calidad de los huevos fue, en general, heterognea
y poco satisfactoria, apareciendo frecuentemente restos de corion y huevos inmaduros. Las
pruebas de fertilidad del semen de peces son bastante vulnerables a errores cuando la
calidad de los huevos es heterognea, ya que no es posible conocer la viabilidad de los
huevos. Debido a esta circunstancia, en unas pruebas podran utilizarse ms huevos viables
que en otras, sin saberlo. Esta sera la causa principal de que dos grupos de huevos,
fecundados con la misma muestra de semen y sometidos a las mismas condiciones de
incubacin, dieran resultados de fertilidad muy diferentes. Adems, en las fecundaciones
con semen criopreservado, algunos duplicados tuvieron que hacerse en fechas diferentes,
aumentando la importancia del factor representado por los huevos.
Aunque se ha dicho que los parmetros estndar no se consideran fiables para
determinar la fertilidad de una muestra de semen, en este trabajo se han encontrado varias
correlaciones entre estas variables. No obstante, estas correlaciones no son muy fuertes.
Entre la fertilidad del semen fresco y el pH se encontr una relacin cuadrtica.
Esto puede explicarse considerando que hay un mrgen ptimo de tolerancia a valores de
pH. Los espermatozoides de salmnidos sufren seguramente un proceso de maduracin
metablica y funcional en los conductos seminferos, dependiente del pH del fluido
seminal formado en estos conductos (Morisawa y Morisawa, 1986, 1988; Miura et al.,
1992). Los resultados obtenidos indican la existencia de un rango ptimo de pH para la
adquisicin de la motilidad, que en este caso estara en torno a 7,24. Por encima o por
debajo de este rango, la calidad seminal disminuye. Estos valores son ms bajos que los
calculados por Morisawa y Morisawa (1988) como ideales para la maduracin de los
espermatozoides de O. mykiss.

58

Discusin

En cambio, la relacin entre la fertilidad del semen criopreservado y el pH es lineal.

Lahnsteiner et al. (1996) encontr una relacin lineal negativa entre la fertilidad del semen
criopreservado de O. mykiss y el pH. Este dato entra en contradiccin con los resultados
obtenidos, ya que aqu se trata de una relacin positiva. Hay que tener en cuenta que
Lahnsteiner et al. citan en su trabajo valores de pH entre 8 y 8,6, mientras que en este
trabajo los valores extremos han sido 6,20 y 8,36. Se podra aventurar que en un rango de
pH ms bajo la relacin es positiva, mientras que cuando se trabaja con rangos de pH altos
la relacin es negativa. El que la correlacin sea lineal y no cuadrtica, como ocurre con el
semen fresco, puede deberse a que en el proceso de criopreservacin influyen factores que
alteran esta relacin. Adems, el bajo coeficiente de determinacin obtenido entre el pH y
la fertilidad y los diferentes tipos de correlacin encontrados segn se tratase de semen
fresco o congelado (cuadrtica o lineal) podran explicarse por la existencia de otros
factores desconocidos, que no se han tenido en cuenta en la ecuacin, ya que la
maduracin seminal en trucha plantea an numerosos interrogantes.
A partir de estos datos no puede, por tanto, deducirse que el pH sea el factor
responsable de la maduracin de los espermatozoides, ni de la fertilidad del semen. Se sabe
que la adquisicin del potencial necesario para desarrollar motilidad es dependiente no slo
del aumento del pH, sino tambin de la concentracin de bicarbonato y K+ en el fluido
seminal. Pero los cambios sufridos por los espermatozoides durante su trnsito a travs de
los espermiductos podran trascender a la adquisicin de la motilidad y depender de ms
factores. Por ejemplo, Loir et al. (1990) detectaron lipoprotenas en el plasma seminal que
podran modificar la composicin lipdica de las membranas espermticas y afectar por lo
tanto de esta forma a la funcionalidad y resistencia de la membrana plasmtica.
Un resultado bastante sorprendente es la correlacin entre la fertilidad del semen
criopreservado con la solucin A y la densidad espermtica. En principio, resultara lgico
encontrar una relacin entre la densidad espermtica y la fertilidad de una muestra, ya que
al aumentar el nmero de espermatozoides por unidad de volumen, aumentara tambin la
probabilidad de fecundar un huevo. Sin embargo, hay que tener en cuenta que se han
utilizado espermatozoides en exceso en todas las pruebas (del orden de 108
espermatozoides/huevo). Para obtener buenos resultados de fertilidad, se recomienda
utilizar hasta 106 clulas/huevo para semen fresco, y hasta 107 clulas/huevo para semen
criopreservado (Stoss y Holtz, 1981; Erdahl y Graham, 1987; Piironen, 1987; Billard,
1988, 1992; Ciereszko y Dabrowski, 1994; Lahnsteiner et al., 1995, 1996a; Lahnsteiner et

59

Discusin

al., 1996d). Con las concentraciones empleadas aqu, las diferencias entre muestras pierden
importancia. Por lo tanto, la correlacin encontrada aqu podra no ser real, sino debida
ms bien a la accin de variables no tenidas en cuenta en el modelo.
En cuanto al anlisis de correlacin realizado a los tres datos de fertilidad (semen
fresco, criopreservado con la solucin A y criopreservado con la solucin B), la ausencia
de correlacin entre el semen fresco y el criopreservado muestra el hecho de que durante el
proceso de criopreservacin intervienen factores que no son revelados por las pruebas de
fertilidad en fresco (velocidad de congelacin y descongelacin, interaccin entre
crioprotectores, modificaciones de la membrana espermtica, etc.). Por lo tanto, ni siquiera
este parmetro, considerado el nico vlido para calificar una muestra seminal, puede
predecir la fertilidad postdescongelacin. Otros autores tampoco han encontrado
correlacin entre la fertilidad del semen antes y despus de la criopreservacin (Maisse et
al., 1988).
La correlacin lineal encontrada entre los dos grupos de semen criopreservado es
comprensible, ya que fueron sometidos al mismo proceso de congelacin, variando
nicamente el estabilizador de membrana utilizado. Sin embargo, el coeficiente de
correlacin obtenido no es muy alto, teniendo en cuenta que no parece haber diferencias
significativas entre ambas soluciones.
La calidad seminal no depende nunca de un solo factor, sino de la combinacin de
varios, por lo que, como se ha confirmado con estos resultados, es muy difcil predecir la
fertilidad de una muestra, tanto fresca como criopreservada, a partir de uno slo de estos
parmetros.

5.2. Tratamientos hipoosmticos

La citometra de flujo es una herramienta muy eficaz para el anlisis de ciertas
caractersticas con un gran nmero de clulas. En este trabajo se ha utilizado para
cuantificar el porcentaje de espermatozoides marcados con ioduro de propidio tras el paso
por una solucin hipoosmtica. Debido a que el ioduro de propidio no traspasa membranas
celulares, se puede relacionar el porcentaje de clulas permeables con el porcentaje de
clulas con la membrana plasmtica daada (Mrin et al., 1993; Ogier et al., 1996, 1997;
Cabrita et al., 1998). Los experimentos realizados con distintas soluciones hipoosmticas y
a diferentes tiempos han demostrado que el porcentaje de clulas permeables es

60

Discusin

directamente proporcional al tiempo e inversamente proporcional a la osmolaridad del

medio (Mrin et al., 1993; Cabrita, 1997; Cabrita et al., 1998, 1999).
Uno de los objetivos de este trabajo fue el anlisis del comportamiento de las
clulas en soluciones hipoosmticas con el fin de valorar la funcionalidad de la membrana
plasmtica. Para ello se relacionaron osmolaridades y tiempos con el porcentaje de clulas
permeables. Como cabra esperar, se registr un rpido aumento del nmero de clulas
permeables en las muestras diluidas en la solucin 10 mOsm. Los espermatozoides sufren
un fuerte choque osmtico en esta solucin, lo cual se traduce en daos en la membrana
plasmtica por la entrada brusca de agua en la clula. La mayora de las muestras diluidas
en esta solucin muestran una proporcin considerable de clulas permeables antes de 10
minutos. Tras ese tiempo no se observa ya un aumento significativo del porcentaje de
clulas permeables (considerando los valores medios).
En cambio, con las otras soluciones ensayadas no se observa este rpido aumento
de clulas permeables. Pocas muestras superan el 10% a los 30 minutos. El estudio de los
datos medios muestra que la diferencia entre los datos de los tiempos extremos, 30 y 30,
es muy pequea. La solucin 100 mOsm/kg parece ser algo ms agresiva, ya que se
observan varias diferencias significativas entre los grupos de tiempos.
Debido a que las osmolaridades registradas por diversos autores para el semen de
salmnidos se encuentran entre 250 mOsm/kg y 300 mOsm/kg, se podra suponer que las
soluciones ms altas no provocasen un aumento perceptible en el porcentaje de clulas
permeables. En este estudio, el valor medio de la osmolaridad del semen fue de 301,19
mOsm/kg, por lo que la solucin 300 mOsm/kg fue prcticamente isoosmtica. El aumento
en el porcentaje de clulas permeables en las soluciones 200 mOsm/kg y 300 mOsm/kg es
slo estadsticamente significativo al comparar los grupos 30 y 30 (tambin entre 2 y
30 en la 300 mOsm/kg). Esto indica una buena resistencia a estas soluciones, reflejando
que la funcionalidad de la membrana permanece intacta durante un largo tiempo en estas
soluciones e indicando, por tanto una buena calidad de las muestras.
Las diferencias entre la solucin 10 mOsm/kg y el resto son corroboradas por las
comparaciones entre los datos de las cuatro osmolaridades en cada tiempo. La ausencia de
diferencias significativas a los 30 segundos se justifica considerando que, en tan poco
tiempo, los efectos del choque hipoosmtico son an limitados. No obstante, la media de la
solucin 10 mOsm/kg es ya superior a las del resto de las soluciones.

61

Discusin

Una cuestin muy interesante es el tipo de relacin entre el nmero de clulas

permeables y el tiempo. Aunque a la vista de las grficas de las tres soluciones de
osmolaridad mas elevada se podra considerar una relacin lineal, no se puede opinar lo
mismo con la 10 mOsm/kg. En este caso, las grficas obtenidas son similares a curvas
sigmoides. Esta curva se caracteriza por tener una regin inicial con poca pendiente, a la
que sigue una regin en la que se produce un aumento exponencial, que decrece hasta
alcanzar una meseta. En biologa hay multitud de procesos que se rigen por el modelo de
curva sigmoide, por lo que pareca razonable comprobar su validez con los datos
obtenidos. Esta hiptesis ha resultado ser mucho ms slida, ya que es vlida tanto para los
datos medios como para cada muestra individual y para todas las osmolaridades,
obtenindose en casi todos los casos un coeficiente de correlacin alto.
Curry y Watson (1994) sugieren en mamferos la existencia de subpoblaciones con
diferente resistencia al choque osmtico en una muestra de semen. La grfica sigmoide se
puede analizar en funcin a la existencia de estas subpoblaciones, lo cual puede ayudar a
interpretar los datos obtenidos con el citmetro.
La zona de incremento exponencial de la grfica se corresponde con el momento en
el que una poblacin de clulas alcanza su lmite de resistencia al cambio de osmolaridad
producido en el medio. Si una clula tiene una membrana plasmtica funcional, se
producen los trasvases de agua y solutos adecuados para adaptarse a la nueva situacin. Si
esta funcin no se lleva a cabo con la suficiente eficiencia, la membrana puede sufrir un
dao suficiente para convertirse en permeable al ioduro de propidio. La pendiente de la
zona de aumento rpido indica la heterogeneidad de la poblacin de clulas daadas. Una
poblacin homognea se refleja en una pendiente grande, ya que todas las clulas tienen un
grado de resistencia similar, y por ello se convierten en permeables prcticamente al
mismo tiempo (Figura 14, Grfica 10 mOsm/Kg)). Una pendiente pequea y prolongada
indica, en cambio, una poblacin heterognea, ya que unas clulas se daan antes que otras
(Figura 15). Al llegar a la meseta, las clulas que quedan sin teir son aquellas que mejor
han resistido el medio al que ha sido sometida la muestra, es decir, aquellas cuya
membrana plasmtica funciona ms eficientemente.
El porcentaje de clulas permeables a los 30 segundos en las osmolaridades 100
mOsm/kg, 200 mOsm/kg y 300 mOsm/kg correspondera a las clulas con membrana
plasmtica daada ya antes de la dilucin en la solucin hipoosmtica (Figura 14, Grfica
200 mOsm/kg). Estas soluciones son osmticamente poco agresivas, y el tiempo

62

Discusin

transcurrido es escaso, por lo que es razonable pensar que la presencia de clulas

permeables no se deba al tratamiento, sino a la condicin previa de la muestra de semen.
En la solucin 10 mOsm/kg, el porcentaje de clulas no permeables cuando se ha
alcanzado la meseta de la grfica (10 minutos trabajando con los datos medios)
corresponde a una subpoblacin de clulas altamente resistente al choque hipoosmtico
(probablemente tambin la poblacin mas resistente a la congelacin), mientras que el
porcentaje de clulas permeables corresponde a la subpoblacin sensible al choque
hipoosmtico (ms las clulas daadas ya antes del tratamiento) (Figura 14, grfica 10
mOsm/kg). Debido a que esta solucin es osmticamente muy agresiva, todas las clulas
sensibles resultan daadas en poco tiempo, quedando sin teir slo aquellas que son muy
resistentes al choque osmtico. Estas clulas sern precisamente las que tengan la
membrana plasmtica en mejores condiciones de funcionalidad.
En las soluciones 100 mOsm/kg, 200 mOsm/kg y 300 mOsm/kg (Figura 14, grfica
200 mOsm/kg), el incremento en el porcentaje de clulas permeables hasta alcanzar la
meseta corresponde a una subpoblacin hipersensible, con la membrana plasmtica muy
dbil. En estas soluciones, el efecto del la osmolaridad es poco importante, por lo que la
200
200 mOsm/kg
mOsm/kg

10
10 mOsm
mOsm/kg
100

80
70
60

Subpoblacin
sensible

50
40
30

9
%Clulas permeables

90
%Clulas permeables

10

Subpoblacin
resistente

8
7
6

Subpoblacin
de clulas
hipersensibles

5
4
3

20

10

Subpoblacin de
clulas ya
daadas

0
0

10

15

20

Tiempo (minutos)

25

30

10

15

20

25

30

Tiempo (minutos)

Figura 14. Grficas ideales correspondientes a una muestra de semen diluida en las soluciones 10
mOsm/kg y 200 mOsm/kg. En la curva correspondiente a la solucin 10 mOsm/kg se indican la
subpoblacin resistente (verde) y la subpoblacin sensible (rojo) al choque osmtico. En la curva
correspondiente a la solucin 200 mOsm/kg se indican la subpoblacin de clulas permeables ya
antes del tratamiento (azul) y la subpoblacin de clulas hipersensibles (rojo). Las clulas
hipersensibles tienen la membrana plasmtica muy dbil, que es daada simplemente por la
dilucin, no por el choque hipoosmtico.
La gran pendiente de la curva correspondiente a la solucin 10 mOsm/kg (en tan slo 5 minutos
alcanza la meseta) indica la existencia de una poblacin homognea de clulas sensibles al choque
hipoosmtico ya que todas las clulas se daan prcticamente al mismo tiempo.

63

Discusin

aparicin de ms clulas permeables se debera simplemente al efecto de la dilucin de la

muestra, ms que al choque hipoosmtico.
Se puede hacer una valoracin de los datos obtenidos en funcin de las clulas
viables y las no viables. Utilizando los valores medios, habra algo menos del 2% de
clulas no viables (clulas permeables a los 30 en las soluciones 100 mOsm/kg, 200
mOsm/kg o 300 mOsm/kg). Alrededor del 30% seran clulas viables con membranas
plasmticas muy resistentes (clulas no permeables a los 10 en la solucin 10 mOsm). El
resto, algo menos del 70%, seran clulas con membranas plasmticas ms dbiles. De
estas ltimas, una fraccin, que podramos calcular alrededor del 7% del total (la diferencia
entre el porcentaje de clulas permeables en la meseta y el porcentaje de clulas
permeables a los 30, en las soluciones 100 mOsm/kg, 200 mOsm/kg y 300 mOsm/kg),
correspondera a las clulas con membrana plasmtica muy frgil.
Si se examinan las grficas correspondientes a diferentes animales (Figura 7 y 7bis )
pueden apreciarse diferencias considerables en las curvas representadas, especialmente en
el caso de la solucin 10 mOsm/kg. Los
resultados de los anlisis estandar ya
10 mOsm
mOsm/kg

mostraban una heterogeneidad en la calidad

100

de las muestras, que lgicamente se refleja

90
%Clulas permeables

80

tambin al analizar la funcionalidad de la

70
60

membrana. A los 30 segundos no hay

50

mucha diferencia entre el valor mximo y

40
30

mnimo de clulas no viables (12,31% del

20

animal T y 0,5% del animal L) y la

10
0
0

10

15

20

25

30

desviacin estndar es de slo 4,01. En

Tiempo (minutos)

cambio, a los 15 minutos hay una diferencia

Figura 15. Grfica ideal correspondiente a
una muestra de semen diluida en la solucin
10 mOsm/kg. Al contrario de lo que se
representa en la Figura 14 (grfica 10
mOsm/kg), la pendiente de la curva no es
muy grande, y abarca un periodo de tiempo
considerable, lo cual indica la existencia de
una poblacin heterognea de clulas
sensibles al choque hipoosmtico. Debido a
esta heterogeneidad, unas clulas se daan
antes que otras (convirtindose, por tanto, en
permeables al ioduro de propidio), lo cual se
refleja en la grfica.

64

de ms de 70 puntos entre el mximo y el

mnimo (94,3% del animal J y 19,69% del
animal H), con una desviacin estndar de
28,07. Adems, se pueden clasificar las
grficas en tres grupos: aquellas con una
pendiente suave (G, Q, U), con una
pendiente media (D, J, L) y con una
pendiente ms acusada (I, N, S, T). Como

Discusin

ya se dijo antes, una pendiente pequea implica, posiblemente, la existencia de una

poblacin heterognea de clulas sensibles al choque hipoosmtico, en la que podemos
encontrar clulas con diferentes grados de resistencia. Una pendiente muy acusada implica
la existencia de una poblacin homognea de clulas sensibles, con pocas diferencias de
unas a otras, por lo que todas se permeabilizan al mismo tiempo.
Una segunda parte del estudio de los datos obtenidos por citmetra de flujo
consisti en el anlisis de correlacin con los datos de fertilidad, con el fin de comprobar si
la resistencia al choque hipoosmtico era un factor fundamental para determinar la
fertilidad antes y despus de la criopreservacin. Como se ha visto, los parmetros estndar
no correlacionan bien con la fertilidad, por lo que se ha buscado un factor que sea lo
suficientemente importante como para estar ntimamente ligado a la fertilidad de una
muestra. La funcionalidad de la membrana plasmtica, estudiada mediante la utilizacin de
tratamientos hipoosmticos, parece ser un indicador de calidad seminal suficientemente
bueno como para cubrir ese papel. Adems, hay que tener en cuenta que el esperma es una
suspensin heterognea, constituida por poblaciones de clulas con caractersticas
diferentes entre si. Para que se produzca la fecundacin se requiere que en el conjunto de la
muestra haya una poblacin de clulas de buena calidad, suficiente para garantizar que una
de ellas pueda fecundar el huevo. Por ello, los parmetros que hacen referencia a un valor
medio de la muestra del semen (osmolaridad, etc.) seran en principio menos adecuados
que aquellos que nos permiten establecer las caractersticas de las distintas poblaciones
espermticas presentes. Esta es, por lo tanto, otra ventaja de este nuevo metodo de anlisis.
La membrana plasmtica tiene un papel muy importante, tanto en la viabilidad
celular como en la interaccin entre gametos, por lo que una muestra con pocas clulas
permeables debera dar buenos resultados de fertilidad en fresco. Adems, tal muestra
resistira mejor el proceso de criopreservacin, ya que ste supone una dura prueba,
especialmente para las membranas celulares, as que tambin debera dar buenos resultados
en la fecundacin con semen congelado.
Las clulas permeables en tiempos altos (10 o 15 minutos) son aquellas que
tericamente, no resistiran bien el proceso de fertilizacin y criopreservacin. As que,
segn la clasificacin propuesta antes, si la funcionalidad de la membrana plasmtica es un
parmetro fundamental en la fertilidad de una muestra, habra una correlacin negativa
entre el porcentaje de clulas permeables en la meseta y la fertilidad de la muestra. Si esto
es cierto, la correlacin sera especialmente fuerte en el caso de la solucin 10 mOsm/kg,

65

Discusin

ya que en esta solucin las clulas sufren un choque hipoosmtico lo suficientemente

fuerte como para poner en evidencia a todas las clulas poco resistentes.
Sin embargo, los resultados obtenidos son bastante confusos, ya que no slo se
obtienen muy pocos casos en los que esta hiptesis resulta vlida, sino que hay diversas
incoherencias entre ellos.
Estos resultados son contradictorios desde dos puntos de vista. En primer lugar,
aparecen tanto correlaciones positivas como negativas. Las correlaciones positivas no
tienen sentido, ya que implican que las muestras con pocas clulas resistentes tendran
mejores resultados post-descongelacin. En segundo lugar, se esperara obtener resultados
similares en ambos grupos de semen criopreservado, puesto que no se han observado
diferencias significativas entre ellos. Sin embargo, el grupo de la solucin A correlaciona
en muchas ms ocasiones con los resultados de los tratamientos hipoosmticos que el
grupo de la solucin B.
Esto puede deberse a que la fertilidad de una muestra de semen tampoco puede ser
prevista mediante el anlisis nicamente del estado de la membrana plasmtica. La
funcionalidad de la membrana plasmtica de los espermatozoides es slo uno de los
muchos factores que intervienen en el proceso de fecundacin (estado del ADN, actividad
mitocondrial, etc). La no inclusin de estos datos en el anlisis puede invalidar los anlisis
de regresin, muy sensibles a la accin de variables omitidas. Por otra parte, aunque el
estado de la membrana parece capital para resistir el proceso de congelacin y
descongelacin, puede no haber sido un factor determinante en las fecundaciones con
semen fresco, ya que la activacin de los espermatozoides se realiz con una solucin
activadora prcticamente isoosmtica. En estas condiciones, incluso los espermatozoides
ms lbiles pueden ser frtiles.
En semen criopreservado, la falta de relacin entre los resultados de los
tratamientos hipoosmticos y los datos de fertilidad ya fue advertida por Cabrita et al.
(1999). Se observ que diversos crioprotectores (BSA, yema de huevo y promina, aislados
o combinados entre si) proporcionaban diferentes grados de proteccin a las membranas de
los espermatozoides criopreservados, pero que, en muchos casos, esta proteccin no se
reflejaba en mejores resultados de fertilidad post-congelacin. Seguramente esto se deba a
la interaccin de los componentes de los crioprotectores con la membrana del
espematozoide, durante el proceso de fecundacin.

66

Discusin

Los agentes crioprotectores (yema de huevo y BSA en nuestro caso) interaccionan

con la membrana plasmtica, protegindola en el proceso de criopreservacin. El
mecanismo por el que se rigen estas interacciones es poco conocido, y se cree que podran
tener efectos negativos en el momento de la fecundacin (Cabrita et al., 1999b). Aunque la
integridad del espermatozoide haya sido bien protegida durante el proceso, su membrana
plasmtica ha podido perder la capacidad de reconocer y fusionarse con la del huevo,
debido a las interacciones con el crioprotector. En caso de que estas interacciones
negativas se produzcan, un test que mida nicamente la resistencia de la membrana
plasmtica puede no correlacionar con la fertilidad postdescongelacin.
Otro factor que puede haber influido en estos anlisis es, como ya hemos
mencionado, la heterogeneidad de los huevos empleados en las pruebas de fertilidad. La
influencia de esta variable sobre los resultados de los anlisis de correlacin es difcil de
establecer, pero parece haber sido importante.
La importancia de considerar varios factores conjuntamente para predecir la
fertilidad de una muestra de esperma se hace evidente al examinar la bibliografa referente
al esperma humano y a reproduccin animal. Es en este campo donde la investigacin
sobre inseminacin artificial y criopreservacin de esperma se encuentra en sus etapas ms
avanzadas. La fertilidad probable del esperma humano no congelado, se evala acudiendo,
no a un parmetro aislado, sino a varios ndices, que agrupan en una expresin matemtica
factores fsicos, qumicos y citolgicos de las muestras de semen (Gimeno y Fernndez,
1983). No obstante, incluso estas frmulas mas o menos complejas, no pueden ser
utilizadas para predecir la fertilidad de un individuo determinado o para identificar
muestras de especial calidad, sino que su utilidad es la de identificar los individuos con
baja fertilidad potencial, candidatos a tratamientos terapeuticos o para desechar las
manipulaciones que producen una reducin evidente de la capacidad fecundante del semen
(Hemmerstedt, 1996). Es decir, se emplean como control negativo para descartar, con
mayor o menor precisin, las muestras que presentan una calidad inferior a la considerada
como adecuada.
Como demuestran nuestros resultados, tambin en la trucha es probable que el
conjunto de todos los test desarrollados pueda conducirnos a la eliminacin de los machos
cuya calidad es menor de la deseada y, por tanto, de aquellos cuya fertilidad o resistencia a
la congelacin pueda ser menor que la media. Pero, dado el gran nmero de factores que
intervienen en la fecundacin y la cantidad de interacciones moleculares que pueden

67

Discusin

producirse, muchas de ellas an desconocidas (especialmente despues de la incorporacin

de diferentes sustancias en el diluyente), no parece posible que en un plazo breve, pueda
predecirse la fertilidad de una muestra dada.
En conclusin, el test hipoosmtico desarrollado por Cabrita (1997) permite
estudiar la funcionalidad de la membrana plasmtica de los espermatozoides de una
muestra de semen de O. Mykiss, e identificar y cuantificar diferentes poblaciones
espermticas de acuerdo a su resistencia al choque hiposmtico. La combinacin de esta
tcnica con la citometra de flujo la hace mucho ms rpida y fiable, en comparacin con la
microscopa de fluorescencia, aunque el alto precio del equipo es un factor a tener en
cuenta. Sin embargo, a la vista de los resultados aqu obtenidos, puede afirmarse que no es
posible predecir la fertilidad de una muestra de semen nicamente por los resultados
obtenidos de la prueba de funcionalidad de la membrana plasmtica.

68

6. CONCLUSIONES
1. Todos los parmetros analizados (osmolaridad, pH, densidad espermtica, fertilidad y
funcionalidad de la membrana plasmtica) reflejan la existencia de una gran
variabilidad entre las muestras de semen analizadas.
2. Ni la osmolaridad ni la densidad espermtica pueden servir para predecir la fertilidad
de una muestra de semen de O. mykiss, fresca o criopreservada.
3. La medida del pH de las muestras podra ser de utilidad para evaluar la calidad seminal
en O. mykiss, ya que se ha encontrado una relacin cuadrtica con la fertilidad del
semen en fresco, demostrando que hay un rango ptimo de pH. Sin embargo, no es un
parmetro en el que se pueda confiar para predecir la fertilidad de la muestra.
4. No hay diferencias significativas en la fertilidad del semen criopreservado de O. mykiss
utilizando como crioprotector externo yema de huevo o BSA.
5. El tratamiento de las muestras con soluciones hipoosmticas permite evaluar, de una
manera sencilla, la funcionalidad de la membrana plasmtica de los espermatozoides de
O. mykiss y diferenciar, dentro de cada muestra, distintas poblaciones espermticas de
acuerdo con su capacidad para resistir el estrs osmtico.
6. La utilizacin de un citmetro de flujo para analizar las muestras tratadas con las
soluciones hipoosmticas aumenta la rapidez y precisin de la tcnica, permitiendo un
estudio fiable de la funcionalidad de la membrana plasmtica de los espermatozoides
de O. mykiss.
7. La solucin 10 mOsm/kg provoca un choque osmtico importante en los
espermatozoides de O. mykiss, que se refleja en una alta proporcin de clulas
permeables en pocos minutos.
8. Las soluciones 100 mOsm/kg, 200 mOsm/kg y 300 mOsm/kg no resultan agresivas
para los espermatozoides de O. mykiss. No hay diferencias significativas en el
comportamiento de las clulas en cada una de estas tres soluciones, pero s difieren
significativamente de su comportamiento en la solucin 10 mOsm/kg.
9. El aumento con el tiempo de la proporcin de espermatozoides de O. mykiss daados,
en cualquiera de las soluciones ensayadas, indica la existencia de una cintica de tipo

Conclusiones

sigmoide. Este tipo de cintica se explica considerando la existencia de subpoblaciones

celulares con diferente sensibilidad al choque osmtico.
10. Las clulas que, al alcanzarse la meseta de la grfica correspondiente a la solucin 10
mOsm/kg, no son permeables al ioduro de propidio, poseen una membrana plasmtica
altamente resistente, que responde adecuadamente a los cambios de osmolaridad del
medio.
11. No se ha encontrado una correlacin clara entre los datos proporcionados por la
citometra de flujo y las pruebas de fertilidad. La resistencia al choque hiposmtico es
un parmetro muy adecuado para evaluar la calidad de una muestra seminal y
cuantificar las diferentes poblaciones celulares presentes en ella, pero no es un dato
suficiente para predecir la fertilidad de una muestra de semen, tanto fresco como
criopreservado.

70

7. BIBLIOGRAFA
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84

8. TABLAS

Tabla I. Composicin del diluyente de

esperma utilizado en este trabajo (modificado
de Erdahl y Graham, 1981).
CaCl2 ...................................... 0,6974 mM
MgCl2 ...................................... 1,0828 mM
Na2 HPO4 ................................. 1,8667 mM
KCl ........................................ 34,3035 mM
NaCl ..................................... 99,9439 mM
cido Ctrico .......................... 0,5205 mM
Glucosa ............................. 55,5065 mM
KOH ........................................ 2,2634 mM
Bicina ...................................... 6,4951 m M
pH ....................................................... 7,4
Osmolaridad ....................... 323 mOsm/kg

Tabla II. Composicin de la

activadora DIA 532 (Billard, 1977)

solucin

NaCl ........................................... 94,9646 mM

Glicina .................................................. 42,09 mM
Tris ..................................................... 19,9769 mM

Tablas

Tabla III. Parmetros estndar de las muestras de semen fresco.

86

Animal

Osmolaridad
(mOsm/kg)

pH

Recuento
(clulas/ml)

Motilidad
(1-5)

A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
Q
R
S
T
U

310
311
301
331
322,67
316
299
300,67
348,67
294,67
299
296,67
311,33
314,67
305,67
296
298,67
257,67
281,67
262,67
266,33

6,20
6,40
6,70
7,80
7,81
7,70
7,75
7,53
7,57
7,09
6,71
6,69
6,70
7,78
7,58
6,80
7,98
7,92
8,01
7,99
8,36

7,831010
6,871010
6,531010
6,671010
1,161011
8,81010
5,571010
2,371010
6,171010
7,931010
5,831010
8,41010
1,561011
1,211011

5
4
5
4
4
4
5
5
5
5
3,5
4
5
4
5
5
5
5
5
5
5

Media

301,19

7,38

8,021010

SD

21,66

0,63

3,271010

Mximo

348,67

8,36

1,561011

Mnimo

257,67

6,20

2,371010

CV (%)

7,19

8,49

40,81

SE

4,84

0,14

7,32109

Tablas

Tabla IV. Fertilidad media de las muestras

de semen fresco. Entre parntesis se
muestran
los
resultados
de
los
experimentos duplicados.
Animal

Fertilidad (%)

A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
P
Q
R
S
T
U

45,45
39,80
31,67
76,96
41,97
61,50
96,72
95,99
95,56
95,14
68,48
94,59
79,53
86,94
93,47
78,62
38,78
63,29
47,63
37,34
47,31

Media
SD
Mximo
Mnimo
CV (%)
SE

67,46
23,60
96,72
31,67
34,99
5,28

(13,54; 77,36)
(29,59; 50,00)
(33,00; 30,34)
(68,63; 85,29)
(33,00; 50,94)
(70,37; 52,63)
(95,45; 97,98)
(98,04; 93,94)
(94,12; 97,00)
(94,29; 96,00)
(70,30; 66,67)
(93,07; 96,12)
(82,52; 76,53)
(88,89; 85,00)
(92,00; 94,95)
(76,24; 81,00)
(29,59; 47,96)
(64,95; 61,63)
(50,70; 44,55)
(17,82; 56,86)
(44,12; 50,50)

87

Tablas

Tabla V. Datos de citometra de flujo correspondientes a la solucin 100 mOsm/kg

(% de clulas permeables).
Animal

30

10

15

30

D
G
I
J
L
N
Q
S
T
U

2,92

8,04
3,27
3,8
2,78
5,84
1,3
5,08
4,49
6,3
5,02

5,17
3,18
4,7
2,77
5,2
1,8
5,23
5,04
10,11
4,95

6,74
3

6,8

1,4
1,08
3,5
0,28
0,03
1,3
3,8
2,94

1,52
2,87
1,8
2,18
3,69
0,87
2,91
4,25
4,48
3,49

3,8
6,84
2,27
5,11
5,45
11,81
6,69

6,77
8,86
12,95
7,08

Media
SD
Mximo
Mnimo
CV (%)
SE

1,92
1,40
3,80
0,03
73,07
0,31

2,81
1,20
4,48
0,87
42,76
0,27

4,59
1,92
8,04
1,30
41,88
0,43

4,82
2,22
10,11
1,80
46,19
0,50

5,75
2,82
11,81
2,27
49,13
0,63

8,13
2,52
12,95
6,30
31,05
0,56

6,3

Tabla VI. Datos de citometra de flujo correspondientes a la solucin 200 mOsm/kg

(% de clulas permeables).
30

10

15

30

D
G
I
J
L
N
Q
S
T
U

1,73
0,5
2
0,72
4,19
0,12
0,13
1,92
3,02
1,4

6,4
2,28
2,8
0,99
3,17
1,05
1,72
2,27
4,49
1,98

7,56
2,22
3,4
1,09
1
1,04
2,07
1,7
6,14
1,2

7,75
3,2
4,2
1,4
1,77
1,99
3,11
3,53
8,8
1,79

6,55
1

1,83
2,73
1,73
3,1
4,4
7,04
2,11

1,41
4,89
4,25
11,02
2,72

Media
SD
Mximo
Mnimo
CV (%)
SE

1,57
1,31
4,19
0,12
83,08
0,29

2,72
1,65
6,40
0,99
60,91
0,37

2,74
2,31
7,56
1,00
84,26
0,52

3,75
2,56
8,80
1,40
68,12
0,57

3,39
2,16
7,04
1,00
63,81
0,48

4,55
3,15
11,02
1,41
69,08
0,70

88

Animal

2,58

Tablas

Tabla VII. Datos de citometra de flujo correspondientes a la solucin 300 mOsm/kg

(% de clulas permeables).
Animal

30

10

15

30

D
G
I
J
L
N
Q
S
T
U

1,84
1
2,4
0,84
4,34
0,31
1,26
2,98
3,12
1,34

8,8
1
2,8
1,67
3,3
0,65
2,12
2,11
4,09
2,24

7,9
2
3,2
1,14
3,18
1,22
3,01
1,95
6,38
3,06

7,04
2,79
3,3
1,92
3,84
1,38
3,03
2,99
6,06
4,21

8,94
2,74
1,72
4,2
1,56
3,61
3,1
6,34
6,67

4,62
7,48
8,77

Media
SD
Mximo
Mnimo
CV (%)
SE

1,94
1,25
4,34
0,31
64,26
0,28

2,88
2,32
8,80
0,65
80,45
0,52

3,30
2,19
7,90
1,14
66,40
0,49

3,66
1,75
7,04
1,38
47,79
0,39

4,32
2,50
8,94
1,56
57,77
0,56

6,96
2,12
8,77
4,62
30,53
0,47

Tabla VIII. Datos de citometra de flujo correspondientes a la solucin 10 mOsm/kg

(% de clulas permeables).
Animal

30

10

15

30

D
G
I
J
L
N
Q
S
T
U

6,33
1
0,96
1,12
0,5
0,69
8,45
3,84
12,31
5

7,8
3,2
4,96
10,06
1,1
14,31
6,82
38,75
7,46

40,94
4,5
70,04
8
35,09
13,17
28,74
78,83
83,63
14,75

81,9
13
85
37,29
90
78
53,8
84,82
87
19,59

93,8
28
87,3
94,3
93,28
84,16
57,02
85,09
87,08
19,69

59,77
87,16
87,21
24,88

Media
SD
Mximo
Mnimo
CV (%)
SE

4,02
4,01
12,31
0,50
99,87
0,90

10,50
11,26
38,75
1,10
107,33
2,52

37,77
29,92
83,63
4,50
79,22
6,69

63,04
29,77
90,00
13,00
47,23
6,66

72,97
28,07
94,30
19,69
38,47
6,28

68,50
25,70
92,00
24,88
37,51
5,75

60
92

89

Tablas

Tabla IX. Fertilidad media de las muestras de semen criopreservado. Entre

parntesis, los resultados de los experimentos duplicados.
Animal

Fertilidad (diluyente A) (%)

D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
Q
S
T
U

21,78
15,20
40,60
32,04
20,78
39,15
29,35
1,52
34,61
5,56
13,14
21,27
41,60
54,04
55,92
35,71

Media
SD
Mximo
Mnimo
CV (%)
SE

28,89
15,83
55,92
1,52
54,80
3,54

(30,69; 12,87)
(57,73; 23,47)
(57,00; 7,07)
(32,65; 8,91)
(69,39; 8,91)
(11,43; 47,27)
(59,22; 10,00)
(8,08; 3,03)
(14,29; 12,00)
(27,72; 14,81)
(37,76; 45,45)
(56,57; 51,52)
(24,49; 46,94)

Fertilidad (diluyente B) (%)

13,01
10,69
16,87
31,65
49,02
26,71
22,57
5,69
25,64
8,76
14,39
25,36
38,18
39,57
30,95
38,10

(3,48; 22,55)
(13,40; 8,00; 10,68)
(12,99; 20,75)
(19,19; 44,12)
(43,62; 9,80)
(14,13; 31,00)
(4,85; 6,52)
(40,38; 10,89)
(5,75; 11,76)
(16,28; 12,50)
(23,36; 27,36)
(32,67; 43,69)
(42,00; 37,14)

24,82
12,61
49,02
5,69
50,82
2,82

Tabla X. Comparacin entre osmolaridades de los tratamientos para citometra de

flujo, agrupados por tiempos. Se muestran los valores medios y desviaciones
estndar, correspondientes a los porcentajes de clulas permeables para cada uno
de los tratamientos. Dos datos de la misma fila que compartan la misma letra no
son estadsticamente diferentes.

30
2
5
10
15
30

90

10 mOsm/kg

100 mOsm/kg

200 mOsm/kg

300 mOsm/kg

4,024,01 a
10,5011,26 a
37,7729,92 a
63,0429,77 a
72,9728,07 a
68,5025,70 a

1,921,40 a
2,811,20 b
4,591,92 b
4,822,22 b
5,752,82 b
8,132,52 b

1,571,31 a
2,721,65 b
2,742,31 b
3,752,56 b
3,392,16 b
4,553,15 b

1,941,25 a
2,882,32 b
3,302,19 b
3,661,75 b
4,322,50 b
6,962,12 b

Tablas

Tabla XI. Comparacin entre tiempos de los tratamientos para citometra de flujo,
agrupados por osmolaridades. Se muestran los valores medios y desviaciones
estndar, correspondientes a los porcentajes de clulas permeables para cada uno
de los tratamientos. Dos datos de la misma columna que compartan la misma letra
no son estadsticamente diferentes.

30
2
5
10
15
30

10 mOsm/kg

100 mOsm/kg

200 mOsm/kg

300 mOsm/kg

4,024,01 a
10,5011,26 a
37,7729,92 b
63,0429,77 c
72,9728,07 c
68,5025,70 c

1,921,40 a
2,811,20 ac
4,591,92 b
4,822,22 bc
5,752,82 bd
8,132,52 d

1,571,31 a
2,721,65 ab
2,742,31 ab
3,752,56 ab
3,392,16 ab
4,553,15 b

1,941,25 a
2,882,32 a
3,302,19 ab
3,661,75 ab
4,322,50 ab
6,962,12 b

Tabla XII. Comparacin entre los dos modelos de regresin analizados para los
datos de citometra de flujo. Se indican los coeficientes de determinacin (r2)
obtenidos del anlisis de regresin frente al tiempo, de los valores medios de los
tratamientos hipoosmticos. Aquellos casos en los que el modelo no es vlido
para los datos analizados (p>0,05) se han sealado con #.
Modelo

10 mOsm/kg

100 mOsm/kg

200 mOsm/kg

300 mOsm/kg

Lineal
Sigmoide

0,6117#
0,9962

0,8605
0,9318

0,7294
0,8473

0,9524
0,9535

Tabla XIII. Ajuste de los datos obtenidos para cada animal por citometra de flujo,
agrupados por osmolaridades, al modelo de regresin lineal. Se indican los
coeficientes de determinacin (r2) obtenidos. Aquellos casos en los que el modelo
lineal no es vlido para los datos analizados (p>0,05) se han sealado con #.
Animal

10 mOsm/kg

100 mOsm/kg

200 mOsm/kg

300 mOsm/kg

D
G
I
J
L
N
Q
S
T
U

0,9600
0,9897
0,7714#
0,7887
0,9250
0,9318
0,6846
0,4822#
0,4343#
0,7335

0,4031#
0,7981
0,9019#
0,9058
0,7702#
0,8577
0,4396#
0,7424
0,7890
0,7748

0,3079#
0,4398#
0,9113
0,9615
0,1024#
0,2858#
0,6722
0,6680
0,7712
0,6690

0,3024#
0,8368
0,7838#
0,4336#
0,0829#
0,7777
0,7512#
0,7237
0,6271#
0,9103

91

Tablas

Tabla XIV. Ajuste de los datos obtenidos para cada animal por citometra de flujo,
agrupados por osmolaridades, al modelo de curva sigmoide. Se indican los
coeficientes de determinacin (r2) obtenidos. El modelo sigmoide es vlido para
todos los casos analizados (p 0,05)
Animal

10 mOsm/kg

100 mOsm/kg

200 mOsm/kg

300 mOsm/kg

D
G
I
J
L
N
Q
S
T
U

0,9943
0,9996
0,9970
0,9647
0,9910
0,9975
0,9965
0,9852
0,9984
0,9731

0,5559
0,8418
0,9783
0,9126
0,8193
0,9520
0,9776
0,7485
0,9946
0,9363

0,9797
0,4554
0,9816
0,9865
0,1198
0,8803
0,8469
0,8038
0,8742
0,6735

0,9595
0,9546
0,9993
0,5051
0,0853
0,9932
0,9674
0,7391
0,9238
0,9840

Tabla XV. Coeficientes de correlacin (r) entre los datos

de fertilidad y los parmetros estndar del semen. Se
indican con asteriscos los casos en los que la
correlacin
lineal
entre
dos
variables
es
estadsticamente significativa (p 0,05).
Fertilidad

Osmolaridad

pH

Densidad
espermtica

Fresco
Diluyente A
Diluyente B

0,3009
-0,3710
-0,4680

-0,0063
0,5822*
0,5048*

-0,4603
0,7183*
0,5490

Tabla XVI. Matriz de correlacin (r) de los datos

de fertilidad. Se indican con asteriscos los
casos en los que la correlacin lineal entre dos
variables es estadsticamente significativa
(p 0,001).
Fresco
Fresco
Diluyente A
Diluyente B

92

1
-,2599
,0135

Diluyente A Diluyente B
1
,7054**

Tablas

Tabla XVII. Coeficientes de correlacin (r) entre los datos de fertilidad y los datos
obtenidos por citometra de flujo a diferentes tiempos, correspondientes a las
muestras tratadas con la solucin 10 mOsm/kg. Se indican con asteriscos los
casos en los que la correlacin lineal entre dos variables es estadsticamente
significativa (* p 0,05; ** p 0,01).
Fertilidad

30

10

15

30

Fresco
Diluyente A
Diluyente B

-0,8820**
0,5179
0,3276

-0,6227
0,6717*
0,3807

-0,4368
0,6899*
0,2158

-0,0832
0,1574
-0,3202

0,2350
-0,0634
-0,5660

-0,0461
0,6332
0,2155

Tabla XVIII. Coeficientes de correlacin (r) entre los datos de fertilidad y los datos
obtenidos por citometra de flujo a diferentes tiempos, correspondientes a las
muestras tratadas con la solucin 100 mOsm/kg. Se indican con asteriscos los
casos en los que la correlacin lineal entre dos variables es estadsticamente
significativa (* p 0,05; ** p 0,01).
Fertilidad

30

10

15

30

Fresco
Diluyente A
Diluyente B

0,0151
0,2494
-0,0425

-0,5201
0,8681**
0,7967**

-0,4314
0,4383
0,1614

-0,6229
0,7645*
0,3939

-0,5890
0,6502
0,2542

-0,5428
0,8529*
0,0830

Tabla XIX. Coeficientes de correlacin (r) entre los datos de fertilidad y los datos
obtenidos por citometra de flujo a diferentes tiempos, correspondientes a las
muestras tratadas con la solucin 200 mOsm/kg. Se indican con asteriscos los
casos en los que la correlacin lineal entre dos variables es estadsticamente
significativa (* p 0,05; ** p 0,01).
Fertilidad

30

10

15

30

Fresco
Diluyente A
Diluyente B

-0,0182
0,4728
0,0762

-0,1631
0,2055
-0,2114

-0,2360
0,1815
-0,2584

-0,3637
0,3345
-0,1286

-0,5794
0,4352
-0,0772

-0,4868
0,7948*
0,4507

Tabla XX. Coeficientes de correlacin (r) entre los datos de fertilidad y los datos
obtenidos por citometra de flujo a diferentes tiempos, correspondientes a las
muestras tratadas con la solucin 300 mOsm/kg. Se indican con asteriscos los
casos en los que la correlacin lineal entre dos variables es estadsticamente
significativa (* p 0,05; ** p 0,01).
Fertilidad

30

10

15

30

Fresco
Diluyente A
Diluyente B

0,1733
-0,6635*
-0,2961

0,2015
-0,1195
0,2850

0,3600
-0,2201
0,1544

0,3893
-0,3279
0,0102

0,4524
-0,2253
-0,0081

0,2711
0,6563
0,3930

93