PRACTICA #9

FOSFATASA ALCALINA (PARTE I)

DAYANA PAOLA PARODY PEREZ

DINA LUZ GUEVARA CANOLE
KESMY ISABEL LIDUEA PEREZ

PRESENTADO A:
RAMON LOZADA DEVIA

UNIVERSIDAD DE SUCRE
FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS
PROGRAMA DE BIOLOGIA
SINCELEJO-SUCRE
04/MAYO/2015

OBJETIVOS

Obtener una curva de calibracin del para-nitrofenol (PNP). Que representa

las variaciones de absorbancia de una solucin que contenga esta
susutancia a diferentes valores de concentracin, esto es absorbancia vs
[PNP]
MARCO TEORICO

Las reacciones qumicas en los sistemas biolgicos slo ocurren en presencia de

catalizadores, que son protenas especficas denominadas enzimas. La presencia
de una enzima se detecta por las reacciones especficas que cataliza. Toda
reaccin enzimtica puede esquematizarse como sigue:

As, la enzima se combina con un sustrato (S) que se transforma en un producto

(P). El tiempo que tarda una determinada cantidad de S en transformarse en P es
lo que caracteriza a la enzima, y se denomina velocidad o actividad enzimtica (v)
que se define como cantidad de sustrato transformado o de producto formado en
la unidad de tiempo.
La catlisis enzimtica es de gran importancia en los seres vivos, pues acelera
reacciones qeue en su ausencia tardaran mucho en ocurrir. La mayora de las
enzimas son de origen proteico.
Las fosfatasas Son protenas de membrana cuya estructura es la de una
glicoprotena. La parte glucdica est formada por cadenas de oligosacridos que
llevan generalmente en el extremo ms alejado de la protena cido silico
La fosfatasa alcalina es una enzima hidrolasa responsable de eliminar los grupos
de fosfato de varios tipos de molculas como nucletidos, protenas y alcaloides.
El proceso de eliminar el grupo se denomina desfosforilacion. Como sugiere su
nombre, las fosfatasas alcalinas son ms efectivas en un entorno alcalino.

La fosfatasa alcalina (Ortofosfrico monoster fosfohidrolasa, (EC 3.1.3.1) es una

enzima ampliamente distribuida que hidroliza el enlace ster fosfrico entre un
grupo fosfato y un radical orgnico a pH bsico (pH ptimo entre 9 y 10) liberando
fosfato inorgnico. Est presente en rin, hgado, intestino y hueso.
p-nitrofenilfosfato ( pNPP ) es un sustrato cromognico para la fosfatasa cida y
alcalina en ensayos espectrofotomtricos convencionales.

Estas enzimas catalizan la hidrlisis de pNPP a amarillo para- nitrofenol . Este

producto absorbe fuertemente a 405 nm y se puede medir con un
espectrofotmetro de luz visible.

Esta enzima hidroliza el p-nitrofenilfosfato para formar el cromgeno amarillo pnitrofenol de acuerdo a la siguiente reaccin:

Imagen 1: reaccin enzimtica

La actividad de una enzima se determina conociendo la velocidad de la reaccin
que cataliza. La velocidad de reaccin se define como la cantidad de sustrato
consumido o de producto formado por unidad de tiempo.
La determinacin de la actividad de la fosfatasa se realiza midiendo la cantidad de
p-nitrofenol liberado por accin del enzima contenido en las clulas durante un
perodo de tiempo determinado. La reaccin se detiene aadiendo carbonato
sdico (Na2CO3) que provoca un cambio brusco de pH alcalinizando el medio. La
actividad de la enzima se puede estudiar gracias a que el producto de la reaccin
(p-nitrofenol) en solucin alcalina posee un color amarillo caracterstico que posee
su mximo de absorbancia a 400 nm (mientras que el sustrato de la reaccin, pnitrofenil-fosfato, no absorbe a esta longitud de onda).

PORCEDIMIENTO.

Tubo

Dilucin de

PNP

Na2HP

Buffer

PNP (con
Buffer de
glicina )
-----1:2
1:4
1:8
1:16

Blanco
1
2
3
4
5

diluid
o
(ml)
---3
3
3
3
3

O4
(ml)

de
Glicina

1
1
1
1
1
1

3
-----------

Tabla 1: Cantidades necesarias para la preparacin de las distintas

muestras

DATOS.

Tubo

Absorbancias

1
2
3
4
5

4,286
3,823
3,970
3,437
1,705

Tabla 2: Absorbancias obtenidas con distintas concentraciones

de PNP

RESULTADOS

1. Concentracin de PNP para cada tubo:

Tubo 1:

Tubo 2:

[ PNP ] =3105 M

C 1V 1=C 2V 2

C 2=

C 1V 1
V2

C 2=

3105 M 3 ml
=1,5105 M
6 ml

Tubo 3:
C 2=

1,5105 M 3 ml
=0,75105 M
6 ml

Tubo 4:
5

0,7510 M 3 ml
C 2=
=0,375105 M
6 ml

Tubo 5:
5

C 2=

0,37510 M 3 ml
=0,1875105 M
6 ml

2. Absorbancia Vs [PNP]

[PNP]

Absorbancia

-5

4,286

3*10

1,5*10

-5

0,75*10

-5

3,823
3,970

3,437

0,1875*1

1,705

0,375*10
5

-5

Absorbancia Vs [PNP]
4.5
f(x) = 43895.09x + 3.08
R = 0.75

4
3.5
3
2.5

Absorbancia.

Linear ()

2
1.5
1
0.5
0
0

[PNP]
Grfica 1: Curva estndar de la Fosfatasa alcalina.
CUESTIONARIO
1. Describa y explique el tipo y subtipo al cual pertenece la fosfatasa
alcalina?
La fosfatasa alcalina (Ortofosfrico monoster fosfohidrolasa, (EC 3.1.3.1)
es una enzima ampliamente distribuida que hidroliza (3) el enlace ster (1)
fosfrico entre un grupo fosfato y un radical orgnico a pH bsico (pH

ptimo entre 9 y 10) liberando fosfato inorgnico. Por lo tanto es de tipo

hidrolasa y de subtipo fosfatasa.
2. Qu funcin cumple la Na2HPO4 en la mezcla de la reaccin?
La funcin que cumple la Na2HPO4 es que detiene la reaccin porque el
exceso de p-nitrofenol inhibe la actividad enzimtica pero la presencia del
fosfato impide esta inhibicin. Otra funcin que cumple es q al momento de
interaccionar con las protenas estas disminuyen la perdida de agua.
Los fosfatos se emplean como aditivos alimentarios
3. Qu significado tiene el que la reaccin se lleve a cabo con un buffer
pH10.4?
Porque a este pH la fosfatasa hidroliza el enlace ester fosftico entre el
grupo fosfato y un radical orgnico y libera fosfato inorgnico
4. Por qu la absorbancia mxima del PNP se mide a 410 nm?
La absorbancia se mide a 410 nm porque La velocidad de incremento de
absorbancia debido a la produccin de p-nitrofenol (pNP) es directamente
proporcional a la actividad de fosfatasa alcalina en la muestra.
5. Explique por qu el ion Zn+2 acta como un activador de la fosfatasa
alcalina?
Zn+2 es un buen aceptor de electrones y puede entrar en un arreglo de
unin coordinado que polariza grupos a los cuales se une. Esta propiedad
permite al cinc incrementar la susceptibilidad de una unin qumica a
ataque