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INSTITUTODEBIOTECNOLOGA,UNAM

MTODOSENBIOQUMICA

SECUENCIACINDEPROTENAS
PORESPECTROMETRADE
MASAS

AyalaBretnCamilo
deRegilHernndezRubn

Cuernavaca,Morelos8deJuniodel2004

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NDICE
SecuenciacindeprotenasporEspectrometradeMasas.......................................................5
I.Espectrometrademasas.......................................................................................................5
1.Fundamentos.....................................................................................................................5
1.1.HistoriadelaEspectrometradeMasas....................................................................5
1.1.1.Lasracesenlafsica..........................................................................................6
1.1.2.LaramificacinhacialaQumica.......................................................................7
1.1.3.Incursionandoenlabiologa...............................................................................8
1.1.3.Antecedentes......................................................................................................9
1.2.GruposFuncionales.................................................................................................12
1.3MtodosdeIonizacin..............................................................................................14
1.3.1Ionizacinelectrnica(EI)................................................................................14
1.3.2BombardeoRpidodeAtomos(FAB)yEspectrometradeMasasdeIon
LquidoSecundario(LSI)..........................................................................................16
1.3.3.IonizacinporElectrospray..............................................................................17
1.4.MtodosdeAnlisis................................................................................................22
1.4.1.AnlisisdeDobleSector..................................................................................22
1.4.2.EspectrometradeMasasdeTiempodeVuelo(TOF)....................................23
1.4.3.AnalizadordeMasasdeCuadrupolos.............................................................25
1.4.4.TransformadadeFourierdeResonanciaIonCiclotrn(FTICR)..................27
1.4.5.AnlisisenTrampaInica..............................................................................28
1.4.6.EspectrometriadeMasasenTndem...............................................................29
1.4.7.PSDMALDI..................................................................................................34
II.Secuenciacindeprotenasporespectrometrademasas..................................................36
2.Determinacindelaestructuraydelasecuenciaporespectrometrademasas............37
2.1.Fragmentacin.........................................................................................................38
2.1.1.Influenciadelaposicinydeslocalizacindelacarga...................................41
2.2.Identificacinysecuenciacindepptidos............................................................42
2.3.CorrelacionandoinformacinMS/MSdelasecuenciaenlabasededatos............47
2.4.Correlacindelainformacindem/zdelpptidoconsecuenciasconocidas.........49
2.5.Cuantificacindepptidos.....................................................................................49
2.5.1.ClculodeMasaMolecular..............................................................................50
2.5.2.BasesdeDatosdeSecuencias..........................................................................51
2.5.3.ConsideracionessobrelaBasedeDatos..........................................................51
2.5.4.EsquemasdePuntaje.........................................................................................52
2.6.Caracterizacindeprotenascontcnicascombinadas...........................................52
2.6.1.IdentificacindeprotenasenmezclasporShotgun.....................................52
2.6.2.Interaccionesprotenaprotenaycomplejosdeprotena..............................53

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2.6.3.Deteccindemutaciones..................................................................................54
2.6.4.Deteccindevariantesatravsdelamedicindelamasadelaprotenaintacta
conESIMS................................................................................................................55
2.6.5.Identificacindeprotenasseparadaselectroforticamente.............................56
2.6.6.Secuenciacindeprotenasengelesdepoliacrilamidateidosporplata........59
2.6.7.Elucidacindeestructurasecundariadeprotenasporionizacinen
electrospray.................................................................................................................59
2.6.8.Localizacindepuentesdisulfuroenprotenas................................................61
2.6.9.Deteccinyverificacindelasecuenciadepptidosconpuentesdisulfuropor
FABMSyMS/MS......................................................................................................62
2.6.10.Localizacindepuentesdisulfuroenpequeasprotenasricasencistena.. .63
2.6.11.Secuenciacinenescaleradeprotenas.........................................................64
2.6.12.ProtenasypptidoshidrofbicosanalizadosporMALDI............................66
2.6.13.AnlisisdeGlicoprotenasyGlicopptidosutilizandoBombardeoRpidode
tomos(FAB)............................................................................................................66
Bibliografia.........................................................................................................................69

SecuenciacindeprotenasporEspectrometradeMasas
I.Espectrometrademasas
1.Fundamentos
QueslaEspectrometradeMasas?
La espectrometrademasas(MS)esunaherramientaespectroscpicaanalticaenfocada
principalmentealaseparacindeespeciesmolecularesyatmicasdeacuerdoasumasa.La
espectrometrademasaspuedeserusadaparaelanlisisdemuchostiposdemuestras,desde
unidadeselementaleshastagrandesprotenasypolmeros.
QunospuededecirlaEspectrometradeMasas?

Unamedicinprecisademasapuedeserusadaparacomprobar/validarfrmulas
empricas.
La fragmentacin, que muchas veces resulta en sitios especficos o en grupos
particularespuedeserusadaparaidentificarmuestrasporcotejoconbasesdedatos
defragmentos.
La fragmentacin controlada puede ser usada para la elucidacin de compuestos
novedosos.
Laobservacindepicoscomunesenunespectropuedeproporcionarinformacin
tilrespectoagruposfuncionales.
La abundancia relativa de istopos es usada para obtener informacin de los
elementosqueformanuncompuesto.
Lasmezclascomplejaspuedenseranalizadasmediantecombinacionesdetcnicas
comoCromatografadeGasesEspectrometradeMasasoHPLCEspectrometrade
Masayevitando,enconsecuencia,laslargastareasdepurificacindemuestras.

1.1.HistoriadelaEspectrometradeMasas
Laespectrometrademasas(MS)tieneunahistoriamarcadaconpremiosNobelyuna
tecnologacontinuamenteenavancequehaaportadoimportantesvaseneldescubrimiento

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de drogas, caracterizacin de protenas e incluso en diagnstico de enfermedades. La
historiadelacienciamuestraclaramentequelaEspectrometradeMasas(MS)tienesus
racesenlafsica,ramificndosealaqumicayenlasltimasdosdcadashaincursionado
enlabiologa.
1.1.1.Lasracesenlafsica
La historia de la MS comienza con Don Joseph John Thompson en los laboratorios
CavendishdelaUniversidaddeCambridge.EltrabajodeThompsonEstudiostericosy
experimentalessobrelaconduccindeelectricidadporgasesllevaldescubrimientodel
electrnen1897, porelcuallefueotorgadoelPremioNobelenFsicaaThompsonen
1906.Enlaprimeradcadadelsigloveinte,Thompsonconstruyelprimerespectrmetro
demasas(llamadoentoncesEspectrgrafodeparbola),enelcuallosioneseranseparados
porsusdistintastrayectoriasparablicasencamposelectromagnticosyladeteccinera
registrada por los choques de los iones en una pantalla fluorescente o en una placa
fotogrfica.

Figura1.J.J.Thomsonyeltuboderayoscatdicosusadopararealizarunasdelasprimerasmedicionesdela
relacincarga/masa.Ladefleccindelelectrnseobservabaunavezqueseencendaelcampoelctrico.

EnlosaossiguientesalaPrimeraGuerraMundial,elasociadodeThompsonenla
UniversidaddeCambridge,FrancisW.Aston(PremioNobelenQumicaen1922),dise
unespectrmetrodemasasquemejorlaresolucinenunordendemagnitud,permitiendo
a Aston estudiaristopos.Enese mismoperodo,A.J.DempsterdelaUniversidadde
Chicagotambinmejorlaresolucinconunanalizadormagnticoydesarrolllaprimera
fuente de impacto electrnico, la cual ioniza molculas volatilizadas con un rayo de
electrones. Las fuentes de impacto electrnico son todava ampliamente usadas en
espectrmetrosdemasasmodernosparaanlisisdemolculaspequeas.

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Thompson, Aston y Dempster sentaron una slida base para la teora de la
Espectrometra de Masas y el diseo instrumental, haciendo posible, para aquellos que
siguieron, desarrollar instrumentos capaces de reunir las demandas de los qumicos y
bilogos.Latareadecreartalesinstrumentos,sinembargo,requirideseis dcadasde
esfuerzo.
1.1.2.LaramificacinhacialaQumica
Unodelasreasalaqueselehadedicadoesfuerzo,particularmenteparalosqumicos,
hasidocrearuninstrumentoconsuficienteprecisinparaelanlisistantodeelementos
comodepequeasmolculasorgnicas.Larespuestaaesteproblemavendraencuatro
diferentesformas:LosSectoresmagnticosdedobleenfoque,elanlisisporTiempode
Vuelo(TOF),elfiltroCuadrupoloylosanalizadoresdemasaporTransformadadeFourier
deResonanciaIonCiclotrn(FTICR).AlfredO.C.NierenlaUniversidaddeMinnesota
desarroll el equipo de alta resolucin de masas de doble enfoque durante la Segunda
GuerraMundialpararealizaranlisisisotpicosyseparar235Ude238U.Dehecho,laprimera
bomba atmica fue desarrollada completamente del Uranio separado por este tipo de
espectrmetrodemasas.
WilliamE.StephensdelaUniversidaddePennsylvaniapropusoelconceptodeTOFMS
en1946.EnunanalizadorporTOF,losionessonseparadosenbasealasdiferenciasensus
velocidadesamedidaquesemuevenenunatrayectoriarectahaciauncolector.TOFMSes
rpida,conunaaltaresolucinyaltaprecisin,yaplicableparaladeteccincromatogrfica.
Esusadaparaladeterminacindemasadegrandesbiomolculasyaquevirtualmenteno
tienelmiteenelrangodemasaaanalizar.
Amediadosdeladcadade1950fuereportadoporprimeravezporWolfgangPauldela
UniversidaddeBonn,queelfiltrodemasasCuadrupoloeraidealparaelacoplamientocon
GC(CromatografadeGases)y,msrecientemente,LC(CromatografadeLquidos).En
este equipo, un campo elctrico cuadrupolar (conformado por radiofrecuencias y
componentes de corriente directa) fue usado para separar iones. Aos mas tarde, Paul,
recibidemaneracompartidaelPremioNobelenFsicaporsutrabajoenlatrampade
iones.
Aunque los espectrmetros de masas de cuadrupolos no eran tan precisos como los
equiposdedoblesectormagntico,ofrecanunrangodinmicoexcelente,eranmuyestables

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yfueronrpidamenteaplicadosalosexperimentosdeEspectrometradeMasasenTndem
(MS/MS).EstascaractersticashicierondelosEspectrmetrosdeMasasdecuadrupolos
equiposmuypopularesparaelanlisiscuantitativoyparaaplicacindedescubrimientode
frmacos.
Paraelproblemadelaaltaresolucinygranprecisin,laespectrometrademasasde
ResonanciaIonCiclotrn(ICR/MS)hasidolatcnicamsexitosaparaelanlisisdemasas.
DescritainicialmenteporJ.A.Hippleycolegas,elICRoperamediantesometeralosionesa
unaradiofrecuencia,uncampoelctricoyuncampomagnticouniformesimultneamente,
loquecausaquelosionessiganunatrayectoriaespiralenunacmara.Haciendounbarrido
enlaradiofrecuenciaoenelcampomagntico,losinvestigadorespudierondetectariones
secuencialmente.En1974,MelvinB.ComisarowyAlanG.MarshalldelaUniversidadde
BritishColumbiarevolucionaronelICRdesarrollandolaTransformadadeFourierICR/MS
(FTICR/MS).LamayorventajadelaFTICR/MSfuequepermitimedirmuchosionesal
mismotiempo,yahoraescomnlograrunaprecisindesubppm(subpartespormilln)
conlosequiposcomerciales.
Todos estos diseos de analizadores de masas, e inclusive combinaciones de diferentes
tcnicasparalaMSenTndem,sonusadostodavayestndesarrollndoseparanuevas
aplicaciones.
1.1.3.Incursionandoenlabiologa
Apesardelosavancesenlaprecisinenlamedicindemasas,elrangodemasaque
poda ser analizado, el anlisis cuantitativo y la habilidad de acoplar los equipos a la
cromatografa,enladcadade1980,laMStodavacarecadeeficaciaparaelanlisisde
biomolculas grandes y pequeas. Una deficiente descomposicin molecular o
fragmentacin durante la vaporizacin/ionizacin y una pobre sensibilidad eran
problemticos. La aplicacin de una ionizacin suave como la de Ionizacin por
Electrospray (ESI) y la Desorcin/Ionizacin por Lser Asistida en Matriz (MALDI)
permitialaMSevolucionarhacialasreasdelabiologa.
EnlaESI/MS,unasfinasgotaselctricamentecargadassondispersadasalasalidadeun
capilarporuncampoelctricoydespusevaporadas.Losionesresultanteserandirigidos
hacia la entradadelespectrmetro.AunqueelprofesordequmicaMalcolmDolede la
UniversidaddeNorthwesternconcibiprimerolatcnicaenlosaos60s,nofuesinohasta

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principiosdelosaos80queJohnB.FenndelaUniversidaddeYalelopusoenprctica
paraelanlisisdebiomolculas.KoichiTanakaycolaboradoresdelacompaaShimadxu,
reportaroninicialmentelatcnicaMALDI/MS,lacualfuedesarrolladatambinporFranz
HillenkampyMichaelKarasenlaUniversidaddeFrankfurt.EnMALDIlasmolculasdel
analito son desorbidas por accin de un rayo lser, de una matriz slida o lquida que
absorberayosUV.
Por su trabajo en el desarrollo de las tcnicas de ionizacin suave las cuales son
adecuadasparaelanlisisdegrandesbiomolculas,FennyTanakacompartieronelPremio
NobelenQumicaen2002.ESIyMALDIhanhechoquelaMSseacadavezmstilpara
experimentos biolgicos sofisticados como el secuenciamiento y anlisis de pptidos y
protenas utilizando las tcnicas desarrolladas por Klaus Biemann del Massachussetts
InstituteofTechnology,estudiosdecomplejosnocovalentesymolculasinmunolgicas,
secuenciacindeDNAyelanlisisdevirusintactos.
1.1.3.Antecedentes
Elespectrmetrodemasas
Loselementosquecomponenunespectrmetrodemasassonlossiguientes:

Unsistemadeinyeccin
Unafuentedeiones
Unanalizadordemasa
Undetector

Lasmuestraspuedenserintroducidasdirectamentealafuentedeionesdelespectrmetroen
unasonda,oenelcasodemezclas,porunsistemaintermediario(ej.Cromatgrafode
Gases,CromatgrafodeLquidos,Electroforesiscapilar,etc.).Unavezquelamuestrase
encuentraenlafuentedeiones,lasmolculasdelamuestrasesometenaionizacin;para
ellolasustanciaesbombardeadaconunrayodeelectronesquetienensuficienteenerga
pararomperlamolcula.Losfragmentospositivosqueseproducen(cationesycationes
radicales)seaceleranenvacoatravsdeuncampomagnticoysondistribudosenbasea
su relacin carga/masa (m/z). Dado que la mayor parte de los iones producidos en el
espectrmetro de masas conllevan una carga positiva, el valor de la relacin m/z es
equivalentealpesomoleculardelfragmento.Elanlisisdelainformacindelespectrode
masasrequierereagrupartericamentelosfragmentosparareconstruirlamolculaoriginal.
Unesquemadeunespectrmetrodemasassemuestraacontinuacin:

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Figura 2. Esquemageneraldelmecanismodedesviacindeionesdefragmentosmedianteunimnenun
espectrmetrodemasas.

Slo una pequea cantidad de molculas de la muestra se hacen pasar a la cmara de

ionizacin (que se encuentra a alto vaco) las cuales son bombardeadas por un haz de
electronesdealtaenerga.Lasmolculassefragmentanyloscationesqueseproducense
aceleran y se dirigen hacia un analizador. La trayectoria de las molculas cargadas es
desviadaporuncampomagnticoaplicado.Losionesquetienenunamenormasa(menor
momentum)serndesviadosmsfcilmenteprovocandoquechoquencontralasparedesdel
analizador. De la misma manera, los iones con alto momentum no sern desviados
suficientementeparaseguirlatrayectoriacurvaqueelcampomagnticogeneraytambin
chocarnconlapareddelanalizador.Losionesconunarelacinm/zadecuadanosern
desviados y seguirn la trayectoria del analizador, saldrn por la ranura de salida y
finalmente chocarn con el colector. Esto genera una corriente elctrica, la cual es
amplificadaydetectada.Variandolafuerzadelcampomagntico,sepuedecontrolarlos
ionesquepasarnalcolector.
Lainformacinquearrojaelespectrmetrodemasasesunagrficadeintensidadrelativa
vs.larelacincarga/masa.Elpicomsintensoenelespectrosellamapicobaseytodos
losdemssereportanenrelacinalaintensidaddeeste.Lospicossonextremadamente
delgadosycomnmenteaparecencomolneasverticales.
Elprocesodefragmentacinocurresiguiendoprincipiosqumicossimplesypredecibles.
Losionesqueseformanrepresentanloscationesycationesradicalesmsestablesquela
molculapuedeformar.Elpicodemayorpesoenelespectrorepresentageneralmentela
molculapadremenosunelectrnyselellamaIonmolecular(M+)Comnmente,los

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picos pequeos aparecen por arriba de los pesos moleculares calculados debido a la
abundancianaturaldelosistopos13C,2H,etc.Muchasmolculasconprotonesmuylbiles
noproducenionesmoleculares;unejemplodeestosonlosalcoholes,enloscualeselpico
demayorpesomolecularocurreaunarelacincarga/masaunomenoselionmolecular(m
1).Losfragmentospuedenseridentificadosporsurelacincarga/masa,peroesmstil
identificarlosporsumasalacualhadisminudoporlosgruposqueseleshanseparadoenla
fragmentacin.Esdecir,laprdidadeungrupometilogenerarunpicodem15,laprdida
deunetilo,m29,etc.
Elespectrodeltolueno(metilbenceno)semuestraacontinuacin.

Figura3. Elespectropresentaunionmolecularfuerteenm/z=92,unospicospequeosm+1ym+2,un
picobaseenm/z=91yunaseriedepicosmenoresenm/z=65ymenores.

Elionmolecular,nuevamente,representalaprdidadeunelectrnylospicosporarribadel
ionmolecularsedebenalaabundanciadeistopos.Elpicobaseeneltoluenoesdebidoala
prdida de un tomo de hidrgeno para formar el catin bencilo que es relativamente
estable.Secreequedespussufreunrearregloparaformarelcatintropilioqueesmuy
estable,yestefuertepicoenm/z=91esunacaractersticadeloscompuestosquecontienen
ungrupobencilo.Elpicomenorenm/z=65representalaprdidadeunacetilenoneutrodel
iontropilioylospicosmenorespordebajodem/z=65surgencomoresultadodeuna
fragmentacinmscompleja.

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1.2.GruposFuncionales
Alcanos: Losalcanossuelensufrirunafragmentacinporlaprdidainicialdeungrupo
metilo para formar especies (m15). Este carbocatin puede sufrir una fragmentacin
subsecuentealolargodelacadenahidrocarbonadaexpulsandolasunidadesneutralesdedos
carbonos (etilenos). Los hidrocarburos ramificados forman carbocationes secundarios y
terciariosmsestables,yestospicossuelendominarelespectrodemasas.

HidrocarburosAromticos:Lafragmentacindelncleoaromticoesuntantocomplejo,
elcualgeneraunaseriedepicosquetienenunarelacincarga/masadem/z=77,65,63,etc.
Aunque estos picos son difciles de describir en trminos simples, forman un perfil (el
agregado aromtico) que se aprende a reconocer con la experiencia. Si la molcula
contieneunaunidadbencilo,larupturamsimportantegenerarelcarbocatinbencilo,el
cualsufreunrearregloparaformareliontropilio.Laexpulsindelacetileno(etino)genera
unpicocaractersticoconunam/z=65.

AldehdosyCetonas:Larupturapredominanteenlosaldehdosycetonaseslaprdidade
una de las cadenas laterales para generar unionoxoniosustitudo. Esta es una ruptura
extremadamentefavorableyesteiongeneralmenterepresentaelpicobaseenelespectro.El
derivadometilo(CH3C O+)comnmenteselellamaelionacilo

Otro tipo de fragmentacin comn que se observa en los compuestos carbonilo (y en

nitrilos,etc.)consisteenlaexpulsindeletilenoneutralenunprocesollamadoelRearreglo
McLafferty,quesigueelmecanismogeneralmostradoacontinuacin:

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Esteres,AcidosyAmidas:Delamismamaneraqueconlosaldehdosycetonas,laruptura
principalobservadaenestoscompuestoseslaexpulsindelgrupoX,comosemuestra
abajo,paraformarelionsustitudooxonio.Paracidoscarboxlicosyamidasnosustitudas,
lospicoscaractersticosenm/z=45y44tambinsepuedenapreciarenelespectro.

Alcoholes: Adems deperder unprotnyunradicalhidroxilo, losalcoholes tienden a

perder uno de los grupos (o hidrgenos) para formar iones oxonio. Para los alcoholes
primarios,estogeneraunpicoenm/z=31;enalcoholessecundariossegeneranlospicosen
m/z=45,59,73,etc.deacuerdoalasustitucin.

Eteres: Siguiendo el comportamiento de los alcoholes, los teres se fragmentan

generalmenteporlaprdidadeunradicalalquiloparaformarelionoxoniosustitudo,como
semuestraparaeldietilter.

Haluros: Loshalurosorgnicossefragmentanconlasimpleexpulsindelhalgeno.Los
ionesmolecularesdeloscompuestosquecontienencloroybromogeneranmltiplespicos
debidoalhechoquecadaunodeellosexistecomodosistoposrelativamenteabundantes.
As,paracloro,larelacin35Cl/37Clesaproximadamente3.08:1yparaelbromolarelacin
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Br/81Bresaproximadamente1.02:1.Elionmoleculardeuncompuestoquecontienecloro
tendrdospicosconunadiferenciadedosunidadesdemasa,enunaproporcinaproximada

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3:1,yuncompuestoquecontienebromotendrdospicosigualmenteconunadiferenciaen
masade2unidadesconintensidadesmuysimilares.

Figura4.Fragmentoscomunesenlosespectrosdemasa.

1.3MtodosdeIonizacin
1.3.1Ionizacinelectrnica(EI)
Teora
Loselectronessonproducidosporemisinterminicadesdeunfilamentodetungstenoo
renio.Unacorrientetpicadeunfilamentoesdelordende1x104amperios.Estoselectrones
salendesdelasuperficiedelfilamentoysonaceleradoshacialacmarafuentedeionesla
cualesmantenidaaunapotencialpositivo(igualalvoltajedeaceleracin)Loselectrones
adquierenunaenergaigualalvoltajeentreelfilamentoylacmarafuente(tpicamente70
electrovoltios,eV).Latrampadeelectronessemantieneaunpotencialfijopositivocon
respecto a la cmara fuente. Una porcin del haz de electrones golpear la trampa de
electrones produciendo la corriente de la trampa. Esta es usada como un circuito de
retroalimentacinparaestabilizarelhazdeelectrones.

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Figura5.EsquemadeunafuentedeIonizacinElectrnica.

Un imn permanente se coloca a lo largo de la cmara fuente para producir un flujo

magntico paralelo al haz de electrones. Esto causa que el haz de electrones tome una
direccindeespiraldesdeelfilamentohastalatrampa,aumentandolaprobabilidadyla
eficienciaparaionizarelanalito.Lasmolculasdeanalitosgaseosossonintroducidasenla
vadelhazdeelectronesendondesonionizadosporinteraccioneselectrnicasconelhazde
electrones.Laionizacinpuederealizarsetambinporimpactodirectodeunelectrncon
unamolculadeanalito.
El repulsor de iones con carga positiva y la excitacin negativa del voltaje actan
conjuntamente para producir un campo elctrico en la cmara fuente tal que los iones
saldrndelacmaraatravsdelaranuradesalidadeiones.Losionessondirigidospor
mediodevarioslentesdeenfoqueycentradosysonenfocadoshacialaranuradesalidade
lacmara.Esentoncescuandolosionespuedenseranalizadosporsumasa.

Mecanismosdeformacindeiones.
ConsidreselaionizacindelanalitoAB:
1. AB+e*>A++B+e
2. AB+e*>A++B+2e
3. AB+e*>[AB+*]+2e
seguidopor[AB+*]>AB+

4. AB+e*>[AB2+*]"+3e

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seguidopor[AB2+*]">A++B+bajaabundancia

5. AH+e*>AH*+e
seguidoporAH*+AH>[AH+H]++A'autoionizacinqumica'

Notas:
Especiesconunsuperndice*seencuentranenestadosdealtaenerga.
Especiesconunsuperndicesonradicales.
Especiesconunsuperndice"sonintermediariosdevidacortaquenopuedenser
vistosenelespectro.
1y2sonprocesosconaltaprobabilidaddeocurrenciadebidoalaaltaabundanciade
lasespeciesysedenominanfragmentacininstantnea.Estaeslaraznporlaquela
IonizacinElectrnicaesconsideradaunprocesodeionizacindura.
3tieneunaprobabilidadmoderadadeocurrirdebidoalarelativaabundanciadesus
especies y es el proceso responsable de la formacin molecular del ion.
Desafortunadamente el radical intermediario de alta energa [AB+*] tiende a
fragmentarse(orearreglarse)comounprocesodeestabilizacin,estodalugaralos
fragmentosionizadosdebajopesopresentesenelespectro.
4esunprocesoconbajaprobabilidaddeocurrirporlaescasezdesusespeciespero
tericamentesipuedeocurrir.
5esunprocesoquepuedeocurriraaltaspresiones(AutoionizacinQumica),esto
esespecialmenteproblemticoenlaionizacindealcoholesyaminasendondese
puede encontrar que el proceso dominante de ionizacin es el intercambio de
protonesentredosmolculasdeanalito,dandolugaralaformacindelionpseudo
molecular[M+H]+.
1.3.2BombardeoRpidodeAtomos(FAB)yEspectrometradeMasasdeIon
LquidoSecundario(LSI)
Teora
LastcnicasdeFAByLSIconsistenenelbombardeodeunamezclaslidadeanalito+
matriz por un rpido haz de partculas. La matriz esta formada por especies pequeas
orgnicas (glicerol o alcohol 3nitrobenclico) las cuales son usadas para mantener una
superficiehomogneafrescaparaelbombardeo,yporlotanto,extendiendoeltiempode
vidaespectralyacentuandolasensibilidad.EnFAB,elhazdepartculasesungasinerte
neutral,comnmenteAroXe,conenergasdebombardeode410keV,mientrasqueen
LSI,elhazdepartculasesunion,tpicamenteCS+,conenergasdebombardeode230
KeV.

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Elhazdepartculasincideenlasuperficiedelanalitoendondetransfieremuchadesu
energaalosalrededores,generandocolisioneseinterferenciasmomentneamente.Algunos
compuestossonexpulsadosfueradelasuperficieenformadecationesyanioneseneste
proceso,yestosionessecundariosliberadossonluegoextradosdelafuenteyanalizados
porunespectrmetrodemasas.Lapolaridaddelafuentedeextraccinpuedesercambiada
dependiendoquecompuestoseestaanalizando.

Figura6.EsquemadeunafuenteRpidadeBombardeoAtmico(FAB).

Lafigura6muestraunesquemaquerepresentaunafuenteRpidadeBombardeoAtmico
operandoenmododeionpositivo.Elrpidohazatmicoincideenlasuperficiedelanalito
+matrizendondeproduceunaliberacindeionessecundarios.Losionespositivosson
extradosdelafuentehaciaelespectrmetrodemasas.
LastcnicasFAByLSIsoncomparativamentetcnicasdeionizacinsuave,yporlotanto
sonadecuadasparacompuestosdabajavolatilidad,queproducentpicamentegrandespicos
para las especias inicas pseudo moleculares [M+H]+ and [MH], conjuntamente con
fragmentosinicosestructuralmentesignificativosyalgunosagregadosinicosdemayor
pesomolecularydmeros.
1.3.3.IonizacinporElectrospray
Teora

18
Laproduccindeionesporevaporacindegotascargadaselctricamenteobtenidamediante
asperjadooburbujeoseconocedesdehacesiglos,perosolorecientementesedescubrique
estosionespuedencontenermsdeunacarga.UnmodelodelaformacindeionesenESI,
quecontienelostemascomnmenteaceptadossedescribeacontinuacin:
Grandesgotascargadasseproducenpornebulizacinneumtica;porejemplocuandose
forzaapasarlasolucindelanalitoatravsdeunaaguja,dondealfinaldestaseaplicaun
potencial;elpotencialusadoessuficientementealtoparadispersarlasolucinquesaleen
pequeas finas gotas cargadas todas a la misma polaridad. El solvente se evapora,
disminuyendoelvolumendelagotay aumentandolaconcentracindelacargaen la
superficiedelagota.Eventualmente,enellmitedeRayleigh,larepulsinculmbicasupera
latensinsuperficialdelagotaystaexplota.Estaexplosinculmbicaformaunaseriede
gotasmspequeasymenoscargadas.Elprocesodedisminucindevolumenseguidodela
explosin se repite hasta que se logran formar iones individuales cargados del analito
puro. Las cargas estn estadsticamente distribuidas en todos los sitios de carga
disponiblesdelanalito,dandolugaralaposibleformacindemltiplesionescargadosen
lascondicionescorrectas.Aumentarlavelocidaddeevaporacindelanalitointroduciendo
unflujodegasdesecante acontracorrientealosionesasperjadosaumentaelgradode
cargadomltiple.Sisedisminuyeeldimetrocapilarysedisminuyeelflujodelasolucin
delanalito,comoenionizacinnanospray,seproducirnionesconunaproporcinmsalta
dem/z(esunatcnicadeionizacinmassuave)quelosproducidosporunESIconvencional
ysondemayorutilidadenelcampodebioanlisis.

Figura7.Esquemadeladistribucintpicadeunafuentedeelectrospray.

19
1.3.4.Desorcin/IonizacinlserasistidaenMatriz(MALDI)
Desorcinlser
El estudio de los compuestos polares siempre ha sido un problema para la
espectrometrademasas.Sedemostraprincipiosdeladcadade1960quelaradiacinde
muestrasorgnicasdebajopesomolecularconunpulsolserdealtaintensidad,produce
ionesquepuedenseranalizadosporsumasa.
Desdeestosprimerosexperimentos,ladesorcinlser(LD)hasidoejecutadaconunamplio
rangodecondicionesinstrumentalesyunagranvariacinenlacalidaddelosresultados.La
aplicacin de LD al anlisis de macromolculas biolgicas polares no voltiles,
macromolculasorgnicasypolmerosfueunpasoimportanteeneldesarrollodeLD.Sin
embargo,estosexperimentosrevelarontenerunlmitemximoparaelpesomolecularde5
10kDa.
ElrequisitoprimarioparaunaDesorcinLserexitosaesquelatransferenciadeenergadel
rayo lser hacia el analito debe ocurrir en el menor tiempo posible para prevenir la
descomposicin de las molculas trmicamente lbiles del analito. El lmite del peso
molecularesprobablementedebidoaquelaenerganecesariaparaprovocarlaexcitacin
resonanteylatransferenciaexitosadeenergaesmsgrandequelaenergadedisociacin
del analito. Por lo tanto, el analito no se desorbe quedando intacto en una cantidad
significativa dando como resultado un espectro de fragmentos de bajo peso molecular
solamente.
OtrarestriccinimportantedelaionizacinLDeslacortaduracindeldestelloinicoque
se produce despus del pulso lser. Una consecuencia de esto es que la tcnica no es
adecuadaparainstrumentosdeanlisisdebarridoensectoroencuadrupolos.Estoindica
queLDesparticularmenteadecuadaparaespectrometrademasasdeTiempodeVuelo
(MS/TOF).
DesarrollodelaDesorcin/IonizacinasistidaenMatriz(MALDI)
En1987,sedescubriqueelusodeunamatrizenDesorcinLser(LD)podraliberarla
limitacinrestrictivadelpesomoleculardelatcnica.Losrequisitosdelamatrizsonque
tengaunafuerteabsorbanciaenlalongituddeondalseryquetengaunpesomolecular

20
suficientementebajoparapodersublimarse.Elanalito,abajaconcentracin,sedispersa
uniformeycompletamenteenlamatrizslidaolquida,depositadaalfinaldeunasondao
enunaplacametlicaeintroducidaalpulsodelrayolser.
Unaanalitoabajaconcentracintieneventajasimportantes:

Laeficienciadelatransferenciadeenergadellseralanalito(atravsdelamatriz)
aumenta,mientrasquelos problemas asociadosconladisociacindelanalito se
reducensignificativamente.

La asociacin de las molculas de analito para formar agregados de alto peso

molecular tambin se reduce y se cree que ciertas matrices especficas pueden
inclusiveacentuarlaformacindeiones.

MecanismodelaDesorcinInica
ElmecanismodelatcnicaMALDInosehacomprendidototalmente,perosecreeque
funcionadelasiguientemanera:

21

Figura8.EsquemadedesorcinporMALDI.

(i)LaformacindeunaSolucinSlida.
Lasmolculasdeanalitoestncompletamentedistribuidasentodalamatrizdemaneraque
se encuentran aisladas unas de otras. Esto es necesario para que la matriz forme una
solucin slida homognea (cualquier solvente lquido usado en la preparacin de la
solucinseretiracuandolamezclasesecaantesdelanlisis)
(ii)ExcitacindelaMatriz.
Algo de la energa lser incidente en la solucin slida es absorbida por la matriz,
produciendorpidasvibracionesycausandounadesintegracinlocaldelasolucinslida
formando agregados compuestos de molculas individuales de analito rodeadas de
molculasdematrizneutrasyexcitadas.Lasmolculasdelamatrizseevaporandeestos
agregadosdejandoatrslamolculaexcitadadelanalito.
(iii)IonizacindelAnalito.
Lasmolculasdeanalitopuedenionizarseporsimpleprotonacinporlamatrizexcitada
fotnicamente,dandolugaralaformacindelcompuestotpicodetipo[M+X]+ (donde
X=H, Li, Na, K, etc.). Algunos compuestos con carga mltiple, dmeros o trmeros se
pueden formartambin.Seproducenaniones porlas reaccionescondesprotonacindel
analitoporlamatrizparaformar[MH]yporlasinteraccionesconlosfotoelectronespara
formarionesmolecularesradicales[M].

22
Estasreaccionesdeionizacinocurrenenlasprimerasdecenasdenanosegundosdespusde
laradiacin,ydentrodelanubededesorcininicialdematriz/analito.Esenestaformaen
queseproduceelespectrocaractersticoMALDI,dandolugartpicamenteagrandesseales
paracompuestosdeltipo[NM+X]n+(N*n).

1.4.MtodosdeAnlisis
1.4.1.AnlisisdeDobleSector
Teora
Losionesseacelerandesdelafuente,bajolaaccindeunvoltaje,Va,yentranalanalizador
electrostticoelcualfuncionacomouninstrumentodedireccionamientodeenerga.Debido
alanaturalezafsicademuchostiposdeionizacin,losionesconunamismamasaycarga
se producen con una energa de distribucin, la cual, si no se corrige, disminuir
drsticamente la resolucin observada y la precisin en la medicin de la masa. El
analizadorelectrostticodirigelosionesconunamismarelacincargamasa,m/z,haciauna
trayectoriamscoherenteatravsdelsectormagntico.
Elsectormagnticoconsisteenuntuboampliocolocadoentreunimnvariabledefuerzade
campoByradior(comnmente60 O 120O).Alcambiarelcampomagnticolafuerza
dirigir a los iones de diferente relacin masacarga hacia el punto de doble
direccionamiento(figura9)yenconsecuenciahaciaeldetectordeiones(usualmenteun
multiplicadorelectrnico).

23

Figura9.Esquemadeunespectrmetrodemasasdedossectores.Componentesbsicosdeunespectrmetro
demasasdedossectores(electrosttico/magntico).

Ionesdemasam,cargazyvelocidadv,entranalcampomagnticoconunaenergacintica
definidaporlaecuacin1,lacuallaadquirieronalsalirdelaranuradelafuente.

Ecuacin1:
La fuerza centrfuga experimentada por los iones debe balancear la fuerza de Lorentz
ejercidaporelcampomagntico(fuerzaB,radior)paraqueseadirigidohaciaelpuntode
dobledireccionamiento.
1.4.2.EspectrometradeMasasdeTiempodeVuelo(TOF)
Teora
ElespectrmetrodemasasTOFeselmssimpledelosanalizadoresdemasasytieneuna
muyaltasensibilidadenvirtualmenteunrangoilimitadodemasas.Losionesdelamuestra
segeneranenunazonafuente,s,enelequipo,porcualquieradelosmtodosdeionizacin.
UnpotencialVs(lafuentedeextraccin)seaplicaalolargodetodalafuenteparaextraery
acelerarlosionesdelafuentehacialazonalibredecampod,delequipo.

24

Figura 10. Desorcinlaserdeunespectrmetrodemasascontiempodevuelo.(A)Unsistemalinealde

tiempodevueloenelcuallosionesgeneradosporladesorcinlaserseaceleranatravsdelaregindela
fuentedeioneshaciaeltubodecampolibrequevaaldetector.(B)Unsistemadetiempodevueloconun
espejo reflectrn de iones que invierte la trayectoria de vuelo de los iones de manera que corrige las
diferenciasenlaenergacinticadelosionesconlamismam/z.

Enuncasoideal,todoslosionesproducidossaldrndelafuentealmismotiempoconla
misma energa cintica, debido a que fueron acelerados por la misma diferencia de
potencial.Enestecaso,losionesproducidosporlatcnicaTiempodeVuelo,dependern
solamentedelamasaydelacargaproducidaenelion.Descartandoeltiempodeextraccin
delafuente,lafrmulabsicaparaelanlisisdemasasporTOFestdadaporlasiguiente
ecuacin:

Donde:

mi=masadeliondeanalito

zi=cargaeneliondeanalito

25

E=campodeextraccin

ti=tiempodevuelodelion

ls=longituddelafuente

ld=longituddelareginlibredecampomagntico

e=cargaelectrnica(1.6022x1019C)

Paraobtenerunespectrodemasasconfiable,eltiempodeextraccindeliondebeserdeuna
altaprecisin.Esteproblemaseabordageneralmenteusandounatcnicadeionizacinde
pulsos como la desorcin lser o MALDI. Hay ciertos problemas con las tcnicas que
causanunadistribucineneltiempodevueloparacadamasa,yporlotantodisminuyenla
resolucin.Estosfactoresdebensercorregidossisedeseaunespectrodealtaresolucin.
Paraobtenerunaaltaresolucinserequiereusarlosequiposmscomplejosreflectrn,tubos
mslargosy/oextraccininicaretrasada.
1.4.3.AnalizadordeMasasdeCuadrupolos
Teora
En un analizador de masas de Cuadrupolos, se usan campos elctricos solamente para
separarlosionesdeacuerdoasurelacincargamasa.Uncuadrupoloconsisteencuatro
varillasparalelasopolosatravsdeloscualessehacenpasarlosionesaseparar.Lospolos
reciben una corriente directa fija y voltajes de radio frecuencia (RF) alternantes.
Dependiendodelcampoelctricoproducido,solamenteionesconciertarelacindecarga
masa serndirigidos haciaeldetector;todoslosdems ionesserndesviadoshacialos
polos.Alvariarlafuerzaylafrecuenciadeloscamposelctricos,diferentesionespueden
ser detectados y formar el espectro de masas. La trayectoria de un ion a travs del
cuadrupoloesmuycompleja.

26

Figura 11. Esquema de un analizador de masas de Cuadrupolos. Las cuatro varillas muestran un rea
transversalcircularperoenlaprcticasondereatransversalhiperblica.

Dospolosopuestostendrnunpotencialde+(U+Vcos(t))ylosotrosdos(U+Vcos(t))
dondeUesunpotencialfijoyVcos(t)representauncampodefrecuenciaderadio(RF)
deamplitudVyfrecuenciacos(t).Cuandocos(t)seencuentraenfaseconeltiempo,t,
losvoltajesaplicadosenparesdepolosopuestosvariarndemanerasinusoidalperoen
polaridad opuesta (debido a que estn en fase opuesta). A lo largo del eje central del
cuadrupoloytambinenelejeentrecadapoloadyacenteelcampoelctricoresultantees
cero.Endireccintransversaldeloscuadrupolos,unionoscilarentrelospolosconuna
trayectoria compleja, dependiendo de su relacin cargamasa, los voltajes U, V y la
frecuencia del potencial alternante RF. Mediante una seleccin adecuada de U,V y wc
solamente iones con una relacin cargamasa oscilarn de manera estable a travs del
analizadordemasasdecuadrupolohaciaeldetector.Todoslosdemsionestendrnuna
mayoramplituddeoscilacinhaciendoqueseestrellenenunodelospolos.Enlaprctica,
lafrecuenciasemantienefijaconvalorestpicosentre12MHz.
Lalongitudydimetrodeloscuadrupolosdeterminarelrangodemasasylaresolucin
finalquepuedeconseguirseporelconjuntodecuadrupolos.Sinembargo,elrangomximo
quepuedelograrseesalrededorde4000kDaconunaresolucindeaproximadamente2000.

27

1.4.4.TransformadadeFourierdeResonanciaIonCiclotrn(FTICR)
Teora
LaespectrometrademasasporresonanciaionciclotrntransformadadeFourier(FTICR)
esprobablementeelmtodomscomplejodeanlisisdemasas.Latcnicahapasadoporun
complejodesarrollodesdesuconcepcinamediadosdelosaos50s.Eslamssensiblede
lastcnicasdeusocomnhoyenda,ytienecasiunaresolucindemasasilimitada,>106
puedeobservarseconlamayoradelosinstrumentosytieneresolucionesenelrangode104
a105.
ElespectrmetrodemasasFTICRconsistedetresseccionesprincipales.Laprimeraesla
fuentedelamuestra,lacualpuedeserprcticamentecualquieradelastcnicas,aunqueESI
yMALDIsonlasmscomunes.Lasegundaseccineslaregindetransferenciainica,
dondelosionesgeneradosenlafuentesondirigidos,agrupadosytransferidoshaciauna
regindealtovacoantesdeentraralaceldadeanalizador.Lareginfinaleslacelda
misma. Es posible, en algunos casos (especialmente con MALDI) generar iones
directamente en la celda; esto evita la necesidad de las regiones complejas de
direccionamientoinicoybombeo.
ElarregloestndarparalaregindelanalizadordelequipodeFTICR,esunatrampainica
colocadadentrouncampomagnticoestticoB0espacialmenteuniforme.Elefectodel
campomagnticoesrestringirlatrayectoriadelosionesincidentesaunarbitacircular,
cuyafrecuenciaesdeterminadaporlamasam,lacargaz,ylavelocidadv,delion,por
accindelafuerzadeLorentz,definidaenlaecuacin1.Eliondelanalitoesdesviadohacia
unatrayectoriacircularenunplanoperpendicularalcampomagntico.

28

Figura12.Esquemadelatrampadeiones,laexcitacinyladeteccindeionesparaproducirunespectrode
masasenespectrometrademasasFTICR.

Lapresenciadeionesentreunpardeelectrodosdeldetector(enlaceldadelatrampa)
realmente no producir ninguna seal medible. Es necesario excitar los iones con una
relacincargamasaespecficacomounpaquetecoherenteparaunradioorbitalmslargo
aplicandounbarridoderadiofrecuenciadepocosmilisegundosatravsdelacelda.Una
frecuenciadadaexcitaraunionconunarelacincargamasaparticular(Latransformada
de Fourier permite medir todas las frecuencias simultneamente). La medicin de la
frecuenciaangular(ecuacin2)llevaavaloresderelacincargamasa(ecuacin3)yporlo
tantoalespectrodemasas.Debidoaquelafrecuenciapuedesermedidademanerams
precisaquecualquierotrapropiedad,latcnicatieneunamuyaltaresolucindemasas.
Despusdelaexcitacin,alosionesselesdejarelajarseyregresarasuestadonaturalde
movimientoparasermedidosnuevamentesiesnecesario.
1.4.5.AnlisisenTrampaInica
Teora
El analizador de masas con cuadrupolo y trampa inica consiste de tres electrodos
hiperblicos:elelectrodocircular,elelectrododetapadeentradayelelectrododetapade
salida.Estoselectrodosformanunacavidadenlaqueesposibleatraparyanalizariones.Los
doselectrodosdetapatienenunpequeoorificioensucentroatravsdeloscualeslosiones
puedenpasar.Elelectrodocircularseencuentraalamitadentrelosdoselectrodosdetapa.

29

Figura13.Componentesbsicosdeunespectrmetrodemasasdetrampainica

Los iones generados desde la fuente entran a la trampa a travs del sistema de
direccionamientodeentradayelelectrododetapadeentrada.Seaplicanvariosvoltajesa
loselectrodosparaatraparyexpulsaralosionesdeacuerdoconsurelacincargamasa.Se
aplicaunpotenciala.c.defrecuenciaconstanteyamplitudvariablealelectrodocircularpara
producir un campo potencial cuadrupolar 3D dentro de la cavidad de la trampa. Esto
atraparalosionesenunatrayectoriaoscilanteestableconfinadaenlaceldadelatrampa.
Lanaturalezadelatrayectoriadependedelpotencialdelatrampaodelarelacincarga
masadelosiones.Duranteladeteccinlospotencialesdelsistemadeelectrodossealteran
paraproducirinestabilidadesenlastrayectoriasdelosionesyenconsecuenciaexpulsana
losionesenunadireccinaxial.Losionessonexpulsadosenordencrecientedeacuerdoa
surelacincargamasa,dirigidosporellentedesalidaydetectadosporelsistemadetector
deiones.
1.4.6.EspectrometriadeMasasenTndem
Eltrminotndemindicaelusodeunasegundaetapadeanlisisdemasasenel
mismo experimento. Esto da lugar a la capacidad de estudiar selectivamente iones
especficos en una mezcla compleja para obtener informacin estructural sobre ese ion.
Acoplandodosanalizadores,separadosporunacmaradecolisionessepuedeobtenerms
informacindelamolcula.Elprimeranalizadorseusaparaseleccionareliondeinters.
Esteionsehacepasarluegohacialacmaradecolisiones,lacual,usualmenteseencuentra

30
presurisadaconungasinerte.Lacolisindelionconlos tomos enlacmarapueden
inducirladisociacindelion.AesteprocesoseleconocecomoDisociacinInducidapor
Colision(CID).Elionoriginalselellamaionprecursoryalosionesdisociadosseles
conocecomoionesproducidos.Estosionesproducidosluegoseanalizanenelsegundo
espectrmetrodemasasdandolugaraunespectrodemasasdeionesproducidosdelion
original.
EstosanlisisseconocencomoMSnendondensignificaelnmerodeetapasdeanlisis
demasas.UnespectroMS2oMS/MSdeionesproducidoscontienedosetapasdeanlisis.

Figura14.Caracterizacinestructuraldeunionseleccionadoenbaseasumasaporespectrometrademasas
entndem.Elanlisisdemasadelionprecursordeterminalam/zdelpptidoionizadodeinters.Eseionse
seleccionaenbaseasumasaenlaprimeraetapadelanlisisyseactivaporcolisinconunamolculadegas
neutralparainducirlareaccindefragmentacin.Losionesproducidosdelareaccindefragmentacinse
analizanenlasegundaetapadelanlisisdemasaparaproducirunespectrodeionesproducidos.

LaMS/MSproporcionainformacinestructuralmedianteelestablecimientoderelaciones
entrelosionesprecursoresysusfragmentosproducidosporlascolisiones.

Laespectrometrademasasentndempuedeclasificarseendostipos:
Tndemenespacio:

Cuadrupolosentndem
ReflectrnTiempodeVuelo
Sectorentndem

31

SectorCuadrupolo

Tndementiempo:

Trampainica
TransformadadeFourier

Figura15.Unarepresentacindecuatromodosdebarridodeespectrometrademasasentndem(A).Modo
estndardeanlisis,elprimeranalizadorylacmaradecolisionestransmitentodoslosionesparaqueel
segundo analizador realice el anlisis de masas. (B) Barrido de iones producidos, el ion en estudio se
seleccionadeacuerdoasumasaenelprimeranalizadorysefragmentaenlacmaradecolisiones.Enel
segundoanalizadordemasasseanalizalamasadelosionesproducidos.Lasealeselresultadodelosiones
producidosderivadosdelionprecursorquefueseleccionadoenbaseasumasa.(C)Barridodeionprecursor,
enelprimeranalizadorserealizaunbarridosecuencialparatransmitirlosioneshacialacmaradecolisiones
parasufragmentacin,elsegundoanalizadorseleccionaelionproducidodeintersdeacuerdoasumasa.La
sealquellegaaldetectoreselresultadodetodoslosionesprecursoresquesepudieronfragmentarenunion
producidocomn.(D)Elbarridodeprdidaneutral,elanlisisdemasasserealizaenambosanalizadores
enlazndolos con una diferencia constante en masa. La seal que llega al detector es el resultado de la
fragmentacindelosionesprecursoresalperderunaespecieneutralespecfica,formandounionconuna
diferenciademasacaracterstica.

32

EquiposdeTndemenespacio.
Losequiposenlacategoradetndementiempoutilizanmsdeunanalizadordemasasque
funcionanindependientementeduranteelexperimento.Elejemploclsicodeestetipode
equiposeseldeCuadrupolosenTndem,alcualseleconocecomoespectrmetrodetriple
cuadrupolo.Seempleaunanalizadorcuadrupoloenambasetapasdeanlisisdemasascon
una cmara de colisiones entre los dos analizadores. Las primeras versiones del
espectromtrodetriplecuadrupolousabanotrocuadrupoloparalacmaradecolisiones,y
poresoelnombredetriplecuadrupolo.Elpropsitodeestesistema,esqueenlacmarade
colisionessellevenacabolascolisionesqueproducirnlaactivacinyfragmentacinala
vezderetenerlosionesdetodoslostamaosyliberarloshacialasegundaetapadeanlisis
demasas.
Otroequipodetndementiempoutilizadoparalasecuenciacindeprotenastieneun
cuadrupoloparaelprimeranalizadordemasasyunanalizadorTiempodeVuelo(TOF)
paraelsegundoanalizador.Ademsutilizaunsistemadelentesoctapoloalrededordela
cmaradecolisiones.Ladiferenciaprincipalenestetipodeequipoesqueelespectrode
masasyelespectrodedeionesproducidosseregistranenunanalizadorTOFcontodassus
ventajascaractersticas.
Untercertipodeequiposdetndemenespacioeselanalizadordemasasconfiguradopara
estudiarreacionesdePostSourceDecay(PSD).Lacaractersticaparticulardeestosequipos
yelequipoestndarReflectronTiempodeVuelo,eslacompuertaelectrostticautilizada
paralaseleccindeionesprecursores.Estascompuertasutilizanpulsosdevoltajepara
desviarlosionesdem/znodeseadosdelaentradaaltubodevuelo.Debidoaquela
resolucinm/zdeestascompuertasesrelativamentebaja(ej,100)laseleccindeuniona
unm/zde1000Thpermitetransmitiroliberarenunaventanadem/zcercade20Th.

Figura 16. Diagrama deunespectrmetro de masascon cuadrupolos en tndem. Enun experimento de

espectrometraentndem,ambasetapasdelanlisisdemasasserealizanconunfiltrodemasascuadrupolo.
Lacmaradecolisinesunsistemadelentesoctapoloquecontieneytransmiteionesdecualquierm/z.Para

33
medicionesdepesomolecular,elprimercuadrupoloseutilizaenunmododeradiofrecuenciaparatransmitir
todoslosionesyelsegundocuadrupolorealizaelanlisisdemasas.

EquiposdeTndementiempo.
Losequiposquerealizanespectrometrademasasentndemeneltiempoconstandesolo
unanalizador,quepornececidad,esteanalizadordebesercapazdeatrapariones.Un
ejemplodeestosequiposeselespectrmetrocontrampainica.Otrosequiposenesta
categorasonlosdeResonanciaIonCiclotrn(ICR).

Enunespectrmetrocontrampainica,elanlisisentndemcomienzaatrapandoionesde
todaslasm/z.Seaplicanunaseriedefuncionesdebarridoderadiofrecuencia(rf),locual
liberadelatrampaatodoslosionesexceptoalosquetienenlam/zdeinters.Enestas
colisiones,laenergacinticadelascolisionesseconvierteenenergainternaenelionpara
inducirlafragmentacin.Finalmenteseefectaunanlisisdemasasensecuenciapara
medirlarelacinm/zdetodoslosionesproducidos.
Laespectrometrademasasentndemtambinpuedeserempleadaparacuantificacin.
Esto se logra mediante el registro en dos etapas del ion seleccionado. El primer
espectrmetroseconfiguraparatransmitireliondeintershacialacmaradecolisionesy
posteriormenteunodesusionesproducidossemonitoreaenelsegundoespectrmetrode
masas.
Laespectrometrademasaspuedeutilizarsetambinparaefectosdeseleccinyexistendos
tcnicasprincipales.Elsegundoespectrmetroseconfiguraestadsticamenteparatransmitir
ionesproducidosseleccionadosconunarelacinm/zespecfica.Estamasasemonitorea
constantementemientrasqueelprimerespectrmetroserealizaunbarrido.Sedetectauna
sealsolamentecuandounionprecursorsefragmenteenelionqueseestamonitoreando.
EstatcnicaseconocecomoBarridodeIonprecursoryseusageneralmenteparafiltrar
unamatrizcompleja(ej.orinaofludoscorporales)conelfindelocalizarcompuestoscon
estructurarelacionada,comometabolitosdeunadrogaconocida.
La otra tcnica es el Barrido de Prdida Neutral Constante. En esta tcnica, ambos
espectrmetrosrealizanbarridossimultneamenteperoseencuentrandesfasadosporuna
cantidad fija que corresponde a la diferencia de masa entre el ion precursor y el ion
producido.Lasealaparecesolocuandoelionprecursorgeneraunionproducidoconla

34
diferencia de masa seleccionada. Esta tcnica puede ser utilizada para seleccionar
compuestosquecontenganunacaractarsticaestructuralespecficaquegenereunprocesode
fragmentacincomn.
1.4.7.PSDMALDI
Elmtodoestabasadoenelanlisisdelosionesproducidos(ionesPSD)enlaprimera
reginlibredecampomagnticodeunreflectrnenunespectrmetroconTiempodeVuelo
(TOF).
AlcontrariodelanlisisdepesomolecularporMALDI/MStradicional,laproduccinde
ionesesmejoradacambiandoaundiseoapropiadodelafuentedeionesmientrasqueel
anlisis de los iones producidos se procesa mediante una evaluacin de los tiempos
caractersticosdevuelodelosionesPSDenelreflectron.
CristalizacindelaMuestra/Matriz
Lamatriztienetresprincipalesfunciones:
Laseparacinysolvatacindemolculasdeanalitoenlafaseslida,
evitandosuaglomeracin.
Absorberlaenergadelrayolaserutilizadaparaladesorcineionizacin
delamatrizyelanalito.
Laionizacindeanalito(protonacin)mediantereaccionescido/baseen
lafasegaseosa.
Lamatriztienegeneralmenteunaltoespectrodeabsorcinenlalongituddeondadellser
usado, mientras que generalmente el analito, aunque no necesariamente, tiene baja
absorcin.Lasolvatacindelanalitoyladesorcindemolculasdeanalitoentreellas,
requieren de la formacin, durante la preparacin, de cristales de la matriz, los cuales
incorporanelanalitoalareddelamatriz.
DesorcineIonizacin
Lasmolculasdelamatrizsecalientanyseexcitanrpidamenteporlaabsorcindefotones,
dando lugaraunarpidaexpulsin dematerial.Lasmolculasprotonadasdelamatriz
(iones de la matriz) se formandespus deuna seriedereacciones fotoqumicas que se
sucedenrpidamenteenunafasedensajustoencimadelasuperficie.Pocodespus,enuna
fasemenosdensa(aundentrodeunadistanciade1mmdelasuperficie)sellevaacabola

35
ionizacindelasmolculasdeanalitoporlatransferenciadeunprotndelosionesdela
matrizalasmolculasneutralesdelanalito;estoesdebidoaunamayorafinidaddelanalito
porprotones.
Activacindentrodelafuente
Dadoqueenlaplumadedesorcinpredominanmolculasneutrasdelamatriz,seproducen
frecuentescolisionesdebajaenergadelosionesconestasmolculasneutralesdurantela
aceleracinenlosprimerosmicrosegundosdespusdelpulsolser.Ladensidaddelanube
demolculasneutralesylaenergacinticadelosionesdeanalitoquecolisionansonlos
dosfactoresclaveparafragmentacionessubsecuentes.Unamayordensidadyunamayor
energa de colisin resultan en una activacin ms eficiente y en fragmentaciones
subsecuentes (ms seales de fragmentos inicos). La densidad neutral se controla
principalmenteporlaradiacindellser,latemperaturadesublimacindelamatrizyel
dimetrodeenfoque.Laenergadecolisin,porotrolado,secontrolabsicamenteporla
fuerzadecampoinicialdeaceleracin.
Desactivacininica
Losionesactivadosporcolisinpasanaunestadodedesactivacinenlareginlibrede
campomagnticodelespectrmetro.Estadesactivacintienevelociadadesktpicamenteen
elrngode2,00030,000seg1.Lasvelociadadesdedesactivacindisminuyenalaumentar
lamasadelion.LalargareginlibredecampodeunespectrmetrodemasasTOFesporlo
tantounabuenaopcinparaobtenerunaaltaeficienciadefragmentacin.
Anlisisdemasa
Losfragmentosinicos(ionesPSD)formadosenlareginlibredecampomagnticotienen
una velocidad igual a la de los iones precursores y, en un equipo lineal TOF, seran
detectadosenelmismotiempo.Laenergacinticadelosionesenunamedidadirectadela
fraccin de la masa del ion precursor. Los fragmentos pequeos (con menos energa
cintica)sonreflejadosprimeroyporlotantotomantrayectoriasmslargasatravsdel
reflectorquelosfragmentosmsgrandes.Paraconocerelespectrocompletodelosiones
PSD desde los fragmentos con menor masa, es necesario obtener varios espectros a
diferentespotencialesenelreflectorparadirefentesenergascinticas.Despusdepasarla
segundareginlibredecampomagnticodelequipoTOF,losionesPSDsedetectanenun
detectordeionescomncomounaplacademicrocanalesounmultiplicadorelectrnico.

36

Figura 17. Un equipo reflectrn con tiempo de vuelo y una compuerta inica. La compuerta inica se
mantieneaunvoltajepositivoexceptoduranteunpequeointervalo,especficoparatransmitirselectivamente
ionesaunaciertam/z.Lafragmentacindebeocurrirantesdeentraralreflectrn,elcualseparalosiones
producidosdeacuerdoalacantidaddeenergacinticaquellevan.

II.Secuenciacindeprotenasporespectrometrade
masas
Los pptidos y protenas son polmeros constitudos por combinaciones de los 20
aminocidosmscomunesunidosporpuentespeptdicos.Adems,lasprotenasproducidas
porlosribosomaspuedensufrirmodificacionescovalentes,llamadasmodificacionespost
traduccionales.Msde200modificacioneshansidodetectadas,lasmsimportantesson:
glicosilacin,formacindepuentesdisulfuro,fosforilacin,hidroxilacin,carboxilaciny

37
acetilacin del cido Nterminal. La espectrometra de masas no slo permite la
determinacinprecisadelpesomolecularsinotambinladeterminacindesussecuencias.
Tabla1.Modificacionesposttraduccionalesyvariacionesenlamasadelaprotena
Modificacinposttraduccional
Metilacin
Propilacin
Sulfacin
Fosforilacin
Glicosilacionespor:
Desoxihexosas(Fuc)
Hexosaminas(GlcN,GalN)
Hexosas(Glc,Gal,Man)
NAcetilhexosaminas(GlcNAc,GalNAc)
Pentosas(Xyl,Ara)
cidosilico(NeuNAc)
Reduccindeunpuentedisulfuro
Carbamidometilacin
Carboximetilacin
Cisteinilacin
Etilpiridilacin
Acetilacin
Formilacin
Biotinilacin
Farnesilacin
Miristoilacin
CondensacinShiffdelpiridoxalfosfato
Estearoilacin
Palmitoilacin
Lipoilacin
CarboxilacindeAspoGlu
DeamidacindeAsnoGln
Hidroxilacin
OxidacindeMetionina
Protelisisdeunpuentepeptdico
DesaminacindeGlnapiroglutmico

Diferenciademasa(Da)
14.03
42.08
80.06
79.98
146.14
161.16
162.14
203.19
132.12
291.26
2.02
57.03
58.04
119.14
105.12
42.04
28.01
226.29
204.36
210.36
231.14
266.47
238.41
188.30
44.01
0.98
16.00
16.00
18.02
17.03

2.Determinacindelaestructuraydelasecuenciapor
espectrometrademasas

38
Elanlisisdeprotenaspuededividirseendoscategorasbsicas:anlisisdemasasy
secuenciacindeaminocidos.Lahabilidadparamedirde maneraprecisalamasadela
protena intacta sirvi como un mtodo para revisar rpidamente si la secuencia de la
protenaeracorrectaoparadeterminarlapresenciademodificacionesposttraduccionales.
Se ha mejorado con gran xito las tcnicas para medir las masas moleculares de las
protenas separadas por electroforesis en gel utilizando MALDI/TOF directamente, para
lograresto,lasprotenassontransferidasaunamembranaadecuadaocortadasdirectamente
delgel.Elcortedelgeldeshidratadoolamembrana,escolocadoenellugardelamuestra,
tratadoconunasolucinmatrizeirradiadaconlser.Laprotenaseliberadelgelola
membranaysedeterminalamasamolecular.

2.1.Fragmentacin
Sisequiereobtenerinformacinestructuralpormediodeespectrometrademasas,la
molculaqueseestudiadebedecortarseenunoovariosenlacesdelesqueletopeptdico
paradespuscorresponderelvalordem/zdelosfragmentosresultantesconsuestructura
qumica. Las tcnicas ms comunes implican la formacin de iones estables que no
producenfragmentos.Estacaractersticaseusaparadeterminarelpesomoleculardelos
pptidosoprotenasauncuandoseencuentrenenunamezclacompleja.Sinembargo,esta
misma caracterstica conlleva una falta de informacin respecto a su estructura. Este
inconvenientesepuedesuperartransfiriendoporlomenoslaenergaextrarequeridaparala
fragmentacinalosionesestablesproducidosdurantelaionizacin.Aunquevariastcnicas
permiten una transferencia de energa, tales como la fotodisociacin y la disociacin
inducidaensuperficie,elmtodomscomneslaDisociacinInducidaporColisin(CID).
LosfragmentosqueresultansonanalizadosutilizandoMSn
Los espectros de masa en tndem pueden ser obtenidos utilizando los instrumentos ya
mencionados como analizadores magnticos, trampas de iones, cuadrupolos, etc. La
diferenciabsicaentretodosestosmtodosradicaenlacantidaddeenergacinticadelos
iones. En instrumentos magnticos la energa del ion precursor es de varios kilo
electrovoltios(keV)mientrasqueenlosotros,comoloscuadrupolosotrampasinicas,la
energacinticanuncaexcedelos100eV.Estadiferenciaenenergainfluye,obviamente,en
elprocesodefragmentacin.Losespectrosdealtaenergaentndempresentanunamplio
rangoderutasdefragmentacin,algunasdelascualesnoseobservanabajaenerga.Un
nmeromayordeionesdefragmentosfrecuentementetienenmsinformacinperotambin
incrementanladificultadparainterpretarelespectro.

39

ElanlisisMS/MSdemuchospptidosconsecuenciasconocidasydesconocidaspermite
identificarlosdistintosprocesosdefragmentacinexistentes.Hayrutasdefragmentacin
rarasyotrasmscomunesqueocurrendependiendodelascondicionesenlasqueserealice
lafragmentacin.Comoejemplosemuestranlosespectrosdefragmentacindealtaybaja
energadeunpptido(metioninaencefalina)enlafigura18.

Figura 18. Espectros de fragmentacin de alta y baja energa de la metioninaencefalina (secuencia

YGGFM).

Losfragmentospuedenclasificarseendoscategoras:
1)
Aquellosderivadosdelcortedeunoodosenlacespeptdicosenlacadena
peptdica.
2)
Aquellosqueademssufrenuncorteenunacadenalateraldeaminocidos.
Losionesdepptidossefragmentancomenzandoporlospuentesamidaalolargodel
esqueletopeptdico.Elcortedeunenlaceenlacadenapeptdicapuedeocurrirentrestipos
deenlacesa)C C,b)CNoc)NC,queformaseistiposdefragmentosquese
nombran an,bn ycn cuandosequedaunacargapositiva enelextremoNterminal y se
nombran xn,yn yzn cuandolacargapositivasemantieneenelextremoCterminal. El
subndice n indicaelnmerodeaminocidoscontenidosenelfragmento. Lafigura19
muestralosdistintostiposdefragmentosproducidosatravsdelcortedeunenlaceenla
cadenapeptdica.

Figura19.PrincipalesvasdefragmentacindelospptidosenCID/MS/MS.

Ladiferenciademasaentreionesconsecutivos(entredospicos)dentrodeunaseriepermite
determinarlaidentidaddeaminocidosconsecutivosyporlotantodeducirlasecuencia
peptdica. Hay dos excepciones: Leu Ile, que son ismeros y por lo tanto tienen
exactamentelamismamasa;yGlnLys,quesonisobares,esdecir,quesondiferentesen
composicinperotienenlamismamasanominal.Normalmenteelespectromuestravarias
seriesincompletasdeionesqueproduceninformacinredundanteyhacenalespectromuy
complejoydifcildeinterpretar.
Hayunamarcadadiferenciaentrelafragmentacinobservadaaaltaybajaenerga.Aalta
energasegenerantodaslasfragmentacionesdescritasenlafigura19.Sinembargo,no
todoslosfragmentossonobservadosenelespectrodebidoaquelafragmentacinpuedeser
influenciada por la naturaleza de los aminocidos en la secuencia. A baja energa, los

40
fragmentos observados son principalmente bn y yn. Estos fragmentos pierden pequeas
molculascomoaguayamoniodelosgruposfuncionalesdelascadenaslateralesdelos
aminocidos.
Losionesdelasseriesdnyvnseproducenporlaescicindelacadenaaminoacdicalateraly
seobservansolamenteenespectrosCIDdealtaenerga.
Losmejoresespectrossonaquellosconunaodosseriesdeiones,demaneraquecadaenlace
peptdicoenlamolculaestarepresentadoenelespectro.Deestamanera,lasecuenciase
determinaporladiferenciademasasentreionessucesivos.Laproduccindemsdedos
series de iones ocurre en espectros de alta energa y generalmente con un espectro
incompletodecualquieradelasseries,yporlotantohaciendolainterpretacinmsdifcil.
Lasmasasmonoisotpicasyqumicasdelosaminocidossemuestranenlatabla2.Lamasa
monoisotpicaeslamasadelistopoconmenorm/zenunespectrodondesemuestranlos
picos de todos los istopos (espectro de alta resolucion). La masa qumica es la masa
promediodetodoslosistopos(espectrodebajaresolucin).
Tabla2.Masadevariosaminocidos
Aminocido
Glicina
Alanina
Serina
Prolina
Valina
Treonina
Cistena
Isoleucina
Leucina
Asparagina
Aspartato
Glutamina
Lisina
Glutamato
Metionina
Histidina
Fenilalanina
Arginina
Tirosina
Triptofano

Cdig
o(3)
Gly
Ala
Ser
Pro
Val
Thr
Cys
Ile
Leu
Asn
Asp
Gln
Lys
Glu
Met
His
Phe
Arg
Tyr
Try

Cdig
o(1)
G
A
S
P
V
T
C
I
L
N
D
Q
K
E
M
H
F
R
Y
W

Masa
monoisotpica
57.02147
71.03712
87.03203
97.05277
99.06842
101.04768
103.00919
113.08407
113.08407
114.04293
115.02695
128.05858
128.09497
129.04260
131.04049
137.05891
147.06842
156.10112
163.06333
186.07932

Masa
qumica
57.052
71.079
87.078
97.117
99.133
101.105
103.144
113.160
113.160
114.104
115.089
128.131
128.174
129.116
131.198
137.142
147.177
156.188
163.17
186.213

Generalmente,enlafragmentacinseproducenencadacortedosfragmentos,unoconun
NterminalyotroconunCterminal.Sepuedenencontrarotrostiposdefragmentosenla

41
mayora delos espectrosqueresultandel cortedealmenosdos puentes internosen la
cadena peptdica. El primer tipo se llama fragmento interno debido a que no contiene
extremosNyCterminal,estaformadoportresacuatroaminocidosyesmuypoco
abundante.Serepresentaporunaseriedesimplesletrascorrespondientesalasecuenciadel
fragmento.Lospptidosquecontienenprolinasonmsabundantesdebidoaqueelgrupo
iminodelaprolinaestaincluidoenunanillodecincotomosyporlotantotieneunamayor
afinidadporelprotnqueotrosenlacespeptdicosenlacadena.Porlotantolaprotonacin
ycortedelenlaceamidadelaprolinaestfavorecidoparaformarunfragmentointerno.
Elsegundotipodefragmentoqueresultadeuncortemltipledelacadenapeptdicaesel
ionimonioque,aligualqueelionanterior,muestraunabajamasaenelespectro.Estos
ionessemarcanporlaletracorrespondientealaminocidopadre.
Ademsdeestosfragmentos,enunespectrodealtaenergasepuedenencontrarotrostres
tiposqueresultandelcortedelacadenapeptdicaydelacadenalateraldelaminocidolos
cualessemuestranenlafigura20.Enlafigura21semuestralasvasparasuformacin.

Figura20.Fragmentosderivadosdeuncortedobledelacadenaprincipaldelpptido

Figura21.Vasdefragmentacinqueproducenlosionescaractersticosdelascadenaslateralesdelos
aminocidos

Dosdeestostiposdefragmentosresultandelcortedeunpuenteentreloscarbonosyde
la cadena lateral de los aminocidos, se simbolizan como dn o wn, respectivamente, de
acuerdo a si contienen la carga positiva en el N terminal o en el Cterminal. Estos
fragmentossontilesparadistinguirlosismerosLeueIle.
2.1.1.Influenciadelaposicinydeslocalizacindelacarga
Laprotonacinocurreprincipalmenteensitiosmsbsicos.Siseaadenmsprotones
estossedirigirnprimerohacialosotrosaminocidosbsicos,siseencuentranpresentes,y
despusalosgruposamida.
Lapresenciaylaposicindeunaminocidobsicodentrodelpptidoinfluenciaelproceso
defragmentacin.Lapresenciadeaminocidosbsicos talescomoArg,Lys,HisoPro
cercadelCterminalinduceprincipalmentelaformacindeionesconteniendoelextremoC
terminal(yn,vn ywn)comosemuestraenlafigura22,mientrasquelapresenciadeestos

42
aminocidoscercadelNterminalfavorecelaformacindeionesconteniendoelextremo
Nterminal(anydn).Sinembargo,laausenciadeunaminocidobsicodentrodelpptidose
caracterizaporuna distribucinmsmarcadadeionesquecontienenyaseaelCoelN
terminalporloquelacomplejidaddelespectroseincrementa..

Figura22Influenciadelapresenciayposicindelacargaenlosfragmentosresultantes.

2.2.Identificacinysecuenciacindepptidos
LaDisociacinInducidaporColisin(CID)produceunaescaleradesecuenciadeiones
dondeladiferenciaenelvalorm/zentreionesconsecutivos(picosenelespectro)indicala
masadelaminocidoenesaposicindelasecuencia.Lainterpretacinexitosarequiere
determinarcualesionesseoriginarondelNoCterminaldeformaquelasdiferenciasenlas
masasentreionesconsecutivosdelmismotipodefragmento(ej.yn)puedansercalculadas.
Porlotanto,unaseriedeionessecuencialesconvalorm/zenordenascendentedefinirla
secuenciadeaminocidos.Elespectroquecontengaunaseriecompletadeionestipobnnos
permitededucirlasecuenciadelpptidodesdeelNterminalalCterminal,mientrasquela
seriedeionestipoynpermitelaidentificacindelasecuenciaenladireccininversa.

43
La distincin entre fragmentos que contengan el C o N terminal se puede lograr al
introduciruntomo18OenelCterminaldelospptidosobtenidospordigestintrptica.La
identificacinseconsiguealidentificarelaumentodemasaproducidoporlaadicindel
18
O.
LadiferenciacinentreLeueIleselografavoreciendolafragmentacindelaseriednown.
Otraforma,esfragmentarlosionesimoniodeestosaminocidosabajaenergaenm/z=86
quecorrespondealamasacaractersticadeestepardeaminocidos.Ladiferenciacinentre
LysyGlnselograporlaacetilacindelgrupoaminoutilizandoanhdridoactico.
Paragenerardosseriesdistintasdelpptido,laprotenasedigierecontripsinaoporotras
proteasas.Elsitioespecficodecorteparaestasyotrasprotenasutilizadassemuestraenla
tabla3.

Tabla3.Corteespecficooenzimticodepolipptidos(elcorteestentreelextremocarboxilodelresiduoX
yelextremoaminodelresiduoY)
Reactivo
Cortequmico
Bromurodeciangeno
cidoFrmico
Hidroxilamina
2Nitro5tiocianobenzoato
Fenilisotiocianato(Edman)
Corteenzimtico
Tripsina
Quimiotripsina
EndoproteasaV8
EndoproteasaAspN

SitiodeCorte
MetY
AspPro
AsnGly
XCys
Grupoaminoterminaldelpptido
ArgY,LysY
TyrY,PheY,TrpY
GluY(AspY)
XAsp(XCys)

Cercade0.12nmolpordigestinsonsuficientesparaunanlisisCIDMS/MS.Elpeso
molecular de cada pptido se determina despus de una separacin por HPLC de fase
reversa,
Elespectrodemasasentndem,adquiridoenunEspectrmetrodemasasdetrampade
ionesFinniganMATLCQ,semuestraenlafigura23.ElanlisisMS/MSdelospptidos
derivadosapartirdeunadigestindeprotenasportripsinageneralmentepresentaunaserie
prominentedeionestipoyenelladodealtamasadelespectroyunresiduodelisinay
argininacomoelaminocidoCterminal.Estosaminocidospuedenserreconocidoscomo
deltipoy1 enelm/z147o175,perocuandoseproducenionesdepptidosgrandespor
MS/MSelespectrodelatrampadeionesdelospptidosnomuestralosvaloresbajosde

44
m/z. La masa que se obtiene por la diferencia entre picos es el valor calculado del
aminocidoylamasaqumicaconocidadeunaminocidoeselvalorpredicho.

Valorespredichos
Valorescalculados
Diferencia

Figura23.Espectrodemasasdedisociacininducidaporcolisin(CID)grabadoenlosiones[M+2H]2+a
m/zde786de[Glu]1fibrinopptidoB.Losvaloresdem/zdebajodelasecuenciasonaquellospredichosa
partirdelasecuencia.Debajodeellosestnlosvaloresdem/zmedidosyladiferenciaentrelosdosvalores.

Lainterpretacinpuedeiniciarseconelionmsabundanteydemsaltom/z,enestecaso
m/z 1285.Sepuedecrearuna tabladediferencias de masa restandolos valores de los
aminocidosprobablesparabuscarelsiguienteion(delmismotipo,ej.yn)delasecuencia,
ladiferenciademasacorrespondealamasadelaminocidosiguiente.Enestecasoeliona
m/z 1171 muestra una diferencia de 114.04 que corresponde al aminocido Asn. Si se
continaconesteprocesoalolargodelespectrodemasasentndemsepuededeterminarla
seriedeochoaminocidos.Debidoaqueelpptidofueproducidoporcortesportripsinase
puedelimitarelresiduoCterminalaLisinaoArginina.Elionpresentea246.1eseliony2
asi que probablemente las combinaciones de aminocidos son ValLys y AlaArg. Una
revisinalespectromuestraunabajaabundanciaam/z1396.Ladiferenciaentre[M+H]+
(m/z1221)yesteiones175.LamasadelresiduodeArg[156+18(H2O)=175]sugiere
quelasecuenciaCterminaldelpptidoesAlaArg.
Lapresenciadeargininaenzonasterminalesfacilitalasecuenciacinptimadeunpptido
porquesolodosseriesdeionesseproducenysehavistoquesiempresonseriescompletas.

45
UnaargininasituadaamitaddelpptidoresultaenlaproduccindeionesNterminalesyC
terminalesdependiendodellugardeescicinrespectoalaarginina.Elespectroresultantees
msdifcildeinterpretarypuedenaparacerzonasenblanco.

Figura24.Espectrodedisociacininducidaporcolisinde(A)Unpptido(SYSMEHFRWGKPVG)[M+H]
+

=1680.3y(B)elmismopptidoderivatizadoconTMMA(trimetilamonioacetilo)[M]+=1780.0

LospptidossinargininageneralmenteproducentantoionesNterminalescomoC
terminales.Tambinpresentanzonasenblanco.Elperfildelespectroylapresenciade
zonasenblancoenlospatronesdefragmentacinvarandepptidoapptido.

46

Figura 25. Espectro de disociacin inducida por colisin de (A) El pptido endorfina
(YGGFMTSEKSQTPLVT)[M+H]+=1745.5(B)DerivatizadoconTMMA(trimetilamonioacetilo)[M]+=
1844.4

Derivadosconcargafija.
Unamaneraefectivadedirigirlaproduccindeseriescompletasdeionesanydneselusode
derivadosconcargafijaenelNterminal.LaderivacinserealizaenelNterminalporque
existen mtodos para la modificacin selectiva del extremo N en presencia de lisina,
mientrasquelamodificacinselectivaalextremoCterminalnoestansimple.Hastaahora
el amoniocuaternario(dimetilalquilamonio), trifenilfosfoniometil (TPPE), trihidrotiofeno
(THTA)hansidoutilizadospararealizarlasderivatizacionesenelNterminal.
Elionprecursorconcargafijallevaunacargainmvilenvezdeunacargamvildeprotn.
Enteoratodoslosionessonproducidosporunafragmentacindecargaremotadirigidapor
lacargafija.Enlaprcticaseobservalafragmentacinesperada,aunquepuedenocurrir
rearreglosenlosquelacargasetransfiereaotrossitiosenelpptido.Estosprocesosde
transferencia de carga ocurren ms a menudo cuando una arginina esta presente en el
pptidoyseencuentracercadelNterminal.
Tresfactoresdebenconsiderarsealescogerderivadoscargadosyson:elefectoenla
produccindeiones,elefectoenlaeficienciadelaionizacinylafacilidaddesntesis.

47
Losderivadosquesehaobservadoquetiendenmenosaprovocarrearreglosenlacargay
producirionesproblematicos,yquetienenunefectoneutralopositivoenlaeficienciade
ionizacinyquesonfcilmentesintetizadossonlosderivadosdedimetilaquilamonio.
EjemplosdelusodeDerivadosCargados
Las figuras 24A y 25A muestran el espectro CID de dos pptidos que se fragmentan
pobremente.Elprimerpptidotieneunaargininaamitaddelpptidoyelsegundonotiene
argininas.LaderivatizacinconTMMA(trimetilamonioacetilo)semuestraenlasfiguras
24By25Brespectivamente.ElefectodeladerivatizacinconTMMAesproducirseries
completasdeionesanydn.
PararesolverlaidentidaddelosaminocidosNterminalesserequieredeunexperimento
MS3 paraconfirmarcualquierinterpretacin.Basndoseenlainformacindelasecuencia
yadisponible,lainformacinpuedeserusadaparabuscarenlabasededatosutilizando
programasdesimilitudensecuencia.

2.3.CorrelacionandoinformacinMS/MSdelasecuenciaenla
basededatos.
Utilizandoalgoritmoscomputacionaleslainformacincreadaporlaionizacininducida
por colisin (CID) de los pptidos puede ser usada para buscar en bases de datos de
nucletidosyprotenas.
Losionesdefragmentoscontenidosenelespectroproveenungradodeespecificidadala
masadelpptidoypermitelaidentificacindelasprotenasbasadoenslounespectrode
masasentndem.Lamayoradelosalgoritmosusancadaespectrodemasasentndemen
unabsquedaindependienteenlabasededatos.Esmuybajalaprobabilidaddequedoso
masespectrosdemasas,decalidadrazonable(buenaproporcinsealruido), coincidan
incorrectamenteconlamismasecuenciadeprotena.
Losespectrosdemasasentndemdepptidoscontienentresnivelesdeinformacin.El
primeroeslamasadelpptido.Lapuramasaexactadelpptidopuedereducirelnmerode
posibilidadesdesecuenciaaunpequeonmero(milesadecenas)cuandosecomparacon
lassecuenciasobtenidasysecortalaprotenaconciertaenzima.

48

Figura 26. Secuenciacin espectromtrica de masas en tndem. Los iones de fragmentos representan la
secuencia de aminocidos del pptido. Al restar los valores m/z de iones adyacentes del mismo tipo, la
secuenciapuedeserelucidada.Elpatrndefragmentacinpuedeserutilizadoparabuscarenlabasededatos
deprotenasparaencontrarlasecuenciadeaminocidosquecorrespondamejorconelespectrodemasasen
tndem.

Al conocer la especificidad de la enzima y con una amplia tolerancia de masa (como

margendeerror),sepuedenidentificarungrannmerodepptidosbasndosesimplemente
enlamasa.Paraidentificarnicamentelasecuenciadeaminocidosrepresentadaporuna
medicindelamasa,senecesitaunsegundoniveldeinformacin.Unespectrodemasasen
tndemproveeunpatrndelosfragmentososecuenciadeionesquesonnicosparauna
secuencia dada. Al comparar la masa predicha del pptido a partir de la secuencia de
aminocidosconaquellaobservadaenelespectrodemasasentndem,sepuededeterminar
lacercanadelacorrespondencia.Eltercerniveldeinformacinpresenteenunespectrode
masasentndemeslasecuenciareal.Alcorrelacionarunasecuenciacortadeaminocidos
(34residuosdeaminocidos)quepuedennosernicosparaunprotenaespecficaconla
masadelpptidocompletosecreaunnivelmsaltodeespecificidad.
Uninconvenientepotencial,cuandoseutilizainformacindeespectrometrademasasen
tndemparabuscarengrandesbasesdedatos,eslaexistenciadeprotenassimilarescon
secuenciasconservadas.

49

2.4.Correlacindelainformacindem/zdelpptidocon
secuenciasconocidas
Conlasestrategiasdeanlisisdeprotenassebuscaobtenersuficienteinformacinpara
identificaralaprotena.Elprimerpasodespusdeobtenerlasecuencia,esbuscarenbases
dedatosparadeterminarsilasecuenciaesconocida.Losvaloresobservadosdem/zson
comparadosenlabasededatosconlosvalorespredichosdecadaprotena.Silaprotenano
seencuentramuymodificadaynohaymasdedosprotenaspresentesenelanlisisde
masas se puede encontrar una correspondencia exacta. Este mtodo es til en la
identificacinrpidadelasprotenas,enparticular,enlaidentificacindelasprotenasen
gelesdedosdimensiones.
Lasmejorasrecientesenlaexactituddelamasa(1050ppm)ylaresolucin(10,000
15,000) en espectrmetros de masas TOF, creados por la combinaciones de extraccin
retardada y reflectores, han mejorado la precisin en la medicin de la masa, lo que
minimizalaambigedadenlaidentificacin.Elmapeodemasastambinsehapropuesto
comounmtodoparalaidentificacindeespeciesrelacionadas.Esteprocesoinvolucrael
usodeinformacinenlabasededatosdeunorganismoparaidentificarprotenassimilares
uhomlogasdeotroorganismoparaelcualnohaymuchassecuenciasdeprotenas.

2.5.Cuantificacindepptidos
Lacuantificacinesunprocesoquerequieredeespecificidad.Algunosmtodosanalticos
comunescomolosradioinmunoensayos,proporcionanaltasensibilidadenladeteccinpero
unapobreespecificidad.Laespectrometrademasasentndem(MS/MS)esunmtodoque
ayuda a incrementar la especificidad en el anlisis cualitativo y cuantitativo de
neuropptidosendgenosdeextractosdetejidos.
EnMS/MSelaltoniveldeespecificidadselogradespusdeladesorcineionizacindel
pptido para producir la molculaion protonada (M+H)+ del pptido por el primer
espectrmetro; el segundo espectrmetro colecta solamente los fragmentos de iones
producidosapartirdeesamolculaionquefueseleccionadaporelprimerespectrmetro.
Para mejorar la especificidad molecular se usa un estndar interno, un istopo estable
incorporadoalasecuenciadeaminocidosdelpptido.

50
Elespectrodemasas delpptidoendgenoydelestndarinternoseregistrausando la
primeraetapa(MS1)delespectrmetroentndem.Muchosdelosfragmentosdeionesque
determinan la secuencia de aminocidos que se observan en el espectro no pueden ser
diferenciadosentrelosfragmentosdelpptidoendgenodelestndarinterno.
Losparmetrosdeoperacindelacmaradecolisionesinducidas(CID)paraelion(M+H)+
puedenseroptimizadasdemaneraqueelion(M+H)+produzcaoaumentelaintensidadde
losfragmentosdeionesproducidos.Porestarazn,elgasdecolisin,lapresindelgasyla
energadecolisinseoptimizanparaproducirlamayorcantidaddefragmentosdeionesque
determinanlasecuenciadeaminocidos.Especficamentelapresindelgasenlacmarade
colisionesinducidas(CID)seajustaparareducirlacantidaddelaion(M+H)+al50%desu
valororiginalyproducirunacorrienteapreciabledefragmentosdeiones.
Elespectrodelosfragmentosdelion(M+H)+delpptidoendgenoseregistraenlasegunda
etapa(MS2)delespectrmetroentndem.
Antes de lacuantificacinserealizaunanlisis cualitativo delpptidoparaverificar la
presencia de los fragmentos de iones que determinan la secuencia. El espectro de los
fragmentosdeionesdelion(M+H)+ delpptidonativosecomparaconunion(M+H)+
sinttico.Silosfragmentosdeionessonequivalentesenestosdosespectros,entoncesla
secuenciadelpptidonativoquedaestablecida.
Lacuantificacindelpptidoseobtieneregistrandolacorrienteinicaproducidaporelion
precursorseleccionadoalpasaraionproducto(fragmentos).
La especificidad molecular de los mtodos MS/MS para una cuantificacin precisa de
pptidosendgenossuperaaotrastcnicasdebidoa:
1. ElanlisiscuantitativoenMS/MSestableceprimerolasecuenciadeamino
cidosdelpptidoendgeno.
2. MS/MSestableceymantieneelenlaceestructuralentreelion(M+H)+ylos
ionescorrespondientesquedeterminanlasecuenciadeaminocidos.
3. Seempleaunistopoestableincorporadoaunpptidosintticocomo
estndarinterno.
2.5.1.ClculodeMasaMolecular
Paraelclculodepesosmolecularesdepptidosproteolizados,esesencialquelosvalores
demasadelos residuos aminocidos correspondanaaquellos queseencuentranen la

51
mezcla.Laconfusinmscomneselestadodelosresiduosdecistena.Generalmentees
deseablecortarlospuentesdedisulfuroantesdeladigestinparahacerlaprotenams
accesiblealaproteasa.Enestecasosoloserequiereaadirunagentereductorparalocual
se deber considerar el peso de la cistena en su estado reducido. Por otro lado, si el
protocolo implica cistenas en estado corboximetilado o piridietilado, entonces el peso
moleculardelacistenadebemodificarseparacadacaso.
Lasmodificacionesposttraduccionalespresentanmayoresdificultades.Unagranpartede
los registros de las bases de datos son derivaciones de traducciones conceptuales de
secuenciasdecidosnuclicos,yporlotantonocontieneninformacindemodificaciones
posttraduccionales.
Lospesosmolecularessecalculangeneralmentedelospesosatmicos,loscualessonlos
valorespromediadosisotpicamentedelosmaterialesenestadonatural.
2.5.2.BasesdeDatosdeSecuencias
Las ms grandes bases de datos son mantenidas por varias instituciones independientes
alrededordelmundo.Aunquehayunintensointercambiodeinformacinentreestosgrupos
yunabasededatosincorporeactualizacionesdevariasotras,noexisteunsistemariguroso
paraasegurarquealgunabasededatoscontengatodaslassecuenciasconocidas.
Estopresentaunadificultadparaelegirlabasededatos:elegirsolounayreconocerque
faltaunafraccindeunasecuenciaconocida,oformarunabasededatoscompuestade
mltiplesbasesdedatosyaceptarlaredundanciaqueseencontrar.Lasolucinideales
construirunabasededatosconcisadelaqueseeliminenregistrosduplicados.Elmejor
ejemplodeunabasededatosnoredundanteeslabasededatoscompuestaOWL,disponible
pormediodelprotocolodeintercambiodearchivosFTPdelapginaeninternethttp://s
ind2.dl.ac.uk o http://ncbi.nlm.nih.gov que contiene registros de SwissProt, PIR, PDB
(Brookhaven)yotras.

2.5.3.ConsideracionessobrelaBasedeDatos
Reglasdeprotelisisenzimtica
Una base de datos de referencia de valores de masa de pptidos proteolizados se crea
relacionandoelcomportamientoobservadodeunaenzimaenlosregistrosdeunacoleccin

52
desecuenciascomoelSwissProtoPIR. Enlaprctica, aconcentracionesdeordende
picomolar,esdifcilasegurarqueladigestinselleveacabocompletamente,asquemucho
delartedelacreacindebasesdedatosradicaenlasimulacinadecuadadedigestiones
incompletas.
2.5.4.EsquemasdePuntaje
Lasestrategiasdebsquedaypuntajemssimples,consistenencalcularlamasadelpptido
de cada registro en la base de datos de la secuencia y se compara contra los valores
experimentales.Cadavalorcalculadoquecaedentrodeunciertorangodetoleranciacon
respecto alvalorexperimentalcuentacomounpunto.Elpuntajefinal eselnmerode
pptidosencontradosporregistro.

2.6.Caracterizacindeprotenascontcnicascombinadas
2.6.1.IdentificacindeprotenasenmezclasporShotgun
ElanlisisporshotgunconsisteenacoplarlaIonizacinporelectrospray(ESI)con
cromatografalquida(LC)pararesolverloscomponentesdemezclascomplejasantesde
introducirlasalespectrmetrodemasasentndem. Grandescantidadesdeespectrosde
masasentndem(cientosamiles) puedenserautomticamentegenerados,locualsera
imposibledeadquiriratravsdelaoperacinmanualdelinstrumento.Elanlisisdirectoy
automatizadodelosespectrosdemasasentndemdelpptidoesposibleconelusode
algoritmosybasesdedatos.

53

Figura27.Identificacinporshotgundemezclasdeprotenas.Unamezcladeprotenassedigiereconuna
proteasaparaproducir una mezclacomplejadepptidos.Lospptidossonanalizadosenserieutilizando
HPLCacopladoaunespectrmetrodemasas.Losespectrosdemasasentndemseutilizanparabuscaren
unabasededatosutilizandoelsoftwaredebsquedaenbasededatosSEQUESTyalgoritmosderevisinde
informacinparaidentificarlasprotenaspresentesenlamezcla.

Existenvariasrazonesparaextenderlacapacidaddelaidentificacinporshotgunparael
anlisisdeprotenas.Primero,elproductofinaldemuchosexperimentosbiolgicos,como
lainmunoprecipitacin,sonmezclaspequeasdeprotenas.Segundo,losprocedimientosde
preparacin y digestin de la muestra pueden ser ms agresivos con calor o agentes
caotrpicosloqueayudaaunaprotelisismscompleta.Finalmente,estatcnicatieneun
altopotencialparaexperimentarenunampliorangodecondicionesfisiolgicas.
Varias aplicaciones del mtodo de identificacin por shotgun han sido demostradas. La
primeraymsimportante,estemtodoesmspoderosoenorganismosconsugenoma
completo secuenciado. Cuando un genoma est completo, la secuencia debera estar
disponibleparacadaprotenaexpresada.
2.6.2.Interaccionesprotenaprotenaycomplejosdeprotena
Lasprotenasinvolucradasenprocesosenzimticosorutasbioqumicaspuedenser
identificadasporlaasociacinbajocondicionesqueindiquenunainteraccinespecfica.Las
tcnicas bioqumicas como la coinmunoprecipitacin son ampliamente utilizadas para
identificarlainteraccindeprotenas.Ladeterminacindeinteraccionesprotenaprotena
se ha vuelto un componente importante para elucidar la funcin de la protena o para
identificarprotenasenprocesosyrutasmetablicas.Variasestrategiasbioqumicasparala

54
determinacindeinteraccionesprotenaprotenasehanadaptadoalaidentificacinpor
shotgunutilizandoLC/MS/MSyunabsquedaposteriorenlabasededatos(Figura28).

Figura28.Tresmtodosbioqumicosparadeterminarlasinteraccionesprotenaprotena.Elprimeroesla
coinmunoprecipitacin.Seutilizaunanticuerpoparaprecipitarlaprotenajuntoconlasprotenasunidas.El
segundomtodo,cromatografadeafinidadporinteraccindeprotenas,utilizaunaprotenaanzuelopara
unirsealasprotenasqueinteractan.Elltimomtodoeslapurificacindelcomplejoproticointacto.

2.6.3.Deteccindemutaciones
Una mutacin puntual dentro de una protena produce una variacin en su peso
molecular.Laespectrometrademasasesunmtodorpidoparaelanlisisdemutaciones
especialmentecuandosepuedenobtenercantidadessuficientesdeprotenas,ademsestil
paraverificarlaestructuradeprotenasrecombinantes.Estasvariantesproticaspuedenser
analizadasalcompararlasconlasprotenasdereferencia.
Paralacaracterizacindemutacionesdeprotenas,serealizaunexperimentoqumicoque
consisteendospasos:mapeodelpptidoysecuenciacindelpptido.Estospasospueden
ser reemplazados por anlisis espectromtrico de masas de una mezcla compleja de
pptidos, seguido por MS en tndem (MS/MS) de las especies de inters. El anlisis
estructuraldevariantesdeprotenasporespectrometrademasapuedeserresumidodela
siguientemanera:
Lavariacindemasasentrelasespeciessilvestreylamutanteesigualaladiferenciaenla
masa entreelresiduomutadoyelresiduodelaprotenasilvestre,asumiendoslo una
mutacin.Laregindeunaprotenaquecontienelamutacinpuedeserdeterminadaporun
cortequmicoopordigestinproteolticadeestaprotenaseguidodeunaespectrometrade

55
masa del los pptidos resultantes. Los pptidos que contienen la mutacin presentan la
mismavariacindelpesomolecularconlaprotenaintacta.Porelotrolado,lospptidos
libresdemutacintienenpesosmolecularescalculadosidnticosaaquelloscalculadospara
lasprotenassilvestres.

Tabla 4 Diferencias en la masa (Da) observada entre varios aminocidos; el residuo en la columna
correspondealaminocidoesperadomientrasqueelresiduoenlafilacorrespondealaminocidomutante
Gly

Al

Se

Pr

Va

Th

Cy

Le

As

As

Gln

Gl

Me

Hi

Ph

Ar

Ty

Trp

Gly
Ala
Ser
Pro
Val
Thr
Cys

14

30

40

42

44

46

/Ile
56

57

58

Lys
71

72

74

80

90

99

106

129

16

26

28

30

32

42

43

44

57

58

60

76

76

85

92

115

10

12

14

16

26

27

28

41

42

44

60

60

69

76

99

16

17

18

31

32

34

50

50

59

66

89

14

15

16

29

30

32

38

48

57

64

87

12

13

14

27

28

30

36

46

55

62

85

10

11

12

25

26

28

34

44

53

60

83

Leu/Ile

2
1

15
14

16
15

18
17

24
23

34
33

43
42

50
49

73
72

Asn
Asp
Gln/Lys

Glu
Met
His
Phe
Arg
Tyr
Trp

13

14

16

22

32

41

48

71

3
2

9
8

19
18

28
27

35
34

58
57

16

25

32

55

10

19

26

49

16

39

30

23

Ladiferenciaentreelpesomoleculardelpptidonativoyeldelpptidomutantepermitela
determinacindelaminocidonaturalquehasidomutado,siempreycuandosloexista
uno,deotraformasenecesitadeMS/MS.
2.6.4.Deteccindevariantesatravsdelamedicindelamasadela
protenaintactaconESIMS
Lafigura29muestraelespectrodemasastransformadoESIdeunamezcladecadenas
globina.Dosdiferentesespeciesdeglobinasonclaramentediferenciadasenelespectro
demasasaunaresolucinde3000ylaseparacindemasas,paraesteanlisis,esde14u.

56

Figura29EspectrodemasastransformadoESIdeunamezcladecadenasglobinaquedifierenen14u

Lasvariantesquetienensustitucionesdeaminocidos(exceptuandoLeueIle,LysyGln)
son,tericamente,detectablesalmedirlamasamoleculardelaprotenaintacta.Lapequea
diferencia en las masas moleculares detectables por MS incrementa con el aumento de
tamaodelasprotenas.
Laidentificacindevariantesdeespeciesdifiriendoen14uenunanlisisreal,corresponde
alpatrntericoenlafigura30,comosepresentaenlafigura29.Ladiferenciamnimaen
lamasamoleculardetectablecomoelpatrnDenlafigura29,paraunamezclaequimolar
con protenas normales de Mr (masa de una molcula calculada utilizando los pesos
atmicosdecadaelemento)mayora100000,escercade20u.Estosignificaquelamitad
detodaslasposiblessustitucionesdeaminocidosenunaprotenadeestetamaopodrn
detectarse.
Figura30.globinasnormalesyvariantes:(A).Protenanormalpura;(B)Normalymutantecon+4
unidadesdemasa;(C)Normalymutante+9;(D)Normalymutante+14

2.6.5.Identificacindeprotenasseparadaselectroforticamente
Dosdiferentesestrategiasespectromtricasdemasahansidoutilizadasparaidentificar
a las protenas separadas por electroforesis en gel. Todos los intentos publicados usan
mtodosdedigestininsitudespusdelaelectroforesisengelparaobtenerpptidosdela
protenaaanalizar.Lascoleccionesdepptidosobtenidassonadecuadasparaelanlisispor
espectrometrademasasparaobtenermapasdemasadelpptidoy,porlotanto,identificar
laprotenadespusdeunabsquedaenlabasededatos.

57
Elespectrogeneradoporladigestindeunaprotenaporunaenzimaesnicoyespecfico
dedichaprotenaypuedesersuficienteparacuantificarla.
Lamaneracomnderealizarloestomandounapequeamuestradelaprotenadeintersy
digerirla con una enzima proteoltica; la mezcla de fragmentos es analizada por MS
empleandoyaseaMALDIoESI.Laslecturasexperimentalessonluegocomparadasenuna
basededatosdemasasdepptidos.Sielespectrodelaprotenadeintersquesedesea
identificarseencuentraenlabasededatos,entonceslaprotenahasidoidentificada.Siel
espectronoseencuentraenlabasededatos,seescogeelespectroquetengaelmayor
porcentajedeidentidadconelespectrodelaprotenadeinters.
Estemtododeidentificacinesmsrpidoysensiblequeelmtododesecuenciacinde
Edmanymuchomssensiblequeladeteccindefirmasporlosperfilesdemigracincon
electroforesisengelesdepoliacrilamida(PAGE)oporlostiemposderetencinenHPLC.
Seleccindeinstrumentacin
Seutilizandostiposdeespectrmetrosdemasas:MALDIacopladoaunanalizadorTOFo
unESIacopladoaunanalizadordecuadrupolos.
ElmtodoMALDItienedoscaractersticasquelohacenespecialmenteadecuadoparael
anlisisdemezclasdedigestinintactascomparadoconotrosmtodosdeionizacin:
1) Esrelativamentetoleranteabajosnivelesdecontaminantescomosalesde
buffery,
2) Ladiscriminacinentrecomponentesenlasmezclasesrelativamentebaja.
AunquealtoleranciadeMALDIabajosnivelesdecontaminantesesmayorqueenotros
mtodos de ionizacin, muchos mtodos cromatogrficos y electroforticos son ms
tolerantesacontaminantesqueelMALDIymsprecisosenlacuantificacin.Esdecir,
MALDIeslamejoreleccincuandoloquesequiereeslafirmadelosfragmentosdela
digestinenrdenesdepicomolesomenoresynosebuscaunacuantificacin.Elerroren
lamedicindemasaessignificativoyesgeneralmentemenoral0.1%llegandohasta0.01%
sielespectrocontieneunpicodemasaconocidaquesirvecomocalibradorinternoloque
equivaldraa1o2Daltonesparaunpptidotrpticocomn.

AislamientoyPurificacindeProtena

58

El anlisis mediantefirmasdefragmentos deprotenasnofuncionabienenmezclasde

protenas.Enestoscasoslaelectroforesisengeleslaopcinindicadaparaelaislamientode
lamuestra.LasdificultadesalanalizarprotenasdegelesconMSsonquelosreactivos
puedensuprimirlaseal,modificarcovalentementelamuestraoalterarelpesomolecular.
Algunos de los reactivos que mayores problemas causan son el SDS, monmero de
acrilamidaymuchosmarcadorescomunes.
Algunos mtodos prcticos paralaproduccin depptidos proteolticos apartir de una
mezclason:
1) Laprotenaintactaseeluyedelgelparaunadigestinsubsecuente
2) Laprotenaesdigeridaenelmismogel
3) Laprotenasetransfiereporblottingaunamembranayluegodigeridain
situ,encondicionesquesefavorezcalaliberacindepptidosalasolucin
LatransferenciahaciaunamembranatienelagranventajadequelamayorpartedelSDS
puedeserlavadoantesdeladigestin.Deotramanera,seranecesariohacerlaremocindel
SDS porprecipitacindelaprotenaoporpurificacindelos pptidosporHPLC.Las
membranasdefluorurodePolivinilideno(PVDF)funcionanmejorquelasdenitrocelulosa
paradigestionesinsituquesevanaanalizarporMALDIdebidoaquetienenunfondo
qumicomslimpio.
AlgunosmarcadorescomolasulforodaminaBparaPVDFoelimidazoldezincsuprimen
menoslasealenMALDIqueelazuldeCoomasieyenconsecuencianoesforzosasu
remocin.Los buffers voltiles seremuevenporliofilizacin.Elglucsido deoctilo es
mejortoleradoqueelSDStantoenMALDIyESI.
Eleccindelaenzima
Enzimasdepocaselectividadquedigierenprotenasproduciendomezclasdeaminocidosy
pptidos muy cortos no son una buena opcin. En un sentido prctico, un mezcla que
contiene un gran nmero de fragmentos de masas similares resulta en un espectro que
contienemuchospicoscoincidentesquesesobrelapan.Delamismamanera,pptidosde
mayor tamao tienen mayor discriminacin que los pequeos porque son hay menor
cantidad y porque el nmero de posibles permutaciones de amino cidos aumenta
geomtricamenteconeltamaodelpptido.

59
Una versin altamente resolutiva de la electroforesis en gel es la electroforesis de dos
dimensionesengel(2DGE),lacualcombinaunaseparacinporpuntoisoelctricoenla
primeradimensinconlaseparacinportamaoenlasegundadimensin.Estemtodoes
capazdesepararmilesdeprotenasenunsoloanlisis.
2.6.6.Secuenciacindeprotenasengelesdepoliacrilamidateidospor
plata
Ladeteccinysecuenciacinsubpicomolardeprotenasapartirdepoliacrilamidaes
unaproposicinrealista.Despusdeunaelectroforesislasprotenassonvisualizadaspor
unatincinconazuldecoomassiesilaprotenaeslosuficientementeabundante(msde
100ng),aunquelatincinporplataesunmtodomuchomssensibleconunlmitede
deteccinentre1y10ng.Laprotenaesdigerida,despus,paraproducirpptidosloscuales
son extrados para posteriormente ser analizados. Este mtodo es compatible con la
caracterizacin microanaltica de protenas debido a que no introduce modificaciones
qumicas,inclusoenlascadenaslateralesaltamenteinestablescomolosgruposSHdela
cistena.
2.6.7.Elucidacindeestructurasecundariadeprotenasporionizacinen
electrospray
Para este estudio, la espectrometra de masas requiere un mtodo en el cual las
diferenciasdelaconformacindelaprotenapuedansermonitoreadas.
Loscambiosenladistribucindelestadodecargadelosionesdelosfragmentosenun
espectro son interpretados como el resultadode las diferencias en el plegamiento de la
protena.Porejemplo,lafigura31muestralosespectrosobtenidosparalalisozimabajolas
mismas condiciones de calibracin en el espectrmetro de masas, pero en diferentes
condicionesdesolvente.Ambosmuestranelpesomoleculardelaprotenacomo14,305D
peroclaramentemuestrandiferentesdistribucionesenelestadodecarga.

60

Figura31EspectrodemasasESIdelisozimadehuevoquemuestraladistribucindelestadodecarga
obtenidoutilizandodiferentessolventes.Elespectrosuperiorfueobtenidodeunasolucin100%acuosaapH
de5.0yelespectroinferiorseobtuvobajocondicionesestndardesolventeparaelectrosprayconuna
solucinacetonitriloaguacidofrmico50:49:1

Elespectrosuperiorfueobtenidodeunasolucinacuosa100%apHde5.0ymuestrauna
proporcindelestadodecargade9+,mientrasqueelespectroinferior,obtenidodeuna
solucinconteniendoacetonitriloal50%ycidofrmicoal1%exhibeunmximode12+.
Estas diferencias del estado de carga pueden ser interpretadas en trmino del grado de
plegamientodelamolculadeprotena.ElbajopH(antesdelaionizacin)delsolvente
altamenteorgnicodespliegalaprotenadeunaformamayorquelasolucinacuosaenla
cuallaprotenaseencuentraensuconformacinnativa.Porlotanto,eldesplegamientode
la protena desorganiza los puentes salinos y expone los sitios que son propensos a la
protonacinperoqueestnenterradosenlaestructuranativa.
Aunque estas diferencias en el estado de carga son un reflejo del plegamiento de la
molcula,tambinsonmuysensiblesalascondicionesdecalibracindelespectrmetro,a
ligerasvariacionesenelpHyaefectosdecontrain.
Otra forma para observar la estructura secundaria es el marcaje por intercambio de
hidrgenodeuterio.Elmtododemarcadodeintercambiodehidrgenodeuterioexplota
el hecho de que los elementos de la estructura secundaria que involucran la unin de
hidrgenoentrelascadenaslateralesdelaminocidoyamidasdelesqueletoproticoenel
ncleodelaprotenaofrecenproteccincontraelintercambiodehidrgeno,mientrasque

61
las regiones que no estn involucradas en la estructura secundaria (que se exponen al
solventeenlasuperficiedelaprotena)intercambiarnmsrpidoelhidrgeno.Poresta
razn,lamedicinenelcambioenlamasadeunaprotenaconeltiempopuedeserutilizada
paraobtenerinformacinacercadelaestructurasecundariadeunaprotena,debidoaquelas
protenasplegadasmsfuertemente conservarn elmarcadoenelncleodelaprotena
durantemstiempoquelosestadosparcialmentemenosestables.
2.6.8.Localizacindepuentesdisulfuroenprotenas
Los grupos sulfihidrilos de los residuos de cistenas, adems de ser altamente
reactivos,estninvolucradosenlossitiosactivosparacatlisisenzimticas,comoenlas
proteasasdecistena.Lasreaccionesdelosgrupossulfihidriloslibresincluyenlaoxidacin
para formar puentes disulfuro, los cuales participan en procesos de plegamiento. La
estrategia general para localizar puentes disulfuro en las protenas por mtodos
convencionalesinvolucravariospasos:
1. Determinarelnmerodegrupossulfihidriloslibresylospuentesdisulfuro.
Estoselogradelasiguientemanera:
Reducirtodoslospuentesdisulfuroyalquilarlosgrupossulfihidrilo
libres.
Alquilarslolosgrupossulfihidrilosoriginalessinreduccindelos
puentesdisulfuro
Determinarelpesomoleculardelaprotenanativaydelasprotenas
modificadas
Paracalcularelnmerodecistenas,grupossulfihidriloslibresypuentes
disulfuro se determina la masa molecular de la protena nativa (Mnat),
protenasreducidasyalquiladas(Mr+a),protenasalquiladas(Ma)ylamasa
conocidadelagentealquilante,queenestecasoes59paraelCH2COOH.

Tabla 5. Determinacindelnmerodecistenas,grupossulfihidriloslibresypuentesdisulfuroen
protenasporISMS

Mnat
Mr+a
Ma
Ncys

Lactoglobulina
18,276.7
18,572.8
18,333.8
5

62
NsH
Nss

1
2

Nota:Ncys=(Mr+aMnat)/59;NSH=(MaMnat)(591);NSS=(NcysNSH)/2

2. Laprotenaescortadaconreactivosqumicosy/oenzimasentrelosresiduos
cisteinil.
3. Los pptidos que contienen cistenas se separan utilizando tcnicas
cromatogrficas.
4. Lospptidosunidosporpuentesdisulfurosonidentificadosporanlisisdela
secuenciadeaminocidos yserelacionanconsegmentosespecficosdela
protena.

Protenapurificada
Esquema1.EstrategiageneralparalalocalizacindepuentesdisulfuroenprotenasporMS.

2.6.9.Deteccinyverificacindelasecuenciadepptidosconpuentes
DeterminarelnmerodepuentesdisulfuroenlaprotenaporMS
disulfuroporFABMSyMS/MS
Despusdelaseparacin,lospptidospurificadospuedenseranalizadosdirectamente
porFAB/MS.Sepuedeemplearlareduccinyoxidacinensondadelospptidospara
Cortarlaprotenaentrelamitaddelosresiduoscisteinilporcortesqumicoso
detectarrpidamentelasfraccionesquetienenpptidosconpuentesdisulfuro.Siunpptido
enzimticos
contieneunpuentedisulfurointramolecularunnuevopicoaparecer2Damsaltounavez
que es reducido en la matriz de glicerol/tioglicerol. Si un pptido contiene un puente
disulfurointermolecular,nuevospicoscorrespondientesalosdospptidosconstituyentes
SepararlospptidosporHPLC
del puente disulfuro, pueden aparecer en el rango de ms baja masa molecular y
desaparecerelpicocorrespondientealpptidointactoconteniendoeldisulfuro.
IdentificarlospptidosquecontienendisulfuroporMS
Aunqueestareduccinensondaessimpleytil,nopuedeserutilizadaparaidentificar
pptidosquecontengantiol.Estorequierededeunabuenaresolucindelinstrumentopara
identificar pptidos conteniendo disulfuros intramoleculares con masas moleculares
relativamentealtas.
La oxidacin en sonda es otra tcnica para identificar pptidos que contienen tiol y
disulfuros,rpidamente.Elcidoperfrmicopuedeconvertirunresiduodecistenaacido
cistico,loqueincrementalamasamolecularpor48Da.Lospptidosunidospordisulfuros
intramoleculares incrementarn el peso molecular en 98 Da, mientras que los pptidos
unidospordisulfurosintermolecularesdesaparecernyformarndospptidosconteniendo
residuosdecidocistico.

63
La figura32muestraelespectrodemasasFABdeunafraccinHPLCdeundigerido
ppticodepapanaantes(a)ydespus(B)delaoxidacinconcidoperfrmico.Elpicoen
lafigura32Aenm/z1875correspondeadospptidos,enlossegmentosVal150Ala162y
Gly198 Tyr 203, unidos por un puente disulfuro, y los picos en m/z 11 y 1267
correspondenalospptidosformadosporelcortedelpuentedisulfuro.Unaseriesimilarde
iones(m/z1946,1338y611)estformadaporelcorteantesdeAla163.Unavezoxidados
(figura32B)lospicosparalospptidosconpuentesdisulfuro(m/z1875y1946)noestn
presentesylasmasasmolecularesparalospptidosconstituyentesseincrementanen48Da.
EstosresultadosdemuestranqueCys153yCys200enlapapanaestabanunidosporun
puentedifsulfuro.
Figura32EspectrodemasaFABdeunafraccinHPLCdeundigeridopeptdicodepapanaantes(A)y
despus(B)delaoxidacinconcidoperfrmico.

2.6.10.Localizacindepuentesdisulfuroenpequeasprotenasricasen
cistena.
Los puentes disulfuro en molculas como toxinas, juegan un papel clave para
mantenerlaestructuratridimensional.Paralalocalizacinexitosadepuentesdisulfuro,las
protenas tienen que ser cortadas entre los residuos cisteinil por mtodos qumicos o
enzimticos,sinintercambiodedisulfuros.Variosintentos,quecombinancorteporCNBry
digestinEnzimticafallaronensuintentodeproducirpptidosconpuentesdisulfuroque
notuvierancambiosenstos.
Lahidrlisiscidaparcialesunaformaalternativadeproducirpptidosdiagnsticoparala
localizacindelospuentes.Unmtodoconsisteenlahidrlisisparcialseguidaporanlisis
FAB/MSyotraconsisteenhidrlisissuaveyanlisisconionsprayMS/MS(Figura33)

64

Figura33.Elespectrodemasasdeunafraccindeunadigestindepapanatienelospicosmayoresenm/z
6111657y2265(A).Seutilizoxidacinyreduccinensonda paraidentificarestospicos.Elpicodel
puentedisulfurofuelocalizadoenelm/z2265queequivalealosaminocidos150166/198203.Estose
comprob posteriormente por FAB/MS con una subdigestin con carboxipeptidasa B que cort las dos
tirosinasdelCterminalparagenerar,almismotiempo,lospicosenm/z448,1494y1939(B).

2.6.11.Secuenciacinenescaleradeprotenas
Esteensayo,llamadosecuenciacinenescaleradeprotenas,noutilizaMS/MSy
consisteendospasos.Primero,segeneraunaseriedefragmentosdepptidos,quedifieren
delsiguienteporunaminocido;estossegeneranapartirdelacadenapolipeptdicaquese
quieresecuenciar.Segundo,seutilizaespectrometrademasasMALDIparaleerlaserie
completadefragmentosenunasolaoperacin.Elespectrodemasascontienelosiones
correspondientesacadaespeciepolipeptdicapresente.Ladiferenciademasasentrepicos
consecutivoscorrespondealosresiduosdeaminocidosysuordendeaparicinenlaserie

65
dedatosdefinelasecuenciadeaminocidosenlacadenapeptdicaoriginal.Lasensibilidad
deestasecuenciacin(enpicomoles)escomparablealaexistenteenelmtododeEdman.
Un mtodo se basa en la degradacin porpasos utilizando el reactivo de Edman (fenil
isotiocianato, PITC) en presencia de pequeas cantidades del agente terminador (fenil
isocianato).UnapequeaporcindepptidoNterminalesbloqueadadurantecadapaso
paraevitarmayordegradacin.Despusdeunsuficientenmerodeciclos,setomauna
pequeaalcuotadelanlisisdemasa.Alsustraerladiferenciadevaloresadyacentesdem/z
seobtienelainformacindelasecuencia(figura34).Lasestrategiasdesecuenciacinen
escalerarequierendeunpptidopuroparaserexitosas.

Figura34.(Arriba)Principiodesecuenciacinenescaleradeprotenas.Elfenilisotiocianato(PITC)produce
feniltiohidantoina(PTH)delaminocidoterminalyunnuevopptido conunaminocidomenos.Elfenil
isocianato (PIC), en baja cantidad, produce fenilcarbamato Nterminal de una pequea fraccin de cada
pptido.(Abajo)Ejemplodesecuenciacinde[Glu1]fibrinopptidoB.

Enotromtodo,seutilizaunreactivovoltilparadegradacin,eltrifluoroetilisotiocianato,
paraevitarlanecesidaddeunmtodocomplejodelimpieza.Laproduccindelaserie
completadepptidosfragmentadosselograaadiendo,acadaciclo,lamismacantidaddela
protenaoriginal.Nohaynecesidaddeaadirunagenteterminador.

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EstosmtodospermitensecuenciarapartirdelNterminal.ParasecuenciarapartirdelC
terminalseutilizaelcorteenzimtico,enelcuallamuestradelpptidosedivideenvarias
partes,cadaunasetrataconunacantidadcrecientedecarboxipeptidasa.Elprimerintento,a
inicios de1980,utilizabaFABparacrearionesdepptidos secuencialmentecortados a
travsdelusodelacarboxipeptidasaYparadejarunCterminaldesigual.Esteintentoha
sido renovado y usado en conjuncin con MALDI/TOF, que es altamente sensible.
Ajustandolaconcentracindelaenzimautilizadaparacrearlaescalera,sepuededisminuir
la velocidad del proceso de corte enzimtico y adems pueden observarse los iones
formadosporelcortedecadaenlaceamida.
2.6.12.ProtenasypptidoshidrofbicosanalizadosporMALDI
LaversatilidaddeMALDI/MSnosbrindaunaalternativaviableparaelanlisisde
protenasinsolublesenagua.Especficamente,lascaractersticasatractivasdeMALDIpara
elanlisisdeespeciesincluyensuinsensibilidadacontaminantescomolpidosyalgunos
detergentes.AunqueelmecanismodeselectividaddelaprotenaenMALDIpermanece
oscuro,lacocristalizacindelamatrizylaprotena(yporlotantolapreparacindela
muestra)claramentejuegaunpapelimportanteenlosanlisisexitosos.
Los protocolos de preparacin de la muestra involucran estrategias que emplean la
solubilizacindelanalitoylamatrizenunsolventeapropiado,yaseaensolventesorgnicos
fuertesosolubilizacinenunasolucindedetergente.
UnavezquesehasolubilizadolamatrizylaprotenasepuedenemplearmtodosMALDI
estndar.EldesarrollodeMSparaelanlisisdepptidoshidrofbicosyprotenasesuna
herramientaaltamentevaliosaparaestudiosestructuralesparaestaclasetanimportantede
protenas.
2.6.13.AnlisisdeGlicoprotenasyGlicopptidosutilizandoBombardeo
Rpidodetomos(FAB)
El enfoque para analizar las muestras de glicoprotenas, utilizando este tipo de
espectrometra (FAB/MS), depende de la informacin requerida. Si slo se requiere la
porcindelcarbohidratodelamolculadeinters,entonceslosglicanosunidosalNpueden
ser liberados directamente de la glicoprotena intacta utilizando peptideN4(Nacetyl
glucosaminyl)asparagineamidaseF(PNGaseF),mientrasquelosglicanosunidosalO
puedensercortadosporeliminacinreductiva.
Siserequieredelainformacindelosglicanosylospptidos,entonceslaprotenaprimero
debeserreducida ysometerseaunprocesodeeliminacindepuentesdisulfuroyuna
subsecuentedigestincontripsinauotraproteasasespecficas.Unaindicacinrpidadel

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sitioositiosdelaglicosilacinunidaalNpuedeserobtenidadelespectrodeFABantesy
despus delaliberacin de los glicanos unidos al N con PNGase F. Debido a quelos
pptidos forman iones pero no los glicopptidos, cualquier nueva seal que aparezca
despus del tratamiento con PNGase F corresponde al pptido que contena el sitio de
glicosilacinN.
Si se requiere un anlisis detallado de los sitios de glicosilacin N y O, la mezcla de
pptidostrpticosyglicopptidospuedeserfraccionadausandounacromatografaenfase
reversa(HPLC)paraaislarlosglicopptidosindividuales.
Para identificar el sitio de unin del glicano al pptido Nglicosilado casi siempre es
necesario quitar el carbohidrato utilizando la PNGase F y luego analizar el pptido
utilizandoFAB/MS (esteanlisis sepuederealizardirectamenteenunaalcuotadeuna
mezcladedigestinconPNGaseF,yaquecontieneunbuffervoltilqueseevaporaenla
cmaradevacodelespectrmetrodemasas).Losionesdelosfragmentosgenerados,tanto
delaminoterminalcomodelcarboxiloterminaldelpptido,permitensusecuenciaciny
porlotantodeducirelsitiodeglicosilacin.
Glicoprotena
Reducciny
Carboximetilacin

PNGaseF
C18
Fraccinqueno
retieneNglicanos

Fraccinretenida
conOglicoprotena
eliminacin

Fraccinquenocontiene
Oglicanos

Reducciny
carboximetilacin

Protelisis
MS

FAB

Paracetilacin

FABMS
AnlisisdeNyOglicanosMapeoporFAB

Reducciny
carboximetilacin
ProtelisisHPLC
Glicopptidosaislados

PNGaseF
Beliminacin

PptidomodificadoPptidomodificado
aislado
aislado

FABMS

FABMS

Anlisisdelsitio

Esquema2.EstrategiageneralparaelanlisisespectromtricoFABdeglicoprotenas

68
LossitiosdeOglicosilacintiendenaencontrarsecercaderesiduosdeserinaydetreonina
ypuedenserdeterminadosconunaeliminacin reductivadeunglicopptidounidoalO,
paraliberarlacadenadecarbohidratosygenerarunresiduodeaminocidonosaturadoa
diferenciadelaminocidoenelpptidonodegradado.

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