Amplificacin y anlisis del gen L1 de VPH-16 y de la regin MY09/MY11 de los VPH tipo 6, 11, 18,

33 y 45 mediante PCR-RFLP
Introduccin
El virus del papiloma humano (VPH) son grupos diversos de virus ADN pertenecientes a la familia de
los Papillomaviridae y representa una de las infecciones de transmisin sexual ms comunes, y se
conocen ms de 100 tipos virales que en relacin a su patogenia oncolgica, se clasifican en tipos de alto
y de bajo riesgo oncolgico. La Agencia Internacional para la Investigacin del Cncer (IARC) considera
que los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 66 son carcingenos para los
humanos tipos de alto riesgo oncolgico y que otros tipos, incluidos el VPH 6 y el VPH 11, son
posibles carcingenos para los humanos (Arteaga, 2007)
Los genes E6 y L1 codifican para protenas propias del virus. El producto funcional del gen E6
complementa el rol de la protena viral E7, y se cree previene la induccin de la apoptosis en respuesta a
la entrada no programada a la fase S mediada por E7. Adems, la asociacin de E6 con la protena p53
inhibe la supresin del crecimiento mediada por esta ltima, por lo que se ha considerado E6 como un
factor de predisposicin asociado a cncer de alto riesgo causados por VPH, pudiendo contribuir
igualmente al desarrollo de metstasis por la disrupcin de uniones celulares.
El gen L1, objeto de estudio en el presente trabajo, codifica para protenas virales de la cpside y se
expresa despus del gen L2, facilitando as el ensamblaje de partculas virales en las capas superiores del
epitelio infectado. Las cpsides cuentan con alrededor de 360 copias de la protena L1 y
aproximadamente 12 copias de la protena L2 que se organizan en 72 capsmeros, constituyendo as una
partcula viral de simetra icosadrica (Doorbar, 2005)

Metodologa:
Muestra
Tanto las amplificaciones como las digestiones se llevaron a cabo con ADN viral de VPH-16 aislado de
muestras clnicas en el Laboratorio de Biologa y Medicina Experimental.
Amplificacin del gen L1 de VPH-16 por el sistema MY-PCR
El gen L1 de VPH-16 fue amplificado por PCR para un volumen final de 25l en una mezcla de reaccin
que contiene Buffer 1X MgCl2 2.5mM, dNTPs 0.2mM, primers 0.2mM sentido 5ACGCGTCGACATGCAGGTGACTTTATTTACATCC-3
y
antisentido
5CCCAAGCTTTTACAGCTTA CGTTTTTTGCGTTTAGC-3, 1,5 U de enzima Taq-polimerasa, ADN del
gen L1 1l y H2O destilada hasta completar 25l. Para el sistema MY-PCR, fue usada la misma mezcla de
reaccin mencionada anteriormente, solo que se usaron los siguientes primers degenerados MY09 5CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC-3 y MY11 5- GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG-3 VPH-6,
11, 18, 33 y 45. El programa de PCR utilizado fue el siguiente: 94C 1h, 94C 30 min para la
desnaturalizacin de ADN, 55C 45 min para el alineamiento de los primers, 72C 45 para la extensin y
72C 1 min para finalizar la extensin. Al finalizar, el amplificado se mantiene a 20C. con un nmero
total de 35 ciclos.
El amplificado del gen L1 para ambas reacciones de PCR, fue purificado siguiendo el protocolo PCRClean-Up. Favorprep Gel/PCR purification kit recomendado por la casa comercial.
PCR-FRLP para el gen L1
A partir del producto de la primera amplificacin del gen L1 por PCR, 90l de amplicn (M1) fue
sometido a digestin en una mezcla de reaccin con Buffer 3 1X (New England Biolabs [NEB]), y las
enzimas PstI 4l y RsaI 8l (NEB) para un volumen total de 21l. En otra reaccin, 85l del amplicn
(M2) fue sometido a digestin en una mezcla de reaccin con Buffer 4 1X (NEB) y las enzimas AluI 4l,
RsaI 4l y HaeIII 4l (NEB). Las mezclas de digestin se incubaron a 37C por 2h y finalmente se detuvo
las reacciones a sometiendo las muestras a 85C por 5 min.
Los productos de amplificacin del gen L1 de los VPH tipo 6, 11, 16, 18, 33 y 45 obtenidos del sistema
MY-PCR, se sometieron a digestin con la enzima HpyCH4V(NEB) en una mezcla de reaccin que
contiene lo siguiente: Buffer 4 1X (NEB), 0.5 U de HpyCH4V 0.5 U/l, ADN gen L1 10l y H2Odd hasta
un volumen final de reaccin de 15l. Las mezclas de digestin se incubaron a 37C por 5h.
Electroforesis en el gel de poliacrilamida
Los geles fueron realizados con una proporcin 23:1 de acrilamida-bisacrilamida respectivamente, 250l
de glicerol, 250l de buffer TAE, 800l de persulfato de amonio y 80l de TEMED para un volumen total
de 20 ml. Las muestras fueron corridas en el gel a 120V durante 45 minutos.

Resultados
Imagen 1. Resultados de la digestin del gen L1 amplificado por PCR.

350 pb

Los resultados mostrados en la figura 1, corresponden a los resultados de la PCR-RFLP. En el pozo M1,
se observan 5 bandas generadas por la digestin con las enzimas PstI/RsaI. En el pozo M2, se observan
seis bandas, esto corresponde a el patrn dejado por el producto de digestin de las enzimas
AluI/RsaI/HaeIII. M1,2 representa la mezcla de las digestiones M1 y M2. EN el pozo 4 se observa un
fragmento de 350pb correspondiente al segmento N-terminal del gen L1 para su secuenciacin.

Imagen 2. Resultados MY-PCR del gen L1 de VPH tipo 6, 11, 18, 33 y 45. PCR-RFLP, M. marcador
LMW DNA ladder, grupo 1 (VPH 6-45); grupo 2 (VPH 6-45); ambos grupos corresponden a muestras
clnicas aisladas en LABIOMEX.

En la imagen 2, se observa el resultado de la PCR-RFLP para dos grupos de muestras clnicas de VPH
del tipo 6, 11, 18, 33 y 45. El gen L1 de los 5 tipos de VPH fue amplificado por MY-PCR usando los
primers degenerados MY09 y MY11 que amplifican una regin en el marco abierto de lectura del gen L1
de aproximadamente 450 pb (Depuydt et al., 2007). En la imagen se observa el patrn de corte para cada
elemento de MY09/MY11 de los tipos de VPH estudiados. EN algunos de los carriles el ADN no es
digerido por la enzima (carriles 1-11, 1-45 y 2-18) El resto de patrones coincide con los resultados
obtenidos en el programa NEB-cutter.
Discusin
Los resultados obtenidos en el experimento, coinciden aproximadamente a los resultdos obtenidos
tericamente, ya que muchos de los cortes que se haban predicho tericamente no se muestran en el gel.
Los resultados obtenidos con las enzimas de restriccin AluI/RsaI/HaeIII en el pozo M2, si corresponden
en su totalidad con lo predicho tericamente.
En los carriles M1,2 y 4 se muestran los patrones encontrados en M1 y M2 pero combinados,
especificando que la digestin que se dio, si fue la correcta. Una de las causas de los fragmentos que
deberan aparecer y no aparecieron, seguramente se debe a que al ser fragmentos tan pequeos, este gel
no los puede separar, por lo tanto quedan incluidos en banda con un tamao mayor.
Actualmente, el sistema de amplificacin por MY-PCR, se ha considerado una tcnica eficiente para la
deteccin de VPH de diferentes tipos en muestras clnicas, sin embargo, hoy se sabe que la amplificacin
de regiones internas del gen L1 no es el nico mtodo de deteccin y tipificacin del virus, adems de
ello, se han diseado sistemas de amplificacin para otros genes como E6 que tambin facilitan la
deteccin de diferentes tipos de VPH y est basado en la amplificacin con primer degenerados de una

regin en el marco abierto de lectura de este gen de aproximadamente 214 pb, siendo est ltima tcnica
una metodologa para el mejoramiento del diagnstico y el seguimiento de pacientes, disminuyendo de
este modo la posibilidad de falsos negativos cuando se utiliza el sistema de amplificacin de la regin
MY09/MY11 del gen L1 (Hernandez et al., 2012).
El patrn encontrado en las bandas, es similar con los patrones obtenidos tericamente realizando cortes
con la enzima HypCH4V. En el pozo 2-6, existe una banda adicional de 516pb, se puede referir a ADN
blanco que no fue digerido.
Las tcnicas de electroforesis en geles de poliacrilamida para la seleccin y anlisis de los amplificados,
es una herramienta eficiente y poderosa. Sin embargo, cuando se trata de pequeos fragmentos y muy
similares, no brinda una separacin detallada de estos pequeos fragmentos. Para estos casos, debera
emplearse geles con una mayor resolucin, con el objetivo de diferenciar estos pequeos fragmentos y
tener un mejor anlisis de lo que se est estudiando.
Bibliografa
Depuydt, CE, Boulet, GAV, Horvat, CAJ, Benoy, IH, Vereecken, AJ y Bogers JJ. (2007). Comparison of
MY09/11 consensus PCR and type-specific PCRs in the detection of oncogenic HPV types: J. Cell. Mol.
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Hernndez D, Cruz J, Vega MQ, Bastidas M y Puig Pons J. (2012). Diseo de un sistema de PCR para la
deteccin del Virus del Papiloma Humano mediante el uso de oligonucletidos degenerados de la regin
E6. Rev Obstet Ginecol Venez;72(4):249-254.
Doorbar, J. (2005). Review. The papillomavirus life cycle. Journal of Clinical Virology. 32S, S7-S15.
Alejandro Arteaga Rodriguez et al. (2007). Virus del papiloma humano. Situacin actual, vacunas y
perspectivas de su utilizacin. Comisin de Salud Pblica/Consejo Interterritorial del Sistema Nacional de
Salud.