Curso HPLC

Facultad de Ciencias
Programa de Educacin Continua
FUNDAMENTOS DE
CROMATOGRAFIA
LIQUIDA DE ALTA
EFICIENCIA
2011
Franklin Muoz Crdenas

framunoz@starmedia.com
1
Historia
1850 Runge
Anilinas (Colorantes)
Cromatografia-Papel
Fm: Solventes
Fe: Papel
1955 Primer CG
1906 Mikhail
Tswett
Pigmentos vegetales
Cromatografia-Colummna
1954 Ray 1 Publicacin
1941 Martn y Singe

Posibilidad terica
Fm: Gas
1952 Martn y
James
Realidad Experimental 1941
1955-1967 usos de otras

Fases mviles JJ kirkalnd 1960
auge-comercializacin
Chroma : Color
Graphein: Escribir
1960 SFC
1987 se comercializa
Definicin IUPAC
Mtodo
Separacin fsica componentes
Muestra distribuye 2 fases
Migracin entre zonas

Fase
Estacionari
a
Fase
Mvil
Lquida
Slida
Gas
Lquida
Slido
Lq/gas
Gel
Modalidades de Cromatografia
Naturaleza
Fase mvil
Gas : C. Gaseosa GC
Lquido: C Lquida LC
Naturaleza
Fase
Estacionaria
Fenmeno en
Columna
L iq-Sol
Liq-Liq
Gas-Liq
Gas-Sol
(LSC)
(LLC)
(GLC)
(GSC)
Capa Delgada TLC

Columna Abierta
HPLC *
Lquido/Gas :SFC
1.
Afinidad
2.
Tamano molecular
Permeacin por gel

Filtracin por gel
Normal/Reversa
Ligada
Intercambio Inico
Cantidad Muestra
Aplicada
Analtica:
Semipreparativa:
Preparativa:
Pg Ug
ug gramos
gramos-
CG
HPLC
vS e p a r a : S u s t a n c i a s O r g n i c a s
Voltiles , NO Termolbiles, peso
molecular promedio (no alto )
vLa fase el parmetro de separacin
vSepara: Orgnicos e inorgnicos

Voltiles o no, Termolbiles o no,
v20% pueden separarse sin previo

tratamiento
vLa fm es el parmetro fundamental de

la separacin.
vDetectores; Diferencian fm del analito,

la fm es inerte al detector
vDetectores; NO Diferencian fm del

analto, la fm no es inerte al detector.
vDestructivo no recupera muestra
vNO Destructivo
recupera muestra
Inter.
Inico
IEC
LiqSol
LSC
Formas
CL
Excl.
Tamao
SEC
LiqLiq
LLC
Fase
ligada
BPC
12
Dnde est ?
Qu se usa?
13
14
Solventes
Es el verdadero motor y una gran diferencia con CG donde
el gas es solo Carrier del analito.
Propiedades de los solventes en HPLC

Alto poder solubilizante de las muestras
Baja reactividad
Compatibilidad con el detector utilizado
Adecuado punto de ebullicin y volatilidad
Baja viscosidad
Seguridad (salud)
Alto grado de pureza
15
17
Preparacin fases mviles
Es necesario tener en cuenta;

1.
2.
3.
4.
Material volumtrico limpio

Fenmenos de contraccin de volmenes
Determinar uso del pH
Despus de preparada se debe filtrar y
desgasificar
19
Se debe filtrar por:
Partculas de la fase mvil taponan y

desgastan los filtros tuberas sellos y
rotor del inyector
Se efecta con membranas de 0.45 o

0.22 um de poro que eliminan
partculas y bacterias
Se recomienda descartar los primeros

mililitros por arrastrar partculas de la
membrana
Las muestras a inyectar tambin se

deben filtrar.
20
21
Se debe desgasificar por:
Liberacin de burbujas
bomba y celda del
detector
Eliminacin de oxigeno
Mtodos de desgasificacin:
Se pueden emplear mtodos por Temperatura, Presin y
Afinidad.
Temperatura favorece o no la disolucin del gas en la

fase
N2 Disminuye en agua pero en Benceno aumenta.
Presin :
Si Disminuye, se
disminuye la disolucin
del gas
A finidad : Son ms solubles en donde predomine

fuerzas diferentes a las propias del gas.
Reflujo, Burbujeo gas inerte, Ultrasonido, Vaco

23
24
Bomba
Funcin : Impulsar Fase mvil desde el Reservorio Inyector y la
columna
Caractersticas
Permitir caudal 0.1 a 10 mL/m

Generar presin hasta 6000 psi ( libras/pulgada )
Exactitud de caudal alto
Ruido Bajo ( Generacin de pulsos mnimos variacin de caudal)
Deriva Baja ( Ruido que se genera por el uso en un largo tiempo)
Sistema Corte: Poder parar cuando aumente o disminuya presin del
sistema
Material
Cuerpo en acero Inoxidable

Partes en contacto fase mvil : Zafiro, Rub, tefln , Acero
Se usa TITANIO cuando el acero es incompatible con muestras
biolgicas
25
Clases Bombas
vPistn ( Reciprocantes )
Mayora equipos la poseen, las hay 1, 2, 3 pistones. Bomba
Tanden.
Desplazamiento Continuo ( Jeringas )

26
27
28
29
30
Porqu usar gradientes ?
31
32
33
34
Permite : Introducir la muestra en solucin interrumpir el

caudal .
Inyectores
Caractersticas
Fcil de operar
Inerte
Soportar altas presiones 7000 psi
Preciso en la cantidad de muestra introducida
Soportar altas temperaturas ( para mantener en
solucin polietilenos )
Biocompatible con la muestra TITANIO
Clases Inyectores
Septum: Elastmero (Cromatografa de gases )
Desprenden material
Perdida de presin
Necesario vencer la presin para inyectar
Necesita flujos altos
Poca reproducibilidad en la inyeccin
36
Clases Inyectores
Vlvulas: Bucles de muestras
Cuerpo fijo con un rotor y loop (intercambiable 5 a 2000 uL)

37
Vlvula
Vlvulas posee dos posiciones:
Posicin de llenado o carga : Fm pasa directo a la
columna Via Inyeccin a Presin atmosfrica
El loop se llena con 5 veces su capacidad
RDS=0.05%
Posicin de Inyeccin : Fm arrastra muestra del
loop y la lleva a la columna
38
39
40
DUCTOS TUBERIA
Para: uniones entre
la fase mvil
bomba
Inyector.
Caractersticas
1.
2.
Inerte
Resistencia a la presin (Indeformable) Acero Inoxidable (316-314),
Polmeros (Polipropileno-tefln)
Acero 316
Mayor Presin
Bomba Inyector
Inyector Columna
Columna Detector
Entre detectores en serie.
Tefln
Menor Presin
Reservorio Solvente - Bomba
Frasco desperdicios.
Su dimetro externo es estndar 1/16 de pulgada

Su dimetro interior va desde 0.2 a 0.7 mm
42
UNIONES
Permiten conectar las tuberas y los componentes
cromatogrficos
Caractersticas
Inertes a la fase Mvil
Cierre hermtico
Evitar volmenes muertos
Son dos piezas:
Macho
Frula + Tornillo
Hembra
Conector
43
44
Columnas
Funcin : contribuir a la separacin de los
analitos de una muestra.
Caractersticas
Tubo de acero Inoxidable > 600 psi.
Tubo de vidrio < 600 psi
Diametro interno Uniforme
45
Clases
1 Analticas 10 a 30cm
Las hay Rectas y helicoidales (se pierde eficiencia)

Dimetro interno 4 a 10 mm
Tamao partcula 5 a 10 um
Ms usadas 25cm - 4,6mm Dint Partcula 5um
3-7cm 1-4mm Dint Partcula 3um
2 Precolumnas
Aumento vida columna

Elimina material suspensin, contaminantes fase mvil y
sustancias que se unen irreversiblemente a la columna
Saturar fase mvil con fase estacionaria.
Rellenos Pelicular y Material poroso
Detectores
Funcin : Ver y ubicar en el tiempo y espacio la posicin de
cada uno de los componentes a la salida de la columna.
Caractersticas
1. Sensible
2. Amplio rango dinmico de respuesta
3. No destruir la muestra
4. Estable a la temperatura
5. Respuesta lineal
6. Alta relacin seal /ruido
7. No contribuir al ensanchamiento de la seal (Banda
extracolumna)
8. Responder a todos los solutos
9. Constante de tiempo baja (Velocidad de respuesta rpida)
47
Clasificacin
Generales
* Miden propiedad fsica de la fm
Con y sin analto
Ej ndice de refraccin
Conductividad
Selectivos
* Sensibles a propiedad del
analto
Ej UV- visible
48
Detector ndice de refraccin

Funcin : Medir la diferencia de Indice de refraccin
entre Solvente puro y solvente con analito
Caractersticas:
Detector Universal porque :
improbable Ir soluto = Ir solvente
No destructivo
Poco sensible
Lo afecta la temperatura
No se pueden emplear series eluotrpicas
49
50
Funcin : Medir la cantidad de luz que absorbe el soluto o

analito a una determinada longitud de onda
Caractersticas
Ms empleado.
Detector Ultravioleta
Buena sensibilidad
Buen rango lineal
No destructivo
Puede emplearse con gradientes eluotrpicos
Estable a cambios de caudal y temperatura
190-350 nm UV
Hasta 700nm Visible
Concentracin analito cumple la ley de Beer
- Visible
A=a.b.c
52
Detector Ultravioleta Visible
Onda fija
Longitud de trabajo prefijada

Generalmente se emplea 254nm - Lmpara de Hg
214nm Lmpara de Zn
229nm Lmpara de Cd
53
54
Onda Variable ( Espectrofotomtrico )

Longitud de mxima absorcin para el analito motivo
de estudio.
Lmpara de Deuterio o Xenn con filamento de
Wolframio
Arreglo de diodos
55
56
58
Detector Ultravioleta - Visible

De luz dispersada tras evaporacin
Se evapora fase mvil

Formacin suspensin analto en un gas ( N o Aire )
Haz de luz laser
Medida dispersin del haz
Mide un fotodiodo de Silicio
Electroqumico
Compuestos redox
1000 veces ms sensible que UV.
Necesita fases mviles conductivas
( Buffers dePO4 0.02M)
Electrodos de Au, C, Pt, Hg
60
61
Bases de la Separacin
Serie de Interacciones de la MUESTRA
estacionaria
Fase mvil y Fase
Hidrofbica
Hidroflica
Puentes de H2
Momentos dipolares
Cargas electrostticas
Todo ello define la afinidad por fm o fe
afinidad fm elucin ms rpida
afinidad fe elucin ms lenta
Cada analito crea su propio equilibrio diferente al otro ello permite
la separacin.
Si Un analito A necesita ms volumen de elucin por ende mayor
tiempo
63
Cromatograma
Volumen de Elucin, de retencin total

Volumen muerto
Lnea base
Tiempo de retencin
Tiempo de retencin neto o relativo
Velocidad lineal ( u)
Factor de capacidad ( K ), Cte , coeficiente, razn de
distribucin (IUPAC)
Factor de separacin, de selectividad, de resolucin
Ancho de pico
Platos tericos, Altura plato terico
Asimetra
Resolucin
Eficiencia
64
65
Procesos de ensanchamiento de banda

El ensanchamiento demuestra la distribucin de un analito desde el momento de la
inyeccin.
Porque se sucede el ensanchamiento?

Por las diluciones que sufre el analito a medida que atraviesa el sistema
cromatogrfico y por efectos extracolumnares.
Analitos menos retenidos producen picos ms angostos
El ensanchamiento depende de la eficiencia (N) Platos tericos y calidad de ellos
Ensanchamiento intramolecular
Segn Van Deemter las contribuciones son 4:
Proceso multipasos ( caminos mltiples)
Difusin Longitudinal
Resistencia a la transferencia de masa en la fase mvil
Resistencia a la transferencia a la fase estacionaria
73
PROCESO MULTIPASO
(A)
Difusin de EDDY y contribuye al ensanchamiento basado en el

Dimetro de la Partcula y por una constante del proceso de relleno y
calidad del empaquetamiento.
Este fenmeno es determinante cuando:
Tamao de partcula irregular

Columna mal empacada
74
DIFUSION LONGITUDINAL
(B/U)
Difusin del analito en todas las direcciones de la fase mvil.

Viscosidad de la fase mvil baja
Flujo de la fase mvil lenta
Coeficiente de difusin del analito es alto
75
RESISTENCIA A LA TRANSFERENCIA DE
MASA (C*U)
En la fase mvil
En la fase estacionaria

Flujos rpidos Porque entre menor volumen de flujo se efecta el
equilibrio fm= fe en ese menor volumen y por tanto se generan
picos ms pequeos
76
77
78
79
Ensanchamiento Extracolumnar
En condiciones normales los ensanchamientos solo se producen por efectos

columnares
Se sucede por: Desajustes en Inyeccin Tuberas, uniones y detector

Como los analitos ms retenidos generan picos ms anchos que los menos
retenidos este fenmeno afecta mas a los picos menos retenidos que son ms
agudos (Se nota mas)
Tuberias:
Inyeccin:
Detector :
velocidad de
A medida que aumenta su longitud , dimetro

Demasiado volumen inyectado
Volumen geometra y tubera de conexin asi como la
respuesta si es lenta se pueden unir picos y ensancharse
81
82
Material relleno columna
1. Morfologa: Esfrico o Irregular con tamao de 2 a 60 um de diametro
2. Porosidad:
volumen de
Poro:
Relacin entre el volumen interno de los poros y el

la partcula
cavidades de mayor profundidad que dimetro, pueden ser abiertos o

cerrados
Area Superficial:
Determina la capacidad de retencin de la fase

estacionaria
A menor dimetro del poro mayor rea superficial y mayor retencin
83
84
Estructura Qumica
La columna se conforma por una estructura

interna y una externa ( responsable de los
procesos de retencin )
La estructura EXTERNA se constituye por
grupos activos
Naturales
Productos de modificacin inducida
Productos de modificacin permanente
85
Estructura Qumica
La estructura INTERNA generalmente es SILICAGEL
Oxido de silicio hidratado
Slido amorfo y poroso de gran rea superficial( 30 a 500 )
Alto volumen de poro ( 0.4 a 1.2 mL/g) con un dimetro de 60 y 300 A
Es fuertemente higroscpico
La humedad bloquea y hace perder actividad
A 200C pierde agua y se condensan los grupos silinoles formando
puentes siloxanos volviendo la silica inactiva
Es insoluble en solventes apolares
Soluble en agua 100ppm a pH Neutro y Temp ambiente
La solubilidad aumenta con el pH (>7.5)
Preparacin fase ligada
Silicagel , almina, agarosa, copolmeros, divinilbenceno

Compuesto con grupo funcional determinado.
1.
2.
3.
4.
Tipo
Tipo
Tipo
Tipo
ester
Amino
Carbono
Siloxano
(Si-OR)
(Si-NR2)
(Si-CR3)
(Si-O-SiR3)
88
89
90
91
Cromatografa Fase Reversa

Fase Estacionaria
Fase mvil
APOLAR
POLAR
VENTAJAS:
Compuestos ionicos , no ionicos e ionizables pueden separarse
en la misma columna, con la misma fase mvil
La fuerza de atraccin superficial es dbil
La adsorcin irreversible raramente ocurre
La fase mvil predominante es agua
El modificador orgnico es etanol o metanol
El orden de elucin es predecible en funcin hidrofobicidad
Los equilibrios del sistema se alcanzan rpido.
92
Fase Mvil (Reversa)

Es un solvente polar
Mezcla de Agua y un modificador orgnico
Se pueden agregar aditivos, sales, Boffers
A mayor proporcin de modificador orgnico menor retencin
(Menor K)
A mayor cantidad de agua Mayor retencin ( Mayor K)
Los solventes de mayor uso son:
Agua
Metano
Acetonitrilo
Por Transparencia al UV y Viscocidad
Tetrahidrofurano
La selectividad es dada por los modificadores orgnicos
93
Fase Mvil(Reversa)
AGUA
Es el carrier.
METANOL
Modificador Orgnico ms utilizado por
Alto poder disolvente de sales y reactivos de apareamiento ionico

Poco txico , fcil adquisicin y purificacin
Bajo costo
DESVENTAJA Avido por el Oxigeno y genera mayor presin que los otros solventes
ACETONITRILO
Se almacena en el oscuro y bien cerrado por ser higroscpico

Ideal para longitudes de onda cortas 190nm
Solvente caro
TETRAHIDROFURANO
Forma facilmente peroxidos y se comercializa con antioxidantes que absorben al UV
DIOXANO
Muy viscoso se usa en pocas proporciones

94
95
Mecanismo de Retencin Fase Reversa
96
97
Mecanismo de Retencin Fase

Reversa
Puede ser de 3 tipos
Particin entre fase mvil y estacionaria

Adsorcin sobre la fase estacionaria
Proceso mixto Particin- adsorcin
Teora Solvofbica: fuerzas intrasolvente ms fuertes que las generadas con el soluto obligando
al soluto a interactuar con la fase estacionaria
ACCION DE LA CADENA CARBONADA ( FASE LIGADA )
La ms empleada son cadenas alquilicas de 18 y 8 carbonos respectivamente

A mayor longitud de la cadena ms retencin
A mayor cobertura mayor retencin
A mayor hidrofobicidaad del soluto mayor retencin.
Ir de c1 a c22 la retencin aumenta 10 veces. 10% de modificador orgnico reduce la
retencin en 2 a 3 veces por tanto la fase mvil sobre la selectividad afecta ms que
la fase estacionaria.
Cadenas cortas producen picos ms simtricos ( por menor tiempo de retencin)
Ensanchamientos intracolumnnares y porque los silinoles libres interaccionan con la
fase mvil permitiendo equilibrios ms rpidos
98
Formas de cromatografa en fase reversa

1.
Regular o de particin Simple La fase mvil son mezclas de agua y un modificador

orgnico ( hasta cuaternarias)
La retencin la gobierna la hidrofobicidad del soluto a Mayor polaridad menor retencin
( Fase mvil Polar)
A mayor proporcin de agua mayor retencin
A mayor proporcin de modificador menor retencin
Fuerza elutiva decrece asi THC> AcN> MeOH> AGUA
2 Control de ionizacin ( Supresin Inica )
Los solutos ionizables dan picos con baja retencin y baja simetra fenmeno que no se
corrige con un modificador orgnico;
3.
De apareamiento ionico
4. Complejacin con iones metlicos Argentacin de la silicagel ( Cu, Cd, Ni, Zn. Ag )
Excelente para resolucin de isomeros geomtricos ( cis- Trans)
5. En medio no acuoso ( para aceites, grasas, Hidrocarburos )
Con solventes de muy baja polaridad pero polares frente a la fase estacionaria
99
100
101
102
103
Cromatografa Fase Normal

Fase Estacionaria
Fase mvil
POLAR
APOLAR
VENTAJAS :
Unico modo en HPLC que permite separar ismeros
posicionales con sustituyenyes polares.
MATERIALES DE RELLENO
Silica Proceso de adsorcin gobernado por los grupos

silinol ( vecinal ,geminal y aislado ) formando ptes de
hidrogeno.
Alumina carcter bsico
Fase ligada
104
Fase Mvil ( Normal )

Es un solvente apolar
Mezcla solventes
Se pueden agregar aditivos que actuan sobre sitios de fuerte
retencines causantes de irregularidades en la fase estacionaria
(Agua o solvente altamente polar)
A mayor proporcin de modificador menor retencin
(Menor K) aumentar la fuerza eluotropica del solvente en 0.05
disminuye k en 3 a 4 unidades
A mayor cantidad de agua menor retencin ( Menor K)
CUIDADO silica soluble en agua
105
Mecanismo de Retencin Fase

Normal
Competencia fase mvil Competencia analito
Superficie adsorbente
Superficie adsorbente
Interacciones dipolo- dipolo

Puentes de hidrogeno
Transferencias de carga
Formacin de complejos Pi
106
107
Cromatografa Intercambio Inico
Fase Estacionaria
Fase mvil
GRUPOS FUNCIONALES IONICOS

SOLUCION ACUOSA DE pH
CLASES :
Aninica
Cationica
UTILIDAD
Solutos ionicos, ionizables y neutros con capacidad de
formar complejos ionicos. Generalmente Acidos, Bases y sus
sales
Esta cromatografia ha sido desplazada por cromatografia en
fase reversa ( Apareamiento ionico, Supresin ionica)
108
109
Mecanismo de Retencin
Intercambio Inico
Reacciones irreversibles entre soluto y fase estacionaria
Distribucin del soluto entre fase estacionaria y fase mvil
Competencia analito- Superficie adsorbente.
Ph = Pka forma ionica y no ionica coexistes 50%

Ph+2UNIDADES por encima del Pka 99% ionizado
Ph-2 UNIDADES por debajo del Pka 99% no ionizado por tanto
se pueden emplear modificadores organicos en este caso
110
Material relleno columna
Polmeros orgnicos
Intercambiadores fase ligada
Oxidos inorgnicos
Intercambiadores peliculares
Fase Mvil
Es un solucin acuosa de pH y fuerza ionica controlada por un
buffer.
111
Cromatografa Exclusin
Fase Estacionaria
Fase mvil
GELES BLANDOS, RIGIDOS

SOLVENTES Y AGUA
CLASES :
De filtracin por gel (Hidrosolubles)
De permeacion por gel ( Insolubles en agua )
UTILIDAD
Solutos de peso mayor a 2000 que presentan
problemas en otros metodos
112
Caractersticas Generales
Picos angostos (por Volumen elucin pequeo)
Tiempo de separacin cortos
Orden elucin predecible (por tamao)
No hay perdida de muestra
La resolucin no puede manipularse (Diferencia peso 10%)
Mecanismo de Retencin Exclusin

Tamao efectivo en solucin (Dimensin molecular)
Exclusin esterica
Mayor peso mayor tiempo
Menor tamao mayor tiempo
114
115
116
117

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Programa de Educacin Continua

Franklin Muoz Crdenas

1954 Ray 1 Publicacin

1941 Martn y Singe

Realidad Experimental 1941

1955-1967 usos de otras

Migracin entre zonas

Capa Delgada TLC

Permeacin por gel

vSepara: Orgnicos e inorgnicos

v20% pueden separarse sin previo

vLa fm es el parmetro fundamental de

vDetectores; Diferencian fm del analito,

vDetectores; NO Diferencian fm del

vDestructivo no recupera muestra

Propiedades de los solventes en HPLC

Preparacin fases mviles

Es necesario tener en cuenta;

Material volumtrico limpio

Se debe filtrar por:

Partculas de la fase mvil taponan y

Se efecta con membranas de 0.45 o

Se recomienda descartar los primeros

Las muestras a inyectar tambin se

Se debe desgasificar por:

Temperatura favorece o no la disolucin del gas en la

N2 Disminuye en agua pero en Benceno aumenta.

A finidad : Son ms solubles en donde predomine

Reflujo, Burbujeo gas inerte, Ultrasonido, Vaco

Permitir caudal 0.1 a 10 mL/m

Cuerpo en acero Inoxidable

Desplazamiento Continuo ( Jeringas )

Porqu usar gradientes ?

Permite : Introducir la muestra en solucin interrumpir el

Vlvulas: Bucles de muestras

Cuerpo fijo con un rotor y loop (intercambiable 5 a 2000 uL)

Su dimetro externo es estndar 1/16 de pulgada

Las hay Rectas y helicoidales (se pierde eficiencia)

Aumento vida columna

Rellenos Pelicular y Material poroso

Detector ndice de refraccin

Funcin : Medir la cantidad de luz que absorbe el soluto o

Detector Ultravioleta Visible

Longitud de trabajo prefijada

Onda Variable ( Espectrofotomtrico )

Detector Ultravioleta - Visible

Se evapora fase mvil

Fase mvil y Fase

Volumen de Elucin, de retencin total

Procesos de ensanchamiento de banda

Porque se sucede el ensanchamiento?

Difusin de EDDY y contribuye al ensanchamiento basado en el

Este fenmeno es determinante cuando:

Tamao de partcula irregular

Este fenmeno es determinante cuando:

Este fenmeno es determinante cuando:

En condiciones normales los ensanchamientos solo se producen por efectos

Se sucede por: Desajustes en Inyeccin Tuberas, uniones y detector

A medida que aumenta su longitud , dimetro

Material relleno columna

Relacin entre el volumen interno de los poros y el

cavidades de mayor profundidad que dimetro, pueden ser abiertos o

Determina la capacidad de retencin de la fase