Tcnicas de Biologa Molecular

DNA
I. Enzimas de restriccin

Anlisis

Las enzimas de restriccin fueron aisladas de bacterias; su

funcin natural es proteger contra DNA extrao

II. Separacin electrofortica de molculas de DNA

(A) Geles de secuenciacin (separacin

de bandas con 1 nt de diferencia)
(B) Electroforesis para RFLP (sepracin
entre 100 a 10000 nt)
+

(C) Electroforesis de campo pulsante

(separacin de DNA cromosomal)

III. Secuenciacin de DNA por el mtodo de Sanger

No acepta elongacin de la
cadena de nucleotidos por
la DNA polimerasa
dsDNA molde (secuencia?)
4 desoxiribonucletidos (dNTPs)
cebador de DNA
DNA polimerasa

3 5

5 3

Secuenciacin automatizada de DNA

Marcaje de un fragmento de DNA

(obtencin de una sonda)

dCTP[P32]

Hibridacin y reconocimiento
de secuencias con alta homologa

65oC

50oC

IV. Southern Blot (deteccin de secuencias especficas

de DNA)
1. Aislamiento de DNA
2. Cortar con enzimas de restriccin
3. Separar fragmentos por electroforesis
4. Desnaturalizar el DNA
5. Transferir a membrana de nitrocelulosa o
nylon
6. Hibridar con sonda especfica
7. Revelar con placa de Rayos X pantalla de
fosforimager

V. Northern blot (deteccin de secuencias especficas

de RNA)
A nivel de transcriptoma (RNA)
Northern Blot

1. Aislamiento de RNA
2. Desnaturalizar el RNA
3. Separar por electroforesis desnaturalizante
4. Transferir a membrana de nitrocelulosa o nylon
5. Hibridar con sonda especfica
6. Revelar con placa de Rayos X pantalla de
fosforimager
Expresin de genes

Bromuro
de etidio

Sonda P32

Southern Blot

Northern Blot

28S
18S

VI. Western Blot (deteccin de protenas

especficas con anticuerpos)

La deteccin de protenas sirve para conocer:

1.
2.
3.
4.
5.

Niveles de expresin
Isoformas
Modificaciones postraduccionales
Tiempo de vida media y degradacin
Localizacin subcelular

VII. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

cebador reverso

cebador directo

Desnaturalizar

Alineamiento

Polimerizacin

94-95C

55-65C

72C

La amplificacin es exponencial

2
4

En 40 ciclos se obtienen millones de copias del gen o fragmento

particular de inters

Pruebas de identidad (PCR a nivel de DNA)

El RT-PCR se puede utilizar como alternativa del

Northern blot
DNA: PCR
Amplificacin directa

Exones +
intrones

RNA: RT-PCR
1. Transcripcin
reversa
(obtencin de
cDNA)
2. Amplificacin
por PCR

Solo
exones

Despus del PCR o RT-PCR los fragmentos se

pueden clonar

Los cebadores son

diseados con extremos
reconocidos por
enzimas de restriccin

VIII. DNA recombinante

DNA A
ligasa

DNA AB

DNA B

Mutagnesis
sitio dirigida
La mutacin se incluye en
uno de los cebadores para
el PCR

Mutagnesis dirigida

Se pueden generar protenas mutadas manipulando su DNA

Generalmente la mutagenesis se hace por PCR:
- Introduccion de mutacion puntual (cambio de un aminoacido por otro)
- Deleciones

Vectores de clonacin

1. Plsmidos
2. Fagos
3. Csmidos
4. Cromosomas artificiales (bacteria, levadura, minicromosomas de maz)

1. Plsmidos
DNA doble cadena,
circular, origen propio
de replicacin

Se pueden clonar
fragmentos entre 1,000 y
10,000 nucletidos

Marcadores de resistencia a
antibiticos
Permiten la seleccin de bacterias
transformadas con el plsmido o
con el DNA recombinante

Otras caractersticas de los plsmidos

Sitios de clonacin
mltiples:
varias enzimas de
restriccin que solo cortan
una vez en el plsmido

Plsmidos de expresin

Caracteristicas adicionales:
- Promotor regulable
- Terminador de la transcripcion
- Sitio de reconocimiento por el ribosoma

Obtencin de mltiples copias de la molcula

recombinante
Mltiples copias de DNA
recombinante

Plsmido de bajo nmero de copias

Plsmido de alto nmero de copias

La transformacin implica la introduccin de DNA extrao a una

clula hospedante