INCIv.29n.10Caracasoct.

2004

Pruebas normalizadas para la evaluacin de la biodegradabilidad de

sustancias qumicas. una revisin
Gabriela A. Vzquez-Rodrguez y Rosa Icela Beltrn-Hernndez
Gabriela A. Vzquez-Rodrguez. Doctora en Microbiologa-Biotecnologa, Centre de
Biotechnologie Gilbert Durand, Institut National des Sciences Apliques de Toulouse,
Francia. Profesor Investigador, Centro de Investigaciones Qumicas, Universidad
Autnoma del Estado de Hidalgo, Mxico. Direccin: Laboratorio de Ciencias
Ambientales, Carretera Pachuca-Tulancingo km. 4.5, Ciudad Universitaria, C.P.
42076, Pachuca, Hgo., Mxico. e-mail: gvazquez@uaeh.edu.mx
Rosa Icela Beltrn-Hernndez. Doctora en Ciencias en Biotecnologa, CINVESTAV-IPN,
Mxico. Profesor Investigador, Centro de Investigaciones Qumicas, Universidad
Autnoma del Estado de Hidalgo, Mxico. e-mail: rosa@uaeh.edu.mx
Resumen
La biodegradabilidad es una propiedad de las sustancias qumicas que determina su
persistencia ambiental. Diversos organismos han estandarizado mtodos para la evaluacin
de esta propiedad, entre los que destacan, por su amplio uso a nivel internacional, las
pruebas de la Organizacin para la Cooperacin y el Desarrollo Econmico (OCDE). En
este trabajo se presenta una descripcin general de estas pruebas, y se discuten sus
principales ventajas e inconvenientes. Para tal efecto, se utiliza la estructura propuesta por
dicha organizacin, que distingue tres niveles sucesivos de ensayo: las pruebas de
biodegradabilidad inmediata, de biodegradabilidad intrnseca y de simulacin. La
complejidad de las condiciones experimentales empleadas aumenta en el mismo orden, por
lo que dicho esquema permite evaluar a bajo costo el potencial de biodegradacin de
cualquier molcula orgnica. En este artculo se sugieren algunas mejoras a los mtodos,
tales como la aplicacin de modelos cinticos para la expresin de los resultados y el uso de
la sustancia de prueba como fuente de N, P o S. Se revisan en particular las pruebas de
simulacin, que permiten conocer el comportamiento de las sustancias en medios naturales
o industriales especficos, y se destaca la importancia de normalizar nuevos mtodos de
simulacin y de optimizar los existentes para hacerlos ms accesibles a los posibles
usuarios. Entre los medios naturales susceptibles de ser normalizados destacan los anxicos
en presencia de distintos aceptores externos de electrones (i.e., nitratos, sulfatos o hierro).
Finalmente, se presentan aplicaciones recientes de estas pruebas, as como algunas reas de
investigacin futura.

Summary
As knowledge of the biodegradability of organic compounds is essential to determine their
environmental fate, several standardized biodegradability tests have been proposed by
regulatory agencies. This paper presents an overview of the most commonly used
standardized methods for biodegradability assessment of chemicals, those of the
Organization for Economic Cooperation and Development (OECD). A general description
is given of these tests and of their most important advantages and disadvantages. The tests
presentation follows the OECD strategy, which classifies the assays in three successive
levels: ready, inherent and simulation tests. Since experimental complexity increases in the
same order, this strategy permits the biodegradability assessment of any organic compound
in a cost-effective way. Some improvements to the tests are suggested, such as the
application of kinetic models for the expression of test results and the use of the test
compound as a source of N, P or S. The simulation tests, which allow the study of the
behavior of chemicals in specific natural or industrial environments, are reviewed. The
need of both new simulation methods and the optimization of available ones in order to
extend their use is emphasized. A relevant simulation test to be standardized is the anoxic
medium with external electron acceptors (i.e., nitrates, sulfates or iron). Finally, some
recent applications of these tests as well as some proposals for future research in the field
are presented.
Resumo
A biodegradabilidade uma propriedade das substncias qumicas que determina sua
persistncia ambiental. Diversos organismos tem estandardizado mtodos para a avaliao
desta propriedade, entre os que destacam, por seu amplo uso a nvel internacional, as
provas da Organizao para a Cooperao e o Desenvolvimento Econmico (OCDE). Neste
trabalho apresenta-se uma descrio geral destas provas, e discutem-se suas principais
vantagens e inconvenientes. Para tal efeito, utiliza-se a estrutura proposta por dita
organizao, que distingue trs nveis sucessivos de ensaios: as provas de
biodegradabilidade imediata, de biodegradabilidade intrnseca e de simulao. A
complexidade das condies experimentais empregadas aumenta na mesma ordem, pelo
que dito esquema permite avaliar a baixo custo o potencial de biodegradao de qualquer
molcula orgnica. Neste artigo se sugerem algumas melhoras aos mtodos, tais como a
aplicao de modelos cinticos para a expresso dos resultados e o uso da substncia de
prova como fonte de N, P ou S. Revisam-se em particular as provas de simulao, que
permitem conhecer o comportamento das substncias em meios naturais ou industriais
especficos, e se destaca a importncia de normalizar novos mtodos de simulao e de
melhorar os existentes para faz-los mais acessveis aos possveis usurios. Entre os meios
naturais susceptveis de ser normalizados destacam os anxicos na presena de distintos
aceptores externos de eltrons (i.e., nitratos, sulfatos ou ferro). Finalmente, se apresentam
aplicaes recentes destas provas, assim como algumas reas de investigao futura.

Palabras Clave / Normalizacin / OCDE / Pruebas de Biodegradabilidad / Sustancias

Antropognicas /
Recibido: 06/01/2004. Modificado: 23/09/2004. Aceptado: 28/09/2004.
La biodegradabilidad es un parmetro determinante en el comportamiento ambiental de las
sustancias qumicas y una propiedad deseable de los productos que se liberan en grandes
cantidades al medio natural, tales como detergentes, pesticidas, materiales de embalaje, etc.
Mediante el proceso conocido como biodegradacin, los microorganismos transforman los
compuestos orgnicos, la mayora de las veces en productos menos txicos que los
compuestos originales. La biodegradacin puede ser primaria y conducir a simples
alteraciones estructurales del compuesto, o bien implicar su conversin a productos
inorgnicos de bajo peso molecular y constituyentes celulares, en cuyo caso se denomina
biodegradacin ltima o mineralizacin (OCDE, 1992; Ecuacin 1).
microorganismos
Compuesto orgnico + O2 > CO2 + H2O + sales + biomasa (1)
La biodegradabilidad ha sido definida como la capacidad intrnseca de una sustancia a ser
transformada en una estructura qumica ms simple por va microbiana (Ottenbrite y
Albertsson, 1992). Para su evaluacin se han diseado una serie de pruebas, las cuales
buscan cuantificar el grado de persistencia de estructuras qumicas en ambientes naturales o
industriales. Algunas de estas pruebas han sido normalizadas para garantizar que sus
resultados son confiables y vlidos independientemente del laboratorio en el que sean
obtenidos.
En el presente trabajo se hace una revisin de los mtodos para la evaluacin de la
biodegradabilidad que han sido normalizados o que estn en proceso de normalizacin por
parte de la Organizacin para la Cooperacin y el Desarrollo Econmico (OCDE). stas
son las pruebas de biodegradabilidad ms utilizadas a nivel internacional y de ellas se
deriva la mayora de los mtodos estandarizados por la Organizacin Internacional de
Normalizacin (ISO), por la Agencia de Proteccin Ambiental de los Estados Unidos (USEPA) y por la Oficina Europea de Sustancias Qumicas (ECB). As mismo, se presenta la
estrategia de evaluacin de la biodegradabilidad ms comnmente utilizada, las principales
ventajas y limitaciones de las pruebas, as como algunas tendencias de investigacin futura.
Estrategia de Evaluacin de la Biodegradabilidad
En el esquema establecido por el Programa de Evaluacin de Productos Qumicos de la
OCDE, la biodegradabilidad de una sustancia se determina utilizando tres niveles sucesivos
de ensayo: las pruebas de biodegradabilidad inmediata, de biodegradabilidad intrnseca y de
simulacin (OCDE, 1992). En la Tabla I se muestran las pruebas que la OCDE ha

propuesto para cada nivel de evaluacin, as como las pruebas ISO, US-EPA y ECB
correspondientes.

Inicialmente se lleva a cabo una prueba de biodegradabilidad inmediata, con la finalidad de

clasificar las molculas en la categora fcilmente biodegradable con medios analticos
simples. Las condiciones experimentales de las pruebas inmediatas restringen al mximo
las posibilidades de que la biodegradacin suceda, razn por la cual se considera que un
resultado positivo indica la biodegradabilidad de la sustancia en la mayora de los medios
naturales y de los sistemas de tratamiento (Nyholm, 1991).
Si el resultado de la prueba de biodegradabilidad inmediata es negativo, se procede a
realizar una prueba intrnseca. Estas pruebas utilizan condiciones experimentales ms
favorables a la degradacin, por lo que un resultado positivo implica que la sustancia es
intrnsecamente biodegradable bajo las condiciones empleadas, aunque no
necesariamente en el medio natural. Por otra parte, un resultado negativo indica muy
probablemente la persistencia ambiental de la sustancia.
Finalmente, si la sustancia mostr una biodegradabilidad mediocre en una prueba
intrnseca, se llevan a cabo pruebas de simulacin. Tales pruebas tienen como objetivo
estudiar su comportamiento en sistemas de tratamiento o medios naturales relevantes, para
lo cual debe contarse con un cierto conocimiento de la distribucin de la sustancia en los
diferentes compartimientos ambientales (agua, suelos, etc.). Si el resultado de la prueba de
simulacin pertinente es a su vez negativo, se presume que la sustancia persiste en el

ambiente y que puede considerrsele sujeta a restricciones en cuanto a su esquema de

produccin o comercializacin; as mismo, suele exigirse la bsqueda de compuestos
sustitutos para un cierto uso (Kaiser, 1998).
Mtodos de Evaluacin de la Biodegradabilidad
Las pruebas de biodegradabilidad inmediata
La OCDE ha normalizado varias pruebas de biodegradabilidad inmediata, cuyas
condiciones experimentales se resumen en la Tabla II. El principio general de estas pruebas
es la incubacin aerobia esttica, o por lote, de una cantidad reducida de biomasa en un
medio mineral, a pH neutro y a una temperatura entre 20 y 25C. La sustancia en estudio se
aade a una concentracin definida, como nica fuente de carbono y energa. El inculo
consiste en una poblacin microbiana natural que no haya sido expuesta al compuesto de
prueba.

Estas pruebas pueden aplicarse a una gran variedad de compuestos, debido a que se basan
en el seguimiento de parmetros directos y no especficos a la molcula que se estudia,
como el Carbono Orgnico Disuelto (COD), o bien de parmetros indirectos
correlacionados con la mineralizacin de la molcula, como la Demanda Bioqumica de
Oxgeno (DBO) o la produccin de CO2. Simultneamente a la prueba se corren varios
testigos, que aseguran que los resultados no se deben a una degradacin abitica, a la
eliminacin fsica de la molcula por adsorcin, a la toxicidad de la sustancia o a una

actividad deficiente del inculo; sta ltima se evala con molculas de referencia
fcilmente biodegradables, tales como la anilina o el acetato de sodio. Los resultados de los
ensayos respiromtricos se corrigen con la respiracin endgena del inculo, la cual se
mide en ausencia de la sustancia de prueba.
El nivel lmite de biodegradacin exigido por estas pruebas es una disminucin del 70%
cuando se monitorea el COD, y del 60% de la Demanda Terica de O2 (ThO2) o de la
Produccin Terica de CO2 (ThCO2) cuando se trata de pruebas respiromtricas, valores
que deben alcanzarse en un perodo de 28 das. ThO2 y ThCO2 se calculan a partir de la
estructura qumica de la molcula considerando una biodegradacin total de la misma
(OCDE, 1992). Para un resultado positivo, y a excepcin de la prueba MITI I (301 C), los
niveles lmite de biodegradacin deben adems alcanzarse en los diez das que se suceden
al final de la fase de latencia, la cual se define arbitrariamente como el tiempo necesario
para alcanzar una biodegradacin del 10%. A este criterio se le conoce como la ventana
de los 10 das. El nivel mximo de biodegradacin presentado al cabo de 28 das, la
duracin de la fase de latencia (tL) y el tiempo de vida media (t1/2), definido como el tiempo
transcurrido para obtener una biodegradacin del 50%, se reportan como resultado de las
pruebas. La obtencin de estos parmetros est representada en la Figura 1.

La seleccin de una prueba se lleva a cabo considerando las propiedades fisicoqumicas de

la sustancia. Los compuestos voltiles deben evaluarse en sistemas cerrados y
preferiblemente mediante la concentracin de O2disuelto (i.e., prueba 301 D). La
biodegradacin de los compuestos poco solubles en agua no deber cuantificarse mediante
el consumo de COD (i.e., evitar las pruebas 301 A y E), mientras que debern preferirse los
ensayos respiromtricos para los compuestos adsorbibles.

Sin embargo, la sola eleccin de un mtodo puede afectar el resultado de la prueba. Por la
reducida concentracin de biomasa que estipulan, las pruebas 301 D y E proporcionan ms
resultados negativos, ya que frecuentemente necesitan largos perodos para que los
microorganismos puedan reproducirse suficientemente. Por otra parte, dado que un
resultado positivo en alguna de estas pruebas restrictivas garantiza que el compuesto se
biodegradar rpidamente, son las ms indicadas para los compuestos que se encontrarn
en grandes cantidades en el medio ambiente.
Se ha reportado que la cintica de biodegradacin de un compuesto determinado depende
de la prueba que se seleccione. Reuschenbach et al. (2003) encontraron que la anilina se
biodegrada ms rpidamente en la prueba 301 A, basada en el seguimiento del COD, que en
la prueba 301 F y ms an que en la 301 B, basadas en el consumo de O2 y en la
produccin de CO2, respectivamente. La prueba 301 B mide el CO2 producido, el cual es
capturado por un lcali en un dispositivo externo al recipiente en el que se lleva a cabo la
biodegradacin. Si ste no cuenta con aireacin y agitacin suficientes, se producir una
acumulacin de HCO3- que modificar la cintica de biodegradacin. Adems, el mtodo de
cuantificacin del CO2 capturado es impreciso per se, ya que ste se calcula a partir de la
diferencia entre los valores de titulacin del lcali del recipiente de prueba y del testigo, que
son relativamente elevados.
En virtud de que la prueba 301 B no es muy confiable desde el punto de vista cintico, es
recomendable que el criterio de la ventana de los 10 das se elimine cuando se utiliza
dicho mtodo. De hecho, se ha mostrado que en el caso de surfactantes este criterio produce
falsos resultados negativos (Richterich y Steber, 2001), aun cuando se utilicen otras pruebas
de biodegradabilidad inmediata.
La prueba 310 (en proceso de normalizacin; OCDE, 2001c) fue propuesta para solventar
algunas de las limitaciones de la prueba 301 B. Esta prueba, que permite probar compuestos
voltiles, poco solubles en agua y adsorbibles, se lleva a cabo en recipientes cerrados, en
los que se deja un volumen determinado de aire. Durante y al final de la incubacin, se
sacrifican botellas de rplica para determinar el C inorgnico presente en el aire o en el
lquido despus de aadir un cido o una base, respectivamente. Considerando la relacin
de volmenes de lquido y de aire, es posible determinar la totalidad de CO2 producido.
Mediante un ensayo interlaboratorio se mostr que esta prueba es la ms adecuada para la
determinacin de la biodegradabilidad inmediata de surfactantes (Painter et al., 2003).
Las pruebas de biodegradabilidad intrnseca
Las pruebas de biodegradabilidad intrnseca se desarrollan bajo condiciones ambientales
ms favorables a la biodegradacin, sobre todo en lo que concierne a la duracin del ensayo
y al mantenimiento de una viabilidad elevada del inculo. Lo anterior se logra mediante la
adaptacin previa del inculo a la sustancia y la adicin de una fuente adicional de C. A la
fecha, la OCDE ha normalizado tres pruebas de biodegradabilidad intrnseca en medio

aerobio: los ensayos SCAS (Semi-Continuous Activated Sludge), Zahn-Wellens y MITI II,
descritos en las lneas directrices 302 A, B y C, respectivamente (Tabla III).

En la prueba SCAS, una muestra de lodos activados se expone tanto a la sustancia como a
un efluente domstico durante 23 horas, al cabo de las cuales se obtiene el sobrenadante
para su anlisis en trminos de COD. El sobrenadante se reemplaza por un volumen
equivalente de efluente domstico y se aade nuevamente la sustancia de prueba
(20mgCOD/l), para reiniciar el ciclo. Debido a su prolongada duracin (hasta de 6 meses) y
al contacto continuo con el efluente, que funge a la vez como inculo y fuente alterna de C,
sta es una prueba muy adecuada para la determinacin de la biodegradabilidad intrnseca.
La prueba Zahn-Wellens se lleva a cabo en modo discontinuo, y se basa tambin en el
seguimiento de la prdida de COD; sin embargo, utiliza altas concentraciones de la
sustancia de prueba (50-400mgCOD/l), que pueden ser txicas para los microorganismos.
La prueba MITI II permite evaluar la biodegradabilidad de sustancias insolubles en agua.
Sin embargo, al igual que la prueba inmediata MITI I, especifica un protocolo de
preparacin del inculo sumamente complicado, que precisa la mezcla de 10 muestras
naturales (i.e., suelo, agua superficial, lodos activados) y su posterior precultivo con
peptona y glucosa en modo semidiscontinuo durante al menos 30 das (OCDE, 1992).
Varios autores han reportado que este procedimiento, lejos de aumentar el potencial de
biodegradacin del inculo, produce ms resultados negativos que otras pruebas con igual
concentracin de biomasa (Painter, 1995).
Recientemente se propuso la prueba CONCAWE (302 D, en proceso de normalizacin)
para la determinacin de la biodegradabilidad intrnseca de productos derivados del
petrleo, y en general de sustancias voltiles y poco solubles. Este ensayo utiliza la misma
metodologa que la prueba inmediata 310, pero a diferencia de sta, utiliza una poblacin
microbiana mixta previamente adaptada a la sustancia de prueba y un perodo de

incubacin de 8 semanas (OCDE, 2001a). Dado que Battersby et al. (1999) encontraron que
la prueba proporciona resultados con reproducibilidad semejante a la de otras pruebas
inherentes, constituye una mejor alternativa que el ensayo MITI II para el estudio de la
biodegradabilidad de sustancias insolubles en agua.
Las pruebas de simulacin
El ensayo 303 A, que reproduce una planta de tratamiento de aguas residuales mediante
lodos activados, es la prueba de simulacin ms utilizada. En esta prueba se determina la
velocidad de remocin de la sustancia (10-20mgCOD/l), contenida en un agua residual
sinttica a base de peptona, en un mdulo de lodos activados, compuesto bsicamente de un
reactor agitado con un tiempo de retencin de lodos de 6 das y un decantador que separa el
agua tratada. La biodegradabilidad de la sustancia se calcula a partir del COD removido en
un tiempo de residencia hidrulica de 3-6 horas y considerando los resultados de una
prueba testigo realizada simultneamente sin la sustancia. Un inconveniente de la prueba es
que utiliza concentraciones muy elevadas con respecto a las que suelen encontrarse en la
mayora de las plantas de tratamiento, lo que conduce a cinticas y mecanismos de
biodegradacin distintos a los que suceden en la realidad. Por tal motivo, Painter (1995)
sugiri realizar estas pruebas a una concentracin aproximada de 10g/l, lo cual necesita
una tcnica analtica especfica o la sustancia marcada con 14C. La OCDE tambin propone
una variante de esta prueba, en la cual se simula un sistema de tratamiento de aguas
residuales por biomasa fija (303 B).
Pruebas de biodegradabilidad en suelos. La prueba 304 A fue normalizada por la OCDE en
1981 para determinar la biodegradabilidad intrnseca de sustancias qumicas en suelos. Una
versin ms completa de esta prueba ha sido normalizada recientemente (307), que permite
estudiar la transformacin aerobia y anaerobia en suelos de compuestos para los cuales
exista un mtodo analtico de sensibilidad suficiente (OCDE, 2002a). Este ensayo implica
la adicin de la sustancia de prueba, la cual puede ser o no marcada radiactivamente, a
muestras de suelo y su posterior incubacin en un bimetro a temperatura y humedad
constantes y en ausencia de luz. A diferentes perodos de incubacin se realiza una
extraccin de las muestras y se determinan los contenidos de la sustancia de prueba y de los
principales productos de degradacin. Los productos voltiles deben ser colectados
absorbindolos en los medios apropiados para su posterior cuantificacin. Cuando se usa la
sustancia marcada con 14C es posible medir su velocidad de mineralizacin mediante
el 14CO2 producido. Para el estudio de las rutas de biodegradacin de una sustancia es
suficiente realizar la evaluacin con un solo tipo de suelo por un perodo no mayor de 120
das. Para la determinacin de velocidades de biodegradacin se aconseja realizar las
pruebas con al menos tres tipos de suelo diferentes en su contenido de C orgnico, pH,
contenido de arcilla y concentracin de biomasa; estos tipos de suelo deben ser
representativos del medio receptor de la molcula que se evala y en este caso la duracin
del estudio puede alargarse hasta 6 o 12 meses.

Se ha encontrado que la adicin de una sustancia fcilmente biodegradable estimula la

degradacin de la materia orgnica nativa del suelo, lo que se conoce con el nombre de
imprimacin (Alexander, 1977). El uso de sustancias marcadas al 14C permite eliminar este
error, al evaluar nicamente el CO2 producto de la degradacin de la sustancia.
Pruebas de biodegradabilidad en medio marino. En virtud de las particularidades del medio
marino, sobre todo en lo que respecta a las caractersticas de las bacterias responsables de
los procesos de biodegradacin (i.e., su halotolerancia), la OCDE propone una prueba de
simulacin de este compartimiento ambiental (306). Esta prueba esttica usa agua marina
como medio e inculo a la vez, y existe en dos variantes: el ensayo en matraz agitado que
mide el consumo de COD durante 60 das, y la prueba de DBO en botella cerrada, con una
duracin de 28 das. Dado que se utiliza el compuesto de prueba como nica fuente de C y
de energa, as como una cantidad muy reducida de biomasa, frecuentemente se considera
este mtodo como una prueba de biodegradabilidad inmediata (Nyholm, 1991).
Pruebas de biodegradabilidad en sedimentos. Los sedimentos naturales son el receptculo
final de un gran nmero de sustancias qumicas descargadas al medio acutico,
principalmente de aquellas que por su hidrofobicidad se adsorben a la materia particulada.
La prueba OCDE 309 (en proceso de normalizacin; OCDE, 2001b), diseada para evaluar
la biodegradabilidad aerobia de compuestos a bajas concentraciones (<100g/l) en aguas
superficiales, es un ensayo en matraz agitado que contempla la adicin de sedimento (1g/l)
para simular la interfase sedimento/agua. La biodegradacin se mide mediante el monitoreo
de la molcula de prueba marcada con 14C o del 14C O2 producido, o utilizando tcnicas
analticas lo suficientemente sensibles, durante un mximo de 60 das. En funcin del
medio que se pretenda estudiar, el sedimento puede caracterizarse por un elevado contenido
en C orgnico (2,5-7,5%) y una textura fina (contenido de arcillas >50%), o bien por un
contenido en C orgnico reducido (0,5-2,5%) y una textura gruesa (contenido de arcillas
<50%).
En un ensayo ms complejo (308), la OCDE propone la simulacin de las diferentes
condiciones que pueden prevalecer en un sistema sedimentario (OCDE, 2002b). En una de
sus dos variantes, la prueba simula una columna de agua aerobia con una capa subyacente
de sedimento sujeta a un gradiente de O2. En la otra variante, se simula un sistema aguasedimento completamente anaerobio. Esta prueba permite, si se utiliza la molcula marcada
con 14C , la identificacin y cuantificacin de los productos de transformacin, as como su
distribucin en las fases slida y lquida. Los sedimentos deben caracterizarse en funcin
del pH, contenido en C orgnico, potencial redox y concentracin de biomasa.
Prueba de biodegradabilidad anaerobia. En estudios anteriores (OCDE, 1981) se ha
encontrado que algunos ambientes anaerobios (i.e., sedimentos) estn sujetos a
concentraciones de contaminantes mayores que los ambientes aerobios. Aunado a lo
anterior, se ha evidenciado que los microorganismos anaerobios son metablicamente ms
verstiles de lo que se crea (Caldwell et al., 1998; Anderson y Lovley, 2000), lo cual ha
incentivado el estudio y la aplicacin de sistemas anaerobios para el tratamiento y la

evaluacin de la biodegradabilidad de una gran variedad de contaminantes. Para tal efecto

la OCDE propuso el mtodo 311, actualmente en proceso de normalizacin (OCDE,
2001d). El mtodo consiste en incubar en recipientes hermticos, durante 60 das a 35
2C, lodos provenientes de un digestor anaerobio (1-3gSST/l; SST: slidos suspendidos
totales) en presencia de una concentracin de 20 a 100mgC/l de la sustancia de prueba. La
cuantificacin de la presin ejercida por los gases producto de la biodegradacin anaerobia
(i.e., CO2 y CH4) permite calcular el grado y la velocidad de degradacin de la sustancia.
Como control se emplean sustancias de referencia fcilmente biodegradables, tales como
fenol o benzoato de sodio. Cuando se desconoce si la sustancia es txica para los
microorganismos anaerobios, se recomienda un control adicional en el que se adicionan la
sustancia de prueba y la de referencia en la misma concentracin; as mismo, cuando se
trabaja con una sustancia poco soluble y se emplea un disolvente, debe incluirse un control
en el que se adicionan el disolvente, el medio de cultivo y el inculo. Este mtodo tambin
considera el empleo de un inculo preadaptado a la sustancia de estudio, cuando se
sospecha que sta no es fcilmente biodegradable.
El mtodo OCDE 311 est limitado a la evaluacin de un sistema metanognico; sin
embargo los microorganismos anaerobios pueden utilizar una variedad de aceptores finales
de electrones (i.e., nitratos, sulfatos, Mn y Fe), los cuales estn presentes en ambientes
naturales y en aguas residuales industriales. Adems, no puede asumirse que el potencial
metablico en un ambiente anaerobio es el mismo con los diferentes aceptores finales de
electrones (Strevett et al., 2002). Por ejemplo, Hee-Sung et al. (2002), al estudiar la
biodegradacin de pirrolidina y piperidina en ambientes desnitrificantes, sulfatorreductores
y metanognicos, observaron una degradacin completa en el ambiente desnitrificante y
ninguna degradacin en los otros dos ambientes despus de seis meses. Otra limitante del
mtodo OCDE 311 es en relacin al medio de cultivo, el cual carece de compuestos
orgnicos (i.e., vitaminas y aminocidos), los cuales pueden ser requeridos por los
microorganismos anaerobios para su ptimo crecimiento (Colleran y Pender, 2002).
El Problema del Inculo
Sin duda, el inculo es el factor que ms afecta la reproducibilidad de las pruebas de
biodegradabilidad, especialmente en el caso de las pruebas inmediatas. Estas pruebas slo
hacen tres especificaciones respecto al inculo: debe ser de origen natural, su densidad
no debe ser mayor a 30mgSST/l y no debe tener contacto previo con el compuesto de
prueba (OCDE, 1992). Lo anterior permite la inoculacin con aguas superficiales, lodos
activados, aguas residuales domsticas, lixiviados de suelo e incluso con una mezcla de
stos (Tabla II), con la nica reserva de que los lodos activados se aconsejan para las
pruebas con concentraciones de biomasa elevadas (301 A, B y F), y las aguas residuales
para las pruebas a baja densidad microbiana (301 D y E). Por otra parte, el nivel de
inoculacin se especifica nicamente en trminos de relacin volumtrica, mientras que no
se exige una verificacin de la masa celular introducida al ensayo. Tal falta de control del
inculo se refleja en los resultados de las pruebas, ya que la concentracin microbiana

inicial define la cintica de biodegradacin (Simkins y Alexander, 1984), el grado de

mineralizacin de la sustancia (Vzquez-Rodrguez et al., 1999) y, por ende, la obtencin
de un resultado positivo en la prueba.
Para mitigar este problema, se ha sugerido el uso de inculos preadaptados a la sustancia
que se evala (Thouand et al., 1996). Por tal motivo, la prueba inmediata 310 (en
proceso de normalizacin) contempla la utilizacin de inculos preadaptados, a
condicin de que esto se especifique en el informe de los resultados. Una sustancia que
presenta un resultado positivo en tales condiciones se considera intrnsecamente
biodegradable (OCDE, 2001c), ya que es posible que se biodegrade rpidamente slo
en los medios que reciban aportes continuos de dicha sustancia.
El control del inculo de las pruebas de biodegradabilidad inmediata implica conciliar
dos requisitos aparentemente opuestos que son la presencia de un espectro amplio de
microorganismos y el comportamiento reproducible del inculo, al menos respecto
a las molculas de referencia positiva, lo que hasta la fecha no se ha conseguido.
Aunque la variabilidad de los resultados de las pruebas inmediatas es posiblemente un
reflejo de lo que sucede en el medio natural, deben conducirse ms estudios que
apoyen o refuten el poder predictivo de estas pruebas a escala ambiental.
Conclusiones
La normalizacin de las pruebas de biodegradabilidad enfrenta un problema que es
inherente a cualquier intento de simulacin ambiental in vitro. Cuando se pretende
integrar en el laboratorio el mayor nmero de variables, buscando reflejar la
complejidad real de los fenmenos naturales, disminuye tambin la posibilidad de
construir mtodos reproducibles y por lo tanto susceptibles de normalizacin. As, las
pruebas de biodegradabilidad normalizadas deben contar con metodologas
experimentales simples y al mismo tiempo aproximarse lo ms posible a los fenmenos
que realmente suceden en la naturaleza.
No obstante, es posible cambiar ciertas prcticas que en un principio tuvieron como
propsito la fcil implementacin de las pruebas y que ahora limitan el uso de los datos que
proporcionan. Por ejemplo, es necesario modificar la expresin de los resultados cinticos
de las pruebas (usualmente en trminos de tiempo de latencia y nivel mximo de
biodegradacin), de modo que stos puedan usarse en la prediccin cuantitativa del
comportamiento de las sustancias. La aplicacin de modelos cinticos y su validacin a
distintas concentraciones de la sustancia sera de gran utilidad para el anlisis cuantitativo
del riesgo ambiental asociado a su dispersin.
Otro aspecto importante que debe considerarse es el uso de la sustancia de prueba como
nica fuente de C. Lo anterior conduce a una subestimacin de su potencial de degradacin,
ya que en el medio natural son frecuentes los procesos cometablicos. La adicin de una
fuente de C fcilmente asimilable (i.e., glucosa) podra aumentar la relevancia de los

resultados de las pruebas, aunque por otra parte hara indispensable el uso de una tcnica
analtica especfica para el seguimiento de la molcula de inters.
Todas las pruebas normalizadas han sido diseadas para considerar la sustancia de prueba
como fuente de C. Sin embargo, ciertos compuestos orgnicos pueden tambin constituir
fuentes de N, P o S. Con algunas modificaciones a los mtodos, sobre todo en lo que
respecta al medio de cultivo, podra conocerse ms acerca de la biodegradabilidad de
dichos compuestos.
Las pruebas de biodegradabilidad inmediata, por su simplicidad, son las ms utilizadas y
referenciadas en la literatura especializada. Por ello, sus principales

inconvenientes ya han sido detectados y revisados, y se ha normalizado

un mtodo (310) como alternativa a la limitada prueba 301 B. Aunque han
sido menos aplicadas, la situacin de las pruebas inherentes es semejante. Con la
normalizacin de la prueba CONCAWE se superarn las desventajas de la prueba MITI II,
y se dispondr de un mtodo confiable para el ensayo de compuestos voltiles y poco
solubles.
En contraste, a excepcin de las pruebas 306 y 311, las pruebas de simulacin implican un
alto costo que limita su aplicacin y por ende su optimizacin por parte de los usuarios. No
obstante, es de importancia que se mejoren las pruebas de simulacin disponibles, y que se
propongan nuevos mtodos que reproduzcan de manera realista, y ms econmica, los
medios receptores de sustancias qumicas. Entre los medios susceptibles de ser
normalizados destacan los anaerobios en presencia de distintos aceptores finales de
electrones (i.e., nitratos, sulfatos, Mn o Fe). Una mayor aplicacin de las pruebas de
biodegradabilidad en general, y de las de simulacin en particular, contribuir sin duda a
aumentar el conocimiento acerca del comportamiento ambiental de las sustancias qumicas.
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