Gua de Practica de Microbiologa General

Primera unidad
1. Tema N 5: ACCIN DE AGENTES FISICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS
2. Propsito:
Explica como los microorganismos son afectados por agentes fsicos como la temperatura, presin osmtica
y radiacin ultravioleta.

3. Conceptos bsicos
Es bien conocido que las actividades vitales de los organismos estn condicionadas por su ambiente.
Modificando fundamentalmente estos factores, el organismo bien se adapta a las nuevas condiciones o
muere; dependiendo esto de la magnitud y tipo de cambio operado. En este aspecto, los microorganismos
difieren de las clulas de plantas superiores y animales.
El conocimiento de varios factores fsicos que controlan la supervivencia y multiplicacin de los microorganismos,
hace que la actividad bacteriana pueda ser incrementada, disminuida o destruida completamente.
Las alteraciones en el tiempo de divisin celular indican que uno de los factores o ms han cambiado. El tipo de muerte
bacteriana por agentes fsicos est relacionado al nmero de bacterias sobrevivientes, lo que significa que el nmero
de microorganismos muertos por unidad de tiempo es mayor al principio y mucho menor cuando la accin contina.
Microorganismos Extremfilos

Los extremfilos se desarrollan bajo condiciones que podran matar a la mayora de otras criaturas y
muchos no pueden sobrevivir en los ambientes considerados globalmente normales. Los ambientes
extremos incluyen aquellos con temperaturas muy elevadas (55-121C) o bajas (2 - -20C), alta salinidad
(NaCl 2- 5M) y alta alcalinidad (pH arriba de 8) o alta acidez (pH menor de 4).
El descubrimiento de microorganismos que habitan en ambientes con temperaturas extremas, pH
extremos, altas presiones baromtricas y alta salinidad, ha despertado el inters de su estudio desde el
punto de vista biotecnolgico debido a las caractersticas de estos microorganismos ya que sus
biomolculas son necesariamente resistentes a las condiciones agresivas de su entorno, lo que
desemboca en intensos trabajos para intentar comprender los mecanismos ntimos de resistencia, pero
tambin para estudiarlos en la perspectiva del desarrollo de aplicaciones industriales entre las que la
PCR
Adems, la presencia de microorganismos en ambientes extremos hace especular que la vida podra
existir en algunos de los ambientes extremos encontrados en el espacio extraterrestre

3.1 FACTORES FISICOS

A. TEMPERATURA
Cada especie microbiana requiere un rango de temperatura de crecimiento, que es determinado por la
sensibilidad al calor por parte de las enzimas, las membranas, los ribosomas, y otros componentes de la
clula. Como consecuencia, el crecimiento microbiano tiene una dependencia de la temperatura, con
distintos rangos de temperaturas mnima, mxima, y ptima.

La temperatura mnima de crecimiento es la temperatura ms baja a la que se producir el crecimiento;

la temperatura mxima de crecimiento es la temperatura ms alta a la que se producir el crecimiento;
y la temperatura ptima de crecimiento es la temperatura a la que la tasa celular de reproduccin es
ms rpida.
La temperatura ptima dada para el crecimiento de un microorganismo se correlaciona con la
temperatura del hbitat normal del microorganismo. Por ejemplo, la temperatura ptima para el
crecimiento de bacterias patgenas para los seres humanos es cerca de la temperatura de la sangre
humana (35 a 37 C).
La mayora de las bacterias pueden clasificarse en uno de los tres grupos principales en base a sus
requerimientos de temperatura:
Tipo
Fisiolgico
Psicrfilos
Mesfilos
Termfilos
Hipertermfilo
s

Temperat
ura
C
0- 15
20 - 25
>55
80-113

Psicrfilos: Crecen de 0 -15 C y tienen una temperatura de crecimiento ptima de 15 C o

inferior; la mxima es de alrededor de 20 C.
Mesfilos: Tienen un crecimiento ptima entre 20 y 45 C. La mayora de las bacterias entran en
esta categora.
Termfilos: Pueden crecer a temperaturas mayores de 55 C o temperaturas superiores.
Hipertermfilos: Crecen entre 80 113 C

Termfilos: Sus enzimas tienen alta estabilidad trmica debido principalmente a redes de interacciones
inicas y modificaciones de la membrana plasmtica.
En Bacteria, presentan alargamiento de las cadenas de cidos grasos (C18-C24), incremento de
cidos grasos saturados, presencia de ramificaciones y ciclos hopanoides.
En Arquea, los lpidos son muy especiales, se trata de teres de hidrocarburos unidos al glicol (el
enlace ter es mas resistente). Algunas presentan una monocapa de C40, que condicionan una
extrema resistencia a agentes ambientales.
La disminucin del crecimiento microbiano por exposicin a temperaturas elevadas se debe a la
desnaturalizacin trmica de las protenas y posiblemente de estructuras celulares tales como la
membrana citoplasmtica.

Psicrfilos: El agua es el disolvente primordial para la vida y debe estar presente en estado lquido para
que sta ocurra. Esto pone un lmite para el crecimiento de organismos por debajo de los 0C.
Tpicamente los organismos psicrfilos pueden crecer en temperaturas por debajo de los 5C, aunque su
rango de temperaturas de crecimiento pueden ir desde los 15C hasta menos de 0C

Los psicrfilos han desarrollado mecanismos de adaptacin para realizar sus funciones metablicas a
bajas temperaturas incorporando caractersticas nicas en sus protenas y membranas. Comparado con
las protenas de los mesfilos, las protenas de los psicrfilos muestran disminucin en interacciones
inicas y enlaces del hidrgeno, poseen menos grupos hidrofbicos y ms grupos cargados en su
superficie. Debido a estas modificaciones, a bajas temperaturas, las protenas de los psicrfilos pierden
su rigidez y ganan flexibilidad estructural para la realizacin de sus funciones catalticas. Las membranas
de los psicrfilos contienen una mayor proporcin de cidos grasos no saturados, por lo que su fluidez y
capacidad de transportar los nutrimentos se mantienen bajo condiciones muy fras.
Ejemplos:
Bacterias Gram-negativas: Vibrio y Pseudomonas
Gram-positivas: Bacillus y Micrococcus.
La composicin de los lpidos de los organismos procariontes y eucariontes, se altera con la temperatura
de crecimiento. A medida que esta disminuye, el contenido de cidos grasos insaturados en los lpidos
aumenta. Este cambio de los cidos grasos es un componente significativo de la adaptacin de las
bacterias a la temperatura
A bajas temperaturas, todas las protenas sufren ligeros cambios de conformacin atribuible al
debilitamiento de sus enlaces hidrofbicos, que cumplen una funcin importante en la determinacin de
la estructura terciaria

Hipertermfilos: Crecen entre 80 113 C

La ebullicin es probablemente uno de los mtodos ms fciles de librar de bacterias dainas a los
materiales. Sin embargo, no todas las bacterias son igualmente sensibles a esta alta temperatura.
Algunas bacterias pueden ser capaces de sobrevivir a la ebullicin a pesar de que son incapaces de
crecer. Estas bacterias se denominan termorresistentes (Bacillus, Clostridium). Muchas bacterias
formadoras de esporas (por ejemplo, B. subtilis) puede soportar el agua hirviendo durante 15 minutos a
causa de sus endosporas resistentes.
Por lo tanto, tanto la temperatura como la especie de bacterias afectarn a la desinfeccin de ciertos
materiales. Esto es importante para saber como tratar de matar a bacterias patgenas con el calor.
En la presente prctica vamos a evaluar dos cepas bacterianas:
Bacillus subtilis, es un bacilo Gram positivo formador de espora, que tiene una temperatura ptima
crecimiento de 30-40C
Escherichia coli, es un bacilo Gram negativo, facultativo anaerobio, que no forma espora y tiene un
temperatura ptima de crecimiento de 37C

B. PRESIN OSMTICA
Definiciones previas:

Presin osmtica: Es la fuerza desarrollada cuando dos soluciones de diferente concentracin de

solutos estn separados por una membrana que es permeable nicamente al solvente. El solvente es
el lquido, normalmente agua, que disuelve a una sustancia, que en este caso es el soluto.

Osmorregulacin: Mantiene los solutos (molculas pequeas y iones) a valores ptimos para la
actividad metablica, incluso cuando la osmolaridad del medio vara en un margen ampliamente
grande.

Cloruro de Sodio (NaCl) o Sal comn, no se lo considera como aditivo. El cloruro de sodio es un
excelente agente osmtico. Su bajo peso molecular (de 58.44 g/gmol) permite una alto tasa de
prdida de agua y gran solubilidad, pero tambin ocasiona alta impregnacin en el tejido animal.
Adems de ser un agente osmtico, es un agente antimicrobiano (conservante), esencialmente por su
efecto depresor de la actividad de agua. El cloruro sdico se ha usado para estabilizar ciertos
alimentos, entre ellos pescados. Adems de lograr la estabilidad de ciertos productos, ciertas
concentraciones de cloruro sdico permiten inhibir microorganismos patgenos en los alimentos.

La disponibilidad de agua, se expresa cuantitativamente en trminos de actividad de agua (aw). El

agua pura tiene un aw = 1,00, mientras que los cereales y otros alimentos secos pueden tener valores
de aw = 0,60 o inferior.

Puesto que las bacterias se separan de su entorno externo por una membrana plasmtica selectiva
permeable, las bacterias pueden ser afectadas por cambios en la presin osmtica o en la disponibilidad
de agua de su entorno.
Las bacterias varan ampliamente en sus requerimientos osmticos. Algunas pueden crecer en
soluciones diluidas o soluciones saturadas de NaCl. Los microorganismos que crecen en disoluciones de
alta osmolaridad reciben el nombre de osmfilos. La mayor parte de ambientes naturales con elevada
osmolaridad contienen concentraciones altas de cloruro sdico (NaCl). Las bacterias que crecen en
estos ambientes se llaman halfitos.
La mayora de bacterias no necesitan regular su osmolaridad interna con precisin porque estn
protegidas con una pared celular capaz de resistir una considerable presin osmtica interna. Las
bacterias, en la naturaleza siempre mantienen su osmolaridad muy por encima de la del medio.
Si una bacteria es colocada en una solucin hipotnica (baja concentracin de solutos y alta en
contenido de agua), el agua entrar en el interior de la clula hasta hincharse y estallar (l a pared celular
se disuelve y la membrana celular se rompe en pequeos fragmentos) proceso denominado lisis. (Figura
41.1a) a menos que se haga algo para evitar este influjo. La mayora de las bacterias tienen paredes
celulares rgidas que mantienen la forma y la integridad de la clula; por lo tanto, las soluciones
hipotnicas no son perjudiciales para estas bacterias.
Cuando las bacterias se colocan en una solucin hipertnica (alto nivel de solutos, baja en contenido
de agua), el agua sale del interior de la clula, y la membrana citoplasmtica se contrae lejos de la pared
(figura 41.1b), proceso conocido como plasmolisis. Esto deshidrata la clula y la arruga.
En las Gram positivas esto provoca que la membrana celular se separe de la pared, se dice que la clula
se ha plasmolizado. Las bacterias Gram negativas no experimentan plasmlisis, dado que la pared se
retrae junto con la membrana, hecho que tambin daa a sta

En una solucin isotnica, la concentracin de solutos es el mismo (iso significa igual) tanto en el exterior
e interior de la bacteria. La bacteria est en equilibrio osmtico con su entorno y por lo tanto no cambia
el volumen de la clula (figura 41.1c).

Aunque en general, las bacterias toleran cierta variacin en la presin osmtica del ambiente, el
crecimiento de la mayora se inhibe si se colocan en un medio con una alta presin osmtica (superior al
2% NaCl). Si estas se colocan en un medio como tal, sufren el fenmeno de plasmlisis. La mayora de
bacterias no son capaces de reproducirse en un medio de presin osmtica elevada, sin embargo hay
algunos microorganismos que pueden crecer en soluciones concentradas de cloruro de sodio, es decir
en medios alta osmolaridad
Los organismos extremfilos estn adaptados a condiciones ambientales muy difciles de soportar para
la mayora de los seres vivos. Por ejemplo, pueden vivir en ambientes ms cidos que el jugo de limn,
soportar temperaturas mayores al punto de ebullicin del agua y muy elevadas condiciones de salinidad
o de radiacin. Los organismos halfilos forman parte de los organismos extremfilos
Halfilos
Los organismos halfilos forman parte de los organismos extremfilos ya que viven en condiciones
extremas, en este caso, en entornos con mucha sal como zonas litorales, salinas y lagunas salobres. Se
llaman halfilos a aquellos organismos que requieren cierta concentracin de NaCl para su desarrollo y
crecimiento. Pueden ser clasificados en funcin de la cantidad de sal que requieren en 4 categorias con
respecto a su tolerancia de sal:

Tipo Fisiolgico

Concentra
Concentraci
cin de
n Molar
NaCl (%)

No halfilos
Halfilos ligeros
Halfilos
moderados

0- 2 %
2-5%

< 0.02 M
0.2 -0.85 M

5-20 %

0.85 - 3.4 M

Halfilos extremos

20-30 %

3.4 -5.1 M

Los organismos halotolerantes son aquellos que pueden crecer en presencia y en ausencia de altas
concentraciones de sal. Muchos organismos halfilos y halotolerantes pueden crecer dentro de un
amplio margen de concentracin de sal, con requerimiento o tolerancia para algunas sales, dependiendo
del medio y de los factores nutricionales.
Los microorganismos halfilos son aquellos que se encuentran en los ambientes hipersalinos, pero se
diferencian de los halotolerantes porque son capaces de reproducirse y realizar sus funciones
metablicas de una manera ms eficaz en presencia de altas concentraciones de sales que en su
ausencia
Tolerancia osmtica:
Tolerancia osmtica, es la capacidad de un microorganismo para crecer en un medio con osmolaridades
muy variadas. Se ha demostrado que muchas bacterias concentran K + en su intracelular mucho ms que
Na+. Adems existe una correlacin entre tolerancia osmtica en las bacterias y su contenido en K +. Los
estudios en E. coli, demuestran que la concentracin intracelular de K + aumenta progresivamente con el
aumento de la osmolaridad (concentracin de NaCl) del medio de crecimiento. Como consecuencia, se
aumenta la osmolaridad como la fuerza inica interna de la clula.
El mantenimiento de una fuerza inica relativamente constante dentro de la clula es de extrema
importancia fisiolgica ya que la estabilidad y el comportamiento de las enzimas y otras molculas
biolgicas dependen de este factor.
Requerimiento de Na+ en las bacterias
El sodio, el cloruro y el magnesio, son requeridos para mantener la estructura y rigidez de la clula.
En la mayora de bacterias no halfilas no se ha podido demostrar un requerimiento especfico de Na.
Por ejemplo E. coli (bacteria no halfila) necesita un mnimo de Na + para crecer, pero eso no demuestra
la dependencia absoluta de Na + para su crecimiento. Por el contrario, las bacterias halfitas moderadas y
extremas, necesitan siempre Na + para crecer, a concentraciones tan altas, que su dependencia absoluta
a este catin Na+, se demuestra experimentalmente.

En el caso de bacterias halfitas moderadas, el Na + asegura en correcto funcionamiento de los

mecanismos de transporte. En los halfilos extremos, una elevada concentracin de NaCl es esencial
para mantener tanto la estabilidad como la actividad cataltica de las enzimas.
Adaptaciones
La membrana citoplasmtica constituye una barrera que separa el citoplasma del medio externo en el
que pueden producirse cambios en la concentracin de sales, por lo que debe jugar un papel importante
en la respuesta de la clula a dichos cambios. Se ha demostrado que la adaptacin de la composicin
lipdica de las membranas celulares frente a una nueva situacin de estrs osmtico incluye
modificaciones en el tipo de fosfolpidos existentes en las membranas, y en el tipo de cidos grasos que
forman parte de los lpidos
La principal estrategia que desarrollan los microorganismos halfilos para adaptarse al estrs osmtico
se basa en la acumulacin masiva de compuestos en el citoplasma para compensar la presin osmtica
del medio externo. Los compuestos acumulados pueden ser inicos o no inicos, segn el tipo de
microorganismo, lo que determina de forma general la existencia de dos mecanismos principales de
acumulacin:
Mecanismo salt-in: Acumulan en su citoplasma iones inorgnicos, principalmente K+ y Cl- . El
aumento en la concentracin de KCl en el citoplasma conlleva a una adaptacin a las altas
concentraciones salinas de todas las protenas y otros componentes celulares como los ribosomas. Es
tpico de Arqueas (bacterias halfilas moderadas)
Mecanismo salt out, es el que utilizan las bacterias tanto halfilas. Estos microorganismos, en
respuesta al estrs osmtico, acumulan en su citoplasma compuestos orgnicos que mantienen el
equilibrio osmtico sin interferir con el metabolismo celular, por lo que se denominan solutos
compatibles y que constituyen la base fundamental de la tolerancia a la sal de estos microorganismos.
Se trata de un sistema mucho ms flexible, ya que permite la adaptacin a las fluctuaciones en la presin
osmtica del medio. Los solutos compatibles pueden acumularse tras su transporte al interior celular
desde el medio externo, o bien mediante sntesis, como sucede, por ejemplo cuando las bacterias se
cultivan en un medio mnimo. Los principales solutos compatibles descritos a la fecha son: aminocidos,
azcares, glicina betana, ectona e hidroxiecton
Tolerancia osmtica de algunas Bacterias
Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo. S. aureus puede crecer en presencia de 15%
(alrededor de 2.5 M) de Cloruro de Sodio (NaCl) o con un aw=0.86
Bacillus subtilis es una bacteria Gram positiva, Catalasa-positiva, aerobio comnmente encontrada en el
suelo. Entre sus principales caractersticas se encuentra su capacidad para formar esporas en diversas
condiciones de estrs, crecer en un intervalo amplio de temperaturas (desde 15 hasta 55 C) y sobrevivir
en concentraciones salinas (hasta el 7% de NaCl)
Escherichia coli es un bacilo Gram negativo, es un habitante normal de la flora intestinal en la parte baja
del intestino de animales de sangre caliente. E. coli es muy sensitivo a las altas concentraciones de sal,
no tiene tolerancia osmtica y no puede crecer debajo de un aw=0.95.

Tipo Fisiolgico

Concentra
Concentrac
cin de
in Molar
NaCl (%)

No halfilos

0- 2 %

Halfilos ligeros
Halfilos
moderados

2-5%

0.2 -0.85 M

5-20 %

0.85 - 3.4 M

20-30 %

3.4 -5.1 M

Halfilos
extremos

< 0.02 M

Organismo

Escherichia coli
Pseudomonas
marinas
Saphilococcus
aureus
Bacillus subtilis
Halobacterium
salinarum

Rango de
concentracin de
NaCl tolerado en
el crecimiento
(%, g/100 ml)
0 -1 %
0,1 -5 %
10-15 %
<7%
12-36 %

Aplicaciones de bacterias halfitas

Las bacterias halfilas han demostrado ser un grupo de extremfilos con un gran potencial
biotecnolgico, debido a que no solo producen compuestos de enorme inters industrial, como enzimas,
biopolmeros o solutos compatibles, sino que adems presentan algunas propiedades fisiolgicas que
facilitan su explotacin comercial. A continuacin se describen algunas de las ms interesantes
aplicaciones de estos microorganismos.

Biodegradacin de residuos. Las bacterias halfilas han alcanzado recientemente un gran inters
en el campo de la degradacin de los residuos txicos. Constituyen una importante alternativa a los
tratamientos microbiolgicos convencionales en aquellos casos en los que stos sean ineficaces,
como son los procesos industriales que generan aguas residuales hipersalinas. Esto sucede por
ejemplo en la produccin de diversas sustancias qumicas como los pesticidas, determinados
productos farmacuticos y herbicidas, y los procesos de extraccin de petrleo y gas

Alimentos fermentados. Las bacterias halfilas tambin tienen diversas aplicaciones en el campo
de la alimentacin. As en la elaboracin de la salsa de soya, etc.

Polmeros. Los polmeros bacterianos tienen gran importancia en la industria petrolera. Gracias a
sus propiedades surfactantes y emulsionantes pueden aumentar la eficacia de los procesos de
extraccin de crudo del subsuelo incrementando la viscosidad del agua que se inyecta alrededor de
las bolsas, disminuyendo as su tensin superficial. Las bolsas de petrleo suelen presentar una
elevada salinidad, lo que hace especialmente interesante la utilizacin directa de bacterias halfilas
moderadas productoras de biopolmeros.

En este prctica, vamos a examinar el efecto de diferentes concentraciones de NaCl (presin osmtica o
actividad de agua, aw) en el crecimiento de dos especies de bacterias. Esta tolerancia (o falta de ella)
pueden ser observados por presencia o ausencia de crecimiento de las dos especies bacterianas en
placas con diferentes concentraciones de Cloruro de Sodio (NaCl)

C.- ACCIN GERMICIDA DE LA LUZ ULTRAVIOLETA

Los rayos ultravioleta son componentes invisibles de la radiacin solar. Todos los microorganismos: hongos, levaduras,
bacterias, virus y esporas son sensibles al tratamiento UV. Sin embargo, las esporas requieren mayor tiempo de
exposicin para tener el mismo porcentaje de reduccin que las clulas vegetativas.
El poder de penetracin de la luz depende de la cantidad de materia suspendida. La experiencia demuestra que 1
minuto de exposicin a la luz UV provoca la muerte del 70% de bacterias G(-) y 60% de G(+) contenidas en cubos de
hielo de 30 mm de grosor.
Los rayos UV son absorbidos por las protenas, el DNA, RNA y otros compuestos orgnicos; siendo las bases
pirimdicas las ms sensibles.
La UV altera el DNA causando dmeros de timina y citosina, lo que provoca mutaciones en la clula irradiada y
cuando la intensidad de irradiacin es mayor el efecto puede ser letal.

1. EQUIPOS/MATERIALES y REACTIVOS A UTILIZAR EN LA PRCTICA:

CANTIDAD
1
4
1
8
1
2

CANTIDAD
4
4
4
4
40
4
80
4
120
16
32
8
8
1

EQUIPO
HORNO
COCINILLAS
BAO MARIA
MECHEROS EN BUEN ESTADO
AUTOCLAVE
LUZ ULTRAVIOLETA

MATERIAL
Gradillas
Rollos de algodn algodn
Probeta graduada
Varillas o braguetas de vidrio
Pipetas esteriles
Vasos Beaker
Tubos esteriles que contengan 9 ml de agua esteril
Propipetas
Placas Petri estriles
Esptulas Drigalsky
Pipetas pasteur
Asas de siembra
Pinzas de madera
Caja de fosforos con sus cerillos

CAPACIDAD
500 gr
100, 500 ml
1ml, 10ml
100; 250 ml

6
80
80
80
80
8
8
8
16

Agar agar fundido en botellas de 250 ml

Placas con agar con concentraciones de NaCl al 5%
Placas con agar con concentracin de NaCl al 10 %
Placas con agar con concentracin de NaCl al 15%
Placas con agar con concentracin de NaCl al 20%
Cepas de caldo nutricio con E. coli
Cepas de caldo nutricio con Stafilococus aureus
Cepas de caldo nutricio con Bacillus Subtiles
Placas con agar nutricio

2.PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

A. EFECTO DE LA TEMPERATURA
Las bacterias son capaces de sobrevivir amplios lmites de temperatura, pero el rango en el que ellos pueden crecer
y ejercer sus actividades est entre los 0-90C.
Rango de muerte trmica: Es el rango de temperaturas en la que muere un organismo al ser expuesta 10 minutos
bajo condiciones controladas.
Condiciones que varan el rango de muerte trmica:
Contenido de agua del medio: La muerte de la bacteria por accin del calor es por
coagulacin de las protenas del protoplasma. Cuanto mayor es el porcentaje de agua en
el medio, menor ser la temperatura requerida para matar la bacteria.
Contenido de agua de los organismos: A menor cantidad de agua, los microorganismos se
secan y se produce mayor resistencia a la temperatura.
Concentracin de hidroqeniones: Los organismos mueren fcilmente en condiciones acidas o alcalinas,
requirindose temperaturas menores que en medios neutros.
Composicin del medio: Los medios que contienen alta concentracin de protenas incrementan la temperatura
requerida para destruir bacterias, ya que las protenas forman una pelcula alrededor de los microorganismos
protegindolos de influencias desfavorables.
Edad de las clulas: Las clulas viejas son ms resistentes que las clulas jvenes a las condiciones adversas.

Informacin de cepas bacterianas a usar:

Bacillus subtilis, es un bacilo Gram positivo, formador de espora, que tiene una temperatura
ptima crecimiento de 30-40C
Escherichia coli, es un Bacilo gram negativo, facultativo anaerobio, que no forma espora y tiene
un temperatura ptima de crecimiento de 37C

MATERIAL.1.- Dos tubos con 8 ml de caldo E. coli de 24 horas

2. Dos tubos con 8 ml caldo de B. subtilis de 5 das
2.- Cuatro pipetas graduadas estril de 1 ml y pera se succin
3.- 14 tubos estriles vacos.
4.- 14 placas estriles vacas.
5.- 2 frascos con 100 ml de agar fundido.
6.- Bao mara a 100 C

PROCEDIMIENTO.1. Tomar los 7 tubos y rotularlos con su respectiva bacteria y enumerar los tubos de acuerdo a la temperatura a
la que le toca ser sometido.
2. Distribuir 2 ml del cultivo de E. coli a cada uno tubos.
3. Llevar el primer tubo a bao mara por 10 minutos a 121 C.
4. Transcurrido este tiempo, enfriarlo bruscamente en agua fra.
5. Una vez enfriado, tomar 1 ml y colocarlo en una placa Petri estril vaca.
6. Luego vertir el agar fundido de 45 C en la placa, mezclar bien y dejar solidificar.
7. Proceder en igual forma con los 6 tubos restantes, pero disminuyendo la temperatura cada vez que se coloca
un nuevo tubo a 100, 80, 60, 37, 30, 20.
8. Incubar a 37 C durante 24-48 hrs
9. Hacer las lecturas y determinar EL RANGO DE MUERTE TERMICA. Observar los resultados y anotar. Use el
signo (+) para indicar presencia de crecimiento y el signo negativo (-) para la ausencia de crecimiento.

B.-ACCIN DE LA PRESIN OSMTICA

Este factor viene a ser la presin desbalanceada que da lugar a los fenmenos de difusin y osmosis, en una
solucin donde hay diferencia de concentraciones.
Las bacterias son sensibles en menor grado a estos cambios osmticos y es necesario que las presiones sean muy
grandes para observar una accin destructiva sobre la bacteria.
Informacin de cepas bacterianas a usar:
Bacillus subtilis, es un bacilo Gram positivo, formador de espora, y sobrevive en concentraciones salinas
(hasta el 7% de NaCl)

Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo. S. aureus puede crecer en presencia de 15% (alrededor de
2.5 M) de Cloruro de Sodio (NaCl) o con un aw=0.86

Escherichia coli es un bacilo Gram negativo, es muy sensitivo a las altas concentraciones de sal, no tiene
tolerancia osmtica y no puede crecer debajo de un aw=0.95

MATERIAL.1. Tubo con caldo Nutritivo de E. coli de 24-48 h

2. Tubo con caldo nutritivo de B. subtilis de 24-48 h
3. Cinco placas con concentraciones crecientes de sacarosa o NaCl al 0%, 5%, 10%, 15%
4. Asas bacteriolgicas
PROCEDIMIENTO.1. Con plumn indeleble, dividir la placa en 2 mitades iguales.
2. Colocar el nombre de la bacteria, la concentracin de NaCl y la fecha
3. Sembrar la respectiva bacteria por estra simple en cada mitad de la placa, en cada una de las 5
diferentes placas
4. Incubar las placas en posicin invertida por 24-48 h a 37 C

5. Observar la relativa cantidad de crecimiento en cada seccin de cada concentracin de sal de las
placas. Comparar el crecimiento con la placa control (Concentracin al 5% de NaCl) sembrada con
bacteria.
6. Reportar el crecimiento como:
No hubo crecimiento: Crecimiento moderado: +,++,+++
Mximo crecimiento: ++++

C.- ACCIN GERMICIDA DE LA LUZ ULTRAVIOLETA

MATERIAL.
1.- Cultivo de E. coli en caldo.
2.- Cultivo de B. subtilis en caldo.
3.- Una placa petri de agar nutritivo.
4.- Una lmpara de radiacin ultravioleta.
5.- Un cartn circular de 12 cm. de dimetro, cortado en uno de los cuadrantes.
6.- Una pipeta Pasteur.
7.- Un lpiz de vidrio.

PROCEDIMIENTO.Con la pipeta capilar colocar de 1 a 2 gotas de uno de los cultivos en el centro de la placa.
Con la esptula de Drigalsky extender la siembra por toda la superficie del medio.
Trazar con el lpiz graso cuatro cuadrantes perpendiculares sobre el dorso de la placa, enumerndolos del 1 al 4.
Colocar la placa sembrada a 32 cm de la lmpara de rayos UV (an no encender la lmpara de UV)
Cambiar la tapa por el crculo de cartn.
Encender la lmpara y exponer el cuadrante libre (1) a la radiacin por 30 seg. Luego apagar la lmpara.
Rotar el crculo de cartn dejando libre el cuadrante (2) y exponer a la luz uV por 60 seg. Apagar la lmpara.
Rotar el crculo de cartn dejando libre el cuadrante (3) y exponer a la luz uV por 90 seg. Apagar la lmpara.
El cuadrante (4) no se expone.
Cubrir con su tapa el cultivo e incubar a 37C por 24 hrs.
Anotar los resultados.

3.RESULTADOS

EFECTO DE LA TEMPERATURA
Basados en tus observaciones del crecimiento bacteriano, anota tus observaciones:

Bacteria

Crecimiento (+) o (-)

20 C 37 C 60 C 80 C 100 C

Tipo
Fisiolgico

E. coli
B. subtilis

1. Cul es el rango de muerte trmica para ambas bacterias?__________________

ACCIN DE LA PRESIN OSMTICA

1. Reportar la cantidad de crecimiento de dos bacterias, en la siguiente tabla:
Use , +, ++, +++, ++++ para indicar la cantidad de crecimiento.

Medio de
Cultivo
0 % NaCl
5 % NaCl
10 % NaCl
20% NaCl

Crecimiento (+,++,+++,++++) o (-)

E. coli
B. subtilis

2. Cul de estas dos bacterias tolera ms la sal?_____________________

3. Cul de estas dos bacterias tolera un amplio rango de sal?____________

4.DISCUSIN
5. CONCLUSIN

6. CUESTIONARIO

1. Cmo se puede determinar experimentalmente si una bacteria es un psicrofilo o un mesfilo?

2. Qu limitaciones hay para el uso de agua hirviendo como un medio para esterilizar materiales?
3. Cundo se dice que un microorganismo es psicrfilo? Explicar su respuesta en base a las
estructuras que presenta: membrana celular, protenas, etc.

4. De qu manera se pueden emplear las bajas temperaturas para el control microbiano?

5. Porque el calor es el agente ms eficaz, que pasos son necesarios para esterilizar un material que
puede ser contaminado con endosporas bacterianos?
6. De la prctica, Responder:
a) Cual de las bacterias tiene la ms amplia rango de tolerancia a la temperatura?
b) Cual tiene el rango ms estrecho rango de tolerancia a la temperatura?
c) Cual es una bacteria termorresistente?
7. Realice un cuadro comparativo explicando que pasa cuando una clula bacteriana con pared y
membrana celular se somete a una solucin isotnica, hipertnica e hipotnica. Esquematice o Dibuje
si ocurre el proceso de plasmlisis y lisis.
8. Definir:
a) Extremfilos
b) Osmosis
c) Presin osmtica
d) Halofilos
e) Osmorregulacin

9. Como es posible que una bacteria pueda crecer en un ambiente hipertnico? Explique su respuesta
en base a la tolerancia osmtica explicando cual es la funcin del K+ intracelular de la bacterias
10. Porque la bacteria no se lisa cuando son colocadas en un medio hipotnico? Explique cul es la
estrategia para evitar la entrada de agua a su interior
11. Qu concentracin de NaCl es ptima para la mayora de bacterias?
12. Qu tipos alimentos son salinizados para ser protegidos de la destruccin por microorganismos?

13. Exponga las ventajas e inconvenientes de la luz ultravioleta y de la radiacin ionizante (Rayos X y
Rayos gamma) como agentes esterilizantes. Indique algunos ejemplos de cmo se utiliza cada una
con ese propsito.

7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

LANSING M. PRESCOTT. 2004 Microbiologa. Quinta Edicion. Mc Graw Hill.

(Biblioteca UC: 616.01 / P85 2004)

LANSING M. PRESCOTT. 2004 Laboratory exercises in Microbiology. Quinta

Edition. Mc Graw Hill.

Web:
https://books.google.com.pe/books?id=2u6Q2XCMDgC&pg=PA218&lpg=PA218&dq=bacterias+que+pueden+crecer+en+
altas+concentraciones+de+cloruro+de+sodio&source=bl&ots=4UjfmewFMs&s
ig=LYrG2wb9KdGsOeJ_h433_tSJvRs&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwjji6GWuJ7M
AhUF4SYKHV4cC8MQ6AEIIjAB#v=onepage&q&f=false
http://www.redalyc.org/pdf/579/57937307.pdf
http://www.scielo.org.ve/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S131525562004000100004
http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/ciencia/v07_n2/pdf/cap2.pdf

https://books.google.com.pe/books?id=2u6Q2XCMDgC&pg=PA219&lpg=PA219&dq=tolerancia+osmotica+de+bacterias&
source=bl&ots=4Ujfn5pKNv&sig=4QmZRQjkjd6TIJLLPIOtH1AIHg&hl=en&sa=X&ved=0ahUKEwis3cWhxZ7MAhWJVz4KHW0ZC8Y
Q6AEIGjAA#v=onepage&q=tolerancia%20osmotica%20de
%20bacterias&f=false