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Termo: 9
Horrio da
aula:
No de turmas
No de equipes
09:45 s 11:30
01
05
20:40 s 22:30
02
10
CRONOGRAMA
Seman
a
Data
Aula Prtica
06/02/15
13/02/15
Biossegurana em laboratrio.
27/02/15
06/03/15
13/03/15
20/03/15
27/03/15
10/04/15
Entrega de relatrios.
17/04/15
Avaliao Parcial.
10
24/04/15
Fermentao alcolica.
11
08/05/15
12
15/05/15
13
22/05/15
14
29/05/15
Preparao de iogurte.
15
12/06/15
Avaliao Parcial.
16
19/06/15
Entrega de relatrios.
17
26/06/15
Avaliao Substitutiva.
SUMRIO
CAPA
- Dever conter o logotipo da instituio na parte superior da pagina;
- O nome da aula pratica realizada;
- O nome de todos os participantes.
INTRODUO
- Deve ser escrita de uma forma clara, apresentando o propsito do
experimento realizado e o porqu esta pratica importante.
- A introduo contida no roteiro de aula no poder ser utilizada para a
produo do relatrio.
MATERIAIS E METODOS
- Dever apresentar todas as etapas realizadas durante a aula prtica,
mesmo que estiver descrito no roteiro;
- Quando no for includo no roteiro da aula prtica, descrever em
etapas ou fluxograma a metodologia utilizada.
RESULTADOS E DISCUSSO
- Dever constar o que voc encontrou e a discusso destes resultados;
- As tabelas e grficos quando apresentados devero ter legendas que
as identifiquem de forma clara e breve o que est contido nas
respectivas, incluindo smbolos quando for o caso;
CONCLUSO
- Apresentar uma afirmao conclusiva sobre a aula prtica.
REFERNCIAS BIBLIOGRAFICA
- Devero ser apresentadas todas as referncias utilizadas na
construo do texto. Siga normas de citao bibliogrficas (ABNT).
BIOSSEGURANA EM LABORATRIO
importante que falemos brevemente sobre como devemos nos portar
dentro de um laboratrio, no importando o que ser estudado, antes de
qualquer atividade prtica.
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CUIDADOS FUNDAMENTAIS
Alguns experimentos que ns realizaremos podem ser perigosos se
voc manipular os materiais impropriamente ou executar os procedimentos
incorretamente. So necessrias algumas medidas de segurana quando se
trabalha com micro-organismos ou substncias qumicas, alm de vidros,
banhos-maria ferventes, instrumentos cortantes e outros materiais. Se voc
tiver qualquer problema com materiais ou procedimentos, no hesite em
chamar o professor ou o monitor para lhe auxiliar.
PROCEDIMENTOS DE PRECAUO E SEGURANA
O laboratrio ser um lugar onde culturas de micro-organismos sero
manipuladas e examinadas. Este tipo de atividade deve ser realizado em
conjunto com boas tcnicas asspticas, num local de trabalho limpo e
organizado. Todos os materiais que sero utilizados nas aulas prticas sero
esterilizados para eliminar todos os micro-organismos presentes, e deve-se
tomar muito cuidado para no haver recontaminao deste material com microorganismos do ambiente.
Geralmente, os micro-organismos estudados no so patognicos, mas
ainda assim, devemos manipular qualquer cultura ou qualquer organismo como
se fosse potencialmente patognico, lembrando que muitos micro-organismos
que geralmente no so patognicos podem causar doenas oportunistas.
Cada estudante deve aprender e praticar as prticas asspticas no
laboratrio. Isto importante para prevenir a contaminao de suas mos,
cabelos e roupas com material contaminado, alm de evitar a contaminao do
seu trabalho e proteger seus colegas que estaro trabalhando na bancada ao
lado.
CONDUTA GERAL NO LABORATRIO
7 Lembre-se de trazer uma caneta que escreva em vidro (caneta para retro,
cd, marcador, etc.)
8 Anote todos os detalhes da aula prtica.
9 Nunca retire culturas ou equipamentos do laboratrio em quaisquer
circunstncias.
10 Terminado o trabalho prtico, deixar a bancada em ordem.
11 Descartar todo o material contaminado em local apropriado e seguro.
OBS: Cada aula prtica dever iniciar-se com uma explicao e um perodo de
demonstrao. O trabalho no deve ser iniciado pelo aluno, at que haja
recebido todas as instrues necessrias.
Desinfeco: um processo menos rigoroso de eliminao de microorganismos, envolvendo usualmente o uso de um agente qumico,
(pele);
Assepsia: conjunto de tcnicas e/ou medidas asspticas, que visam a
no contaminao de algo (por exemplo, de alimentos durante o
preparo);
Pasteurizao: tratamento trmico utilizado para reduo drstica no
nmero de micro-organismos;
Tindalizao: processo de esterilizao capaz de eliminar esporos
CALOR
ao esterilizante (causa a morte do microorganismo).
- Condies de esterilizao: de 150 a 180C,
Forno ou
Estufa
de 3 a 4 horas.
- Utilizao: esterilizao de substncias
imiscveis
em
gua
(como
ps,
leos),
produtos
contaminados
micro-
organismo).
Flambagem
Calor
mido
constituem os micro-organismos.
- Condies para esterilizao: 121C por 15 a 30
minutos a 1 atm.
- Substncias miscveis com gua (meios de
micro-organismos
Elimina
patognicos:
Radiaes Ionizantes
(raios Gama)
energia).
Promove
excitao
de
FILTRAO
Remove
Esterilizante
os
micro-organismos
atravs
da
SONICAO
Vibraes snicas
11
apontados diversos
13
como
desinfetantes.
Exemplo:
Oznio,
gua
oxigenada,
14
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL:
A. FLAMBAGEM ALA DE PLATINA
1. Ascender o bico de Bunsen. Pegar uma ala de platina. Observe o modo
correto de segur-la.
2. Flambar a ala de platina. Observe a posio VERTICAL.
3. Resfriar a ala na zona assptica do bico de Bunsen.
4. Deposit-la na grande. Verifique o modo correto.
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INTRODUO
O cultivo de micro-organismos requer a formulao de meios de cultura
e o estabelecimento de condies que favoream seu crescimento fora do seu
habitat natural. Assim se queremos cultivar e manter micro-organismos vivo em
laboratrio, e necessrio coloc-los em meios de cultura, contendo os
nutrientes apropriados para o seu crescimento. Alm de nutrientes
igualmente necessrio que as condies de oxignio (presena ou ausncia),
pH e presso osmtica sejam adequadas ao crescimento desses microorganismos. Os meios de cultura mais comumente utilizados podem ser
SINTTICOS (componentes qumicos puros e em quantidades conhecidas) ou
COMPLEXOS (quantidade e o tipo de nutrientes no so determinados).
Existem ainda os meios SELETIVOS (contm uma ou mais substncias que
inibem o crescimento de um determinado grupo de micro-organismos, mas
permite o desenvolvimento de outros), de ENRIQUECIMENTO (aumentam a
possibilidade de crescimento da espcie desejada, quando a mesma se
encontra em pequeno nmero) e DIFERENCIAL (permite a distino de
colnias de micro-organismos).
Dependendo da finalidade a que se destinam os meios podem ser
lquidos, usados em estudos de crescimento, de fermentao e na produo de
biomassa, e slidos, teis para contagem e isolamento de micro-organismos.
No preparo dos meios slidos e utilizado como agente solidificante o agar,
devido a sua propriedade de se fundir a 96 oC e solidificar 45oC, e por no ser
utilizado como nutriente pela maioria dos micro-organismos.
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OBJETIVOS
Com a aula prtica o aluno dever ser capaz de conceituar e identificar
quais os tipos de meios mais comumente utilizados; preparar meios de cultura
em estado slido; praticar as tcnicas de esterilizao e de assepsia.
MATERIAIS POR EQUIPE:
- 4 bequer de 100 mL
- 3 erlenmeyer de 125 mL.
- 5 tubos de ensaio de 16x 160 mm.
- 1 proveta de 50 mL.
- 1 basto de vidro.
- 1 pipeta graduada de 10 mL com seringa para suco.
- 1 esptula para pesagem.
MTODOS
Calcular e pesar a quantidade de meio de cultura para preparar 50 mL de; gar
MacConKey, Agar EMB, Agar nutriente e caldo nutriente.
Aquecer em micro-ondas ou banho-maria os meios slidos (Agar) para
dissolver o gar.
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19
20
INTRODUO
As chamadas "tcnicas asspticas" so indispensveis quando se
trabalha com micro-organismos. Elas tm a finalidade de evitar contaminaes
do meio de cultura ou dos materiais utilizados para determinado procedimento
por micro-organismos presentes no meio (ar, gua, mos, roupas, etc.).
Portanto, a aula prtica tem como propsito demonstrar que os microorganismos esto presentes em todos os lugares, sendo assim, e de extrema
importncia que ao se trabalhar com equipamentos, meios de cultura ou algum
tipo de material que foi esterilizado, se tome muito cuidado para que no haja
recontaminao por micro-organismos presente no ambiente.
OBJETIVOS
A aula prtica tem como objetivo constatar a presena de microorganismos no ambiente; demonstrar mtodos de coleta de amostras para
anlise microbiolgica de equipamentos, superfcies, manipuladores e
ambientes; compreender a importncia dos critrios bsicos de higiene.
MATERIAIS
Para aula prtica ser necessrio:
Equipamentos, Materiais e Reagentes (uso comum):
salina estreis).
06 tubos com 9 ml de agua peptonada esterilizada para a
realizao das diluies nos mtodos de espalhamento e Pour
plate
02 moldes de 50 cm2 (faixa de 5 X 10 cm)
01 pipetador automtico de 1000 L
01 caixa de ponteiras de 1000 L estril
01 pisseta de 500 mL com gua destilada
01 pisseta com lcool 70%
01 bico de Bunsen
01 swab estril
01tesoura de metal (ser submetida a flambagem)
01 ala de Drigalsky
01 bquer com lcool absoluto
MTODOS
Micro-organismos presentes em superfcies
1- Retirar um swab esterilizado, segurando-o com cuidado para no tocar
em qualquer parte que venha a ter contato com a soluo tamponada;
2- Abrir, assepticamente, o tubo com soluo tamponada. Umedecer o
algodo e pression-lo contra a parede do tubo drenando o excesso de
lquido;
3- Esfregar o swab, lenta e firmemente, trs vezes sobre a superfcie
conforme relacionado abaixo:
Utenslios de uso individual toda a superfcie que o individuo pode ter
contato com a boca;
Grandes utenslios ou superfcies de trabalho 5 reas de 50 cm 2 (faixa
de 5 X 10 cm);
Amostragem de mos dever ser feita com o swab percorrendo toda a
extenso da palma e dorso da mo e entre os dedos;
22
23
24
REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS
AMERICAN PUBLIC HEALT ASSOCIATION APHA. Compendium of methods
for Microbiological Examination of Foods. 4. ed. Washington: 2001.
OBS: NO TEM RELATORIO. SER ENTREGUE JUNTO COM O PROXIMO
ROTEIRO.
MTODOS DE QUANTIFICAO DE MICRO-ORGANISMOS
INTRODUO
25
(ex.
composio,
pH)
as
condies
de
incubao
UFC =
30 x 10
UFC /cm 2 ,isto , 3,0 x 106 UFC /cm2
0,1
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MTODOS
Procedimento para contagem
1- Contar placas que apresentarem entre 25 e 300 colnias.
2- Para superfcies que tiverem 5 reas de 50 cm 2 amostradas, a contagem
residual de bactrias no deve exceder 500 (mdia de 2 UFC por cm 2).
3- Para utenslios de uso individual e outros, considera-se aceitvel at o
nvel de 100 UFC por utenslio.
Amostra
Nmero de
colnias
Alquota
Diluio
plaquead
Resultado
a
10-1
10-2
10-3
Amostra
Nmero de
colnias
Alquota
Diluio
plaquead
Resultado
a
10-1
10-2
10-3
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Tempo de exposio
Nmero de
colnias
Resultado
REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS
AMERICAN PUBLIC HEALT ASSOCIATION APHA. Compendium of methods
for Microbiological Examination of Foods. 4. ed. Washington: 2001.
BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E. Biotecnologa
Industrial: Fundamentos. So Paulo, SP, Ed. Edgard Blucher LTDA,
2001. vol. 1. 251p.
28
separadas,
formaro
agregados
de
clulas
idnticas
denominadas colnias. Este mtodo assume que uma colnia, que contem
milhares de clulas, proveniente de uma nica cultura microbiana. Quando
esta for transferida para novo meio de cultura, as clulas se multiplicaro livres
de outros micro-organismos, constituindo assim, uma cultura pura, se a colnia
for originada de uma clula, ou axnica, se for originada de mais de uma
clula.
O isolamento de um micro-organismo adequado para um processo
comercial pode ser longo e muito caro e, portanto de extrema importncia
sua preservao. As tcnicas de preservao de cepas isoladas visam evitar
problemas como: um novo isolamento de micro-organismos; evitar o problema
da contaminao decorrente de pesquisadores com falta de experincia; perda
de viabilidade e evitar problemas de mutao (que causa a perda das
caractersticas fisiolgicas da linhagem isolada).
As tcnicas de preservao tm sido desenvolvidas para a manuteno
de culturas em estado de animao suspensa. O armazenamento das cepas
podem ser feito por; tcnicas de armazenamento em curto prazo (repique
continuo), tcnicas de armazenamento de mdio prazo (preservao em leo
mineral; preservao em gua; congelamento a -20C; secagem em slica, solo
e papel de filtro) ou tcnicas de armazenamento longo-termo (liofilizao;
congelamento a - 80C; criopreservao em nitrognio lquido).
OBJETIVOS
Nesta aula ser realizado o procedimento para obteno de cultura pura,
pelo mtodo de esgotamento do inoculo em superfcie de agar, utilizando
Estrias simples e Estrias compostas.
MATERIAIS
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aureus.
01 tubo de caldo nutriente com cultura microbiana.
04 placas de Petri com meio gar nutriente.
01 Pisseta com lcool 70%
01 bico de Bunsen
01 ala de nquel cromo
MTODOS
Isolamento de cultura pura Estrias em placa
1- Inicialmente limpe bem a bancada de trabalho com lcool 70%;
2- Acenda o bico de Bunsen;
3- Coloque os materiais (placa com os micro-organismos, placas de agar
nutriente, ala de nquel - cromo) que sero utilizados atrs do bico de
Bunsen;
4- Esterilize a ala de nquel cromo na chama do bico de Bunsen;
5- Transferir, de forma assptica a suspenso bacteriana contida na placa
contendo a cultura mista para a superfcie do agar nutriente;
6- Espalhe as colnias conforme as tcnicas descritas a seguir:
ESTRIAS SIMPLES
ESTRIAS COMPOSTAS
30
Espalhe
(esgotamento), em movimentos de
repicagem,
ala
superfcie da placa.
inoculo
em
resfrie,
no
primeiro
movimentos
encostando-a
de
no
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FERMENTAO ALCOLICA
INTRODUO
As leveduras e outros micro-organismos fermentam glicose produzindo
etanol e CO2. Os monossacardeos glicose e frutose so convertidos
anaerobicamente para piruvato atravs da Via Glicoltica e o piruvato
convertido em etanol e CO2 atravs das enzimas piruvato descarboxilase e
lcool desidrogenase. A piruvato descarboxilase produzida por leveduras de
cervejarias e de panificao e outros micro-organismos que realizam a
fermentao alcolica. Est enzima no encontrada em animais nem em
32
carboxilase
da
levedura
responsvel
pela
carbonatao
fermentao
alcolica
da
sacarose
pela
levedura
Saccharomyces cerevisiae.
MATERIAIS
Para aula prtica ser necessrio:
Equipamentos, Materiais e Reagentes (uso comum):
Balana semi-anlitica
Saccharomyces cerevisiae (fermento biolgico) (40 g)
02 elernmeyer de 250 mL
100 mL de agua destilada esterelizada.
33
MTODOS
1- Prepare um suspenso de S. cerevisiae 20 % (p/v) em gua destilada
2- Adicione assepticamente 5 mL de suspenso de S. cerevisiae 20% p/v
no erlenmeyer contendo o meio de sacarose 13%.
3- Pesar o frasco (tempo zero de fermentao). Como controle pesar o
frasco de erlenmeyer de 250 mL contendo gua destilada.
4- Incubar os frascos a 30oC e pesar os frascos aps aproximadamente 24,
72 e 96 horas de fermentao. (Agitar os frascos antes da pesagem).
5- Traar o grfico: g de CO2 formado X Tempo de fermentao.
Tempo de
fermentao
Meio de
sacarose
Controle
13%
INTRODUO
A invertase ou
OBJETIVOS
Demonstrar em escala laboratorial o processo de produo de
compostos de alto valor a partir de micro-organismos, com a utilizao do meio
de cultura semi-slido.
MATERIAL
Para aula prtica ser necessrio:
Equipamentos, Materiais e Reagentes (uso comum):
Balana semi-anlitica
Farelo de trigo
Estufa de crescimento microbiano
Papel alumnio
Autoclave
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01 erlenmeyer de 250 mL
03 tubos inclinado de agar batata com o Aspergillus niger.
01 Pisseta de 500 mL com gua destilada
01 Pisseta com lcool 70%
01 tampo feito de gaze e algodo para erlenmeyer 250 mL
01 bquer de 100 mL
01 proveta de 100 mL
01 esptula para pesagem
01 bico de Bunsen
Ala de nquel cromo
MTODOS
Preparo do meio de fermentao
12345-
INTRODUO
O fungo Aspergillus nger produtor de varias enzimas de grande
interesse industrial, como por exemplo, as amilases, proteases,
38
MATERIAIS
Para aula prtica ser necessrio:
Equipamentos, Materiais e Reagentes (uso comum):
Banho-maria 40oC
Banho-maria em ebulio
Glicose P.A.
Agitador rotatrio (Shaker)
Reagente de Somogyi e Nelson (reagentes SN1 e SN2)
39
glicose
1
2
3
4
5
6
7
8
(mL)
0,125
0,250
0,500
0,750
1,250
1,500
2,0
2,500
gua destilada
Volume
Concentrao de
(mL)
final (mL)
glicose (mg/mL)
4,875
4,750
4,500
4,250
3,750
3,500
3,000
2,500
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
0,025
0,05
0,10
0,15
0,25
0,3
0,4
0,5
41
INTRODUO
A espectrofotometria visvel e ultravioleta um dos mtodos analticos
mais usados nas determinaes analticas em diversas reas. aplicada para
determinaes de compostos orgnicos e inorgnicos, como, por exemplo, na
identificao do princpio ativo de frmacos, enzimas, etc.
Espectrofotmetros so instrumentos capazes de registrar dados de
absorbncia ou transmitncia em funo do comprimento de onda. Este
registro chamado de espectro de absoro ou de espectro de transmisso,
segundo
dado
registrado
for
de
absorbncia
ou
transmitncia,
monocromticas,
que
possibilita
inmeras
determinaes
Fontes de radiao
Monocromado
r
Dispositivo de
processamentos de dados
Compartimento
Amostra/padro
Sistema detector
42
OBJETIVOS
Demonstrar
tcnica
de
quantificao
denominada
de
Banho-maria 40oC
Banho-maria em ebulio
Reagente de Somogyi e Nelson (reagentes SN1 e SN2)
PREPARAO DE IOGURTE
PROCEDIMENTO:
45
D a 95 0D, onde o pH deve estar por volta de 4,6 que o ponto isoeltrico da
APNDICE
REAGENTE DE SOMOGYI E NELSON
Forma de preparo:
REAGENTE SN1:
Dissolve-se 4 g CuSO4 .5H2O, 24 g Na2CO3, 16 g NaHCO3, 12 g Tartarato
de sdio e potssio, 18 g Na2SO4 em 1000 mL de gua destilada (conservar em
frasco escuro).
REAGENTE SN2
46
47