Em silcio e anlises quantitativas dos putativos FLC-como homlogo do Caf

(Coffea arabica L. )

Resumo
o padro sequencial de florao do caf uma grande restrio que afeta diretamente a
produtividade, aumenta custos de colheita e gera um produto final de qualidade inferior
para a mistura de frutos secos com os maduros e imaturos. O objetivo deste trabalho foi
identificar e analisar um dos os principais genes envolveram no Regulamento de
florao, florao LOCUS C (FLC) em caf (Coffea arabica L.).
A identificao deste gene foi conduzida em silico usando um banco de dados do EST
de caf (CAFEST) e ferramentas de Bioinformtica. Resultados PCR quantitativos
sugerem que o CaFLClike identificado homlogo est diretamente envolvido no
Regulamento de florao no caf.
Isso expande o nosso conhecimento sobre conservao evolutiva das vias pertencente
espcie dicot. Os estudos funcionais do CaFLC, como com mutantes de uma espcie
mais tractable conduzir a uma melhor compreenso do Regulamento de molecular,
bem como as funes especficas de cada gene florao durante a induo floral no caf.
INTRODUO
O caf um dos mais importantes e valiosos commodities agrcolas do mundo, com
Brasil sendo o maior produtor e exportador. Em 2009, 137 milhes sacas de 60 quilos
de caf foram produzidas em todo o mundo com sua ocupando 9,6 milhes ha de
plantaes e uma mdia rendimento de 14.3 sacos/ha (www.faostat.fao.org).
Embora o Gnero Coffea abrange espcies de 100, apenas dois dos Estes tm grande
importncia econmica: Coffea arabica (arbica) e Coffea canephora (robusta), com o
antigo produzir uma bebida de melhor qualidade e sendo responsvel para a maioria da
produo do mundo, apesar de seus mais sistema de produo exigentes.
Embora a fisiologia de caf tem sido estudada extensivamente, as restries de chave da
produo ainda continuam por resolver, incluindo o seu padro de florao seqencial
(ou seja, tempo de florao no simultneo na mesma planta) resultando em
maturao frutos irregulares, tornando a baga colheita mais difcil e causa perdas no
rendimento e bebida de qualidade (Farnezi et al, 2010; Chalfoun 2010).
sabido que a induo de florao depende expresso equilibrada de uma rede
complexa de gene regulamentada pelo sugestes endgenas e ambientais, que em caf
inclui seca como um factor-chave para acionar a reproduo diferenciao de gemas
vegetativas, seguido por uma estao chuvosa para permitir o desenvolvimento de flores
e frutas.

Alm disso, adicionais aspectos esto associados com o desenvolvimento reprodutivo

nesta espcie perene, polycarpic, tais como uma Bienal ciclo de produo (produo
mais intensa no 1 ano seguido por baixa produo no ano subsequente) e bud letargia
(Camargo 1985; Rena e Maestri, 1985; Silva et al. 2010), que so aspectos que se
desviar do florescimento Biologia estudou em espcies de plantas anuais modelo e fazer
o processo de florao global em culturas mais difceis de Entendo. Como resultado,
embora os efeitos ambientais foram cuidadosamente estudadas sobre sua fisiologia,
muito pouco se sabe atualmente sobre o Regulamento da florao genes no caf.
Incluem ferramentas moleculares recentemente disponibilizadas para caf Projeto
CAFEST (um EST de banco de dados e clone banco;Vieira et al. 2006), o projeto de
PUCE CAFE que produziu um microarray k 15 para anlises de expresso de gene
(Privat et al., 2011) e o projeto genoma caf (http://bioinfo04.ibi.unicamp. br/coffea:
Vidal et al, 2010; Mondego et al 2011) que permite a busca de genes candidatos
relacionados com caractersticas de interesse.
Como um conseqncia, gentica molecular pode lucrar agora com estas ferramentas
poderosas para a identificao e o funcional caracterizao de genes envolvidos na
regulao da vias metablicas e de desenvolvimento no caf.
Estudos genticos com mutantes revelaram vrios genes responsveis para o
Regulamento molecular da florao transio e o desenvolvimento de estruturas
reprodutivas em Arabidopsis (Blazquez 2000; Simpson e Dean 2002; Ciannamea 2007;
Xu et al. 2010).
O LOCUS de florao C (FLC, tambm conhecido como AGL25) uma transio de
florao repressor pertencentes para o fator de transcrio de MADS-caixa famlia,
cujos membros so diretamente associados a florao processo e tm sido muito
estudados em vrios espcie (Liu et al. 2010; Cano et al, 2010; Du e Pijut 2010; Wu et
al, 2010; Hou et al. 2011).
FLC atua inibindo o transcrio do florigen FT em rgos vegetativos para que florao
ocorre somente aps a represso FLC (Michaels e Amasino 1999; Johanson et al, 2000;
Yan et al. 2010). Em Arabidopsis, sua expresso ativador por tratamento a frio, qual
desencadeia florao.
O caf uma rvore tropical espcies e sua florao provocado principalmente pela
seca. Expresso FLC e mecanismos de ao so bastante estudados no o modelo
Arabidopsis e espcies afins, mas pouco conhecido. fora da famlia Brassicaceae.
Esto em curso esforos para entender a induo de florao em angiospermas perenes,
incluindo espcies estreitamente relacionadas a Arabidopsis (Arabis alpina) e nas
culturas, como caf e citros (Oliveira et al, 2010; Wang et al. 2009; Tan e Swain 2007).
Que visa caracterizar em caf arbica, o homlogo da FLC. Este trabalho amplia nossa
compreenso sobre a florao Regulamento no caf, com implicaes potenciais para
molecular programas de melhoramento.

MATERIAL E METODOS
Identificao da FLC homlogos na transcrio de caf seqncias de caf florao
LOCUS C (FLC) homlogos foram identificados no banco de dados CAFEST
(http://www.lge.ibi.unicamp.br/cafe; Vieira et al. 2006) usando a interface do Gene
Project para procurar leituras e seqncias de consenso provisrio (TCs) de montagem.
Intrnseca anotao de leituras no banco de dados foi usada para recuperar seqncias
por palavra-chave de busca, alm de tBLASTn pesquisa (Altschul et al., 1997) usando a
Arabidopsis FLC seqncia de transcrio como consulta com limite de valor E de 10
5.
ESTs todas encontraram foram agrupadas de forma contigs ou camisolas. Contigs
montados foram usados para a nova ronda de seqncia busca de similaridade no banco
de dados CAFEST para estender a TCs incompletos, at atingir a saturao, quando no
h novas leituras foram encontradas. TC e singlet seqncias foram procurou por
homologia no banco de dados do NCBI usando BLASTx. Para definir o quadro de
codificao putativo de transcries de caf, o Ferramenta NCBI ORF Finder foi usada.
Anlises de alinhamento de seqncias de protena foi executada com ClustalW
(Thompson et al., 1994) seguido por ajuste manual. A anlise filogentica foi gerada
com MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007) usando neighborjoining (Saitou e Nei 1987) como
modelo de comparao, p mtodo de distncia e a supresso por pares. Arquitetura de
rvore foi validado pelo teste bootstrap probabilstica com 100 Replica (Sitnikova et al.,
1995). A caixa de MADS amino cido seqncias de putativos homlogos FLC caf
foram alinhado com o CGC e exibido com GeneDoc programa
(http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/).
Na anlise de expresso de Gene de Silico a freqncia de cada seqncia de transcrio
(TCs e camisolas) sob estudo foi calculado em bibliotecas CAFEST, e os dados foram
normalizados para permitir a comparao de expresso gnica em cada rgo e
tratamento. Normalizao consistia em multiplicar o nmero de leituras relacionadas
com cada seqncia FLC-relacionados (TC ou singlete) pelo quociente entre o nmero
total de leitura de todas as bibliotecas e leitura nmero da biblioteca em um determinado
tratamento / rgo. Anlise de cluster hierrquica (Eisen et al., 1998) foi realizadas e
visualizadas usando ClustalW2 (http://www.ebi. ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) e
TreeView (http://taxonomy. programas de Zoology.gla.AC.uk/Rod/TreeView.html),
respectivamente.
Plantar caf Material material vegetal foi coletado na campo experimental da
Universidade Federal de Lavras (UFLA), municpio de Lavras, MG (21 1442S 45
0000W). Cinco tecidos de planta de c. arabica CV. Rubi foram amostrados: secundrio
razes (roots), folhas de plantas submetidas a 90 dias de gua stress, folhas durante a
florao, as flores (G4-G5 estgios, como descrito por Morais et al, e frutas (em
diferentes estdios de desenvolvimento). Amostras foram imediatamente preservadas
em nitrognio lquido e armazenadas em 80 C. Extrao do RNA e cDNA sntese

concerto planta RNA Reagente (Invitrogen) foi usado para a extrao do RNA total,
seguindo as recomendaes do manuais, com menor alteraes.
Amostras de RNA foram tratadas com DNase I usando Turbo Kit de DNA livres
(Ambion) para a eliminao da contaminao residual do ADN. RNA integridade foi
verificada em gel de agarose 0,8% e as amostras foram quantificados em Nanodrop
ND-1000. As amostras que apresentado alta integridade e pureza foram usados para
cDNA sntese com o alta capacidade do cDNA transcrio reversa Kit (Biosystems
aplicados). Aps a sntese do cDNA, as amostras foram armazenadas em 20 C.
cDNA de seqenciamento e folha de anlise do banco de dados do cDNA as amostras
foram amplificadas utilizando uma enzima de alta fidelidade (Pfx DNA polimerase,
Invitrogen) e primers especficos para florao LOCUS C (Fw CaFLC-como 5 '-CAC
CGAAGGAATTAAGGA e CaFLC, como Rv 5 '-TTAAAGTAGTTCAAGCATA). O
fragmento amplificado foi eluda de gel de agarose com o MinElute Kit (Qiagen ) e
seqenciado. A seqncia obtida foi Conceitualmente traduzida e comparada contra caf
homlogos e contra o uso de banco de dados do GenBank BLASTx (Altschul et al.,
1997). O longa-metragem de codificao seqncia para CaFLC, como depositado no
GenBank (HQ845334).
Primer Design a partir de seqncias de transcrio putativo de transcries de florao
LOCUS C (FLC) caf obtidas do estudo de silico, iniciadores de PCR foram projetados
usando o Programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) e para anlise de qRTPCR, primers foram desenhados usando o Primer Express v 2.0 programa (Applied
Biosystems). Os primers usado para quantificar a expresso CaFLC, como eram RTCaFLC-como FW 5 '-GCTGAGGGAAGAAAACAAGC e RT-CaFLClike RV 5 'CGTGTGTAAGGTCCCCAAAT.
Quantitativos RT-PCR para expresso gnica quantitativa anlises, uma reao contendo
80 ng cDNA, 1,5 M cada primer e 5.0 L SYBR Green UDG Master Mix com ROX
(Invitrogen) foi preparado em uma volume final 10,0 L/amostra. As condies
trmicas eram 2 min a 50 C, 10 min a 95 C, seguido de 40 ciclos de 15 s 95 C e 1
min de 60 C em um ABI PRISMA 7.500 thermalcycler de PCR em tempo real
(Applied Biosystems). Os dados foram coletados com o Software rpido de 7500 (v.
2.1). Quantificao relativa foi obtida usando o 2CT mtodo com o housekeeping
genes -actina (ACTINA-Fw 5 '- AATTGTCCGTGACATCAAGGAA e ACTINA-Rv 5
'-TGAGCTGCTTTGGCTGTTC) e gliceraldedo-3-fosfato desidrogenase (GAPDH-Fw
5 '-TTGAAGGGCGGTG CAAPORA e GAPDH-Rv 5 'AACATGGGTGCATCCTTGCT; Barsalobres-Cavallari et al. 2009). Todos os primers
rendidos PCR eficincia > 90%, avaliada pelo mtodo de curva de diluio, e a
especificidade de amplificao foi avaliada pelo derretimento curva.
RESULTADOS
Anlises de seqncia do putativo FLC homlogos BLASTx anlise no banco de dados
CAFEST usando a Arabidopsis FLC como consulta processado 57 leituras que foram

agrupadas em 12 contigs e 9 camisolas todas contendo caixa de MADS conservada do

domnio (Fig. 1). Filogenia dos homlogos FLC tem sido explorado em vrios outros
estudos (Becker e Theissen 2003; Reeves et al, 2007; Zhang et al. 2009). Comparamos
seqncias de FLC-como caf contra protena sequncias de outras espcies e
homologia encontrada com FLC-como seqncias de Beta vulgaris, Poncirus trifoliata,
Arabidopsis e outras espcies de plantas (Fig. 2). Alm disso para que, quando uma
comparao entre a deduzir totalmente amino relacionados ao cido seqncias do tipo
CaFLC e o mais prximo as seqncias encontraram na anlise da filogenia (BvFLC e
PtFLC) e o AtFLC (Fig. 3) feito, um altamente conservadas domnio encontrado.
Gene expresso Virtual norte gerados a partir de leitura contando no banco de dados
CAFEST revelou que contig 9 (Como CaFLC) tinha o mais alto padro de expresso
biblioteca derivado de rgos submetidos a abitico (pool de tecidos sob estresse
hdrico, SH2) e estresses biticos (hastes infectado com Xylella spp., RX1; Fig. 4). Isso
relevante Porque o caf uma planta short-day que necessita de estresse (tais como
seca ou frio) para o desenvolvimento da flor (Alvim 1960; Miranda et al. 2009). Entre
os outros contigs, apenas Contig 3 mostrou expresso em tecidos seca-salientou.
Expresso FLC em outras espcies foi mostrado para ser semelhante ao funcionalmente
caracterizadas FLC homlogos (por exemplo, Arabidopsis, Thellungiella e Brassica),
que eram capazes de atrasando a florao, assim sendo relacionados ao controle de
transio da vegetativa para a reprodutiva fase quando expressos em plantas
transgnicas de Arabidopsis. Estes resultados so interessantes porque sequncias de
ambas as espcies B. vulgar e p. trifoliata agrupado com o c. arabica contig 9 (Fig. 3),
demonstrando que esta contig de fato uma forte candidato para segurar as informaes
da funo FLC em plantas de caf.
Nossos experimentos PCR em tempo real revelaram que CaFLC, como
constitutivamente expressa e mais elevada nas folhas da florao Ramos e flores (Fig.
5), corroborando o perfil de expresso semelhante relatado por Zhang et al. (2009) para
homlogo Poncirus FLC. A mais alta expresso do CaFLC, como foi observada nas
folhas das plantas submetidas a 90 dias de gua estresse e antes de florescncia. Desde
que a seca induz florao transio no caf, este padro de expresso oposta que
espervamos para um repressor de florao. No entanto, nossos dados so suportados
pelo padro de expresso de FLC de p. trifoliata (Zhang et al., 2009) e outro anterior em
anlise de silcio em caf (Oliveira et al., 2010). P. trifoliata uma espcie de portaenxerto usada em orqudeas ctricas e altamente tolerante ao estresse trmico. Como
seca no caf, frio induz um springflush Florao em citros. Curiosamente, o PtFLC
upregulated durante o inverno (Zhang et al. 2009), que confirma nossa concluses e
lana a pergunta sobre como evolutivamente atividade e expresso de FLC conservada
so economicamente espcies relevantes das culturas em relao a Brassicacea estudada
famlia. Alm disso, esta situao poderia ser um adaptvel condio para plantas
tropicais, como caf e citrus desde que em regies tropicais os mais longos perodos de
seca esto associados temperatura mais baixa ao longo do ano (inverno seco e vero
mido).

Em toto, este estudo identificou e habilitado o funcional caracterizao de um gene

chave envolvida em florao Regulamento em c. arabica, com perspectivas de gentica
complementar estudos utilizando os mutantes no modelo heterlogo espcies para
fornecer uma melhor compreenso de que a regulamentao processos envolvidos, bem
como as funes especficas de cada Gene durante a induo floral neste
economicamente importante, embora Understudy, espcie de culturas.