BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA

FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA-ALIMENTOS
LABORATORIO DE BIOQUMICA I
Garca Mendoza Armando Jacob, Monroy Arellano Mitzi Rubi, Ordoez Avila Adrian,
Xahuentitla Zamora Arleth

EL CN Y EL Pb INHIBEN LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA?

INTRODUCCIN

RESULTADOS

Las enzimas son protenas globulares con accin especifica, necesarias para la vida pues funcionan como catalizadores biolgicos, acelerando hasta un
milln de veces las reacciones qumicas que se llevan a cabo dentro del organismo.
Las acciones de muchas enzimas estn reguladas de modo que pueden cambiar de un estado de baja actividad a uno de alta actividad, dependiendo las
condiciones en las que se encuentren.

Intensidad de
burbujeo

OBJETIVOS

Tienen un sitio activo que interacciona con el sustrato, este se encuentra en los residuos catalticos en forma de hendidura y representa una pequea porcin del volumen total de la enzima.

Su especificidad esta dada por:

La forma del sitio activo: ESPECIFICIDAD ABSOLUTA, un solo sustrato es reconocido.
Los residuos del sitio activo: ESPECIFICIDAD RELATIVA, los sustratos reconocidos tienen similitud qumica.
Por el medio electrnico del sitio activo: ESTEREOESPECIFICIDAD ABSOLUTA, de los posibles estereoismeros solo se reconoce a uno.

Observar la actividad de la enzima catalasa utilizando diferentes fuentes biolgicas.

Comparar el efecto de la temperatura de algunos inhibidores como el Pb y el CN sobre la actividad enzimtica de la Catalasa.

MATERIAL

Algunas enzimas de baja actividad cataltica requieren un coadyuvante para presentar su mxima actividad, pueden ser iones metlicos (cofactores) o molculas orgnicas (coenzimas). Estas estabilizan la conformacin activa de la enzima y sirven como puente de unin entre el sitio activo y el sustrato, son
responsables directos de la catlisis.
INHIBIDORES
Un inhibidor enzimtico es algn compuesto que impide que alguna, o algunas, enzimas catalicen. Este tipo de compuestos son especficos. Los inhibidores, dependiendo de la forma en que actan se han clasificado en dos grandes grupos:
Inhibidores reversibles: reaccionan con la enzima, pero el complejo enzima inhibidor producido puede separarse para formar la enzima libre
ms el inhibidor. Mientras I permanezca unido a E la enzima es inactiva puesto que no puede unir al sustrato:

Inhibidores reversibles competitivos: tienen

la caracterstica de ser qumicamente muy parecidos al sustrato, de tal manera que pueden
ocupar el sitio activo de la enzima, pero sta no
los transforma, mientras el inhibidor est dentro
del sitio activo el verdadero sustrato no puede
entrar y por lo tanto no es posible que se forme
ES y no hay formacin de producto.

Inhibidores reversibles no competitivos: se

unen a la enzima en un sitio especfico diferente al
activo. Este tipo de compuestos puede tener una
estructura qumica totalmente diferente a la del sustrato. Al unir a la enzima un inhibidor de este tipo,
se produce un cambio en su estructura tridimensional que altera la configuracin del sitio activo, imposibilitando el reconocimiento del sustrato. Cuando
EI se rompe, la enzima adquiere su conformacin
activa.

Inhibidores reversibles acompetitivos: se unen al complejo

ES, impidiendo de este modo
cumplir las funciones enzimticas correctas.

FICHAS DE SEGURIDAD

Intensidad de
burbujeo

La mayora de estas enzimas son homotetrmeros con un grupo hemo en cada subunidad. Se ha determinado la estructura cristalogrfica de nueve catalasas. Algunas catalasas tienen subunidades pequeas (masa molecular 60
kDa) y otras grandes (masa molecular > 80 kDa). Entre estos dos tipos de catalasas existen diferencias estructurales
importantes. Las catalasas pequeas son menos resistentes a la desnaturalizacin, unen NADPH, tienen hemo b y
se inhiben e inactivan por sustrato. En cambio, las catalasas grandes tienen un dominio extra en el C-terminal que es
semejante a la flavodoxina, son muy resistentes a la desnaturalizacin, tienen hemo d, presentan enlaces covalentes
inusuales cercanos al sitio activo y son resistentes a concentraciones molares de H2O2.

Tubo 1
+++

M AN Z AN A
Tubo 2
+

Tubo 3
+

Tubo 4
+

Tubo 1
+++++

H G AD O
Tubo 2
+

Tubo 3
++

Tubo 4
+++

1 pipeta de 5 ml
Se observan 4 tubos para cada tejido preparados segn la tabla anterior, donde la intensidad de burbujeo indica la presencia de catalasa.

1 vaso de precipitado de 50 ml
1 placa Petri

El hgado fue el tejido con ms presencia de catalasa, en segundo lugar fue la papa y
por ltimo la manzana.

Imagen 3 Tubos que contienen un pequeo corte de hgado de

pollo, preparados como lo menciona la tabla anterior.

1 pinza para tubos de ensayo

Bao Mara 100C
Bistur

DISCUSIN
Con base a los fundamentos de esta prctica esperamos obtener una mayor intensidad de burbujeo en el tubo uno, puesto que en su interior
el tejido se encuentra sin hervir y slo reaccionar la catalasa al adicionarle el perxido de hidrogeno (H 2O2), en dicha reaccin ocurrir la liberacin de oxigeno y agua en forma de burbujas. El tubo dos, a excepcin de los dems, se somete a un proceso de calentamiento, en bao
mara, en el cual el incremento de temperatura desnaturaliza la enzima, perdiendo as su actividad catalizadora. En el tubo tres, se espera
una intensidad de burbujeo menor que en el tubo uno puesto que la formacin del complejo ion ferrocianuro impide su funcin enzimtica. As
mismo el tubo cuatro, esperamos observar una intensidad de burbujeo ligeramente mayor que en el tubo 3 ya que en este caso se une al grupo tiol y realiza su funcin inhibidora que es de menor intensidad que el NaCN.
De los resultados obtenidos fue posible observar el comportamiento que presentan los tejidos utilizados en la prctica al estar expuestos en
diferentes condiciones.

Hgado de pollo*

Hgado:
En el tubo 1, en ausencia de inhibidor, se observ una mayor intensidad de burbujeo debido a que cuando la catalasa reacciona con H2O2
hay un desprendimiento de O2 muy notorio. El tubo 2 presenta una intensidad de burbujeo baja dado que al someterlo a un proceso previo de
calentamiento la catalasa se desnaturaliza por el aumento de temperatura. En el tubo 3, que contena el inhibidor de NaCN, el cual durante la
reaccin se une al grupo hemo de la catalasa perdiendo as su actividad catalizadora por lo que la intensidad de burbujeo es baja pero en
comparacin con el tubo 2 es mayor. Finalmente en el tubo 4 el cual contena Pb(NO 3)2 como inhibidor se observ una intensidad de burbujeo mayor que el tubo 3 ya que el Pb se une al grupo tiol (-SH) de la cistena encontrada en catalasa .
Manzana:
En el tubo 1, se present una intensidad de burbujeo mayor en comparacin con los otros tubos debido a que la catalasa del trozo de manzana reaccion con el H2O2 desprendiendo O2 , indicando la presencia de catalasa. En el tubo 2 no se observ burbujeo derivado de que al
someterlo a calentamiento la enzima se desnaturaliz por el incremento de temperatura. El tubo 3, contiene el inhibidor de NaCN el cual reacciona con el grupo hemo de la catalasa presentndose un intensidad de burbujeo inferior al tubo 1 y por ltimo en el tubo 4 la intensidad de
burbujeo fue igual que en el tubo 3 pero en este caso el Pb se une al grupo tiol de la cistena SH en la catalasa y no se observa una intensidad alta de burbujeo debido a que la manzana tiene una mnima cantidad de catalasa.

REACTIVOS

Tubo 4
++

Tabla 3 Tabla que representa la intensidad de burbujeo que present el hgado al reaccionar con el perxido de hidrogeno tras haber preparado los tubos como lo menciona el apartado de procedimiento.

1 pipeta de 10 ml

*en crudo

La catalasa es una enzima antioxidante del tipo oxidorreductasa, presente en la mayora de los organismos aerobios. Cataliza la dismutacin del perxido
de hidrgeno (H2O2) en agua y oxgeno.
2H2O2 2H2O + O2

Imagen 2 Tubos que contienen manzana, preparados como lo indica la

tabla anterior, presentando la reaccin con perxido de hidrogeno.

1 gradilla

Papa*

C AT AL AS A

Tubo 3
+

Tabla 2 Tabla que representa la intensidad de burbujeo que present la manzana al reaccionar con el perxido de hidrogeno tras haber preparado los tubos como lo menciona el apartado de procedimiento.

Intensidad de
burbujeo

Manzana*

Inhibidores irreversibles: Este tipo de compuestos se unen, de manera irreversible, con el grupo R de algn aminocido de la enzima, formando
un complejo enzima - inhibidor (EI), el cual es incapaz de llevar a cabo el acto de catlisis, debido a que el complejo EI no puede unir al sustrato para formar ES: E + I EI

Imagen 1 Tubos que contienen papa,

preparados como lo menciona la tabla
anterior, presentando la reaccin con
perxido de hidrgeno.

12 tubos de ensaye

MATERIAL BIOLOGICO

P AP A
Tubo 2
+

Tabla 1 Tabla que representa la intensidad de burbujeo que present la papa al reaccionar con el perxido
de hidrogeno tras haber preparado los tubos como lo menciona el apartado de procedimiento.

Estas se denominan con la terminacin -asa- tomando como base el tipo de reaccin que catalizan y/o el sustrato que transforman; y se clasifican en 6
clases:
Oxidoreductasas: Catalizan reacciones de oxido reduccin.
Transferasas: Catalizan reacciones de transferencia de grupos.
Hidrolasas: Catalizan ruptura de enlaces qumicos con adicin de agua.
Liasas: Catalizan la ruptura de enlaces qumicos sin participacin de agua.
Isomerasas: Catalizan reacciones de isomeracin.
Sintetasas: Catalizan en reacciones que consisten en unir dos molculas. Reaccin acloptada con la intervencin de enlaces fosfato de ATP
(consumen energa) .

Tubo 1
+++

Cianuro de sodio (NaCN) al 5%

Nitrato de plomo (Pb(NO3)2 ) al 5%

Papa:
En el tubo 1, que nicamente contena el tejido, se observo una intensidad de burbujeo parcialmente alta debido a la reaccin de la catalasa
con el H2O2, observando el desprendiendo de O2 en forma de burbujas. El tubo 2 se observa una intensidad de burbujeo baja debido a la
desnaturalizacin de la catalasa al someterse a un previo calentamiento. En el tubo 3 se observa una intensidad de burbujeo igual que en el
tubo 2 debido a que la formacin del complejo entre el CN y el Fe impide poder realizar su funcin. En el tubo 4 se presenta una intensidad
de burbujeo mayor que en el tubo 2 y 3 debido a que el Pb se une a los grupos tioles.

Perxido de hidrgeno (H2O2)

En los resultados se observa que el NaCN inhibi mayormente la reaccin enzimtica de la catalasa, dado que en los 3 tejidos el burbujeo fue
menor que en aquellos tubos que contenan el inhibidor Pb(NO3)2 .

Fig. 1 A. El dmero de una catalasa pequea (BLC). Se

muestra como estn entrelazados los monmeros .
B. El tetrmero de una catalasa. grande (HPII).

PROCEDIMIENTO

FUNDAMENTO

CONCLUSIN
Podemos decir que el CN y el Pb si inhiben la reaccin enzimtica ya que son de tipo irreversible, concluimos que el CN es un mejor inhibidor dado
que al unirse al Fe de la catalasa forman el complejo ferrocianuro, mientras que el Pb por su afinidad hacia los grupos SH de la cistena contenida
en la catalasa se une a ellos.

La catalasa es una enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno (H202) en oxgeno y agua. El perxido de hidrgeno se forma por la dismutacin del radical superxido y tambin en la reaccin de algunas oxidasas, es txico para la mayora de los organismos vivos.
El perxido de hidrgeno es uno de los productos del metabolismo celular en diversos organismos, pero dada su potencial toxicidad, es transformado enseguida por la enzima catalasa.
H2O2 + Fe(III)-E H2O + O=Fe(IV)-E

CUESTIONARIO

H2O2 + O=Fe(IV)-E H2O + Fe(III)-E + O2

Efecto de la Temperatura
Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reaccin hasta cierta temperatura ptima. Dentro de un intervalo en que la enzima es
estable y activa. Todas las enzimas son protenas. Por lo tanto, todas las enzimas sufren desnaturalizacin frente al calor. Esto quiere decir que cuando la
temperatura es muy elevada, la enzima pierde su estructura y su actividad cataltica, por lo tanto su sitio activo tambin se desnaturaliza, y ya no puede
cumplir su funcin. La enzima catalasa al igual que otras protenas, se puede desnaturalizar al exponerlas a altas temperaturas. Al perder su estructura se
perder tambin la funcin, por lo que no podr descomponer el agua oxigenada.

1. Cul es el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica?

Inhibicin

2. Qu es el factor Q-10?

La accin de la enzima es va una reaccin directa del ion Fe(III) con el oxgeno, para liberar el perxido y formar agua.

El Q-10 es el factor por el cual aumenta la velocidad de un proceso cuando la temperatura ambiente aumenta 10 C, este factor define la
relacin que existe entre la velocidad de un proceso, o de una reaccin, a una temperatura dada, y la velocidad del mismo proceso ante un
cambio de temperatura de 10C, y est dado por la siguiente expresin:

La velocidad de reacciones catalizadas por enzimas se incrementa con la temperatura hasta que su punto mximo es alcanzado, es decir,
su temperatura ptima donde la velocidad de la reaccin es mayor, este incremento se debe a que aumenta el nmero de molculas ricas
en energa que pueden pasar la barrera energtica de estado de transicin, para formar a los productos. Despus de que las enzimas han
alcanzado la temperatura ptima el incremento de la temperatura desactiva a las enzimas debido a que las enzimas son protenas y se
desnaturalizan a temperaturas mayores entre 55-60 C, por consecuencia la velocidad de reaccin disminuye.

Plomo
El plomo inhibe a travs de su unin con los grupos tioles (-SH) de la cistena que contiene la catalasa, de forma covalente, ya que el Pb tiene una gran afinidad por estos grupos, por lo tanto el Pb es un inhibidor de tipo irreversible.
Cianuro
El cianuro es un inhibidor de tipo irreversible. Esto hace que el ion Fe(III) no tenga la capacidad de reaccionar con el oxgeno extra del perxido de hidrgeno, y entonces no cumpla su funcin debido a que el cianuro se une por enlaces covalentes al grupo funcional de la enzima siendo su sitio activo el grupo
hemo, es decir, la inhibicin por el CN esta dada por la formacin del complejo ferrocianuro, lo cual impide su actividad enzimtica.

donde: KT es la constante de velocidad del proceso a la temperatura T y KT+10 es la constante de velocidad a una temperatura 10 C mayor.
3.Escribir el complejo que se forma con el Fe y el CN-

BIBLIOGRAFA

Complejo resultante al reaccionar el Fe y el CN:

El ion ferroso y el ion frrico forman un complejo octadrico con 6 iones CN, donde la nica diferencia es que el complejo de Fe(II) tiene un electrn ms
que el complejo (III).

Voet, D., & Voet, J. G. (2006). Bioquimica. Madrid, etc: Editorial Medica Panamericana.

Lehninger, A. L., Nelson, D. L., & Cox, M. M. (2005). Principios de bioquimica. Barcelona: Omega.

Berg, J. M., Tymoczko, J. L., & Stryer, L. (2003). Bioquimica. Barcelona: Revert

Ayudas didcticas, Bioquimica I.

Enzimas. Martinez Guerra Juan Jos. Universidad Autonoma de Aguascalientes. Inhibidores enzimticos. Recuperado 12 Octubre 2016. http://
libroelectronico.uaa.mx/capitulo-6-enzimas/inhibidores-enzimaticos.html

Tanto el ion ferroso como el ion frrico forman un complejo octadrico con 6 iones (CN) el cual se llama ferrocianuro, la nica diferencia
es que el complejo de Fe (II) tiene un electrn mas que el complejo de Fe (lIl).