Crioconservacin De Meristemos Utilizando La Tcnica De

Encapsulamiento Y Deshidratacin

El encapsulamiento y deshidratacin tiene su fundamento en la

tecnologa desarrollada para la produccin de semillas sintticas, en la
cual los embriones son envueltos en una cpsula de alginato.

Para

crioconservacin, sta consiste en el aislamiento de los explantes y su

cultivo por un da en el medio de cultivo estndar para que se recuperen del
estrs de la diseccin. Los explantes son encapsulados en alginato de calcio
y precultivados en medio de cultivo con concentraciones crecientes de
sacarosa (0,3 a 1,5 M) por periodos de al menos 1 da en cada
concentracin.

Las cpsulas son deshidratadas utilizando el flujo de aire

estril de la cmara de transferencia o por exposicin a slica gel en

recipientes sellados. El congelamiento se realiza rpidamente por inmersin
directa de las muestras en nitrgeno lquido o en dos pasos, iniciando con un
enfriamiento lento hacindo uso de un congelador programable, seguido
inmediatamente por el congelamiento rpido en nitrgeno lquido.

Est

tcnica ha sido modificada y combinada con otros procedimientos como la

vitrificacin (incubacin de las cpsulas en soluciones concentradas de
crioprotectores como glicerol, etilenglicol y DMSO), con el fin de incrementar
los porcentajes de sobrevivencia de algunos materiales. Ha sido evaluada en
pices, meristemos, embriones somticos y suspensiones celulares de un
gran nmero de especies como pera, manzana, caa de azcar, papa, clavel,
wasabi, lirios y otros.
Esta tcnica presenta muchas ventajas para la crioconservacin de
pices en comparacin con los protocolos clsicos.
sobrevivencia

son

generalmente

mayores,

Los porcentajes de
lo

mismo

que

la

reproducibilidad entre experimentos, la recuperacin es ms rpida y

por lo general, sin pasar por una fase transitoria de callo. Desde el punto
de vista prctico, las condiciones de precultivo y congelamiento son ms

simples, debido a que la sacarosa es el nico crioprotector empleado y el uso

del congelador programable no es necesario. Adems, la manipulacin de
los pices o meristemos se facilita cuando estn encapsulados.

Objetivo: Con esta prctica se pretende familiarizar al estudiante con una

de las tcnicas ms utilizadas para la conservacin in vitro de
germoplasma vegetal.

Materiales:
Medio de cultivo de papa estndar semi-slido, autoclavado y dispensado en
platos Petri deschables.
Medios de cultivo de papa estndar lquido con 0,3 M, 0,5 M y 0,75 M de
sacarosa,

dispensados

en

frascos

de

cultivo

(Gerber)

grandes

autoclavados.
Medio de cultivo de papa estndar lquido sin calcio. Dividir el volumen en
dos.
Dejar uno sin calcio y al otro agregar 100 mM de cloruro de calcio.
Dispensar el que contiene el calcio en frascos grandes gerber y autoclavar.
Solucin de alginato de sodio al 3% en el medio de cultivo sin calcio.
Calentar el medio de cultivo y agregar el alginato lentamente. Autoclavar.

Procedimiento:

Preparacin de medios de cultivo:

Medio de cultivo de papa estndar: M&S + Vitaminas + 2 mgL-1

de pantotenato de calcio + 0,5 mgL-1 de GA3 + 30 gL-1 de sacarosa . pH 5,8.
Transferir a un frasco refractario.
Medios de cultivo estndar lquidos:

Igual al anterior pero

agregando a cada uno de los medio una de las siguientes concentraciones:

0,3, 0,5 0,75 M sacarosa. No adicionar gelificante. Dispensar en frascos
de cultivo grandes y autoclavar. Preparar 500 ml de cada medio.
Medio de cultivo estndar lquido sin calcio: Para preparar este
medio de cultivo, primero debe preparar una solucin nutritiva de
macroelementos eliminando las frmulas que contienen calcio y agregar sta
al medio de cultivo, en lugar de la solucin madre de macroelementos
estndar.

El resto del medio de cultivo se prepara igual al anterior

(estndar) pero sin agregar gelificante. Dividir este medio en 2 volmenes

iguales en frascos refractarios.
Medio de cultivo con 100 mM de cloruro de calcio: A uno de los
volmenes que prepar anteriormente, agregar el cloruro de calcio.
Autoclavar y guardar en un frasco refractario.
Medio de cultivo con alginato de sodio al 3%:

Al segundo

volumen de medio sin calcio agregar el alginato de sodio. Para preparar esta
solucin, empezar calentando el medio en un calentador-agitador magntico,
agitando fuertemente. Agregar lentamente el alginato de sodio de manera
que ste se disuelva.

Tal vez no se logre la disolucin total antes de la

esterilizacin, pero durante el autoclavado se terminar de disolver.

Preparar en un frasco refractario.

Aislamiento de meristemos: Con la ayuda de un estereoscopio,

aislar meristemos axilares de vitroplantas de papa de
aproximadamente 12 das y cultivarlos en medio estndar semi-slido
por 1 da.

Encapsulamiento de meristemos: Suspender los meristemos en el

medio de cultivo que contiene alginato de sodio. Con la ayuda de un
gotero estril, dejar caer una gota del alginato que contenga un
meristemo, en el medio de cultivo con cloruro de calcio. Incubar al
menos 20 min para que se formen las cpsulas y tomen la consistencia
adecuada. Pasado este periodo, eliminar todo el medio con cloruro de
calcio. Secar el exceso de lquido de las cpsulas transfirindolas a un
plato Petri que contenga papel de filtro estril.

Precultivo en las soluciones de sacarosa: (opcional)

Transferir las cpsulas que contienen meristemos al medio de cultivo

que contiene 0,3 M sacarosa. Al da siguiente transferirlas al medio con 0,5
M sacarosa y al siguiente da al medio con 0,75 M sacarosa por 24 horas
aproximadamente.

Deshidratacin de las cpsulas y congelamiento rpido:

Colocar platos Petri estriles en el fondo de la cmara de transferencia

de flujo laminar. Colocar 30 meristemos por tratamiento de deshidratacin

(0, 1, 2 y 2,5 horas). A la vez preparar cpsulas vacas (sin meristemas) para
deshidratar por los mismos periodos, de manera que al final de cada periodo
de deshidratacin se pueda determinar el peso fresco de estas cpsulas
vacas, para luego determinar el peso seco y el contenido de humedad.
Al finalizar cada periodo, tomar una muestra de 10 cpsulas que
contengan meristema, inocularlas en el medio de recuperacin (control de

deshidratacin). Tomar otra muestra de 10 cpsulas que contengan

meristema y transferirlas a un criotubo previamente marcado con el
tratamiento y congelar rpidamente por inmersin del criotubo en nitrgeno
lquido.

Descongelamiento:
Para descongelar las muestras, sacar los tubos del nitrgeno lquido y

colocarlos en la cmara de transferencia de flujo laminar, durante

aproximadamente 20 min, para que se descongelen lentamente. Luego,
colocar cada cpsula en el medio de recuperacin para permitir la brotacin
de los meristemas y la regeneracin de plntulas.
Si se realiza la parte de precultivo en sacaros, recordar tomar una
muestra de 10 meristemos de papa recin aislados y colocarlos en el medio
de recuperacin (estndar semi-slido), ste ser el control de aislamiento.
10 meristemos encapsulados (control de encapsulamiento). 10 meristemos
despus de incubacin en las diferentes concentraciones de sacarosa
(control con 24 h de precultivo en 0,3 M sacarosa), (control con 24 h en 0,3 M
sacarosa + 24 h en 0,5 M sacarosa) y (control con 24 h en 0,3 M sacarosa +
24 h en 0,5 M sacarosa + 24 h en 0,75 M sacarosa).

Resultados: Evaluar la sobrevivencia de los meristemas de papa y tabular

los resultados y discutir.

Cuadro 1.

Contenido de humedad de las cpsulas de alginato de calcio,

despus de la deshidratacin en el flujo de aire estril de la cmara de

transferencia de flujo laminar.

Deshidratacin
(Horas)

Peso Fresco
(Mg)

Peso Seco
(Mg)

Contenido De
Humedad (%)

0
1
1,5
2

Cuadro 2.

Efecto del aislamiento, encapsulamiento, deshidratacin y

congelamiento rpido en nitrgeno lquido de meristemas de papa.

Tratamiento:
deshidratacin

Sobrevivencia (%)
- NL

+
NL

0h
1h
1,5 h
2h
Crioconservacin De Meristemos De Papa Utilizando La Tcnica De
Vitrificacin

Cuando se utiliza el congelamiento rpido en nitrgeno lquido para la

crioconservacin, es esencial evitar el congelamiento intracelular letal. Esto
puede

lograrse

induciendo

una

deshidratacin

adecuada

en

los

especmenes, de manera que se evite la formacin de cristales de hielo y as

lograr que el contenido intracelular vitrifique durante el congelamiento
rpido.

La vitrificacin se considera el nico mecanismo que evita el

congelamiento intracelular y que permite que clulas, tejidos y rganos, an

hidratados, sobrevivan a la temperatura del nitrgeno lquido.

La vitrificacin es un proceso fsico que se define como la fase de

transicin de una solucin acuosa de la fase lquida a una fase de slido
amorfo vtrio o vidrioso.
La tcnica de vitrificacin comprende el pretratamiento de las
muestras con soluciones concentradas de crioprotectores, a las que se
conocen como sustancias vitrificadoras. Una sustancia vitrificadora es una
sustancia extremadamente viscosa, que presenta un potencial hdrico menor
que el correspondiente slido cristalino y por lo tanto, evita una mayor
deshidratacin. Las soluciones vitrificadoras se enfran fcil y rpidamente
hasta temperaturas menores de 100C y finalmente se solidifican en un
vidrio metaestable a la temperatura de transicin del vidrio (-110C).
Despus de la exposicin a las soluciones vitrificadoras, las muestras se
congelan directamente en el nitrgeno lquido para lograr la vitrificacin
intracelular.
Es importante tomar en cuenta que las soluciones crioprotectoras
utilizadas en la vitrificacin son txicas para las clulas, por lo tanto, se debe
ser cuidadoso y ajustar el tiempo de exposicin a estas sustancias de
acuerdo al tamao del explante.

Despus del descongelamiento, es

importante remover la solucin gradualmente.

Algunas de las soluciones vitrificadoras ms utilizadas han sido
desarrolladas por Sakai y en general consisten en mezclas de glicerol (30% al
35%), elilenglicol (15% a 30%), DMSO (0% a 15%) y sacarosa (0,4 M a 0,6
M).

La

tcnica

de

vitrificacin

ofrece

muchas

ventajas

para

la

crioconservacin. Permite obtener mayor sobrevivencia en el congelamiento

de rganos ms complejos (brotes, embriones somticos), simplifica el
procedimiento de crioconservacin, elimina la preocupacin por la formacin

intra y extracelular de cristales de hielo y presenta gran potencial para

aplicarla en diferentes tipos de clulas realizando pequeas modificaciones.

Objetivos: Familiarizar al estudiante con la tcnica de vitrificacin, la

preparacin de las soluciones vitrificadoras y los cuidados al aplicar este
procedimiento de crioconservacin.
Materiales
Solucin vitrificadora PVS2: 30% glicerol + 30% etilenglicol + 15% DMSO en
medio de cultivo bsico con 0,4 M sacarosa)
Medio de cultivo de papa slido en frascos Gerber pequeos
Medio de cultivo de papa lquido con 1,2 M sacarosa

Procedimiento
Iniciar la prctica aislando los meristemas de las vitroplantas de papa
(al menos 100 por grupo de trabajo) y colocarlos en el medio de cultivo
slido.
Tomar 10 meristemas y cultivarlos en el medio de cultivo slido bajo
condiciones de luminosidad normales. Este ser el control de aislamiento.
Luego, preparar una batera de 8 criotubos y marcarlos de la siguiente
manera en pares:
15 -NL

15 +NL

30 -NL

30 +NL

45 NL

45 + NL

Agregar a cada criotubo 0,5 ml de la solucin vitrificadora y colocar 10

meristemas en cada uno.

Despus de 15 minutos en la solucin

vitrificadora, tomar los 2 criotubos marcados (15 +NL) y sumergir

rpidamente en el nitrgeno lquido. Inmediatamente despus, eliminar el
contenido el contenido de cada criotubo marcado (15 NL) utilizando un
gotero. Realizar 2 lavados (de 2 minutos cada uno) de los meristemas con el
medio de cultivo lquido con 1,2 M sacarosa. Luego, volcar el contenido de
cada criotubo sobre los platos petri conteniendo el papael de filtro. Cultivar
los 10 meristemas de cada criotubo en el medio de cultivo slido en la
oscuridad por 1 da. Pasar a las condiciones de luminosidad normales.
Al pasar los 30 minutos de incubacin en la solucin vitrificadora, repetir el
procedimiento con el grupo de criotubos marcados (30 NL) y (30 +NL) y
(45 NL) y (45 +NL).
Para descongelar los criotubos, preparar baos de agua a 40C. Sumergir los
criotubos y esperar de 60 a 90 segundos. Repetir con estos especmenes las
operaciones de lavado y cultivo. Evaluar despus de 2 semanas.

Resultados
TRATAMIENTO
CONTROL
PVS2 15 -NL
PVS2 15 +NL
PVS2 30 -NL
PVS2 30 +NL
PVS2 45 -NL
PVS2 45 +NL

MERISTEMAS
TRATADOS

MERISTEMAS
SOBREVIVIENTES