UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE MEDICINA
ESCUELA DE MEDICINA LUIS RAZETTI
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLGICAS
CTEDRA DE FISIOLOGA

Sonja Klebe, Kim Griggs, Yuen Cheng, Jack Driml,

DouglasW. Henderson, and Glen Reid

Department of Anatomical Pathology, Flinders University,

Adelaide, Bedford, SA 5042, Australia
Volume 2015 (2015), Article ID 286719, 9 pages
http://ow.ly/D0z0300WmPn

Es un tumor agresivo de las membranas serosas

Perodo de latencia:
Mnimo: 10 aos
Mximo: 30 a 50 aos
Ocurre ms en hombres que en mujeres

-Es una protena transmembrana,

encargada de transportar el agua.

-6 hlices alfa con abertura en su

interior por la que pueden
pasar molculas de agua.

AQP1 Es la

ms abndate presente en endotelio, eritrocitos

RESULTADOS
Y
DISCUSIN

RESULTADOS

EL AUMENTO DE LA EXPRESIN DE
AQP1 ESTA ASOCIADO CON LA
PROLIFERACIN CELULAR
Las clulas primarias de MM fueron evaluadas
mediante el ensayo de MTS.
Ensayo MTS Prueba para medir la
proliferacin celular mediante el uso de
colormetro.

2 = 0,485 (coeficiente de determinacin)

P= 0,026
Mientras mas clulas expresen AQP1, habr
una mayor proliferacin de stas.

ALTERACIN DE LA FUNCIN Y LA PROLIFERACIN CELULAR

AQP1 MM IN VITRO

Disminucin dependiente de la dosis en la actividad proliferativa cuando se incubaron las clulas con AqB050
de 1 h y, a 80 M.
Disminucin estadsticamente significativa en la actividad proliferativa en comparacin con el control de vector
Clulas H226 : Expresin > 20 % AQP1
V = Control
AqB050 = bloqueador de AQP1

Bloqueador de AQP1 las clulas fueron

cultivadas en el medio control y en presencia del
bloqueador AqB050.
Varianza entre columnas = 0.021
(ANOVA)

* = Mayor varianza ( TUKEY POST-HOC)

= 0.016
Disminucin dependiente de la dosis de inhibidor

Cultivos de clulas de MM primario

BAJA : Expresa < 20% AQP1
ALTA : Expresa > 20% AQP1

ALTA
BAJA

A menor expresin de AQP1 no se evidencia disminucin

significativa de la proliferacin , independientemente de la dosis de
inhibidor

Clulas H226 y de MM primarias

transfectadas
Tratamiento siRNA Con siARN (small interfering RNA)
de AQP1 antes de medir la proliferacin celular.

mRNA de AQP1 se redujo rutinariamente a 6-17% de los niveles de

control de vehculo.

S = Ambas clulas

A= Clulas MM primarias
A travs del siARN se confirma el efecto de la
inhibicin de las AQP1

El tratamiento AQP1 siRNA redujo significativamente la

tasa de proliferacin celular tanto en las clulas H226 y
las clulas primarias

V: vector
S: Scrambled
G: GAPDH

No dieron lugar a disminucin de la

proliferacin celular

A: AQP1
La especificidad del tratamiento AQP1 siRNA se demostr por
disminucin de la expresin de mRNA AQP1 .

AQP1

AQP1 expresin de la protena evaluada por inmunohistoqumica

(etiquetado marrn) est conservada en la superficie celular de las
clulas primarias de MM tratados con siRNA codificado.

Expresin de la protena AQP1 se reduce en la superficie celular de las

mismas clulas de MM primero tratadas con AQP1 siRNA.

Se evidencia la disminucin de la expresin de la AQP1 despus

de ser tratadas con siRNA

EL BLOQUEO DE AQP1 DISMINUYE LA MOTILIDAD CELULAR Y EL

ANCLAJE- INDEPENDIENTE DEL CRECIMIENTO.

Wound Width (microns)

-Ensayo de cero utilizado para determinar si el bloqueo

de AQP1 inhibe la motilidad celular.
-Ensayo de anclaje independiente incubacin en
concentraciones crecientes de AQB050 observando
inhibicin en todos los grupos con respecto al vehculo.

La capacidad de las clulas MM al moverse

para cubrir la herida se redujo en todos los
grupos expuestos MM-AqB050 de una manera
dependiente de la dosis.

La posicin de 10 clulas individuales fue rastreado ms

de 12 h por la fotografa a intervalos

Medio de control del vehculo

Tratamiento de 80 M AqB050

In Vivo

El modelo de xenoinjerto Subcutneo de MM.

Usando un ratn lampio modelo de xenoinjerto subcutneo de MM se utiliz
para evaluar el potencial teraputico de AqB050 in vivo.
Modelo animal para la bsqueda de la dosis inicial
se utilizaron tres grupos de animales, aplicando una
inyeccin intratumoral diaria, tratados con: DMSO,
AqB050 a 20M y AqB050 a 80M.
Para el experimento de seguimiento se evaluaron
ratones tratados con: AqB050 a 20M, DMSO y
ratones de control no tratados.

Tumour size (mm3)

Tumour size (mm3)

Patrn hacia de disminucin temprana del tamao

del tumor se observ en el experimento de
bsqueda en la dosis inicial

Patrn de seguimiento ms largo utilizando la dosis con el

mayor potencial para mejorar la respuesta. Confirmo despus
de 15 das de tratamiento, no hubo un efecto significativo del
tratamiento sobre el crecimiento tumoral entre tratados, y los
controles del vehculo sin tratar

Ninguna diferencia en el tamao del tumor en modelos de xenoinjerto subcutneo de MM

CONCLUSIONES

AQP1 Y
MESOTELIOMA MALIGNO

Es independiente en MM.
La inhibicin de AQP1 puede considerarse como tratamiento
atractivo.
Se demostr que su aumento beneficia a las clulas de MM.

Bloqueo de AQP1 in vitro disminuye el movimiento celular.

Puede ser aprovechado en terapias.
AqB050 en concentraciones no txicas, genera disminucin de la
proliferacin celular.
In vitro vs. in vivo.

QU PUDO HABER OCURRIDO?

Se plantearon las siguientes posibilidades en cuanto a lo que pudo haber
sucedido en el experimento in vivo y su fracaso:
Modelo de xenotransplante subcutneo.
Posible interaccin del frmaco con las protenas sanguneas.
Frmaco local.
Dosis.
Frecuencia de terapia.
Vida in vivo del frmaco.

Fengxia Qin, Huikun Zhang, Ying Shao, Xiaoli Liu, Limin Yang, Yong
Huang, Li Fu, Feng Gu, and Yongjie Ma

Department of Breast Cancer Pathology and Research

Laboratory, Key Laboratory of Breast Cancer Prevention and
Therapy (Ministry of Education), National Clinical Research
Center for Cancer, Tianjin, China

AQP1 fue localizada predominantemente en el citoplasma de las clulas cancerosas de los pacientes con cncer de
mama invasivo

Estudio proporcion la primera evidencia de que la expresin citoplasmtica de AQP1

promueve la progresin del cncer de mama y que podra ser un biomarcador de pronstico
potencial para el cncer de mama.

Basado en el estudio de un gran cohorte de especmenes de cncer de mama

invasivos humanos, para investigar la expresin y funcin de AQP1.

Clulas de los conductos mamarios en lesiones benignas (33 casos)

Clulas de Carcinoma ductal in situ (CDIS) (45 casos)
Clulas de Carcinoma ductal invasivo (IDC). (341 casos)
Lneas celulares MDA-MB-231 y MCF7

RESULTADOS
La expresin AQP1 se evalu mediante anlisis de
inmunohistoqumica

15,2% (5/33) de las lesiones mamarias benignas

Membrana
28,9% (13/45) de carcinoma ductal in situ

41,9% (143/341) de Carcinoma ductal invasivo

Citoplasma

Se ha detectado localizacin celular distinto de AQP1 en diferentes tejidos de

la mama
Mostraron alta expresin citoplasmtica de AQP1, lo que indica que AQP1
citoplsmica est involucrada en la progresin del cncer de mama

La expresin citoplasmtica de AQP1 estuvo positivamente correlacionado con las

caractersticas patolgicas avanzadas de carcinoma ductal invasivo

Mayor expresin de AQP1 citoplasmtica aumenta con

respecto al avance y metstasis de cncer de mama

Con el grado histolgico de cncer de mama

Aument significativamente a medida que
aumenta el estado de pTNM
Mayor en los pacientes con metstasis en los
ganglios linfticos
Aumenta con la reaparicin o metstasis
distante

AQP1 = 0
AQP1= 1-2
AQP1= 3-9

No tincin
Moderada
Intensa

ANLISIS DE INMUNOHISTOQUMICA DE EXPRESIN AQP1

Mostr que haba una sobre regulacin de la expresin AQP1
como aument del grado histolgico.

SE CONFIRM POR ANLISIS DE WESTERN BLOT

La expresin de AQP1 en pacientes con metstasis en los ganglios

linfticos fue mayor que en pacientes sin metstasis.

La expresin citoplasmtica de AQP1 no esta

relacionado con ER y PR y se relaciona
positivamente con la progresin del cncer de
mama

I fase

Anlisis de inmunohistoquimica

Fase avanzada

La expresin citoplsmica de AQP1 en la

metstasis de los ganglios linfticos fue
mayor que en sus tumores primarios

Se estudiaron 50 tejidos de cncer de mama primario y

sus pares de metstasis en los ganglios linfticos.

La expresin citoplasmtica de AQP1 en linfonodulos con metstasis fue mayor que los tumores
primarios.

Mayor expresin de AQP1 en presencia de metstasis en los linfonodulos

La sobreexpresin de AQP1 promueve la proliferacin e invasin de clulas de

cncer de mama

El papel de AQP1 en el desarrollo de cncer de mam fue validado por los

experimentos in vitro
Ncleo

Lineas celulares
MCF7
MDA-MB-231

Expresin exgena
ER y PR +

Primarias de cncer de mama

Endgena
ER y PR -

La invasin se detect utilizando clulas MCF7 y MDA-MB-231 que sobreexpresan AQP1 que
promueve la proliferacin e invasin de clulas de cncer de mama.

Pharmacological blockade of aquaporin-1

water channel by AqB013 restricts
migration and invasiveness of colon cancer
cells and prevents endothelial tube
formation in vitro
Hilary S. Dorward, Alice Du, Maressa A. Bruhn, Joseph Wrin, Jinxin V. Pei, Andreas
Evdokiou, Timothy J. Price, Andrea J. Yool and Jennifer E. Hardingham.

M O L E C U L A R O N C O L O G Y, B A S I L H E T Z E L I N S T I T U T E , T H E Q U E E N
E L I Z A B E T H H O S P I TA L , W O O D V I L L E , S A , AU S T R A L I A .

D I S C I P L I N E O F P H Y S I O L O G Y, S C H O O L O F M E D I C I N E ,
U N I V E R S I T Y O F A D E L A I D E , A D E L A I D E , S A , AU S T R A L I A .

Los estudios demostraron la relacin de la actividad de la AQP1 y cmo con su bloqueo con AqB013
hubo una disminucin de la migracin e invasin de clulas cancergenas y la anulacin de la capacidad
de angiognesis de las clulas endoteliales

Lneas de clulas de cncer de colon: HT29 y HCT-116 (ATCC,

Manassas, USA).
Tumores de 57 pacientes que fueron operados de CCR.

RESULTADOS
Las clulas de endotelio de vena
umbilical humana presentaron mayor
expresin de AQP1, seguido por las
clulas tumorales, las HT29 y las HCT116.

Metodo de cuantificacin relativa Las

clulas tumorales de colon presentaron una
mayor expresin de AQP1 que las clulas de
la mucosa normal del mismo paciente.

ANALISIS WESTERN BLOT

Bandas de
aproximadamente 28kDa

Se confirmo que la expresin de AQP1

en clulas HCT-116 fue reducida en un
67% comparado con las clulas HT29 y
en un 71% comparado con HUVEC
(clulas endoteliales de vena umbilical).

INMUNOFLUORESCENCIA

Mediante la tincin con

inmunofluorescencia se evidencio
la expresin de AQP1, tanto en el
citoplasma como en la membrana
celular de las clulas HT29.

En las clulas epiteliales malignas de

las criptas, la expresin de AQP1 varia,
de baja, moderada y elevada
intensidad

+1

+2

+3

Las clulas endoteliales de los micro vasos

sanguneos poseen una capacidad de tincin alta, lo
cual refleja la gran expresin de AQP1 a nivel del
mRNA.

EL TRATAMIENTO CON AqB013 DISMINUYE LA

MIGRACION DE LAS CELULAS DEL CANCER DE COLON QUE
EXPRESAN CANTIDADES SIGNIFICATIVAS DE AQP1.

Clulas HCT-116

Clulas HT29

PRUEBA DEL RASGUO

Las clulas HT29 tratadas con AqB013 a
concentraciones de 160M o 360M
presentaron un mayor cierre de heridas
comparado con el vehculo (control) al cabo de
48 horas.

Las clulas HCT-116 (las cuales poseen un

bajo nivel de expresin de AQP1) no
mostraron cambios significativos en su
migracin a la administracin del AqB013.

Celulas HCT-116

Clulas HT29

EL TRATAMIENTO CON AqB013 REDUCE LA INVASION

DE LAS CELULAS DEL CANCER DE COLON
Las esferas de clulas HT29 tratadas con AqB013 a
concentraciones de 80M y 160M presentaron
diminucin de la invasin luego de 144 horas. Tambin
presento disminucin comparado con las clulas
control.

Las esferas de clulas HCT-116 tratadas con AqB013

no presentaron cambios en la invasin esferoide.

PROLIFERACIN
No hubo un efecto citotxico apreciable
ya que el AqB013 no tuvo efectos en la
proliferacin de las clulas HCT-116 a
una concentracin 320M.
Hubo una muy pequea disminucin de
la proliferacin de las clulas HT29
tratadas con una concentracin de
160M.

El tratamiento en clulas endoteliales

con AqB013 inhibe marcadamente la
angiognesis
A) Muestra sin el tratamiento.
B) Muestra con el vehculo.
C) Muestra con el tratamiento (40M).

D) Muestra con el tratamiento (80M).

E) Comparacin del nmero de uniones en las distintas
muestras.
F) Comparacin del porcentaje de proliferacion en las
distintas muestras.