Abstrak

Latar Belakang: Demam rematik pada anak-anak adalah penyebab paling umum
dari Mitral Stenosis di negara-negara berkembang.
Penyakit ini ditandai dengan katup mitral yang rusak dan cacat predisposisi
mereka untuk jaringan parut dan penyempitan
(Stenosis) yang menghasilkan hipertrofi atrium kiri diikuti oleh gagal jantung.
Saat ini, echocardiography adalah utama
teknik pencitraan yang digunakan untuk mendiagnosa Mitral Stenosis. Meskipun
prevalensi tinggi dan peningkatan morbiditas, tidak ada
indikator biokimia yang tersedia untuk prediksi, diagnosis dan penatalaksanaan
penyakit. mengadopsi
Pendekatan proteomik untuk mempelajari rematik mitral Stenosis karena itu
mungkin melemparkan beberapa cahaya dalam arah ini. dalam kami
studi, kami melakukan proteomik plasma dari subyek manusia menderita
rematik mitral Stenosis (n = 6) dan
Kontrol subyek (n = 6). Enam sampel plasma, masing-masing tiga dari kontrol
dan pasien kelompok dikumpulkan dan
mengalami pengayaan protein kelimpahan rendah. Dikumpulkan sampel plasma
(mentah dan menyamakan kedudukan) kemudian
dikenakan di-solusi tripsin pencernaan secara terpisah. Mencerna dianalisis
dengan menggunakan nano LC-MSE
. Data diakuisisi
dengan Protein Lynx global Server perangkat lunak v2.5.2 dan pencarian yang
dilakukan terhadap Homo sapiens Database Ulasan
(UniProtKB) untuk identifikasi protein. Label-bebas kuantifikasi protein dilakukan
dalam plasma mentah saja.
Hasil: Sebanyak 130 protein yang mencakup 9-192 kDa diidentifikasi. Dari 83
protein ini adalah umum untuk kedua
kelompok dan 34 yang diferensial diatur. penjelasan fungsional tumpang tindih
dan diferensial protein mengungkapkan
bahwa lebih dari 50% protein yang terlibat dalam peradangan dan respon
kekebalan tubuh. Hal ini dikuatkan oleh
Temuan dari analisis jalur dan studi histopatologi pada bagian jaringan yang
dipotong dari katup mitral stenosis.

Verifikasi calon protein dipilih oleh immunotechniques dalam plasma mentah

dikuatkan temuan kami dari
label bebas protein kuantifikasi.
Kesimpulan: Kami mengusulkan bahwa profil protein ini plasma darah, atau salah
satu protein individu, bisa berfungsi sebagai
titik fokus untuk studi mekanistik masa depan pada Mitral Stenosis. Selain itu,
beberapa protein yang terkait dengan ini
Gangguan mungkin biomarker calon diagnosis penyakit dan prognosis. Temuan
kami mungkin membantu untuk memperkaya
pengetahuan yang ada pada mekanisme molekuler yang terlibat dalam Mitral
Stenosis dan meningkatkan diagnostik saat ini
alat dalam jangka panjang.
Kata kunci: Demam rematik, mitral Stenosis, proteomik Plasma, Peradangan,
Immunotechniques

latar belakang

demam rematik akut yang merupakan gejala sisa dari Grup A

infeksi tenggorokan streptokokus di genetik rentan
individu, tetap alasan paling umum untuk
Rematik Penyakit Jantung (RHD). RHD adalah kronis diperoleh
gangguan jantung pada anak-anak dan dewasa muda di seluruh dunia
[1]. Ini adalah masalah kesehatan masyarakat yang utama di Low dan
Negara Pendapatan Tengah (LMICs) memiliki prevalensi global yang
minimal 15,6 juta kasus, dengan 282.000 kasus baru
dan mendaftarkan 233.000 kematian setiap tahun [2]. Di India, RHD
account untuk 30-40% penyakit kardiovaskular rumah sakit terkait
penerimaan [3].
RHD adalah penyakit autoimun pasca-infeksi. Hal ini ditandai
oleh peradangan kronis dari miokardium dan
jantung katup pada khususnya. katup mitral adalah yang paling umum
terpengaruh diikuti oleh keterlibatan katup aorta. trikuspid
dan katup paru biasanya kurang terpengaruh.
RHD di aparat katup mitral memanifestasikan paling umum
sebagai Mitral Stenosis atau mitral Regurgitasi atau kombinasi
kedua memproduksi beban hemodinamik pada jantung [4].
Mitral Stenosis mengacu penyempitan katup mitral
mengakibatkan obstruksi aliran darah dari kiri
atrium ke ventrikel kiri. Katup mitral rusak
dan cacat predisposisi untuk jaringan parut dan penyempitan
(Stenosis) di kemudian hari. Rematik mitral Stenosis dikaitkan
dengan penebalan daun katup mitral dan fusi
dari commissures dan korda tendinea bersama-sama
dengan fibrosis dan kalsifikasi. Hipertrofi kiri
atrium mengembangkan dan dapat diikuti oleh kanan sisi

gagal jantung dan edema paru. echocardiography adalah

teknik pencitraan utama yang digunakan untuk menilai pasien dengan
Mitral Stenosis. Gejala biasanya berkembang ketika
area katup mitral menurun di bawah 2,5 cm2 dan diklasifikasikan
"ringan" stenosis. Ketika area katup mitral menurun
di bawah 1,5 cm2 itu dianggap sebagai stenosis "moderat" dan
ketika daerah berkurang di bawah 1,0 cm2 itu disebut "parah"
stenosis [5].
Echocardiography memiliki peran yang didirikan tidak hanya di
diagnosis tetapi juga menentukan keparahan Mitral Stenosis dari
asal rematik. Selama 10 tahun terakhir, kemajuan dalam
kuantifikasi stenosis katup telah terjadi. Ini
teknik baru memungkinkan untuk diferensiasi ringan dari
moderat dan moderat dari penyakit yang berat. Namun itu adalah
mahal di negara-negara dengan beban penyakit tertinggi dan hanya
tersedia di fasilitas pelayanan kesehatan tersier terbatas. Di daerah tersebut,
skrining ekokardiografi mungkin dianggap logistik
profilaksis tidak layak atau sekunder kurang
dikembangkan untuk merekomendasikan skrining. Selain itu, menjadi
sangat operator / teknisi tergantung modalitas pencitraan,
ada kesempatan besar atas atau di bawah-diagnosis
Rematik mitral Stenosis dengan echocardiography saja.
perangkap teknis dari akuisisi gambar dan ekokardiografi
pengaturan mesin harus selalu ditujukan sebagai
kualitas gambar secara substansial dapat mempengaruhi interpretasi
gambar. Kurangnya jumlah yang memadai ahli di ekokardiografi
diagnosis rematik mitral Stenosis di endemik
negara-negara seperti India akan mencegah deteksi halus

fitur ekokardiografi juga. Jadi strategi terbaik mungkin

menjadi pendekatan gabungan ekokardiografi dan biomarker berdasarkan
untuk memprediksi, mendiagnosa dan mengelola rematik kronis
Mitral Stenosis.
Dalam beberapa tahun terakhir proteomik telah muncul sebagai teknologi baru
yang telah banyak diterapkan untuk kardiovaskular
penelitian penyakit dengan tujuan untuk memahami penyakit
mekanisme. Mengadopsi pendekatan proteomik untuk mempelajari
patogenesis rematik mitral Stenosis dapat membuang
terang tentang bagaimana penyakit ini berkembang, karena sampel
dari berbagai sumber dapat dianalisis, seperti jaringan, tubuh
cairan dan sel-sel yang beredar. Dalam penelitian ini kami menganalisis
proteome plasma, sumber klinis sangat berguna
untuk analisis proteomik dalam berbagai patologi. Plasma merupakan
sampel biologis yang ideal karena aksesibilitas [6]. Bahkan,
seperti darah bersirkulasi melalui setiap organ dan jaringan
tubuh, berisi informasi berharga yang berkaitan dengan
negara fisiologis dan patologis yang berbeda dari
organisme [7]. Sistem peredaran darah sehingga memberikan
repertoar unik protein ditumpahkan oleh sel-sel dan jaringan yang
potensial dapat digunakan untuk menilai baik normal dan penyakit
kondisi.
Namun, plasma adalah salah satu cairan tubuh yang paling kompleks
dengan dynamic range yang lebar dari konsentrasi protein (910 perintah). Ini merupakan tantangan analitis ekstrim
di karakterisasi proteome plasma sebagai sangat
protein berlimpah cenderung menutupi yang berlimpah rendah [8].
Kompleksitas ini melebihi kemampuan analitis yang paling

pendekatan proteomik. Untuk alasan ini, analisis plasma membutuhkan

pra-fraksinasi. Saturasi protein mengikat ke
kombinasi peptida ligan perpustakaan (CPLL) dalam kombinasi
dengan spektrometri massa baru-baru telah memperoleh pentingnya
dalam menganalisis proteome plasma sebagai alternatif
Pendekatan dengan metode yang lebih tradisional dan banyak digunakan
dari "immunodepletion" [14/09].
Sampai saat ini, tidak ada penelitian proteomik telah menyelidiki perbedaan
antara stenosis dan non plasma manusia stenosis
protein dalam konteks penyakit rematik Katup Mitral.
Dalam penelitian ini, dengan mengadopsi proteomik gratis label
Pendekatan oleh karena itu kita menganalisis profil protein dalam kontrol
dan plasma pasien. Hasil kami menyoroti bahwa rematik
Mitral Stenosis adalah proses inflamasi aktif
yang memanifestasikan kedua komponen inflamasi dan trombosis.
informasi baru tentang protein ini akan menguraikan
pengetahuan kita tentang fisiologi dan etiologi ini
penyakit.
hasil
desain penelitian
Gambar 1 menyajikan gambaran dari alur kerja proteomik
diadopsi dalam penelitian ini

karakteristik dasar
Karakteristik dasar dari kontrol dan subjek pasien
ditunjukkan pada Tabel 1. Tekanan darah diastolik, kiri atrium
(LA) diameter dan fraksi ejeksi ventrikel kiri yang
ditemukan secara signifikan berbeda dalam kelompok pasien

daripada kelompok kontrol. Bahkan, pembesaran atrium kiri sebagai

dipahami dari diameter LA adalah yang paling umum di
pasien dengan kronis rematik mitral Stenosis. pasien
dan subyek kontrol yang usia dan jenis kelamin yang serupa.
Seperti ditunjukkan pada Tabel 2, 66% dari pasien yang direkrut di
studi itu memiliki riwayat demam rematik pada anak
dan 34% memiliki fibrilasi atrium. 46% dari pasien
milik New York Heart Association (NYHA) kelas
Saya, 31% milik kelas II, 17% di kelas III dan
Sisanya 6% di kelas IV. Obat diberikan kepada pasien
dalam penelitian ini ditunjukkan (Tabel 3). Sekitar 2% dari pasien
mengambil diuretik, 71% digoxin, 31% aldactone,
sekitar 6% inhibitor ACE dan 20% memakai beta
blocker. Hampir 51% dari pasien berada di bawah antikoagulan
(Warfarin) terapi. Semua pasien termasuk dalam
Penelitian berada di bawah profilaksis penisilin ketat untuk mencegah
episode berulang akut Demam rematik.
temuan proteomik
Untuk menganalisis mentah dan plasma pra-fraksinasi, stenosis
dan sampel plasma non-stenosis dipilih untuk proteomik
analisis dengan nanoLC-MSE
. Hal ini menyebabkan identifikasi
dari 130 protein yang mencakup berbagai massa molekul
mencakup 9-192 kDa dan berbagai pl meliputi 4,4-9,8 (lihat
file tambahan 1 dan tambahan berkas 2). Semua protein ini
diidentifikasi dalam setidaknya dua dari tiga teknik replikasi
dengan dua atau lebih peptida cocok. Sebanyak 106
protein yang diidentifikasi dalam sampel dikumpulkan dari kontrol

kelompok dan 107 protein dalam sampel dikumpulkan dari pasien

kelompok masing-masing. Dari jumlah tersebut, 83 adalah umum untuk kedua
kontrol dan kelompok pasien (Gambar 2A). Namun 23 protein
yang unik untuk kelompok kontrol dan 24 protein untuk
kelompok pasien.
Di antara protein yang diidentifikasi dalam proteomik komparatif ini
studi, 34 protein yang ditemukan menjadi berbeda-beda
berlimpah. Immunoglobulin berat rantai seperti , dan
rantai ringan K dan secara signifikan menurunkan regulasi (i.
e .; kelimpahan spesies protein ini lebih tinggi pada
kontrol dari pasien) dalam kelompok Mitral Stenosis. Melengkapi
protein seperti C3, C4a, isoform 2 komplemen
C4a, C4b, melengkapi C4b mengikat protein
rantai, faktor pelengkap B, faktor pelengkap H yang
juga ditemukan secara signifikan menurunkan regulasi pada pasien
kelompok. protein lain seperti -1-acid glycoprotein I, -2macroglobulin, -2-HS-glikoprotein, ceruloplasmin, -1antitrypsin, -1-antichymotrypsin, haptoglobin, haptoglobin
protein terkait semua menurunkan regulasi. Di antara apolipoprotein,
Apo AI dan apo CIII secara signifikan menurunkan regulasi
(2.1 kali lipat dan 2,5 kali lipat masing-masing) pada pasien.
Juga, isoform 2 rantai fibrinogen , fibrinogen rantai sebagai
serta isoform A fibrinogen rantai secara signifikan
menurunkan regulasi 1,9 kali lipat, 2,5 kali lipat dan 2.7- lipat masing-masing
pada kelompok pasien (Tabel 4).
penjelasan fungsional protein diprofilkan
83 protein umum untuk kedua kelompok dan 34
protein ditemukan berbeda-beda diubah diklasifikasikan

oleh penjelasan fungsional. Dalam kedua kasus, mayoritas

protein dapat diklasifikasikan menjadi 4 yang berbeda fungsional
kategori langsung berhubungan dengan biologi penting
proses dalam sistem kardiovaskular: Peradangan
dan respon kekebalan; homeostasis darah dan koagulasi;
Metabolisme lipid; Transportasi dan Lainnya (Gambar 2B
dan 2C). Ini kategori fungsional terutama ditentukan
menggunakan database Swiss-Prot. Proporsi protein peradangan yang terkait
meningkat dari sekitar
55% pada kelompok yang tumpang tindih untuk sekitar 70% di differentially
yang
kelompok diatur.
koneksi jaringan protein untuk lebih lanjut
investigasi
Seperti yang terlihat pada Gambar 3, diferensial protein seperti komplemen
Faktor B, komplemen faktor H, C4b mengikat protein
rantai, orosomucoid saya atau glikoprotein -1-asam I,
-1-antitrypsin, -2-macroglobulin, haptoglobin, ceruloplasmin,
albumin, apolipoprotein AI dan CIII bersama-sama
dengan fibrinogen yang sangat jaringan.
set protein membentuk modul novel jaringan
termasuk berbagai varian immunoglobulin.
Ini jenis jaringan menunjukkan interaksi kolaboratif
antara beberapa kandidat protein; pada kasus ini,
protein umum dan / atau protein diferensial.
Kuantifikasi calon penanda dipilih dalam minyak mentah
sampel plasma dengan kolorimetri ELISA
Untuk menilai kinerja calon penanda potensial
diidentifikasi oleh nano analisis LC-MSE, kelimpahan mereka

dalam plasma mentah dari kontrol individu dan pasien

subyek ditentukan oleh immunoassay (ELISA atau
immunoturbidimetry). Beberapa kriteria yang digunakan untuk
pilih calon potensial untuk ELISA validasi. Itu
kandidat protein harus memenuhi berikut: (1) identifikasi
calon protein yang dipilih dalam rangkap tiga
berjalan di kedua mentah dan keterbagian dikumpulkan plasma pasien
dan subyek sehat; (2) perbedaan dalam tingkat harus
secara statistik signifikan yaitu, p <0,05 dan peraturan yang konsisten
di menganalisis semua ulangan tersebut; (3) potensi relevansi biologi
protein ini untuk katup jantung dan / atau kardiovaskular
penyakit berdasarkan informasi yang diperoleh dari penjelasan fungsional
protein diidentifikasi dan pencarian literatur panduan
publikasi dan terakhir; (4) ketersediaan komersial
tersedia ELISA kit atau antibodi primer. Sebagai setengah dari
pasien yang menggunakan terapi antikoagulan, banyak
penanda calon koagulasi atau beberapa protease yang
inhibitor diketahui terlibat dalam kaskade koagulasi,
tidak dapat divalidasi karena ini bisa menyebabkan salah
estimasi tingkat sirkulasi mereka di bawah kondisi penyakit.
-2- Plasma HS-glikoprotein konsentrasi secara signifikan
lebih rendah dalam mata pelajaran stenosis dari kontrol (818,3
66,8 vs 646,8 43,5 mg / ml, p = 0,03; berpasangan t-test;
Gambar 4A). tingkat plasma apolipoprotein AI juga secara signifikan
lebih rendah pada pasien dengan mitral Stenosis dari
subyek kontrol sehat (1390,8 33,1 vs.1166.2
78,2 mg / ml, p = 0,02; berpasangan t-test; Gambar 4B). Dari
peta jaringan protein umum dan diferensial

dalam Gambar 3, terlihat bahwa apolipoprotein AI adalah

diperkirakan untuk berinteraksi dengan protein seperti vitronektin dan
clusterin yang juga telah diidentifikasi dalam kontrol dan
plasma pasien dalam penelitian ini. Oleh karena itu, untuk memeriksa status
di kronis mitral Stenosis, tingkat sirkulasi
protein ini juga diukur dengan kuantitatif ELISA. tingkat clusterin plasma secara
signifikan lebih rendah
pada pasien dibandingkan subyek kontrol (317,4 31.1vs.178.2
17,5 mg / ml, p <0,0001; berpasangan t-test; Gambar 4C).
Terakhir, tingkat plasma dari vitronektin juga secara signifikan
lebih rendah pada pasien dengan mitral Stenosis dari kontrol
subyek (68,2 6,2 vs 47,9 4,5 mg / ml, p = 0,01;
Gambar 4D).
Identifikasi jalur terkait dengan rematik
mitral Stenosis
analisis jalur untuk umum dan berbeda-beda
protein berlimpah di rematik mitral Stenosis mengungkapkan
bahwa sekitar 18 dari mereka milik komplemen
dan koagulasi cascade (Gambar 5). Hal ini relevan dalam
konteks penelitian ini sejak kronis rematik mitral Stenosis merupakan
peradangan yang sedang berlangsung
negara.
analisis histopatologi
pemeriksaan mikroskopis dari hematoxylin - eosin (HE)
stained bagian katup mitral dari rematik mitral
subyek stenosis menunjukkan tingkat ditingkatkan fibrosis
dan neovaskularisasi (panah ditandai pada Gambar 6).
Focal perivaskular infiltrasi ringan limfosit dan
sel plasma yang melimpah yang menonjol, sehingga mengkonfirmasikan

etiologi peradangan di mata pelajaran, konsisten

dengan temuan dari analisis jalur serta dari
penjelasan fungsional protein diprofilkan. Sebaliknya,
katup mitral yang normal terdiri dari jaringan kolagen longgar tanpa pembuluh
darah dan sel-sel inflamasi
(Gambar 6).
Diskusi
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memberikan pemahaman yang lebih baik
mekanisme patofisiologi yang terlibat
di rematik mitral Stenosis. Untuk mencapai hal ini,
kami melakukan dua analisis yang berbeda - menggunakan plasma mentah
dan strategi yang berbeda untuk mengurangi kompleksitas
plasma proteome (pemerataan). Untuk pengetahuan kita, yang paling
dari protein yang diidentifikasi dalam studi ini sebelumnya belum pernah
dijelaskan dalam konteks rematik mitral
Stenosis.
Untuk meningkatkan terdeteksi proteoma rentang dinamis
kami menggunakan metode pre-fraksinasi alternatif, CPLL teknologi yang dirancang untuk sampel pemerataan dengan menggunakan
perpustakaan kombinatorial dari hexapeptides terikat dengan kromatografi
mendukung. pemerataan Plasma mengungkapkan protein
yang tidak terdeteksi dalam sampel plasma mentah seperti
serum amyloid A4, lipopolisakarida mengikat protein,
vitamin K protein bergantung S, paraoxonase 1 dan
di. Meskipun pemerataan plasma dikombinasikan dengan
kekuatan nano LC-MSE membantu untuk mengungkap kurang berlimpah
protein seperti ficolin 3 (21,6 mg / ml) [15], hormon seks
binding globulin (8,1 ng / ml) [16] dan angiotensinogen
(1,5 mg / ml) [17], kedalaman cakupan proteome rendah.

Namun, banyak dari protein yang berlimpah terutama

banyak imunoglobulin, -1-asam glikoprotein, 2-macroglobulin, haptoglobin dan serotransferrin yang
hilang dalam pendekatan ini.
Untuk lebih memahami makna dari kebanyakan
protein yang mungkin muncul dalam plasma dalam menanggapi
beragam peristiwa fisiologis di mitral Stenosis, kami membandingkan
pola protein kelimpahan dalam plasma mentah
antara pasien rematik mitral Stenosis dan normal
mengontrol menggunakan teknik proteomik label bebas. Kami mengidentifikasi
34 protein diferensial yang downregulated
dalam plasma pasien. Protein yang berbeda-beda
berlimpah antara kedua kelompok yang potensial serologis
biomarker untuk Mitral Stenosis. Selain itu, protein
yang berbeda-beda berlimpah pada pasien bisa
mencerminkan perubahan patofisiologis yang timbul dari normal
struktur katup mitral dan fungsi. protein ini
dapat digunakan untuk diagnosis dan penyakit pemantauan.
Untuk mendapatkan informasi tentang pentingnya biologis dari
diubah dan protein umum di penyakit, berbeda-beda yang
protein berlimpah dan tumpang tindih dikategorikan
sesuai dengan fungsi biologis mereka dilaporkan.
karakterisasi fungsional protein ini menarik
mengungkapkan bahwa lebih dari 50% yang terlibat dalam peradangan
dan respon imun. Hal ini dikuatkan oleh temuan
dari analisis jalur serta dari histopatologi
Studi pada bagian jaringan yang dipotong dari mitral stenosis
katup. Menariknya, bukti peradangan kronis

dengan infiltrasi seluler telah dilaporkan sebelumnya

oleh beberapa penulis di katup pulmonalis aorta [18,19].
Sebagian besar perbedaan yang ditemukan dalam protein terkait
dengan Peradangan dan respon kekebalan pada saat ini
belajar. Perubahan dalam protein sistem komplemen
khususnya downregulation dari C4a dan isoform nya,
C4b, melengkapi faktor H, melengkapi faktor B, C3
dan C4b mengikat protein rantai bersama dengan beberapa
bentuk imunoglobulin yang diamati dalam plasma
pasien mitral Stenosis dalam studi protein kuantifikasi gratis label. Sistem
komplemen adalah yang paling
komponen penting dari autoimunitas humoral di
Mekanisme pertahanan alami dalam diri manusia. sistem ini tidak
hanya penting bagi pertahanan tuan rumah terhadap penyakit menular,
juga memainkan peran penting dalam perlindungan, pengembangan,
dan perkembangan penyakit inflamasi termasuk banyak
gangguan rematik [20]. Kehadiran komplemen C1
protein dan C3 molekul jelas menunjukkan bahwa baik
'Klasik' dan 'alternatif' jalur operasional di
proses penyakit. Pelengkap C4, komponen penting
dari respon imun humoral, memainkan peran sentral dalam
aktivasi jalur klasik dan lektin dari
sistem komplemen. infeksi kronis dapat melakukan pembentukan
kompleks imun, menyebabkan aktivasi terus menerus
dan konsumsi komplemen [21]. Ini mungkin
alasan untuk kelimpahan rendah dari C3, C4a, C4b dan
C4b mengikat protein rantai diamati pada Mitral Stenosis
pasien. Bahkan, status C4b copy nomor operator rendah memiliki
dilaporkan pada pasien dengan infark miokard akut

dan stroke [22]. Identifikasi protein seperti serum amyloid komponen P, yang
telah terbukti
mengikat beberapa komponen pelengkap ficolin 3 (kolagen / fibrinogen
domain yang mengandung lektin 3p35) dan galectin 3
protein yang mengikat (basement autoantigen membran p105
atau lectin galaktosida mengikat larut 3 protein yang mengikat) di
pasien bersama-sama menunjuk pada fakta bahwa mungkin lektin yang
jalur komplemen juga berperan dalam patofisiologi
dari rematik mitral Stenosis. Semua data ini
menunjukkan bahwa ada respon bawaan yang kuat di Mitral
Stenosis. Oleh karena itu adalah proses inflamasi aktif yang
dapat menyebabkan keadaan prothrombotic.
Hal ini diketahui bahwa protease inhibitor dan protease bermain
peran penting dalam berbagai fungsi fisiologis seperti darah
homeostasis dan koagulasi, transportasi, matriks ekstraselular
omset dan remodeling jaringan serta memicu atau
modulasi proses peradangan dalam situasi patologis.
Beberapa protein (-1-antichymotrypsin, -1antitrypsin, antar tripsin inhibitor, protein AMBP) memiliki
sebelumnya telah terlibat dalam aterosklerosis, katup aorta
stenosis dan penyakit kardiovaskular lainnya [23-25]. analisis kami
mendeteksi kelompok protein pada pasien Mitral Stenosis.
Serin protease inhibitor (Serpins) mewakili
mekanisme pengaturan utama mengendalikan aktivitas enzim dari
faktor koagulasi diaktifkan. Di bawah sirkulasi darah normal
kondisi, protein ini hadir dalam konsentrasi yang cukup
untuk lebih down-mengatur berbagai pembekuan
faktor sehingga bertindak sebagai jaminan terhadap aktivasi acak
trombin atau protease lain dan fibrin yang dihasilkan

gumpalan. Serpins seperti antitrombin III (serpin C1) dan

heparin kofaktor II (serpin D1) telah terdeteksi dalam
penelitian ini. Kedua protein memiliki antikoagulan
sifat mereka erat mengikat dan menonaktifkan trombin.
Kami juga menunjukkan downregulation beredar antiprotease
seperti -1-antichymotrypsin (serpin A3) dan 1-antitrypsin (serpin A1) mungkin menunjuk ke pengembangan
dari keadaan yang lebih prothrombotic di Rematik
Mitral Stenosis. Efek pro-koagulan ini dapat membatasi infeksi
dengan menjebak patogen di pembekuan darah lokal. Sebuah mengacaukan
keseimbangan dalam homeostasis darah dan sistem koagulasi,
mengarah ke keadaan prothrombotic lokal aorta yang
katup, telah dilaporkan sebelumnya [26]. Kami menunjukkan
berkurang kelimpahan protein yang terlibat dalam
homeostasis darah dan koagulasi terutama fibrinogen.
Protrombin adalah protease serin yang disintesis
dalam hati dan berisi 10 residu Gla di aminoterminal nya
domain. Faktor Xa memotong protrombin menjadi yang
diaktifkan bentuk trombin. Trombin pada gilirannya bertindak sebagai
serin protease yang mengubah fibrinogen larut ke dalam larut
helai fibrin, serta katalis banyak lainnya
Reaksi terkait koagulasi. inhibitor koagulasi endogen
seperti vitamin K protein bergantung S, kofaktor dari
protein C juga terdeteksi dalam penelitian ini. Protein C adalah
Gla mengandung protease yang ketika diaktifkan dapat proteolitik
memotong Faktor Va dan VIIIA bersama-sama dengan kofaktor
protein S. Proteolisis bisa, karena itu, menjadi metode
mengatur proses biologis dengan memutar protein aktif
menjadi yang aktif.

Selain kelimpahan, modifikasi pasca-translasi

juga telah digambarkan peran dalam mengatur kegiatan
faktor pembekuan darah tertentu. Sintesis unik
residu glutamat dimodifikasi disebut carboxyglutamate
(Gla) hasil dari modifikasi pasca-translasi
baru disintesis faktor koagulasi tidak aktif seperti Prothrombin
dalam hati retikulum endoplasma oleh
vitamin K-dependent karboksilase [27]. Hal ini disebut sebagai
karboksilasi yang merupakan posttranslational ireversibel
modifikasi yang berperan dalam fungsi efektif
faktor pembekuan darah. Dalam gamma karboksilasi, a
gugus karboksil melekat rantai samping Glu tertentu
protein mengakibatkan konversi Glu untuk y -carboxyglutamate
(Gla). Fosforilasi protrombin
juga telah diamati. Oleh karena itu, data kami dalam penelitian ini menunjukkan
sebuah deregulasi penting atau gangguan fungsi
protease, anti-protease dan protein koagulasi di
pengembangan mitral Stenosis.
Dalam analisis kami, kami mendeteksi beberapa apolipoprotein
(Apo AI, Apo AII, Apo AIV, Apo CI, Apo CII, Apo CIII,
Apo D, apo E) dalam kontrol dan plasma pasien. Di
Selain itu, kami menemukan perubahan dalam kelimpahan apolipoprotein
AI dan CIII dalam fase "proteomik" dari
belajar. Apolipoprotein AI adalah salah satu protein yang dominan
di high density lipoprotein (HDL) tapi apolipoprotein lainnya diidentifikasi dalam
studi ini juga telah
digambarkan sebagai komponen HDL [28]. baru-baru ini
Studi proteomik telah melaporkan bahwa HDL membawa protein
keluarga terlibat dalam aktivasi komplemen, regulasi

dari proteolisis, dan respon fase akut [29]. ini

lanjut diketahui bahwa dalam kondisi inflamasi anti
protein inflamasi seperti paraoxonase 1 dan clusterin
mengungsi dari HDL oleh orang-orang proinflamasi
seperti serum amyloid A dan haptoglobin. Jadi antiinflamasi
HDL ternyata proinflamasi yang juga
disebut HDL disfungsional [30]. Semua ini menandakan bahwa
HDL dapat berfungsi sebagai penghubung antara metabolisme lipid, peradangan
dan gangguan katup mitral etiologi rematik.
Ini adalah aspek yang menarik dari penyakit ini yang
belum diteliti banyak sehingga jauh tapi akan mengejar
penyelidikan masa depan. Hal ini diyakini bahwa oksidasi rendah
density lipoprotein dalam darah menyebabkan penyakit jantung. Itu
Kehadiran glutathione peroxidase 3 dalam plasma Samakan
dari rematik mitral Stenosis meningkatkan kemungkinan dari
peran pelindung dalam patologi ini, karena memodulasi oksidatif
stres dengan meningkatkan resistensi sel untuk jenis seperti
cedera vaskular. protein struktural seperti fibulin 1 dan gelsolin
bersama-sama dengan isoform di rematik mitral Stenosis
menunjukkan fakta yang mungkin sel mengalami renovasi struktural
baik dari segi unsur cytoskeletal dan
matriks ekstraselular. Kelompok ini protein benar-benar tidak ada
pada kelompok kontrol. Namun yang lebih mendalam
Studi dijamin untuk membuktikan awal ini
pengamatan.
Kami fokus pada memilih umum dan diferensial protein
kandidat untuk mengembangkan model jaringan prediktif
untuk penyelidikan biologi lanjut menggunakan Search Tool untuk

Retrieval dari Berinteraksi Gen / Protein (STRING)

Database. Hal ini dilakukan dengan menggunakan data dari fungsi biologis
jaringan lokal seputar kandidat protein
[31-34]. Selain itu, untuk memverifikasi temuan dari
tahap uji coba kami telah diuji kelimpahan panel
empat protein calon serum (-2-HS-glikoprotein,
apolipoprotein AI, clusterin dan vitronektin) oleh immunoassay.
Hasil mengkonfirmasi bahwa tingkat plasma rata-rata
protein calon ini pada pasien Mitral Stenosis
secara signifikan diubah dibandingkan dengan kontrol.
fetuin Seorang manusia, juga dikenal sebagai -2-Heremans-Schmid
glikoprotein, adalah anggota dari superfamili cystatin dari
sistein protease inhibitor. Plasma -2-HS-glikoprotein
terutama diproduksi oleh hepatosit dan monosit / makrofag
dan terlibat dalam peradangan [35,36]. Serum
tingkat a-2-HS-glikoprotein berhubungan dengan katup
kalsifikasi pada pasien yang menderita penyakit ginjal stadium akhir
[37]. Hubungan terbalik antara serum -2-HSglycoprotein
tingkat dan prevalensi aorta Valve
Stenosis pada pasien non-diabetes, tapi tidak pada pasien diabetes tanpa
penyakit ginjal ditunjukkan [38]. Dalam
"Bebas label" teknik proteomik, sebuah downregulation signifikan
dari -2-HS-glikoprotein sekitar 1,4 kali lipat terlihat di
plasma pasien Mitral Stenosis. Studi verifikasi juga
mengungkapkan secara signifikan berkurang plasma -2-HS-glikoprotein
tingkat dalam mata pelajaran Mitral Stenosis dibandingkan dengan kontrol. Baru
saja
serum rendah -2-HS-glikoprotein tingkat telah
dilaporkan pada pasien Turki dengan rematik Mitral Valve

Penyakit [39]. Ini bisa jadi karena sintesis -2HS-glikoprotein tetap menurunkan regulasi selama cedera dan
peradangan. Ini juga menunjukkan bahwa -2-HS-glikoprotein
memainkan peran penting dalam kalsifikasi katup mitral karena
bertindak sebagai inhibitor endogen kalsifikasi ektopik.
Oleh karena itu downregulation dari -2-HS-glikoprotein dapat mengakibatkan
untuk mineralisasi yang tidak benar dengan mempercepat pengendapan garam
kalsium
di katup mitral stenosis.
Apolipoprotein AI, polipeptida tunggal utama
komponen HDL. Beberapa efek kardioprotektif
HDL telah dikaitkan dengan Apo AI. Dalam verifikasi kami
percobaan, tingkat apolipoprotein AI secara signifikan
lebih rendah dalam mata pelajaran rematik mitral Stenosis dibandingkan
untuk kontrol mungkin karena sintesis protein menurun,
dipercepat HDL katabolisme dan penggantian Apo AI
serum amyloid A [40] atau kegigihan dari
peradangan kronis. Apo AI juga terkenal karena nya
sifat anti-inflamasi [41,42]. Clusterin atau apolipoprotein
J adalah protein multifungsi disekresikan bahwa
bernama karena kemampuannya untuk menginduksi pengelompokan seluler.
Saya t
dapat berfungsi sebagai pendamping dari ekstraseluler gagal melipat
protein. Apo J telah disarankan untuk memiliki antiinflamasi
[43], cytoprotective [44,45] dan antiapoptotic
sifat [46]. bukti eksperimental menunjukkan
bahwa clusterin atau Apo J berinteraksi dengan Apo AI in vitro
yang bisa menjadi fisiologis penting [47]. Dalam
penelitian ini, tingkat clusterin plasma berbeda secara signifikan

antara kelompok kontrol dan pasien.

Vitronektin (VN), atau serum menyebarkan faktor dan milik
untuk kelompok Arg-Gly-Asp (RGD) jenis sel
glikoprotein adhesi dalam plasma, mengatur kekebalan tubuh
dan sistem hemostatik terutama di bloodendothelium yang
antarmuka [48]. Melalui mengikat yang berbeda
integrin, VN dapat langsung berinteraksi dengan sel-sel endotel
dan trombosit [49-51]. Dalam studi, vitronektin plasma kami
tingkat ditemukan secara signifikan lebih rendah di Mitral Stenosis
subjek dibandingkan dengan kontrol. Ini mungkin menyiratkan berkurang
perlindungan terhadap pelengkap sublytic dan serangan litik
baik sebagai clusterin dan vitronektin dikenal untuk mengatur
komplemen jalur dengan menghambat komplemen dimediasi
lisis sel [52]. Baru-baru ini, mengurangi plasma
konsentrasi vitronektin telah diamati di Rematik
subyek Penyakit katup dalam populasi Cina [53].
Selain itu, vitronektin berperan dalam jantung burung
pengembangan katup [54]. Secara keseluruhan, temuan dari
penelitian ini menunjukkan bahwa perubahan konsentrasi
di vitronektin mungkin terkait dengan patologis katup
perubahan dan juga dapat menunjukkan cacat genetik cenderung sedemikian
pasien.
Temuan ini didasarkan pada sejumlah
sampel pasien representatif. A lebih besar multi-centric populasi
akan lebih efektif untuk verifikasi
studi. Sekali lagi, penelitian ini disediakan deskripsi
perubahan Mitral Stenosis pada tingkat protein saja. pembaur
faktor penyakit seperti usia, meninggalkan diameter atrium,

area katup mitral dan tekanan sistolik arteri pulmonalis

dapat mempengaruhi perubahan protein di Mitral Stenosis.
Selain itu, protein plasma pada konsentrasi tinggi dan menengah
terutama dideteksi dengan menggunakan pendekatan ini. banyak lainnya
protein dalam kisaran ng / ml seperti sitokin, peptida kecil
dan faktor pertumbuhan yang tidak terdeteksi. Namun, diyakini
bahwa protein lebih berlimpah dapat memainkan penting
peran dalam perkembangan gangguan katup dan
dengan demikian, kelimpahan mereka dapat diubah di patologis
keadaan. Seperti yang diharapkan, kami menemukan perubahan dalam cukup
Beberapa protein plasma berlimpah. Terakhir, perubahan kali lipat analisis
untuk setiap protein dalam sampel plasma menyamakan kedudukan tidak bisa
dilakukan sebagai teknik CPLL biasanya menormalkan
kelimpahan dari kebanyakan protein. Namun demikian, ini adalah yang paling
studi komprehensif yang dilakukan sampai tanggal pada plasma
proteome di rematik mitral Stenosis.
Kesimpulan
Peristiwa molekul yang mengarah ke pengembangan penyakit
yang kompleks dan beragam dan tetap tidak lengkap ditandai
sejauh ini. Identifikasi, kuantifikasi dan
karakterisasi fungsional protein sangat penting untuk
memahami peristiwa molekuler. Sangat sedikit proteomik
studi tentang penyakit katup rematik telah dilakukan
out sampai tanggal dan tidak ada sama sekali pada katup mitral stenosis
kekacauan. Hasil kami menyoroti bahwa rematik mitral
Stenosis adalah proses inflamasi aktif yang memanifestasikan
kedua komponen inflamasi dan trombosis.
Meskipun temuan kami adalah murni eksplorasi, studi ini

memberikan contoh bagaimana seseorang dapat mencoba untuk

mengidentifikasi
seluruh populasi protein plasma yang menjadi ciri
keadaan penyakit. Dengan demikian, bebas label plasma analisis proteomik
di rematik mitral Stenosis untuk pertama kalinya
terbukti menjadi strategi yang berguna untuk mempelajari protein, beberapa
yang mungkin memainkan peran penting dalam patofisiologi
dari Mitral Stenosis. Oleh karena itu, profil protein ini dapat melayani
sebagai titik fokus untuk studi mekanistik masa depan. Selain
beberapa protein ditemukan secara berbeda berlimpah
dalam gangguan ini mungkin biomarker calon penyakit
diagnosis dan prognosis yang studi validasi di
pasien individu dalam populasi yang lebih besar di beberapa
pusat perlu dilakukan. Hasil ini mungkin membantu
untuk memberikan informasi tambahan tentang molekul
mekanisme Mitral Stenosis dan meningkatkan yang sudah ada
strategi diagnostik.
Mukherjee et al. Proteomika klinis 2014, 11:35 Page 13 of 18
http://www.clinicalproteomicsjournal.com/content/11/1/35
metode
persetujuan etika
Protokol penelitian sesuai dengan prinsip-prinsip yang
Deklarasi Helsinki dan telah disetujui oleh Institutional
Ulasan Dewan Indian Institute of Chemical
Biologi, Kolkata dan IPGME & R-SSKM, Kolkata, India.
Informed consent tertulis diperoleh dari semua mata pelajaran
sebelum dimasukkan dalam studi di atas.
desain studi dan populasi
Populasi penelitian terdiri dari 54 mata pelajaran yang termasuk

19 kontrol dan 35 kronis rematik mitral

pasien stenosis. Sedang sampai parah mitral Stenosis
subyek yang mengunjungi Jantung dan bedah vaskular
(CTVs) departemen Institut Pascasarjana
Pendidikan Kedokteran dan Penelitian-Seth Sukhlal Karnani
Memorial Hospital (IPGME & R-SSKM), Kolkata, India
direkrut ke dalam penelitian. individu yang sehat dengan
tidak ada penyakit jantung jelas atau sejarah arteri koroner
penyakit atau riwayat demam rematik atau obat apa pun
Penggunaan dipilih sebagai kontrol dan menjalani
protokol yang sama. Semua kontrol memiliki tekanan darah normal,
fungsi jantung dan profil lipid. Mereka juga memiliki yang normal
kadar glukosa darah puasa.
Inklusi kriteria / Pengecualian
Subyek setelah klinis didokumentasikan rheumatoid arthritis,
diabetes, hipertensi, penyakit sistemik yang berat, gagal ginjal,
gagal hati atau penyakit jantung organik kecuali rematik
Penyakit jantung dikeluarkan dari penelitian tersebut. bahkan rematik
pasien penyakit jantung yang mengalami didominasi
lesi stenosis atau regurgitasi katup aorta atau
memiliki regurgitasi dominan dari katup mitral yang
dikecualikan. Kriteria eksklusi lainnya termasuk keganasan,
inflamasi dan ikat gangguan jaringan lainnya.
echocardiography
Dua echocardiography transthoracic dimensi adalah
dilakukan pada semua mata pelajaran menggunakan tersedia secara komersial
sistem. diagnosis ekokardiografi dari rematik mitral
Stenosis dilakukan mengikuti pedoman yang ditetapkan di

kriteria 2012 World Federation Hati [55]. atrium kiri

dan meninggalkan diameter ventrikel baik di sistol dan diastol
dinilai. area katup mitral (MVA) ditentukan
baik oleh planimetry dan tekanan separuh waktu (PHT)
metode. Paru tekanan sistolik arteri (pasp) adalah
juga diukur. fraksi ejeksi ditentukan oleh Simpson
metode. Tak satu pun dari subyek yang dipilih untuk penelitian ini
memiliki gagal jantung yang dinilai oleh fraksi ejeksi 50%.
pemeriksaan klinis
Semua subjek diperiksa oleh dokter dan klinis mereka
data yang dimasukkan dalam pro terstruktur forma. gejala
pasien dikategorikan menurut NYHA
kelas fungsional. Tekanan darah sistolik (SBP) dan diastolik
tekanan darah (DBP) ditentukan. Denyut nadi
diamati dan ketidakteraturan setiap tercatat. electrocardiograms terbaru
(EKG) dievaluasi.
pengumpulan sampel dan pengolahan
Perifer darah vena (~ 7-8 ml) ditarik secara aseptik
dari pasien Mitral Stenosis (n = 35) dan subyek kontrol
(N = 19) selama penilaian klinis rutin (RCA).
Dalam "penemuan" atau "analisis proteomik" fase, 6 pasien
sampel dan 6 sampel kontrol yang digunakan untuk
analisis profil. Untuk pemahaman yang lebih baik, demografi,
keparahan penyakit serta pengobatan ini
6 pasien yang dipilih disajikan pada Tabel 2 dan 3 masing-masing
dan ditunjukkan dalam huruf miring. Yang tersisa
sampel plasma yang digunakan dalam percobaan verifikasi.
Beberapa kontrol dan pasien sampel yang digunakan dalam

fase profil juga dimasukkan dalam verifikasi

Studi (berkas tambahan 3). Sampel darah dikumpulkan
dari kontrol dan dari pasien sebelum mitral penggantian katup
operasi di steril (13 75 mm 3 ml) Vacutainers
(BD, Franklin Lakes, NJ, USA) mengandung semprot
dikeringkan K2 EDTA sebagai antikoagulan. Plasma diperoleh
oleh pengolahan dalam waktu 3 jam dari koleksi darah. Secara singkat,
tabung digulung ujung ke ujung untuk sekitar 10 kali
diikuti dengan sentrifugasi pada 2000-2500 g selama 15 menit
pada 4 C. Bagian atas 2/3 bagian atau supernatan dikumpulkan
sebagai plasma dan aliquoted di 400-500 ml atau kurang di
steril 1,5 ml tabung microcentrifuge. Sampel berlabel
dan segera disimpan dalam -80 C atau nitrogen cair
sampai analisis lebih lanjut. siklus beku-mencair diulang
dihindari. konsentrasi protein plasma mentah
sampel ditentukan dengan menggunakan alat tes Lowry [56].
Pengayaan kelimpahan rendah proteoma plasma pada
hexapeptide manik ligan perpustakaan
Untuk mengurangi kompleksitas sampel dan untuk meningkatkan sensitivitas
deteksi kami menggunakan teknologi CPLL. Ini
Metode ini sangat direproduksi, memungkinkan aliran-melalui
fraksi (menengah ke protein berlimpah rendah) untuk digabungkan
setelah beberapa langkah elusi untuk mendapatkan
jumlah protein yang diperlukan untuk proteomik throughput yang tinggi
analisis. sampel plasma dikumpulkan dari sehat
individu (n = 3) dan pasien stenosis (n = 3) yang
dikumpulkan dan pra-diperlakukan dengan pengayaan protein ProteoMiner
kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)

sesuai dengan instruksi produsen. The dielusi

fraksi dari pasien dan kontrol kolom berputar
dikumpulkan dan disimpan pada -20 C sebelum analisis.
Protein curah hujan, kuantifikasi dan di-solusi
tripsin pencernaan
Protein diperoleh dengan metode pengayaan diendapkan
dalam empat volume sampel es-dingin aseton (100%) semalam di -20 C.
Sampel kemudian disentrifugasi
di 14000 g selama 10 menit dan pelet dilarutkan
di 100 ml 20 mM NH4HCO3. konsentrasi protein
ditentukan oleh DC uji protein (Bio Rad, Hercules,
CA, USA) sesuai dengan instruksi pabrik.
Untuk di-solusi pencernaan, protein (100 mg) dari minyak mentah
dan plasma menyamakan kedudukan dilarutkan dengan 0,1% RapiGest
SF (Waters Corporation, Milford, MA, USA) di
50 mM NH4HCO3 untuk meningkatkan pembelahan proteolitik. protein
berkurang dan teralkilasi dengan 100 mM DTT di
37 C selama 45-60 menit dan 200 mM Iodoacetamide di
gelap pada suhu kamar selama 45-60 menit, masing-masing.
Protein yang dicerna semalam (~ 16-18 jam) dengan
sequencing kelas babi tripsin (Promega, Madison,
WI, USA) dalam 50: 1 rasio pada 37 C. reaksi itu
berhenti dengan menginkubasi dengan 2 ml dari 50% asam format di
37 C selama 20 menit. Digest itu vortexed dan disentrifugasi
untuk mengumpulkan supernatan yang mengandung peptida.
LC-MSE
LC-MSE
, Senapan massa bebas label spektrometri berdasarkan
Teknik proteomik diadopsi untuk kuantifikasi

protein secara diferensial berlimpah seperti yang dijelaskan sebelumnya [57].

kondisi UPLC
400 ng peptida dicerna setelah membangun kembali di 3%
asetonitril, 0,1% asam format disuntik ke online
nanoACQUITY UPLC digabungkan ke QTOF, SynaptHDMS
spektrometer massa (Waters Corporation, Milford,
MA, USA). Peptida dipisahkan dengan menggunakan
BEH 130-C18 terbalik kolom fase (1,7 m x 75 m x
250 mm) (Waters Corporation, Milford, MA, USA). Itu
sistem pelarut biner digunakan terdiri 99,9% air dan
0,1% asam format (fase gerak A) dan 99,9% asetonitril
dan 0,1% asam format (mobile fase B). peptida
awalnya preconcentrated dan dihilangkan garamnya online di
tingkat 5 ml / menit mengalir menggunakan perangkap 5 pm Symmetry C18
Kolom (internal yang diameter 180 mm, panjang 20 mm)
(Waters Corporation, Milford, MA, USA) dengan 0,1% B.
Setelah masing-masing injeksi, peptida dielusi ke NanoLockSpray
Sumber ion pada laju alir dari 300 nL / min menggunakan
gradien 2- 40% B selama 90 menit. Kemudian kolom
dicuci dan equilibrated.
kondisi spektrometri massa
Q-TOF MS / MS dilakukan pada resolusi sekitar
10000 lebar penuh setengah maksimum (FWHM) menggunakan ESI
antarmuka. Untuk kalibrasi instrumen, kalibrasi eksternal
standar atau massa kunci [(GLU1)] - fibrinopeptida
B, 50 fmol / ml) terus-menerus diresapi oleh NanoACQUITY
pompa tambahan pada laju alir konstan 500nL /
menit pada selang waktu 20 detik (frekuensi semprot kunci) dan

kesalahan massa kurang dari 2 ppm. Data massa kunci

rata-rata untuk koreksi. Spektrum peptida dielusi
diakuisisi oleh Synapt HDMS (Q-TOF) di V positif
modus dalam berbagai massa scan 50-2000 m / z dengan scan
waktu 0,7 detik. Peptida on-line dielusi dianalisis
pada kedua energi rendah tabrakan (4 eV) dan tabrakan tinggi
energi (15-40 eV). Mencerna tryptic dihasilkan
baik dari plasma mentah atau menyamakan kedudukan, dijalankan di
triplicates.
identifikasi protein
LC-MSE analisis data dilakukan dengan Protein yang
Lynx global Server 2.5.2 software (PLGS; Waters Corporation,
Milford, MA, USA). pencarian awal yang
dibuat untuk identifikasi protein terhadap Homo Ulasan
sapiens Database (UniProtKB) menggunakan mesin pencari
protein lynx terintegrasi server global [58]. prekursor dan
fragmen peptida toleransi massa terpilih "otomatis"
dalam alur kerja PLGS. PLGS mengidentifikasi protein
dengan kurang dari 10-15 ppm untuk prekursor dan produk
(50 ppm). Oksidasi metionin dan carbamidomethylation
sistein digeledah sebagai variabel dan tetap
modifikasi, enzim spesifisitas itu tripsin dan upto
dua perpecahan terjawab diizinkan. False positive
Tingkat disimpan di 4% dalam alur kerja PLGS. teoritis
massa molekul (MW) dan titik isoelektrik (pI)
ditentukan untuk masing-masing protein yang diidentifikasi menggunakan
ExPASy Bioinformatika Sumber Daya Portal (www.expasy.
org / compute_pi /). Hanya mereka protein dianggap

diidentifikasi mana protein yang sama diidentifikasi oleh PLGS

di semua tiga ulangan teknis atau di setidaknya dua dari
tiga kali. Protein menunjukkan tren peningkatan regulasi di
analisis proteomik ditampilkan dalam file tambahan 4.
Label kuantifikasi protein gratis
Label kuantifikasi protein bebas dilakukan dengan pendekatan MSE.
Sebagai kontrol deteksi internal 100 fmol dari digest
dehidrogenase alkohol ragi [Swiss-Prot: P00330]
itu dibubuhi protein dicerna untuk kuantifikasi. Tiga
sebagian peptida intens protein berduri dianggap
untuk kuantifikasi. Data diperoleh di tiga teknis
ulangan dan keluar dari orang-orang yang yang menunjukkan tertinggi
konsentrasi nanogram digunakan untuk normalisasi
kontrol dan pasien berjalan masing-masing. massa akurat dan
pertandingan waktu retensi prekursor dibandingkan
di semua LC-MS berjalan untuk kuantitasi berdasarkan intensitas label bebas.
rasio atau lipat perubahan untuk setiap protein diubah sebagai
juga rasio protein nilai p untuk kelimpahan diferensial
dihitung oleh PLGS.
penjelasan fungsional protein diprofilkan
fungsi utama dari tumpang tindih dan berbeda-beda berlimpah
protein ditentukan dengan menggunakan Swiss- Prot
database [59].

Verifikasi protein dipilih oleh kuantitatif ELISA

konsentrasi plasma tiga operator proteins- -2-HSglycoprotein
(R & D Systems, Minneapolis, MN, USA),

clusterin (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) dan

vitronektin (Takara Bio Inc. Shiga, Jepang), ditentukan
di masing-masing pasien dan kontrol plasma dengan immunoassay enzim
(EIA) menggunakan sistem uji komersial berikut
produsen protokol. pengukuran duplikat yang
diambil dan rata-rata. Plasma -2-HS- glikoprotein adalah
dinilai dalam 10 kontrol dan 18 mata pelajaran pasien sementara clusterin
diukur dalam 10 kontrol dan 15 mata pelajaran yang sakit.
vitronektin Plasma diukur dalam 10 kontrol dan 14
pasien. konsentrasi plasma apolipoprotein AI yang
kuantitatif dinilai dalam 12 kontrol dan 13 plasma pasien
sampel menggunakan uji immunoturbidimetric (Randox Laboratories).
Tidak ada reaksi silang terdeteksi atau gangguan
diamati untuk salah satu dari empat protein diuji. Itu
sensitivitas deteksi minimum berkisar 0,16-1,74 ng /
ml untuk -2-HS- glikoprotein dan 0,06-1,05 ng / ml untuk clusterin
sedangkan untuk vitronektin itu 5 ng / ml. Inter dan
variasi intra-assay berkisar antara 2,2-9,6% dan
4,9-6,3% untuk vitronektin, 6,8-8,4% dan 3,4-3,7% untuk
clusterin dan 7,3-8,4% dan 3,9-4,9% untuk -2-HS-glikoprotein
masing-masing.
Identifikasi jalur terkait dengan rematik
stenosis mitral
Dalam rangka untuk lebih memahami relevansi
protein yang diidentifikasi dalam konteks penyakit, analisis jalur
dilakukan dengan menggunakan Database untuk Anotasi,
Visualisasi dan Integrated Discovery (DAVID) bioinformatika
sumber (david.abcc.ncifcrf.gov/tools.jsp).

Untuk ini, nomor aksesi manusia UniProt yang

upload sebagai "Gene Daftar" dengan Identifier terpilih sebagai
"UNIPROT_ACCESSION". Akhirnya, alat DAVID
[60] digunakan sebagai interface ke kegg [61] jalur
repositori di Universitas Kyoto untuk menghasilkan jalur
diagram yang menggambarkan beberapa hubungan yang mungkin
protein umum dan diubah dengan patofisiologi
dari rematik mitral Stenosis.
analisis histopatologi
leaflet anterior sampel jaringan katup mitral, dari
subyek menjalani penggantian katup dan dari pos
mortem subjek kontrol tanpa sejarah diketahui
penyakit jantung, dikumpulkan dan tetap di 10%
formalin. Sampel jaringan kemudian ditanam dalam parafin
dan 5 m bagian tebal disiapkan. bagian
kemudian diwarnai dengan HE noda (Sigma Chemical Co,
St Louis, MO, USA) seperti yang dijelaskan sebelumnya [62]. bagian
diperiksa di bawah Olympus BX51 (Olympus Corporation,
Tokyo, Jepang) mikroskop dan gambar yang
yang diambil dengan kamera digital yang melekat padanya.
Analisis jaringan interaksi protein
jaringan interaksi protein untuk berbeda-beda berlimpah
serta protein umum yang dihitung dengan
STRING versi 9.1 (string-db.org/). node STRING adalah
protein dan ujung-ujungnya asosiasi fungsional yang diprediksi
berdasarkan database primer seperti kegg dan GO,
dan literatur primer. STRING memprediksi interaksi ini
berdasarkan lingkungan, produk gen fusi,

homologi dan kesamaan tentang ekspresi pola. Jaringan

skor interaksi untuk setiap node dinyatakan sebagai
probabilitas gabungan yang berasal dari database curated eksperimental
informasi, pertambangan teks dan komputasi diprediksi
oleh kedekatan genetik [63]. Dalam studi ini, STRING
jaringan dihitung dengan pengaturan default berikut
- Media skor keyakinan: 0.400, kedalaman jaringan: 0
dan sampai 50 interaksi.
Analisis statistik
Data dinyatakan sebagai mean standard error dari mean
(SEM). variabel kategori dianalisis dengan Chi square
(
2
) Atau tes eksak Fisher. Perbedaan antara kontrol
dan kelompok pasien yang diuji dengan uji t Student untuk
Data berpasangan sekali normalitas ditunjukkan oleh
uji Shapiro Wilk. diagram Venn dilakukan dengan Microsoft
excel 2010. Nilai probabilitas <0,05 dianggap statistik
penting.