TECNICAS DIAGNOSTICAS

Carolina San Martn Rodriguez (M.V)

AQUAGESTION-FUNDACION CHILE

SRS: Sindrome Rickettsial Salmonideo

Sindrome del Salmn Coho , Huito Disease.
Antecedentes 1988
Se ha observado en Salmon Coho (+ sucept.),
Atlntico, Trucha y Chinook.
Provoca altas mortalidades, no siempre responde a
tratamientos antibiticos y vacuna eficaz en desarrollo

Agente: Piscirickettsia salmonis

Patgeno Intracelular Obligado
Gram Negativo
No mvil
Pleomrfico
Predominantemente cocoide y forma de anillo
con tamao variable entre 0.5 a 2 m
Puede encontrarse individuales, en pares o
grupal
-proteobacteria

Signologa caracterstica
Hemorragias en piel, aletas y ano;
Internamente alteracin de
rganos, hemorragias; lesiones
necrticas en hgado

CEPAS MAS CONOCIDAS

Denominacion
LF-89
EM-90*
ATL-4-91
NOR-92
SLGO-94

Especie
Salmon Coho
S. Atlntico
S. Atlntico
S. Atlntico
Trucha arcoiris

Ao
1989
1990
1991
1992
1994

Procedencia
Chile
Chile
Canada
Noruega
Chile

* Similar a LF-89 en 98.5 -98.9%, A diferencia de

los otros aislados que son similares en 99.4%

Aislados de Rickettsias de Chile, Noruega, Irlanda, Canad
son similares, lo que permite su identificacin mediante
pruebas serolgicas

CUAL ES NUESTRO DESAFIO COMO SERVICIO DIAGNOSTICO ???

Diagnsticos rpidos

Tcnicas sensibles

Tcnicas especificas

Costos razonables

TECNICAS DISPONIBLES
TINCIONES
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
ELISA
PCR
INMUNOHISTOQUIMICA
HIBRIDACION IN SITU
MACROARREGLOS
Aislamiento en lnea celular

TINCIONES
GRAM
NARANJA DE ACRIDINA
GIEMSA

VENTAJAS:

DESVENTAJAS:

RAPIDEZ

DIAGNOSTICO PRESUNTIVO

COSTO

NECESITA DE CONFIRMACION SEROLOGICA

TERRENO

TINCION GRAM

GIEMSA

NARANJA DE ACRIDINA

INMUNOFLUORESCENCIA

Esta tcnica utiliza anticuerpos que son especficos para

Piscirickettsia salmonis,
Al agregar este reactivo a preparaciones de tejidos que contienen el
patgeno, los anticuerpos reaccionan con diferentes antgenos
especficos del patgeno.
Despus de una etapa de lavado para remover el anticuerpo libre, la
presencia del patgeno se detecta con un segundo anticuerpo anti
IgG conjugado con isotiocianato de fluorescencia (FITC), las muestras
se observan en un microscopio de Fluorescencia

Inmunofluorescencia

Ventajas
Rpida
Sensible
Costo razonable
Tejidos (rin, hgado, cerebro)
Desventajas
Depende experiencia analista
(fluorescencia inespecfica)

INMUNOFLUORESCENCIA

Inmunofluorescencia Directa (+ rpida)

Inmunofluorescencia Indirecta (+ sensible)

La lectura de ambas modalidades de IF se hace con un microscopio

de fluorescencia cuya luz excita al isotiocianato de fluorescena
haciendo que emita luz fluorescente de color verde.

Inmunofluorescencia

CONCLUSIONES

Inmunofluorescencia a partir de frotis es una

alternativa de bajo costo
Existen diversas alternativas en el mercado
Es una tcnica especifica y sensible
Existen formas de atenuar los problemas de
background y fading

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)

ELISA SRS es un ensayo inmunoenzimtico en fase slida para
la deteccin de Piscirickettsia salmonis en muestras de tejidos,
basado en la utilizacin de anticuerpos monoclonales

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)

Cuantificar niveles de antgeno
de P. salmonis presentes en
tejido
muestra: tejido (rin)
Semen, fluido celmico,
sobrenadante C.celular
Tcnica especifica
Costo mas elevado (doble
pocillo por muestra)
Menos utilizada

PCR
REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA
Utiliza una enzima denominada ADN polimerasa que copia
cadenas de ADN en un proceso que simula la forma en la que
el ADN se replica de modo natural en la clula.
Este proceso, que ha revolucionado todos los campos de la
biologa, permite a los cientficos obtener gran nmero de
copias a partir de un segmento determinado de ADN

Tcnica Rpida
Sensible
Especifica

PCR SRS
1

500 pb
400 pb

476 pb

Carril 1: DNA ladder 100pb; Carril 2: control positivo; Carril 3: control

negativo; Carril 4: Muestra Positiva SRS; Carril 5: amplificacin de
DNA de Renibacterium salmoninarum; Carril 6: amplificacin de RNA
de IPNV; Carril 7: amplificacin de DNA de Vibrio anguillarum

Inmunohistoqumica

Se basa en la capacidad que tienen ciertos fijadores de conservar

la estructura de pequeos trozos de tejidos de forma similar a la
estructura in vivo y la reactividad de determinados antgenos de
reaccionar con un anticuerpo.
Sobre finos cortes de estos trozos de tejidos es posible crear una
reaccin antgeno anticuerpo las que es revelada mediante un
cromgeno y visualizada por medio de microscopia ptica.
Recuperacin antignica mediante calor
Bloqueo de antgenos inespecficos (por ejemplo caseina)

Rin 40 X IHQ SRS

Hgado 40 X IHQ SRS

HIBRIDACION IN SITU
A partir de cortes histolgicos (ventaja hallazgos
anatomopatolgicos)
Se utiliza una sonda biotinilada (partidores
especficos para el patgeno)
Reaccin biotina estreptovidina + cromgeno
Patgeno con cromgeno

HIBRIDACION IN SITU

AISLAMIENTO DEL PATOGENO

Patgeno Intracelular Obligado

La nica manera de replicarlo es mediante su

incubacin en clulas vivas
Lneas celulares: CHSE-214, EPC, RTG-2, Sf21 lnea celular de
insecto (Spodoptera frugiperda)
T incubacin entre 12-21C (ptimo 15 a 18C)
Efecto citoptico entre 5 a 6 das hasta 15 das dependiendo titulo
Sensible a la congelacin, sin embargo al 10% Dimethyl sulfoxide

 Es necesario trabajar con medio sin antibiticos

(fcil contaminacin)
Utilizacin de IPNV Neutralizante
Efecto citotxico
Tasa aislamiento exitoso es baja
Efecto citoptico debe ser comprobado mediante
pruebas serolgicas o biologa molecular
Proceso lento (Incubacion dura 28 dias) baja
probabilidad de remuestreo bajo mismas condiciones.

CIM
CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA
El Test de Concentracin Inhibitoria Mnima se realiza utilizando el
mtodo de la dilucin en placa. Es decir, se inocula la cepa de P.
salmonis a ensayar, en microplacas que presentan una monocapa
celular confluente y en cuyo sobrenadante se encuentran diluidas las
diferentes concentraciones de la o las drogas a testear

ANTIBIOTICO

CIM ug/ml

Florfenicol
Flumequina
Acido Oxolnico
Oxitetraciclina

0.5
5.3
1.9
2.5

Ac. Oxolinico

Flumequina

52 %

18 %
5%

Florfenicol

25 %

Oxitetraciclina

AQUAGESTION dispone de:

Diagnsticos rpidos

Tcnicas sensibles

Tcnicas especificas

Personal Capacitado

Costos razonables

carolina.sanmartin@aquagestion.cl

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