Resultados y discusiones

Para visualizar etapas clave en el desarrollo de clulas

germinales de ESCs in vitro, se us la lnea celular de ratn ESC
transgnico
Se obtuvo un perfil de expresin de genes por RT-PCR para
comprobar , y este perfil de expresin era muy parecido al que
se obtiene al evaluar PGCs in vivo, por lo que se confirma que la
especificidad de las PGCLCs.
Se analiz un perfil epogentico a travs de Western Blot, en el
cual se demostr que la dinmica de modificacin de histonas
que se observa durante la formacin in vivo de las PGCs es
similar al in vitro.

Microambiente
Solo en los cultivos suplementados con los tres morfogenes
(activin A, BMPs y RA), las Stra8-EGFP-clulas de expresin se
mostraron a los 3 das de exposicin de los co-cultivos. Esto
sugiere el inicio de meiosis de SGPD PGCLCs in vitro.
336 de 400 mostraron seales positivas de Stra8-EGFP. Las
colonias resultaron positivas para marcadores de clulas
germinales (DDX4), clulas somticas de testculos (GATA4) y
clulas Sertoli (SOX9). Estos resultados demostraron que las
SGPD PGCLCs se integraron a colonias formadas por diferentes
tipos de clulas testiculares.
Por los resultados obtenidos anteriormente, se demuestra que
los co-cultivos simulan un microambiente que da lugar al inicio
de la meiosis en clulas germinales.
Formacin de clulas haploides.
en la presencia de los factores hormonales (testosterona, FSH y
BPE), se observ en el da 14 la upregulation de marcadores de
clulas haploides.
En la presencia de los factores hormonales, el 14% de las clulas
mostraron tener 1C de contenido de DNA, indicando la
formacin de clulas haploides masculinas SLC.
Se demostr de se requiere de las hormonas para la progresin
de la meiosis.
En los cultivos con las tres hormonas presentes, se detectaron
las primeras clulas haploides desde el da 10 y, se increment
el nmero en los prximos cuatro das de un 14% a un 20%. Las
clulas presentaron un cariotipo normal en la metafase de la
meiosis.
Sinapsis de cromosomas y recombinacin

Se analiza la sinapsis y recombinacin para evaluar la progresin

de la meiosis durante el cultivo.
La distribucin de histonas fosforiladas es similar a la de in vivo.
Analisis cuantitativos demostraron que al octavo da de
diferenciacin in vitro, mas del 90% de espermatocitos primarios,
estaban en la etapa del leptoteno o zigoteno de la mesiosis.
En el 10 da, el 64% estaba en la etapa Paquiteno, indicando la
correcta reparacin del ADN DSBs y la complecin de la sinapsis.
Mas del 50% de los espermatocitos haban entrado al diploteno
al da 12.
Estos resultados demuestran que la meiosis in vitro lleva a cabo
la sinapsis y recombinacin, y estaba sincronizada en la mayora
de las clulas germinales.
De igual forma, se encontr que la upregulation de los
transcriptos de los factores de meiosis ocurria de manera
programada, como sucede normalmente en un ciclo de divisin
meiotica in vivo.
Marcadores para clulas haploides fueron positivos, indicando la
formacin de las mismas.

Descendencia frtil
Secuenciacin por bisulfito revel clulas germinales masculinas
especficas con diferenciacin por metilacin los loci de genes
H19 y Snrpn, similar al que se encuentra en espemtidas in vivo.
HealthyFertileOffspringProducedbyICSIwithInVitroDerivedSLCsSortedSLCs

containedacapshapedacrosome(Figure5A).Tovalidategenomeintegrity,we
performed0.13wholegenomesequencingofsinglesortedSLCs.Ofeightsmalland
roundcellsselectedforsequencing(Figure5B),sixwerehaploidcellswithnormal
genomestructure,onecellwashaploidwithchromosomaldeletions,andonewas
diploid(FigureS4).ThepresenceofdiploidcellswasnotunexpectedbecausethePrm1
DsRedpositivepopulationcontaineddiploidcells(Figure4A),andwechosenotto
selectcellsforDNAcontenttoavoidinterferencewithsequencing.Bisulfitesequencing
revealedmalegermcellspecificdifferentialmethylationattheimprintedH19andSnrpn
locicomparablewiththatofinvivoroundspermatids(Figure5C).
GlobaltranscriptionprofileclusteringanalysesrevealedthesimilarityofinvitroSLCsto
invivospermatids(Figure5D).Theseanalysesalsoconfirmedthatglobaltranscription
profilesofSSEA1/integrinb3doublepositivePGCLCsonday6clusteredcloselywith
thoseofSSEA1/integrinb3doublepositivePGCsfromE12.5malefetusesbutdiffered
fromESCsanddifferentiatedgermcells
FromembryotransfersofSGPDderivedtwocellstageembryos,weobtainedsixfull
termpupsthatweretransgenicforPrm1DsRed(Figures5Eand5F).Analysisofone
puprevealedanormalkaryotype(Figure5G).Bisulfitesequencingindicatedapattern
associatedwithmaternalandpaternalgeneticcontributions(Figure5H).Themouse
developednormallytoadulthood.
Genomewidereducedrepresentationbisulfitesequencing(RRBS)oftailtipfibroblastof

amaleandafemaleoffspringderivedfromBVSCESCswasperformedtoanalyzethe
wholegenomemethylationstatusoftheoffspringwithnormalmaleandfemalemiceas
controls.BVSCESCderivedoffspringhadanormalmethylationlevel.Allofthesemice
developedtoadulthoodandhadoffspring.
ThesedatademonstratethegenerationoffunctionalspermatidsinvitrofrombothSGPD
andBVSCESClines.
Enresumen,wedescribethesuccessfulgenerationofESCderivedspermatidsinvitro
thatfullyconformtothegoldstandardsproposedforinvitroderivedgermcells.

Discusiones/REsumen
Specifically,wedemonstratethatmouseESCderivedPGCLCsenteredmeiosisinvitro,under
goingkeyprocessesofinvivomeiosis,includingchromosomalsynapsisandrecombination,and
finallydifferentiatedintohaploidSLCs.TheseSLCssuccessfullyfertilizedoocytesbyICSI,and
theresultingembryosunderwentembryonicdevelopment,resultinginfertileoffspringthatgave
birthtothenextgeneration.Thisunequivocallydemonstratestherecapitulationofmeiosisina
cultureenvironmentandprovesthefunctionalityofspermatidsgeneratedfrompluripotentstem
cellsinvitro.
WefoundthatsimultaneousexposureofPGCLCstoactivinA,BMPs,andRAresultedinrapid
silencingofBlimp1andStellaandsubsequentupregulationofStra8expression,resultingin
initiationofmeiosisandchangesingeneexpressionthatresemblethoseofinvivodiffer
entiatinggermcells.
ConsistentwithpreviousobservationsdemonstratingthatBMPsandactivinAarerequiredfor
theselfrenewal(Huetal.,2004;Puglisietal.,2004)andproliferationofneonatalgermcells
(Mithraprabhuetal.,2010),ourresultsalsosuggestthatBMPsandactivinAareessentialforthe
proliferationofmeiosiscompetentPGCLCsinculture,whereasRAisrequiredtoinduce
regulatorynetworksthatleadtomeioticentryanddifferentiation.
Wepresumethattheinvitroculturesystemlacksfeaturesofthetesticularmicroenvironmentat
thebasementmembranerequiredforSSCmaintenance,includinglackofgrowthfactors
requiredforSSCselfrenewalporquelasESCderivadasdePGCLCnopuedierondiferenciarse
enSSCscapacesdeautorenovarse.
WefoundthatdifferentiationofPGCLCsintomalepostmeioticgermcellsinvitrorequired
simultaneousexposuretothesexhormonestestosterone,FSH,andBPE.
FSHayudaalaproliferaciondeclulasSertoliyestimulaladivisionmitoticadela
espermatogeniamanteniendouncontroldelnumerodecelulas.BPEesnecesarioporque
promuevelaprogressiondelameiosisydiferenciacinespermtida.
Theanalysisandscreeningofpituitarytissuesforfactorsaffectinginvitrogermcell
differentiationmayfurtherimproveprotocolsforinvitromeiosis.