Optimizacin estadstica de los medios para el crecimiento

del micelio y la produccin de exo-polisacrido

mediante Lentinus edodes y un estudio modelo cintico de
dos morfologas de crecimiento

Yi Li Feng- un ,
Wei-Qi Li una ,, ,
Xue Qian Wu- b ,
Jun-Wen Cheng b ,
Su-Yun Ma una
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http://biblio.ucaldas.edu.co:2102/10.1016/j.bej.2009.12.002
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Abstracto
Lentinus edodes (hongo shiitake) es un hongo medicinal y comestible muy
conocido en todo el mundo. Optimizacin estadstica se emplea para optimizar el
medio de cultivo para el crecimiento mximo del micelio y exo-polisacridos de
produccin (EPS) en fermentacin sumergida: se aplic el diseo Plackett-Burman
(PBD) para determinar los factores significativos, seguido por los caminos de
ascenso ms rpido para pasar a la vecindad general del diseo ptimo y BoxBehnken (BBD) para obtener la composicin de medio de cultivo ptima final. La
glucosa, la levadura en polvo y el pH fueron significativas para la
fermentacin. 15.4 g de glucosa y 5,32 g de levadura en polvo por litro y pH 4,61
eran ptimo para la acumulacin de biomasa a partir de 2,75 g / l a 6,88 g / l,
mientras que 15,78 g de glucosa y 5,86 g de levadura en polvo por litro y pH 4,48
eran ptima para EPS produccin de 0,214 g / l a 0.751 g / l. Bajo la condicin de
cultivo optimizado, los modelos cinticos de cultivo se estudiaron en el matraz (la
forma de crecimiento de pellets) y el transporte areo (forma de crecimiento
filamentoso) reactores. Los dos morfologas resultaron en diferentes procesos de
cultivo y modelos matemticos.

Palabras clave

Lentinus edodes ;
Optimizacin estadstica ;
biomasa ;
Exo-polisacridos ;
morfologa;
cintica de crecimiento

1. Introduccin

Lentinus edodes , comnmente conocido como el hongo shiitake, es el segundo

hongo medicinal china tradicional ms utilizado en el mercado
mundial [1] y [2] . Es conocido por ser rico en fibra diettica, minerales, vitaminas,
y varias sustancias activas [3] , y debido a sus beneficios para la salud percibidos,
este hongo ha ganado gran popularidad como un alimento saludable en los pases
del este asitico. En la actualidad, un gran inters se centra ahora en los
polisacridos producidos por hongos debido a sus actividades biolgicas como
inmunomoduladora y antitumoral [3] , [4] y [5] , y esto es probable que provoque
una mayor demanda en el futuro prximo .
Es mucho tiempo para cosechar el cuerpo fructfero de los hongos cultivados con
fines comerciales [4] . Cultivo sumergido tiene una serie de ventajas, incluyendo
una mayor produccin de micelio en un espacio ms compacto y menos tiempo,
con menos posibilidades de contaminacin [3] , [6] , [7] y [8] , y esto est
atrayendo la atencin como una alternativa para la produccin eficiente de
micelios y polisacrido. Adems de polisacrido obtenible a partir de la biomasa,
los cultivos miceliales tambin excretan polisacrido extracelular (EPS) en el caldo
de fermentacin que difiere un poco en la estructura, composicin y actividad
fisiolgica.
EPS es ms fcil de obtener de cultivo sumergido que es el polisacrido interno
localizado dentro de los micelios, pero exhibe una actividad biolgica
similar [9] . Para L. edodes , EPS de produccin en cultivo lquido an no ha sido
examinado. En otras especies, la tasa de crecimiento del micelio, EPS tasa de
produccin, y la productividad EPS se ha demostrado que variar segn las
condiciones ambientales y la composicin del medio, incluyendo la fuente de
carbono, fuente de nitrgeno, pH, etc. [10] . En el presente trabajo, las fuentes de
carbono y nitrgeno ms eficaces para el crecimiento y produccin de EPS micelio
se investigaron en L. edodes utilizando el enfoque de un solo factor en-a-tiempo. A
continuacin, se aplic un diseo Plackett-Burman, seguido por los caminos de la
metodologa de superficie de ms empinado ascenso y respuesta, para optimizar
la composicin del medio de cultivo para el crecimiento del micelio y EPS
produccin. Ya que se encontraron condiciones de fermentacin a tener efectos
significativos en la morfologa cultivo posterior y la produccin del metabolito, la
cintica de crecimiento de L. edodesmicelio en condiciones optimizadas en frasco
(forma de pellets de crecimiento) y fermentador de transporte areo (forma de
crecimiento filamentoso) cultura fueron investigados.

2. Materiales y mtodos
2.1. condiciones de microorganismos y cultura
L. edodes (ZFA0033) se obtuvo de Zhejiang Academia Forestal, Zhejiang,
China. La cepa se irradi con 60 Co y se mantuvo en agar de dextrosa de patata
(PDA) a 4 C y se subcultivan cada 3 meses.
El cultivo se realiz en dos etapas: el medio de cultivo de siembra consisti en los
siguientes componentes: 20,0 g de glucosa, 2,0 g de levadura en polvo, 1,0 g
KH 2 PO 4 , 1,0 g K 2 HPO 4 , y 1,5 g MgSO 4 7H 2 O . El pH inicial no se ajust (pH
5,0-5,5). La solucin se someti a autoclave a 115 C durante 30 min.

Los experimentos de cultivo en matraz se realizaron en matraces de 250 ml que

contiene 100 ml de medio de fermentacin, que se inocul con 10% (v / v) del
cultivo de siembra. Los matraces se inocularon como anteriormente y se incubaron
en un agitador rotatorio a 160 rpm y 28 C durante 10 das.
Los experimentos de fermentador de transporte areo fueron preformados en un
100 l biorreactor con un proyecto de tubo concntrico (volumen de trabajo 70 l) a
un nivel de inculo del 5%. El biorreactor se hizo funcionar a 28 C con una
aireacin de 50 l / min y un aumento (alrededor de 70 l / min) en la fase
exponencial. El pH se control por adicin de base. La muestra (100 ml) se tom
tres veces de forma asptica puente areo fermentador a intervalos.
2.2. Estimacin del peso celular seco y la produccin de EPS
La biomasa se midi mediante filtracin de la cultivo de hongos a travs de un
papel de filtro Whatman No. 4 hasta que se obtuvo un filtrado transparente. Los
micelios obtenidos se lavaron dos veces con agua destilada y se secaron durante
la noche a un peso constante a 50 C. EPS se precipit a partir del medio de
cultivo filtrado restante mediante la mezcla de 10 ml con cuatro volmenes de 95%
(v / v) de etanol. Esto se dej en reposo a 4 C durante la noche para precipitar
EPS crudo. Los EPS precipitado se sedimentaron por centrifugacin a 11.712
g durante 40 min a 4 C y el sobrenadante se descart. El precipitado se
resuspendi despus en un volumen igual de 75% de etanol [11] y [12] para
eliminar los oligosacridos y se centrifug de nuevo como anteriormente. El
precipitado de EPS puras se sec a 40 C para eliminar el etanol residual. El
contenido de EPS se determin mediante un mtodo de fenol-cido sulfrico
utilizando glucosa como el estndar [13] .
2.3. Un factor-en-un-tiempo
En cada experimento, un factor que no modifica la celebracin de todos los dems
factores constantes. diferentes fuentes de carbono (glucosa, sacarosa, maltosa,
lactosa, fructosa), fuentes de nitrgeno (sulfato de amonio (AS), extracto de carne
(BE), peptona (PT), extracto de levadura (YE), levadura en polvo (YP)), a
diferentes concentraciones, los componentes principales, y el pH se estudiaron
inicialmente por experimentos solo factor.
2.4. diseo Plackett-Burman para el cribado
Diseo Plackett-Burman (PBD) [14] es una herramienta poderosa y til cuando
rpidamente la bsqueda de los factores clave en un sistema multivariable. En el
presente estudio, se utiliz para el cribado de los factores clave antes de la
optimizacin.
Cada variable independiente se prob en dos niveles, alto (+) y bajo (-), como se
indica en el diseo experimental se mostr en la Tabla 1 . Tabla 2 muestra los
detalles de la matriz de diseo. Ocho factores fueron elegidos, incluyendo la
fuente de carbono y nitrgeno, elementos esenciales para el crecimiento [10] y el
pH. Tres variables ficticias se estudiaron en 12 experimentos para calcular el error
estndar. PBD se basa en el modelo polinomial de primer orden:

ecuacin( 1 )

Y = +

Girar mathjax en

donde Y es la respuesta, es el modelo de intercepcin, i es el coeficiente

lineal, y x ies el nivel de la variable independiente.
Tabla 1.
definicin experimental para el diseo Plackett-Burman.
Los valores experimentales
cdigo de smbolo

factores
bajo nivel (-1) Alto Nivel (1)

X 1 (g / l)
X 2 (g / l)
X 3 (g / l)
X 4 (g / l)
X 5 (g / l)
X 6 (g / l)
X 7 (g / l)
X8
X 9 - X 11

Glucosa
La levadura en polvo
KH 2 PO 4
K 2 HPO 4
MgSO 4 7H 2 O
CaCl 2
NaCl
pH
factores ficticias

5
2
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
3
-

15
6
2
2
2
2
2
6
opciones de la tabla

Tabla 2.
matriz de diseo Plackett-Burman con la biomasa como respuesta.
correr
X1
X2
X3
X4
X5
X6
X7
X8
X9
X 10
1
1
-1
1
1
1
1
1
-1
-1
-1
2
1
1
-1
1
-1
1
-1
1
-1
1
3
-1
1
1
-1
-1
1
1
1
-1
-1
4
-1
1
1
1
1
-1
-1
-1
-1
1
5
-1
-1
1
-1
1
1
-1
1
1
1
6
-1
-1
-1
1
-1
1
1
-1
1
1
7
1
-1
1
1
-1
-1
-1
1
1
-1
8
-1
1
-1
1
1
-1
1
1
1
-1
9
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
-1
10
1
1
-1
-1
1
1
-1
-1
1
-1
11
1
1
1
-1
-1
-1
1
-1
1
1
12
1
-1
-1
-1
1
-1
1
1
-1
1

X 11
-1
-1
1
1
-1
1
1
-1
-1
1
-1
1

Respuesta (g / l)
3.50 0.18
5,70 0,11
5.42 0.30
4,28 0,35
3,88 0,27
3,18 0,16
4,22 0,22
3,82 0,53
3.14 0.30
5,10 0,12
5,24 0,11
3,88 0,09

opciones de la tabla

2.5. Sendero del experimento ascenso ms rpido

La estimacin inicial de las condiciones ptimas estaba lejos de ser el ptimo
real. El mtodo de la subida ms empinada es un procedimiento simple y eficiente

para mover la regin experimental de una respuesta en la direccin del cambio

mximo hacia el ptimo.Se adoptaron Estos experimentos para determinar una
direccin adecuada aumentando o disminuyendo la concentracin de variables de
acuerdo con los resultados de PBD [15] y [16] .
2.6. metodologa de superficie de respuesta para la optimizacin de los
componentes del medio seleccionados
Se utiliz la metodologa de superficie de respuesta (RSM) para determinar la
concentracin ptima de estas variables para la elevacin de crecimiento y
produccin de EPS micelial. El diseo experimental fue un diseo de planta
experimental de Box-Behnken con tres factores clave seleccionados por PBD.
El comportamiento del sistema se explica por la siguiente ecuacin cuadrtica:
ecuacin( 2 )
Girar mathjax en

donde Y es la respuesta predicha, 0 es el trmino de desplazamiento, i es el

desplazamiento lineal, ii es el al cuadrado offset, ij es el efecto de la
interaccin, y x ies el valor codificado de adimensional X i .
2.7. Cintica de crecimiento de L. edodes micelio
Forma micelios de pellets se cultivaron en matraces (250 ml) inoculados con un 10
ml de una suspensin de pellets. Mltiples matraces se ejecutan al mismo tiempo,
y se tomaron tres frascos cada vez por muestreo diario. Culturas sedimentadas se
supone tradicionalmente para seguir una cintica de raz
cbica [17] y [18] . Emerson expresin biocinticos [17] se utiliz para el
crecimiento microbiano:
ecuacin( 3 )
Girar mathjax en

donde M es la masa total (g), y k c es una constante (g 1/3 h -1 ).

Forma micelios filamentosos se hicieron crecer en un biorreactor de puente
areo. Una ecuacin logstica se utiliz para ajustar la curva de
biomasa [19] . Esta ecuacin es un modelo independiente de sustrato, y es un
modelo ampliamente utilizado no estructurada para describir el crecimiento
celular [20] , [21] y [22] :
ecuacin( 4 )

Girar mathjax en

donde C es la biomasa (g / l), mu m es la tasa mxima de crecimiento especfico

(h -1 ) yC m es la concentracin mxima alcanzable biomasa (g / l).
Luedeking-Piret se utiliz para la curva de EPS [23] . Esta ecuacin se utiliza
ampliamente en las predicciones de metabolitos [21] y [22] .
ecuacin( 5 )
Girar mathjax en

donde P x es la concentracin de EPS (g / l), C x es la biomasa (g / l), (g g 1

), (g (g h) -1 ) son constantes. El modelo es de naturaleza
emprica, dCx / dt representa la produccin de EPS en proporcin con la tasa de
crecimiento y Cx representa la produccin de EPS independientemente de
crecimiento.
2.8. anlisis estadstico
Se utiliz un diseo experto 7,0 para los diseos experimentales y anlisis
regressional posterior de los datos experimentales. Matlab 7.0 se utiliz para la
estimacin de montaje y parmetro de curva. En todos los casos hubo tres
rplicas ( n = 3) para asegurar la reproducibilidad. Desviacin estndar (SD) se
calcul para todos los datos, los resultados se presentan como media desviacin
estndar de tres determinaciones.

3. Resultados y discusin
3.1. Un factor-en-un-tiempo
Aunque los mtodos de variables individuales son tediosos, y pasar por alto la
interaccin entre diferentes factores, este mtodo ha sido til para la seleccin de
los niveles de PBD, por lo que el resultado ms razonable y creble.
3.1.1. La seleccin de las fuentes de carbono y las concentraciones
Los hidratos de carbono son un importante componente del citoesqueleto y un
importante requerimiento nutricional para el crecimiento y desarrollo de hongos
superiores [24] . Todas las fuentes de carbono seleccionados dio lugar a un buen
crecimiento del micelio y el rendimiento del producto. La glucosa promueve el
crecimiento del micelio mxima de 2,75 g / l, pero dio lugar a comparativamente
baja produccin de EPS. Sin embargo, la glucosa era un precio bajo y
biolgicamente era la fuente de energa ms eficaz, as que elegimos la glucosa
es la fuente de carbono.
Ambos micelio y EPS produccin aument con aumentos en la concentracin de
glucosa de 0,5 a 3%. Sin embargo, aumentos adicionales tuvieron un efecto
negativo ( Fig. 1 ).

Higo. 1.
Efecto de fuentes de carbono (a) y (b) las concentraciones de biomasa micelial y EPS de
produccin en L.edodes culturas.
Figura opciones

3.1.2. Proyeccin de fuentes de nitrgeno y concentraciones

El efecto de las fuentes de nitrgeno en el metabolismo secundario est
condicionada por muchos factores [25] , incluyendo el organismo productor, el tipo
y concentracin de las fuentes de nitrgeno y el mtodo estacionario de cultivo o
sumergidos.
L. edodes podran crecer en un nmero de diferentes fuentes de nitrgeno
orgnico, pero las fuentes de nitrgeno para la EPS y la produccin de biomasa
eran bastante distinta (Fig. 2 ). Entre los cinco fuentes de nitrgeno diferentes que
hemos examinado, la levadura en polvo fue el ms eficaz para mejorar la
produccin de EPS (0,160 g / l) y la biomasa (2,07 g / l) por L. edodes . El
nitrgeno inorgnico no fue efectivo para el crecimiento del micelio. La levadura en
polvo a menudo se ha utilizado para proporcionar factores de crecimiento
necesarios; sin embargo, una concentracin demasiado alta de extracto de
levadura reducira el uso de otras fuentes de carbono y la acumulacin de
metabolitos.

Higo. 2.
Efecto de fuentes de nitrgeno (A) y las concentraciones de (B) de la biomasa micelial y
EPS produccin en L. edodes culturas.

Figura opciones

3.1.3. Efectos de la concentracin de tres componentes de medios

K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 y MgSO 4 7H 2 O proporcionado cuatro elementos
esenciales. PH inicial tambin tuvo un efecto significativo sobre el crecimiento de
hongos [11] y [26] . L.edodes mantuvo una tasa de crecimiento mximo a pH
bajo [27] y [28] .
La concentracin de los tres componentes principales K 2 HPO 4 , KH 2 PO 4 ,
MgSO 4 7H2 O (0,01, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3%) y el pH inicial (2-6) se evaluaron en los
experimentos de los factores individuales (datos no mostrada).
3.2. diseo Plackett-Burman para la deteccin de elementos traza
Ocho elementos traza fueron elegidos y los ms significativos fueron
seleccionados utilizando un PBD. La Tabla 3 muestra el ANOVA para los
resultados del PBD. Un coeficiente de contraste grande, ya sea positivo o
negativo, indica un factor que tena un gran impacto en el ttulo, mientras que un
coeficiente de cerca de cero significa que el factor tuvo poco o ningn
efecto [29] . Una baja P -valor indica un efecto "real" o significativa.
Tabla 3.
Anlisis de varianza para Plackett-Burman modelo factorial.
Suma de
Grados de
Cuadrado
Fuente
cuadrados
libertad
medio
Modelo
8.41
8
1.05
X1
1.28
1
1.28
X2
5.02
1
5.02
X3
0.25
1
0.25
X4
0.32
1
0.32
X5
0.50
1
0.50
X6
0.40
1
0.40
X7
0.14
1
0.14
X8
0.51
1
0.51
Residual
0.15
3
0.05
Cor total
8.56
11

F -valor
21.13
25.72
100.81
4.95
6.43
9.97
8.10
2.74
10.30

P -valor
Prof> F
0.0146
0.0148
0.0021
0,1125
0.0850
0.0510
0.0653
0.1963
0.0490

opciones de la tabla

La bondad del modelo se comprob mediante el coeficiente de

determinacin R 2(0,9826), lo que explica 98.26% de la variabilidad de la
respuesta. El Modelo F -valor de 21,13 implicaba tambin el modelo fue
significativo. Slo haba una posibilidad de que un 1,46% "Modelo F -valor" podra
ocurrir debido al ruido.
Una precisin adecuada mide la relacin seal a ruido. Una proporcin mayor que
4 era deseable. La relacin obtenida de 13.318 indica una seal adecuada. Este
modelo podra ser utilizado para navegar por el espacio de diseo.
Tres de los ocho elementos tuvieron un efecto significativo sobre el crecimiento del
micelio ( P <0,05). La glucosa, la levadura en polvo y el pH fueron seleccionados
para una mayor optimizacin, mientras que los minerales tenan poca

influencia. Este resultado tambin estuvo de acuerdo con el diseo de un factoren-un-tiempo.

3.3. Optimizacin de la ruta de ascenso ms rpido experimento
los resultados indicaron que los PBD de glucosa, levadura en polvo, y los efectos
del pH fueron positivos. Por lo tanto, el aumento de la concentracin de glucosa, la
concentracin de la levadura en polvo, y el pH deben predecir los niveles ptimos
de las variables y resultar en un crecimiento micelial superior.
El experimento subida ms empinada comenz desde el punto central de los
parmetros en el PBD, y los coeficientes especifica la direccin apropiada de las
variables cambiantes, como se muestra en la Tabla 4 . La biomasa alcanz su
punto mximo en el tercer paso y ninguna mejora adicional se podra lograr en la
respuesta . Los parmetros fueron 15 g / l de glucosa, 5 g / l de levadura en polvo
y pH 5. Estos puntos fueron entonces elegidas para una mayor optimizacin,
tomada como el nivel 0 en RSM.
Tabla 4.
Diseo experimental de ascenso ms rpido y la respuesta correspondiente.
Experimentar
La glucosa (g /
La levadura en polvo
pH
ninguna.
l)
(g / l)
inicial
0
10
4
4
0 + 1
12.5
4.5
4.5
0 + 2
15
5
5
0 + 3
17.5
5.5
5.5
0 + 4
20
6
6

La biomasa (g /
l)
3,68 0,13
4,54 0,31
5.11 0.29
4.22 0.37
2.77 0.40

opciones de la tabla

3.4. Optimizacin del diseo de Box-Behnken

Basado en el PBD y el mtodo de la subida ms empinada, se utilizaron tres
variables (glucosa, levadura en polvo, pH inicial) para determinar los niveles
ptimos de estos parmetros. La matriz de diseo de las variables en unidades
codificadas se da en la Tabla 5 , junto con los valores experimentales de la
respuesta.
Tabla 5.
matriz de diseo de Box-Behnken con biomasa y EPS como respuestas.
Variables independientes
Respuesta
correr

X 1 : glucosa
(g / l)
0 (15)

X 2 : levadura en polvo
(g / l)
-1 (2,0)

X3:
pH
-1 (3,5)

La biomasa (g /
l)
3,66 0,08

0 (15)

1 (8,0)

-1 (3,5)

5,04 0,13

-1 (5)

1 (8,0)

0 (5,0)

4.04 0.42

1 (25)

0 (5,0)

-1 (3,5)

4,47 0,08

EPS (g / l)
0,327
0,072
0,611
0,106
0,488
0,056
0,553

Variables independientes

Respuesta

correr
X 1 : glucosa
(g / l)

X 2 : levadura en polvo
(g / l)

X3:
pH

La biomasa (g /
l)

1 (25)

0 (5,0)

1 (6,5)

2.43 0.42

0 (15)

1 (8,0)

1 (6,5)

2,04 0,30

-1 (5)

-1 (2,0)

0 (5,0)

3,26 0,78

-1 (5)

0 (5,0)

-1 (3,5)

4.17 0.13

0 (15)

-1 (2,0)

1 (6,5)

2.46 0.40

10

1 (25)

1 (8,0)

0 (5,0)

4.11 0.65

11

1 (25)

-1 (2,0)

0 (5,0)

4,08 0,53

12

-1 (5)

0 (5,0)

1 (6,5)

3,20 0,16

13

0 (15)

0 (5,0)

0 (5,0)

6,54 0,42

14

0 (15)

0 (5,0)

0 (5,0)

6,62 0,25

15

0 (15)

0 (5,0)

0 (5,0)

6,80 0,25

diecisis

0 (15)

0 (5,0)

0 (5,0)

6,81 0,61

17

0 (15)

0 (5,0)

0 (5,0)

6,61 0,38

EPS (g / l)
0,044
0,283
0,078
0,271
0,078
0,321
0,037
0,523
0,087
0,241
0,100
0,529
0,012
0,405
0,062
0,265
0,056
0,737
0,022
0,725
0,062
0,732
0,053
0,734
0,081
0,713
0,028

opciones de la tabla

3.4.1. Optimizacin de la biomasa de crecimiento micelial

Haba una considerable variacin en la biomasa en funcin de las condiciones de
fermentacin, como se muestra en la Tabla 5 . La replicacin en las condiciones
de punto de centro result en la biomasa ms altas que en otros niveles. La
respuesta predicha Y se obtuvo para la biomasa como sigue:
ecuacin( 6 )

Girar mathjax en

La significacin estadstica de la Ec. (6) se confirm mediante una prueba F, y el

anlisis de la varianza (ANOVA) para el modelo de superficie de respuesta
cuadrtica se resume en la Tabla 6 .
Tabla 6.
ANOVA de modelo de regresin de crecimiento del micelio.
Fuente
La suma de df
Cuadrado medio
Modelo
40.55
9
4.51
X1
0.83
1
0.83
X2
0.89
1
0.89
X3
5.30
1
5.30
X1 X2
0.68
1
0.68
X1 X3
0,78
1
0,78
X2 X3
0,81
1
0,81
3.17
1
3.17

Residual
Falta de ajuste
error pura
total de cor

F cuadrados-valor
34.32
6.34
6.79
40.35
5.18
5.97
6.17
24.11

( P )> F
<0,0001
0.0400
0,0351
0.0004
0,0569
0,0446
0.0420
0,0017

5.66

5.66

43.12

0.0003

19.73

19.73

150.27

<0,0001

0.92
0,78
0.14
41.47

7
3
4
diecisis

0.13
0.26
0,036

7.24

0,0429

opciones de la tabla

El anlisis de varianza del modelo de regresin cuadrtica demostr que el

modelo fue significativo, con un F -test de un valor muy baja probabilidad
( P > F ) <0,0001. La bondad del modelo se indica mediante el coeficiente de
determinacin ( R 2 ) y el coeficiente de correlacin mltiple ( R ). El valor
de R 2 (0,9778) para la Ec. (6) sugiri que la variacin de la muestra de 97,78%
para la biomasa se atribuy a las variables independientes, y slo alrededor de
2,22% de la variacin total no puede ser explicado por el modelo. Cuanto ms
cerca del valor de R (0,9888) a 1, mejor ser la correlacin entre los valores
experimentales y predichos [30] . El "Pred R -squared" de 0,8455 era
razonablemente de acuerdo con el "Adj R -squared" de 0.9746. Se utiliz la
precisin adecuada para medir la relacin de seal a ruido, que en general es
deseable que sea mayor que 4. En el presente estudio, el valor de esta relacin
(16,59) sugiere que el modelo cuadrtico polinomio era de una seal adecuada, y
podra ser utilizado para navegar por el espacio de diseo.
Las P -valores se utilizaron como una herramienta para comprobar el significado
de cada coeficiente, menor es el valor de P , ms significativo fue el
correspondiente coeficiente de[31] . Como puede verse a partir de la Tabla 6 , tres
coeficientes lineales ( X 1 - X 3 ) y todos los coeficientes cuadrticos fueron
significativas, como lo fueron dos de los coeficientes de interaccin. Los
coeficientes no significativos no se omitieron de la Ec. (6) , ya que era un modelo
jerrquico [32] .
La trama 3D-superficie y 2D-proyeccin podran mostrar visualmente la respuesta
sobre una regin de los niveles de factor de inters, la relacin entre la respuesta

y los niveles experimentales de cada variable, y el tipo de interacciones entre las

variables de prueba con el fin de deducir las condiciones ptimas ( Fig. 3 (a-c)).

Higo. 3.
(a) El 3D-trama y 2D-proyeccin que muestra la interaccin entre la glucosa y la levadura
en polvo, a pH 5,0 sobre la biomasa ( Y ). (b) El 3D-trama y 2D-proyeccin que muestra la
interaccin entre el pH y glucosa a 5,0 g / l de levadura en polvo de la biomasa ( Y ). (c) El
3D-trama y 2D-proyeccin que muestra la interaccin entre el pH y la levadura en polvo a
15,0 g / l de glucosa en biomasa ( Y ).
Figura opciones

La trama 3D-superficie y 2D-proyeccin ( Fig. 3 (a)) representan los efectos de la

glucosa y la levadura en polvo sobre la biomasa, mientras que el pH se fij en su
concentracin ptima. El 3D-plot mostr evidencia de que el rendimiento de la
biomasa del micelio aument significativamente al aumentar la levadura en polvo
hasta aproximadamente 6,0 g / l, pero disminuy considerablemente ms all de
este, alcanzando un rendimiento mximo a aproximadamente 5,5 g / l. El efecto de
la glucosa sobre el crecimiento tambin fue sensible dentro del intervalo
ensayado, alcanzando un rendimiento mximo a aproximadamente 14 g / l. La
misma tendencia se indica en la Fig. 3 (b y c).
Al resolver la matriz inversa (de la Ec. (6) ), los valores ptimos de las variables de
ensayo en unidades no codificados fueron 15,4 g / l de glucosa, 5,32 g / l de
levadura en polvo y pH 4,61. En esta situacin, el mximo predijo cantidad de
biomasa del micelio fue 6,82 g / l.
3.4.2. Optimizacin del rendimiento de EPS
En base a la Tabla 5 , la respuesta predicha Y para el EPS es el siguiente:
ecuacin( 7 )

Girar mathjax en

La significacin estadstica de la Ec. (7) se comprob por un F -test y el anlisis de

la varianza (ANOVA). El ANOVA (datos no mostrados) del modelo de regresin
cuadrtica demostr que el modelo fue significativa, con un F -test de un valor de
probabilidad muy baja [( P > F ) <0,0001]. El valor de R 2 (0.9957) de la
Ec. (7) demostr la bondad del modelo.
La "falta de ajuste F -valor" de 7,66 a entender que la falta de ajuste fue
significativa. Slo haba una posibilidad de que un 3,91% "falta de ajuste F -valor"
podra ocurrir debido al ruido. El "Pred R -squared" de 0,9398 era razonablemente
de acuerdo con el "Adj R -squared" de 0.9901. Fig. 4 (a-c) es la trama 3D y 2Dsuperficie-proyeccin.

Higo. 4.
(a) El 3D-trama y 2D-proyeccin que muestra la interaccin entre la glucosa y la levadura
en polvo a pH 5,0 en EPS ( Y ). (b) El 3D-trama y 2D-proyeccin que muestra la interaccin
entre el pH y glucosa a 5,0 g / l de levadura en polvo en EPS ( Y ). (c) El 3D-trama y 2Dproyeccin que muestra la interaccin entre el pH y la levadura en polvo a 15,0 g / l de
glucosa en EPS ( Y ).
Figura opciones

Los valores ptimos de las variables de ensayo en unidades no codificados fueron

15,78 g / l de glucosa, 5,86 g / l de levadura en polvo y pH 4,48. En esta situacin,
el mximo predijo cantidad de produccin de EPS fue 0,761 g / l.
3.4.3. Validacin de los modelos
Con el fin de confirmar los resultados predichos del modelo, los experimentos en
condiciones ptimas se llevaron a cabo, produciendo una biomasa de 6,88 g / l y
un rendimiento EPS de 0,751 g / l.
3.5. Cintica de crecimiento de L. edodes micelio en condiciones optimizadas
Los hongos presentan diferentes formas morfolgicas en cultivo sumergido,
dispersos principalmente en forma de filamentos de micelio y las masas de micelio
densamente entrelazadas (pellets). Estas formas morfolgicas influyen en el
crecimiento y produccin de metabolito micelial. Parque [33] encontr que los
grnulos eran una forma micelial favorables para la produccin de exo-biopolmero
por Cordyceps militaris , mientras que Lee [34] encontr lo contrario
en G. frondosa fermentacin: los filamentos generan una mayor produccin de
biomasa y EPS.
La forma de grnulos era por lo general menos viscosa que la forma filamentosa,
cerca de las caractersticas del fluido de Newton [35] . El sedimento se considera
que es una masa esfrica de micelios no creciente rodeadas por una cubierta
externa de hifas activo [10] .Las partes centrales de la pastilla era probable que
autolizan como resultado de la deficiencia nutricional. Sin embargo, a travs de la
ramificacin de las hifas, el crecimiento apical era compatible con el crecimiento
exponencial, lo que requiere para el crecimiento de raz cbica [36] .
En la forma filamentosa, todos las hifas fueron expuestos al medio y por lo tanto
todos eran capaces de contribuir al crecimiento del micelio, que requieren para el
crecimiento exponencial [36] . Esto hizo que el caldo ms viscoso, cerca de las
caractersticas del fluido pseudoplstico.
3.5.1. Cintica de crecimiento de forma de grnulos
Higo. 5 representa el rendimiento de biomasa y EPS durante la fermentacin. La
curva de crecimiento era ms suave que una curva en S-figura debido a las
condiciones ambientales limitados en frascos y el carcter forma de grnulos. La
fase de latencia se prolong (aproximadamente 3 das) y la fase exponencial se
extendi como el oxgeno disuelto y un descenso gradual del pH. El perodo de
crecimiento no se pronuncia con una baja tasa de crecimiento. La fase
estacionaria apareci despus de 10 das, y por lo tanto el modelo simplemente
representa un perodo de tiempo limitado (etapa de crecimiento gradual).

Higo. 5.
Los datos de regresin y curvas experimentales de biomasa y EPS en forma de grnulos:
() de datos experimentales de la biomasa; () los datos experimentales de EPS; (-) Curva
de regresin.
Figura opciones

Se utiliz la ecuacin cintica de raz cbica para simular los cambios en la

biomasa y la ecuacin Luedeking-Piret para simular la concentracin de EPS. La
Ec. (3) fue reescrito como:
ecuacin( 8 )
Girar mathjax en

Ec. (8) fue sustituido en la Ec. (5) como:

ecuacin( 9 )

Girar mathjax en

Los valores de regresin se presentan en la Tabla 7 , lo que demuestra que el

perfil cintico del crecimiento celular fue bien descrito por el modelo ( R 2 =
0,9478). El modelo cintico de EPS tambin fue bien descrito ( R 2 = 0,9954). La
minimizacin entre el valor calculado y experimental era dependiente de la
estimacin inicial de los coeficientes debido al algoritmo recursivo. Un resultado
prometedor se obtuvo debido a una estimacin razonable de acuerdo con los
datos experimentales. La falta de transferencia de masa de oxgeno y la absorcin
de la nutricin se produjo dentro de las bolitas slo en el ltimo perodo coincidi
con una baja tasa de crecimiento; As, el crecimiento forma de grnulos tena un
largo ciclo en paralelo con los rendimientos EPS inferiores. El coeficiente negativo
de indica la produccin asociada al crecimiento aumentado a expensas de la
produccin no asociada al crecimiento cuando la cantidad total de la EPS fue
constante.

Tabla 7.
Los valores de los coeficientes cinticos de la forma de grnulo y la forma filamentosa.
forma de grnulos
forma filamentosa

Los parmetros cinticos

C0
k ((g / l) 1/3 h -1 )
P0
(g g -1 )
(g (g h) -1 )

valores cinticos
0,341
0,005
0,030
0,524
-0,0044

Los parmetros cinticos

C 0 (g / l)
C m (g / l)
m (h -1 )
P 0 (g / l)
(g g -1 )
(g (g h) -1 )

valores cinticos
0,010
8,437
0,081
0,157
0,044
2,11 10 -4

opciones de la tabla

3.5.2. Cintica de crecimiento de la forma filamentosa

Higo. 6 representa el rendimiento de biomasa y EPS durante la fermentacin. Esta
curva de crecimiento era una tpica curva S-figura. Despus de una fase de
latencia (aproximadamente 2 das), el micelio de repente entr en la fase
exponencial y la produccin de EPS inicia simultneamente. La biomasa alcanz
el mximo en 4-5 das, y el producto EPS en la media hora.

Higo. 6.
Los datos de regresin y curvas experimentales de biomasa y EPS en forma filamentosa:
() de datos experimentales de la biomasa; () los datos experimentales de EPS; (-) Curva
de regresin.
Figura opciones

Se utiliz el sustrato ecuacin logstica independiente para simular los cambios en

la biomasa y la ecuacin Luedeking-Piret para simular las concentraciones de
BPA. La Ec.(4) fue reescrito como:
ecuacin( 10 )
Girar mathjax en

La Ec. (10) fue sustituido en la Ec. (5) como:

ecuacin( 11 )

P (t) = P

+ [C (t) -C

] + C

{ln [C

/ C (t)] + m u

t} /

Girar mathjax en

Los valores de regresin se presentan en la Tabla 7 . El perfil cintico del

crecimiento celular fue bien descrito por el modelo ( R 2 = 0,9902) y el modelo
cintico de EPS tambin fue bien descrito ( R 2 = 0,9567). El valor calculado
de C m era menor que el valor experimental (9,02 g / l), que quizs pudiera
atribuirse a la llegada de la fase de descenso.La constante de crecimiento
asociada valor era mucho ms grande que la constante de no-crecimiento
asociada , lo que significaba exista una relacin lineal entre la biomasa y el EPS
y EPS produccin fue de crecimiento asociados-consecuencia. Los resultados
mostraron que el fermentador puente areo mantenido un suministro de oxgeno
continuo con una aireacin eficaz y mantenido el caldo bien mezclado, el micelio
se dispers de manera ms eficiente, y como resultado, la forma filamentosa
tenido una mayor produccin y acortar el ciclo de crecimiento coincidi con una
relativamente alta tasa mxima de crecimiento especfico ( m = 0,081) de la
biomasa. Este resultado fue similar con el trabajo de Song [28] . El modelo de
cintica se podra utilizar para controlar un sistema paraL. edodes fermentacin
incluyendo la determinacin del perodo de produccin de micelio y la prediccin
del proceso. Sin embargo, los coeficientes cinticos variaran dependiendo de las
condiciones del proceso de fermentacin en un caso especfico.

4. Conclusiones
La relacin entre el crecimiento del micelio y la produccin de EPS todava no est
claro y es digno de estudio adicional. Aunque algunas investigaciones han
encontrado ninguna relacin entre la produccin y el crecimiento del micelio EPS,
otros resultados han demostrado una correlacin positiva entre
ellas [21] y [22] . En este experimento, los datos indicaron una relacin lineal
entre la biomasa y EPS produccin. Por lo tanto, se seleccionaron factores
importantes basadas nicamente en la biomasa del micelio.
En un primer momento, el factor-en-un-tiempo fue tomada. A pesar de que era
tedioso, defectuoso e ignorado en muchas investigaciones, este mtodo ha sido
til en la seleccin de nivel en PBD. Se seleccionaron los factores principales y
encontramos las proximidades preliminar de los ptimos. Finalmente se obtuvo el
medio ptimo. En las condiciones ptimas, la biomasa aument 1,5 veces, y las
EPS aument 2,5 veces.
La fermentacin es un proceso muy complejo, con dificultades para obtener una
imagen completa en una fermentacin de casos especficos. Hasta donde
sabemos, no ha habido relativamente poca investigacin sobre el comportamiento
del crecimiento de hongos en las morfologas de pellets y filamentosas que se
considera como uno de los parmetros clave en la produccin industrial. La forma
de pellets aumenta de tamao, mientras que la forma filamentosa extiende sus
hifas. Por lo tanto, el crecimiento de raz cbica puede estar asociado con la forma
de grnulos y el crecimiento exponencial con la forma filamentosa.Se utilizaron los

modelos no estructurados para describir el sistema biolgico, y los modelos que

describen las relaciones entre las variables principales explicaron
cuantitativamente el comportamiento del proceso de fermentacin. Cuando se
estudiaron estas dos morfologas, y se ajustaron los modelos cinticos, la forma
filamentosa era adecuado para la fermentacin a gran escala. Aunque el modelo
no estructurado era matemticamente ms manejable y fcil de verificar, el modelo
de estructura teniendo en cuenta algunos aspectos bsicos de la estructura,
funcin y composicin pareca ms amplia. Koutinas, Wang y Webb [37] utilizaron
un mtodo indirecto (metablica datos de CO 2 tasa de evolucin) para estimar el
crecimiento de hongos debido a la adherencia de las clulas fngicas y partculas
de trigo en medios complejos, que era un mtodo extraordinariamente ingeniosa
para identificar el proceso de fermentacin, y se ilumine en nuestro trabajo
futuro. Con todo, nuestra investigacin actual acaba de identificar los fenmenos
clave y llevara a cabo una investigacin pionera para el trabajo posterior.
El mtodo estadstico utilizado en este estudio fue cientfica, creble y vale la pena
aplicar en otros campos de investigacin. Los resultados obtenidos en este estudio
pueden ser tiles para una produccin altamente eficaz de la biomasa y valiosos
metabolitos bioactivos. El modelo cintico describe la fermentacin perfectamente
y puede proporcionar directrices eficaces y control avanzado de procesos
fermentativos para la produccin industrial de L. edodes .

Reconocimiento
Este trabajo fue apoyado por una beca de los programas clave para la Ciencia y
Tecnologa para el Desarrollo de la provincia de Zhejiang ( 2006C12094 ).

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