Reductasa

Introduccin
Esta enzima se encuentra slo en la leche de vaca.
Para estimar el nmero aproximado de microorganismos en la leche cruda
se utiliza un mtodo indirecto basado en la reduccin del colorante azul de
metileno que es un indicador de oxido-reduccin (es azul cuando est
oxidado e incoloro cuando esta reducido).
La mayora de los grmenes de la leche elaboran reductasas que modifican el potencial de xidoreduccin de la misma. Para demostrar ese fenmeno basta aadir a la leche una sustancia que se
decolore al pasar de la forma oxidada a la forma reducida. La rapidez con que cambia de color est en
funcin de la poblacin bacteriana y, por ello, puede ser un ndice del grado de contaminacin de la leche.
El colorante ms empleado es el azul de metileno, pero tambin se pueden utilizar la resazurina y el
cloruro de 2, 3, 5, trifenil-tetrazolium, ya que son colorantes fcilmente absorbibles por las clulas vivas.
En general se admite que la decoloracin es ms rpida cuanto mayor es el nmero de microorganismos
en la leche. Sin embargo, las bacterias presentan distinta habilidad para reducir el azul de metileno, as
el Streptococcus liquefaciens, los grmenes del grupo coliaergenos y los de la putrefaccin (Bacillus
subtilis) se muestran muy activos. Las clulas somticas presentes en la leche tambin influye mucho en
la velocidad de decoloracin, sobretodo los leucocitos.

OBJETIVOS

Conocer la metodologa para la determinacin de reductasa que

contiene la leche.
Aplicar las pruebas del azul de metileno para comprobar la calidad sanitaria de
la leche cruda.

Material

Tubos de ensayo con tapones estriles.

Bao mara estufa a 37C.

Pipetas graduadas

Reactivos

Solucin de azul de metileno. Preparar una solucin madre diluyendo unos gramos de azul de
metileno en alcohol de 96 hasta conseguir la saturacin.

Para preparar la solucin de trabajo tomar 2.5 mL de la solucin madre y adicionar 97.5 mL de
agua destilada estril.

Procedimiento

PRUEBA DE LA REDUCCIN DEL AZUL DE METILENO

Se pipete 10 mL de agua destilada estril en una botella y se le

agreg 0.5 mL de la solucin de azul de metileno.
Luego, con una pipeta de 10 mL tomamos esa misma cantidad de
muestra de leche en un tubo de ensayo; luego lo pasteurizamos; una vez
pasteurizado lo agregamos 0.5ml del azul de metileno.
Tapamos ambos tubos de ensayo con las muestras sin y
pasteurizadas y lo agitamos.
Previamente debemos tener ya al bao Mara calentado a 37 C (
0.1), verificar que en ste haya un control ms y menos y un tubo con la
muestra y el termmetro.
Luego, rotulamos los dos tubos, la muestra sin pasteurizar lo
sumergimos en el bao Mara.
-

Revisar cada 30 min.

Si pasados los primeros 30 min. no se vuelve blanco el contenido

del tubo, lo sacamos, lo invertimos suavemente 3 veces y lo volvemos a
poner en el bao Mara por otros 30 min. y as hasta que el contenido se
vuelva blanco.
Al final, anotamos el tiempo que demore en virar de color e
interpretamos:

Parmetros de color para comparacin

color azul; Calificacin: muy buena
color azul-violeta; Calificacin: buena
color rojo-violeta; Calificaron: suficiente

 color rojo; Calificacin: insuficiente

incoloras Calificacin: mala