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Turaya Naas,, Masoud Ghorbani, Catalina Soare, Nicole Scherling, Rudy Muller,
Peyman Ghorbani, Francisco Diaz-Mitoma.
Comparative Hepatology 2010, 9:7
http://www.comparative-hepatology.com/content/9/1/7
Abstracto.
Antecedentes: El virus de la hepatitis C (VHC) es una causa importante de hepatitis
crnica y un problema de salud que afectan a ms de 170 millones de personas alrededor
del mundo.
Anteriormente estudiamos ratones transgnicos que expresan HCV Core, protena de
envoltura 1 y 2 predominantemente en el hgado, resultando en esteatosis del hgado y
tumores linfoides y carcinoma hepatocelular.
Aqu, la respuesta celular inmunitaria a los antgenos de la hepatitis C fue evaluada por
transferencia adoptiva de esplenocitos etiquetados con el ster de succinimidyl
carboxyfluorescein (CFSE) de ratones inmunizados con HCV en HCV ratones
transgnicos.
Resultados: En comparacin con los ratones no transgnicos, hubo una disminucin
significativa en el porcentaje de clulas en sangre perifrica marcadas con CFSE en
celulas T CD4+ y CD8+.
En el ratn transgnico que recibe transferencia adoptiva de clulas de ratones donantes
inmunizados.
Por otra parte, el porcentaje de clulas CD4 y CD8 marcados con CFSE + fueron
significativamente mayores en el bazo deratones transgnicos y no transgnicos cuando
reciban esplenocitos de ratones no-inmunizados que de ratones inmunizados;
Por otra parte, los porcentajes de clulas T CD4+ y CD8+ en los ganglios linfativos de los
ratones receptores no transgnicas fueron significativamente mayores que los ratones
transgnicos cuando recibieron la transferencia adoptiva de donantes inmunizados.
Los hgados de los ratones transgnicos que recibieron transferencias celulares de
ratones inmunizados tenan de manera significativa un mayor porcentaje de clulas T
etiquetadas con CFSE que los hgados de los ratones no transgnicos que recibieron
clulas de ratones no inmunizados.
Conclusiones: Estos resultados sugieren que las clulas T de los ratones inmunizados
con VHC reconocen las protenas del VHC en el hgado del modelo de ratn transgnico y
van a los sitios de expresin de antgenos de VHC.
Proponemos el uso de este modelo animal para estudiar las respuestas activas de la
clula de T en la infeccin por el VHC.
Introduccin.
El virus de la hepatitis C (HCV) es una causa importante de la enfermedad heptica
crnica en todo el mundo. El virus produce infeccin crnica en el 80% de pacientes
agudo infectado con HCV. Un subconjunto de estos individuos desarrollan una lesin
heptica progresiva que lleva a carcinoma del hgado, cirrosis o cncer hepatocelular.
La respuesta inmune al VHC desempea un papel importante en las distintas etapas de
la infeccin. Est emergiendo evidencia de la capacidad de los pacientes agudos
infectados con HCV en tener control de la infeccin primaria de HCV dependiendo de la
vigorosa reaccin inmune celular del virus.
En la fase crnica de la infeccin, la respuesta inmune determina la tasa de progresin de
la enfermedad, tanto al limitar la replicacin viral como contribuyendo al proiceso
inmunopatologico.
Los hgados de personas infectadas crnicamente por VHC. Estn infiltrados con clulas
T; sin embargo, estas clulas no son especficas para VHC y son incapaces de erradicar
el virus.
Estos linfocitos infiltrantes de hgado se asocian con dao heptico en infeccin crnica
por VHC a travs de mecanismos no son bien entendidas.
Hay varios mecanismos de evasin inmune, que podran explicar la capacidad del virus
de escapar de la respuesta inmune y establecer una infeccin persistente.
La estrategia de evasin inmune incluyen: mutacin del virus, falla primaria de respuesta
de la clula de T, pobre presentacin del antgeno, supresin de la funcin de la clula de
T por las protenas del VHC.
Mtodos:
-
Ratones
Plsmidos y protenas
AGC ATG AAT ACG CCT AAA CCTC 3 ' y hacia atrs cartilla 5 ' TGG TAG GGT GAA
TGT GGA ACA CG 3 '. El fragmento amplificado fue clonado en los sitios EcoR1
del vector pCR 2.1 utilizando el kit de clonacin TA TOPO (Invitrogen, Burlington, ON).
La secuencia de nucletidos fue verificado por la secuencia en la Universidad de
de Ottawa. El Core, los fragmentos E1, E2 posteriormente fue subclonado en plsmido
pVAX-1 (Invitrogen, Burlington, ON) posterior (5) a un promotor del citomegalovirus.
El vector de expresin de la proteina recombinante de HCV Core, E1 y E2 fue tambin
descrito en nuestro estudio anterior. Brevemente, la construccin TOPOTA
HCVcore/E1/E2 fue subclonedo del vector de expresion la pEF6 Myc- (Invitrogen
Burlington, ON); este vector contiene 6 residuos de histidina que permitio la purificacin
de la poliprotena del VHC inmovilizandolo por cromatografa de afinidad metlica
(Clontech Talon Kit de resina, Palo Alto, CA). El plasmido recombinante que contiene el
inserto correctamente orientado fue transfected en las clulas de DH5, amplificados y
purificados usando el Endofree plsmido purificacin kit (Qiagen), como descrito
previamente.
Las clulas de ovario de hmster chino fueron transfectadas transitoriamente con el
recombinante pEF6/Myc- Su vector con el inserto de base/E1/E2.
La transfeccin fue realizada por 2 choques de electroporacin en 1.4- 1.6 KV utilizando
un aparato de electroporacin (BTX Inc.,San Diego, CA).
Se incubaron las clulas transfected en IMDM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) que
contiene 10% FCS (laboratorios de tecnologas de la vida, Grand Island, NY) y 50 g/mL
penicilina-gentamicina.
SE cosecharon las celualas 65 horas despus de la transfeccin, estas fueron lisadas en
tampn de lisis (25 mmol/L Tris base, mercaptoetanol 2,5 mmol/L, y 1% Triton-X100),
sonicadas y sometidas a la purificacin de protenas mediante el kit de resina de afinidad
Talon como descrito antes. Se verific la pureza de la protena por espectrometra de
masas y la protena con ~ 85% de pureza fue utilizada para la inmunizacin.
-
Ocho ratones donantes fueron inmunizados con una vacuna de VHC que contengan
pVAX HCV Core, E1 y E2 ADN (100 g); Protenas core, E1 y E2 (25 g) en solucin de
PBS y adyuvante montanide (50 l) fue de ISA-51 (Seppic Inc., Fairfield, NJ).
Los ratones fueron inmunizados tres veces con 100 l de la vacuna y dos veces por va
intramuscular en el cudriceps mayor con intervalos de dos semanas entre cada vacuna
booster . Ocho ratones de tipo salvaje no inmunizados fueron inyectados con solucin de
PBS y montanide ISA-51 solamente y fueron utilizados como control negativo. Despus
de cada inmunizacin, la respuesta inmunitaria humoral fue evaluados por un ELISA IgG
usando suero de ratn.
La respuesta celular inmune se evalu mediante PBMCs aislados de la sangre despus
de las primeras vacunas y se uso d PBMCs aislados de esplenocitos despus de la ltima
vacunacin. Los ratones fueron anestesiados con 50 Somnotal (productos farmacuticos
MTC, Cambridge, ON, Canad), sacrificado y su sangre y bazo recogidos.
Preparacin de los linfocitos del bazo de ratn donante Ratones de donantes fueron
sacrificados con anestesia, y El bazo se retira y se coloca en tubos con PBS estril. Los
linfocitos se prepararon como una suspensin presionando suavemente segmentos de
rganos a travs de un colador de plstico fino de la clula con una pipeta de plstico;
entonces, 10 ml de PBS es aadido al pasar las clulas a travs de la malla.
Las suspensiones de clulas de bazo se limpian de celulas rojos de la sangre (RBC) con
tampn de lisis de glbulos rojos (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO 3 y 0.1 mM EDTA). La
suspensin celular se lavan tres veces mediante la adicin de 0.1% de BSA en PBS y se
centrifugan a 1600 rpm a 4 C por 5 min, la las clulas fueron contadas y divididas en 2
partes: las clulas etiquetadas con CFSE, que fueron utilizadas para la inyeccin y
ensayo de proliferacin CFSE y clulas para ensayos de CTL y ELISASPOT para evaluar
la respuesta inmune.
-
ELISA
Respuestas CTL por clulas CD8 + de raton se evaluaron por medicin de la produccin
IFN- gamma utilizandose una tincin intracelular. Se realizaron los procedimientos
intracelulares segn Protocolo de Caltag Laboratories. Brevemente, PBMCs aislados de
sangre fresca o los esplenocitos de ratones inmunizados fueron cultivados en medios
RPMI completo en la presencia de 10 brefeldin g/ml (Sigma) y estimulados con ncleo,
protenas E1 y E2, pptidos del core o polivinlico de vaccinia VHC (NIH SIDA, Cat #
9426) que expresan el ncleo del VHC-1, E1 y E2, P7, NS2 truncado.
Celulas sin estimular o estimuladas con vaccinia vaco fueron utilizadas como control
negativo. PMA/ION clulas estimuladas se utilizaron como control positivo.
Dieciocho horas despus de la incubacin a 37 C, las clulas se lavaron con azida de
sodio PBS/2% FCS/0.01% y la superficie del posillo enjuagada durante 15 min con
anticuerpo monoclional PE marcado contra ratn CD3 +, y anticuerpo marcado con TC a
CD 8 + y CD 4+. (Caltag Laboratories, Hornby, ON). Las clulas fueron lavadas como
arriba, fijadas y permeabilized con Caltag reactivo A y B de fijacin y permeabilizacin
soluciones (Caltag Laboratories). Las clulas se tieron intracelulamente con anti-ratn
IFN-g FITClabeled Ab y se incubaron durante 30 min (en la oscuridad) a 4 C. Despus
de lavado, las clulas fueron analizadas en un citmetro de flujo FacScan (Becton
Dickinson, Mississauga, ON). Las clulas con un aumento de 0,1% en la produccin de
IFN-g sobre el control sin estimular o estimuladas por virus de la vaccinia vaco se
consideraban como respuesta positiva a la vacunacin.
-
IFN-g ELISPOT
Microscopa de fluorescencia
Microscopia de fluorescencia de fue utilizado para localizar los linfocitos en los rganos
intactos. Secciones gruesas de uno o dos mm de hgado congelado fresco y bazo fueron
montadas en un portaobjetos de microscopio empotrado de montaje y examinadas bajo
microscopa de fluorescencia (excitacin a 491 nm y emisin a 518 nm). El anlisis
histolgico para el estudio de los cambios histolgicos, hgado de ratn fueron en
paraformaldehdo al 4% y embebidos en parafina. Cinco m espesor secciones fueron
teidas con hematoxilina y eosina (H & E), segn mtodos estndar utilizados en el
Departamento de patologa y medicina de laboratorio en la Facultad de medicina,
Universidad de Ottawa.
-
Anlisis estadstico utilizan software Instat para hacer un ANOVA, seguido por la prueba
post hoc de Student-Newman-Keuls. Diferencias significativas se basan en P < 0.05.
Resultados
-
En este estudio, se utiliz la misma estrategia para inmunizar los ratones donantes.
Ratones inmunizados con una combina la vacuna VHC mostr una respuesta inmune
humoral y celular antiviral consistente, (la vacuna consisten en dos HCVcore/E1 /E2 ADN
y protenas y el adyuvante montanide A51). El ensayo de ELISA demostr un aumento
significativo de ttulos de anticuerpos contra inmunogenos HCV.
Hubo un aumento significativo de IgG total, IgG1, y IgG2a despus de la tercera
inmunizacin en 1:900 anticuerpottulo (* P < 0.005) (Figura 1).
CD8+ actividad citoltica de las clulas T fue demostrado por INF- g produccin utilizando
tincin intracelular y ELISPOT.
La produccin de INF- g fue significativamente mayor en ratones inmunizados frente a los
controles (Figura 3, 4).
Estos resultados fueron confirmados por IFN- g Biolgico. Los esplenocitos de los ratones
inmunizados produjo significativamente ms IFN g cuando eran estimulados con VORE,
protenas E1 y E2, pptidos del Core o vaccinia recombinante HCV de codificacin
protenas (poly HCV de vaccinia) (P < 0.05) (Figura 4).
(Figura 5).
De hecho, entre los grupos de ratones estudiados, los animales transgnicos tenan el
menor porcentaje de clulas T del donante en la sangre (figura6B). No hubo diferencias
significativas en el porcentajes de clulas de donantes en los grupos que recibieron
clulas de donantes no inmunizados.
Un mayor porcentaje de las clulas T de donantes de los grupos no inmunizados Se
alojaron en el bazo en comparacin con los animales inmunizados. Haba cuatro a diez
veces mas clulas T CD4 + y CD8 + en los bazos de ratones que recibieron esplenocitos
de ratones no inmunizados.
(Figura 7a).
Las clulas donantes de animales inmunizados Se alojaron en los ganglios linfticos slo
en los ratones de tipo salvaje. Haba algunas clulas marcadas en la linfa de los nodos
La proporcin de CD8 + de clulas T fue superior que de CD4+ en los ganglios linfticos
de animales s de tipo salvaje receptores de ratones donantes inmunizados. No hubo
diferencias entre el receptor transgnico y no transgnicas en los grupos de ratn cuando
recibieron las transferencias de animales donantes no inmunizados.
En contraste con el raton -tipo salvaje, las clulas de los ratones inmunizados se alojaron
en el hgado de los ratones transgnicos segn lo demostrado por un triple aumento en la
ambos CD4 + y CD8 + de las clulas T en comparacin con los otros grupos de ratones
receptores (Figura 8). Esto puede indicar un mecanismo de captura o autoguiados hacia
el blanco para las clulas T en los higados de los animales transgnicos debido a la
expresin dominante de laTransgen de VHC.
Por otra parte, los ratones transgnicos que recibieron clulas de donantes no
inmunizados demostraron pocas clulas etiquyetadas CFSE en el hgado y no hay
infiltracin de clulas en las seccines heptica (figura10A, b).
Discusin
En nuestro estudio anterior, mostramos un modelo de ratn HCV transgnicos con
expresin de protenas VHC estructurales (core, E1 y E2) en el hgado [17]. Estos
ratones transgnicos desarrollados formacin de esteatosis, hepatopata y tumores del
hgado debido a la expresin de la protena del VHC.
En este estudio,describimos una transferencia adoptiva de esplenocitos de ratones
inmunizado con VHC a ratones transgnicos de VHC. Como se mostr anteriormente [18]
as como como en este estudio, los ratones inmunizados con una combinacin de una
vacuna HCV de candidato de recombinante Plsmido de DNA de ncleo/E1/E2 HCV,
recombinante poliprotena del VHC y montanide demuestran una respuesta inmune
antiviral significativa humoral y celular.
Hay fuerte evidencia de la importancia de ambos CD4 virus especficos + y CD8 + Clulas
de T en VHC remocin de virus, as como mediadores de dao celular heptico en la
infeccin de la hepatitis crnica C [20,21]. Los dos principales mecanismos de lisis
mediada por clulas T son perforina-granzima - Citotoxicidad mediada y Citotoxicidad
mediada por Fas. Ambos mecanismos pueden matar directamente las clulas infectadas.
El sistema Fas Fas ligando se piensa asociado a la muerte de la hepatocitos en pacientes
infectados crnicamente con hepatitis C virus. [23,24]. Los linfocitos infiltrantes de hgado
expresan Ligando de FAS que se unir con el receptor Fas en la superficie de hepatocitos
y se iniciara uan muerte mediada por Fas.
En estudios previos se ha demostrado las clulas T CD8 + pueden matar a los objetivos
en vivo por citlisis mediante por perforina y TNF- o requieren IFN- g. Hay varios
modelos experimentales de dao heptico inmune-mediado en la hepatitis crnica.
Modelos de transferencia adoptiva a animales transgnicos expresando HBV ha sido
descrito previamente.
Estos ratones desarrollan tolerancia las protenas codificadas por el virus, pero la infusin
de celuals no tolerantes puede causar inflamacin del hgado. A pesar de algunos
estudios in vitro mostraron que las pptidos VHC estructural, core y protenas E2, fueron
capaces de causar inmunosupresin [28-30], no existe evidencia que muestra que ratones
transgnicos que expresaban core VHC, E1 y las protenas E2 tienen inmunosupresin
global.
Conclusiones
Hemos sido capaces de transferir clulas T no tolerantes en ratones transgnicos que
expresan el transgn de VHC en los hepatocitos. La transferencia resulta en una rpida y
selectiva acumulacin de clulas T activadas en el hgado de los ratones transgnicos,
pero no el bazo o los ganglios linfticos.
En este estudio no estudiamos el destino de la clulas transferidas; sin embargo, parece
ser que estas clulas tienen el potencial de tener un efecto antiviral con inflamacin del
hgado y, por consiguiente ms lesiones graves.
Por otra parte, sugerimos que la transferencia adoptiva de esplenocitos de ratones
inmunizado con VHC en Ratones transgnicos HCV es un buen modelo para el estudio de
los mecanismos de lesin heptica en la hepatitis crnica por hepatitis C. Este estudio
puede ayudar potencialmente a la desarrollo de una estrategia de inmunoterapia para el
VHC.