Inmuno Practicas

E.
P Medicina Humana UCSM
Gua Prctica de Inmunologa
PRACTICA IV
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LINFOCITOS Y
NEUTROFILOS HUMANOS
I. INTRODUCCIN
La densidad de una clula es la principal caracterstica fsica que es
usada para la purificacin y separacin de poblaciones celulares por
medio de centrifugacin isopicnica. La densidad refleja la composicin
qumica promedio de una clula mas que su tamao o alguna
caracterstica de su superficie. Los principales componentes celulares
difieren sustancialmente en sus densidades. Sin embargo, ya que
muchas clulas tienen similares proporciones de estos componentes, el
rango de densidad de las clulas es relativamente estrecho. La
separacin es conseguida simplemente por centrifugacin de una clula
con la suficiente fuerza
centrfuga y por un periodo
de tiempo
suficiente para que alcance su densidad isopicnica en la gradiente, que

se define como la localizacin en la gradiente donde la densidad de la
clula es la misma que la densidad de la gradiente.
Este mtodo es simple y rpido y toma ventajas de las diferencias de
densidad entre las clulas mononucleares, polimorfonucleares y otras
clulas encontrados en la sangre. Primero las clulas son sedimentadas
en dextrano y luego hay una separacin diferencial en una gradiente de
densidad discontinua de ficollhypaque. En el dextrano los eritrocitos
forman roulex y de este modo sedimentan ms rpidamente que los
granulocitos En el ficollhypaque las clulas mononucleares y plaquetas
son colectadas en la parte superior de la capa de, debido a que estas
clulas
tiene
una
baja
densidad.
En
contraste
los
granulocitos
E.P Medicina Humana UCSM
(neutrfilos) tienen una densidad mayor que el
ficollhypaque y son
colectados en la parte inferior de la capa ficollhypaque las plaquetas

son separadas de las clulas mononucleares por subsecuentes pasos de
lavados y centrifugacin
II. OBJETIVOS
- Aislar linfocitos y neutrfilos humanos utilizando dextrano y una
gradiente de densidad con ficollhypaque
- Cultivar linfocitos y neutrfilos humanos en medio de cultivo RPMI
1640
III. REACTIVOS Y MATERIALES
a) Materiales
-
Tubos de centrifuga de 15ml (falcon)
Centrfuga
Micropipetas
Tubos eppendofts
Hemocitometro
b) Reactivos
-
Ficoll hypaque
dextrano
medio de cultivo RPMI 1640
PBS
Sangre con anticoagulante ( EDTA )
Azul de trypan
NaCl 1,8 %
IV. PROCEDIMIENTO
A. Obtencin de la Sangre
1. Colectar 20ml de sangre en tubos de vidrio
con
anticoagulante (EDTA)
2. Mezclar bien la sangre con el anticoagulante.
B. Sedimentacin en dextrano
1. Anadir 2.5 ml de dextrano al 10% por cada 20ml de sangre
2. Mezclar suavemente por inversin 10 veces
3. Dejar sedimentar durante ~40 minutos en posicin vertical
4. Recuperar la capa superior (sobrenadante) y colocarla sobre
el ficollhypaque, La relacin Ficoll sobrenadante debe ser
1:2.
C. Preparacin de la gradiente de densidad con ficoll
hypaque
1.
Colocar 5 ml de ficollhypaque en un tubo de falcon
2.
Colocar lentamente 10 ml del sobrenadante obtenido en la

etapa anterior, sobre el ficollhypaque evitando la mezcla de
ambas soluciones
D.
Separacin de las clulas
1.
Centrifugar a 2000 rpm durante 20 min ( 200 C )
2.
Retirar los tubos de la centrfuga lentamente evitando

mezclar las fases
3.
Colectar la interfase de leucocitos mononucleares ubicada

entre la capa de ficollhypaque y la capa de plasma
transferirla a un nuevo tubo falcon

4.
Luego colectar el pecipitado, conteniendo los neutrfilos,

ubicado por debajo de la capa de ficollhypaque y transferirlo a
un nuevo tubo falcon
3.
Agregar 10ml de PBS
4.
Centrifugar a 2000 rpm durante 4 min Si el pellet esta

contaminado realizar um shock osmtico
5.
Eliminar el sobrenadante y Resuspender el precipitado

celular en 1-2 ml de medio de cultivo completo (RPMI 1640 )
con suero humano AB+ AL 10 %, penicilina 100 u / ml,
estreptonicina 100 g / ml
6.
Contar las clulas y determinar la viabilidad celular por el

mtodo de azul de trypan.
E. Cultivo primario de linfocitos y neutrofilos
1. Colocar 3 x 106 clulas ( 1 x106 clulas 1 cm2 ) en placas de

cultivo de 60 mm. de dimetro con 4 ml de
medio de cultivo
completo
2. Incubar las clulas a 370 C con 5 % de CO2 95 % de humedad
V. RESULTADOS
1.
Esquematice el procedimiento de aislamiento y cultivo

de linfocitos y neutrofilos humanos
2.
Determinar la viabilidad y el numero
de linfocitos y
neutrofilos humanos obtenidos por mililitro

VI. CUESTIONARIO
1.
Indique el fundamento del aislamiento de linfocitos y neutrofilos

humanos con ficollhypaque.
2.
Qu caractersticas fsicas de las clulas de la sangre permiten

la distribucin de las clulas de la sangre en distintos capas?.
3.
Qu es una gradiente de densidad?
4.
indique los tipos de linfocitos que se encuentran en la sangre
5.
Qu es una centrifugacion isopicnica?
6.
Indique que otros medios de densidad se puede utilizar para la

separacion de linfocitos?
7.
Indique cual es la composicin del medio de Cultivo RPMI-1640

en indique la importancia de sus componetes
8.
Porque se utiliza CO2 en el cultivo de Clulas animales o

humanas cual es su funcion? Que buffer se puede emplear en vez del
CO2?
Informe 2
Obtencin de clulas del sistema

inmunolgico a partir de rganos linfoides
I. Introduccin
Para muchas pruebas inmunolgicas in vitro se requieren preparaciones purificadas o
enriquecidas de linfocitos de la sangre perifrica. Algunos ejemplos son la enumeracin
o recuento de linfocitos T y B por mtodos manuales, las pruebas de respuesta
proliferativa hacia mitgenos en cultivo, la determinacin de antgenos HLA, la
respuesta al cultivo mixto de linfocitos, y otros procedimientos de utilidad tanto en el
laboratorio clnico de rutina como en el de investigacin. Las primeras tcnicas
empleadas para aislar los linfocitos sanguneos consistan en mezclar la muestra con un
agente aglutinante de eritrocitos, con el fin de que estos se separaran debido a la
sedimentacin de los grumos. Sin embargo, estas tcnicas son lentas, dan un bajo
rendimiento final y una baja pureza. Posteriormente se desarrollaron las tcnicas de
centrifugacin en gradientes. Byum (1958) ide un mtodo basado en la centrifugacin
de la muestra sobre un gradiente de densidad discontinuo, cuyo medio original consista

en una mezcla de ficoll y metrizoato de sodio, con densidad de 1,077 g/ml. Este mtodo
es rpido y simple, por lo que se utiliza muy comunmente para obtener preparaciones
enriquecidas de linfocitos sanguneos. Aunque estrictamente esta tcnica resulta en la
separacin de los leucocitos mononucleares, que incluyen tanto a los linfocitos como a
los monocitos, los primeros superan ampliamente en nmero a los segundos, cuando se
trabaja con muestras de sangre perifrica.
II.
Metodologa
1. Extrajimos los tejidos linfoides (medula sea, bazo y timo) de una rata joven entre
2-3 meses de edad (Anexo1)
2. Trituramos con una pinza y bistur los tejidos linfoides y los mezclamos con suero
fisiolgico (Anexo2)
3. Una vez que tuvimos bien triturados e integrados los tejidos retiramos las impureza
y lo pasamos a un tubo falcn para centrifugarlo
4. Centrifugamos a 300rpm por 15 min
5. Tras la centrifugacin obtuvimos dos fases: El pellet celular y el sobrenadante o

suero. (Anexo3)
6. Decantamos el suero y conservamos las clulas (Anexo4)

7. Al pellet celular le aadimos el medio de cultivo que es la sustancia que mantiene la
integridad celular (Anexo5)
8. Aadimos 20ul a la cmara de Nuebauer he hicimos el conteo celular (Anexo6)

9. De la mezcla de pellet y medio de cultivo retiramos 50ul y esto le aadimos 50ul de
azul de tripan para evaluar la viabilidad celular (Anexo7)
10. Finalmente sacamos 2ul de la nueva muestra y he hicimos la determinacin de la

viabilidad celular (Anexo8)
III. Resultados
Conteo celular
Medula sea
- Conteo celular
Recuento de clulas por mm3 : 400
# de clulas: 40050= 20 000 cel/mm3
- Viabilidad celular : No se alcanz a terminar la practica
Bazo
- Conteo celular
# de clulas: 868100= 868 000 cel/mm3
- Viabilidad celular: No se alcanz a terminar la practica
Timo
Conteo celular
# de clulas: 1275100= 1275 000 cel/mm3
Viabilidad celular
V: 622
NoV: 91
Total: 713
Viabilidad: 87.2%
Esquema de los rganos linfoides utilizados
Esquema del procedimiento de aislamiento de clulas a partir de medula

sea, timo y bazo
IV. Conclusiones
La importancia de la verificacin de viabilidad de clulas en el bazo es
fundamental para permitir observar si es que su funcin inmunitaria est
funcionando como debera, pues contribuye con la hematopoyesis. Es
adems un importante rgano en la inmunidad humoral y celular. La
presencia de muchas clulas del bazo o la ausencia de ellas y su
viabilidad sirven para determinar mtodos efectivos de diagnstico a
posibles patologas que pueda o no tener.
De la misma manera con el timo, que ejerce una influencia en el

desarrollo y maduracin del sistema linftico, por ende, de la respuesta
inmunitaria defensiva del organismo, pero principalmente se le conoce
porque all es donde maduran los linfocitos T que salieron originalmente
de la medula sea.
Hacindole los exmenes hechos se puede observar que tan es ese timo
extrado y si es que sus recuentos celulares eran los adecuados para un
rat winstar de mximo 3 meses.
La medula sea es atentada por infecciones, que ocasionan un

decremento en la produccin de clulas sanguneas y plaquetas;
mediante un recuento celular y viabilidad de una extraccin de la misma
se puede diagnosticar dicha y otras enfermedades que afecten a la
medula sea.
V. Bibliografa
http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/histologia/sistema_inmunitario.pdf
VI. Cuestionario
1. Indique cuales son los rganos linfoides primarios y secundarios
rganos primarios
Como rganos primarios tenemos al timo, donde maduran los linfocitos T, y la mdula
sea, sitio de linfopoyesis y maduracin de los linfocitos B. En etapas tempranas del
desarrollo fetal, el hgado asume estas funciones, aunque paulatinamente se ve
sustituido por la mdula el cual es el otro rgano primario que por su importancia en
la hematopoyesis.
rganos secundarios
Los rganos secundarios estn representados por el bazo, el cual procesa los
antgenos que transitan en la sangre, los ganglios linfticos que lo hacen de los
existentes en los tejidos y por ltimo tenemos el tejido linfoide asociado a mucosa,
que se encarga de realizar esta funcin en las mucosas de los rganos como el
pulmn, las vas digestivas y el tracto urinario. Tambin se debe de tener en cuenta
que en la respuesta secundaria la mdula sea se comporta como un rgano
secundario.
2. Mencione cual es la funcin de los rganos linfoides en la respuesta inmunitaria
Los rganos linfoides son los responsables de la formacin de los linfocitos. En
los ganglios linfticos se filtra la linfa y se le aaden los anticuerpos. El bazo
filtra y aade anticuerpos a sangre. En el bazo tambin se destruyen las clulas
sanguneas viejas. En los agregados linfoides, sean o no encapsulados, situados
en el tejido conjuntivo se filtra el lquido tisular y se producen anticuerpos. La
funcin del timo es nicamente la de producir y madurar los linfocitos T.
3. Cul es la estructura del timo y qu importancia tiene desde el punto de vista
Inmunolgico
El timo es una estructura de dos lbulos que se coloca en la cavidad superior del
pecho, que se extiende
parcialmente dentro de la
regin
del
cuello.
La
importancia
inmunolgica
del timo radica en que da
hogar a los linfocitos T para
que lleven a cabo su
maduracin en la cual se
diferenciaran en distintos
subtipos que cumplirn
diferentes funciones.
4. Comente la relacin estructura-funcin

del bazo en la respuesta inmunolgica
El bazo es el mayor de los rganos
linfticos,
estando
peritonizado,
inmunolgicamente es un importante rgano en la inmunidad humoral y celular:

Los antgenos son filtrados desde la sangre circulante y se transportan a los
centros germinales del rgano, donde se sintetiza inmunoglobulina M, potente
opsonizador que provoca lisis bacteriana, envueltas vricas
5. Explique el fundamento del Mtodo de exclusin del Azul de Trypan

El azul de tripano, azul de tripn o azul tripn es un colorante azoico que se
utiliza en tinciones histolgicas para ensayos de viabilidad que permiten
diferenciar clulas vivas de clulas muertas.
Las clulas vivas o tejidos con la membrana celular intacta no se colorean
debido a que la membrana celular es selectiva respecto a qu compuestos
pueden atravesarla. En las clulas viables, con membrana intacta, no se
incorpora el azul de tripano; por el contrario, s atraviesa la membrana de las
clulas muertas. Por lo tanto, las clulas muertas se muestran de un distintivo
color azul bajo el microscopio.
VII. Anexos
1.
Procedimiento: Extraccin de tejidos (Timo)
2. Procedimiento: Trituracin del tejido linfoide y suero fisiolgico
3. Procedimiento: Fases obtenidas en la centrifugacin
4. Procedimiento: Decantacin de suero
5. Procedimiento: Medio de cultivo con pellet celular
6. Procedimiento: Conteo celular
7. Procedimiento: Azul de tripan y pellet celular
8. Procedimiento: Viabilidad celular al microscopio
PRACTICA V
INMUNOAGLUTINACION
DETERMINACION DEL FACTOR REUMATOIDEO (FR)
I. OBJETIVO
- Conocer el fundamento de la tcnica de Inmunoaglutinacion y sus
aplicaciones en el diagnostico medico.
- Determinar el Factor Reumatoideo en suero, utilizando la tcnica de
Inmunoaglutinacin.
II.INTRODUCCION
La artritis reumatoidea es un sndrome crnico de etiologa desconocida,
caracterizado por una inflamacin inespecfica y generalmente simtrica
de las articulaciones, que a veces evoluciona hacia la destruccin de las
estructuras articulares y periarticulares.
En la articulacin enferma se observa un engrosamiento de la
membrana sinovial con formacin de pliegues y proliferacin de
linfocitos. Estas clulas, que forman folculos linfoides, son las
responsables de la sntesis de factores reumatoideos (FR) y otras
inmunoglobulinas.
Los FR son generalmente de tipo IgM anti-IgG, es decir que reaccionan
con las fracciones Fc de las IgG. Tambin se han encontrado FR de tipo
IgG, aunque en menor proporcin de casos.
Los FR de tipo IgM estn presentes en el 85-90% de los adultos con
artritis reumatoidea aunque no es especfico de la enfermedad puesto
que tambin se han encontrado en individuos sanos (en un 3 a 5% de
los casos).
Por tal motivo, cuando se sospecha la existencia de una enfermedad
distinta de la artritis reumatoidea, frente a una reaccin de aglutinacin
positiva es aconsejable realizar la precipitacin de las globulinas con
sulfato de amonio. De tal forma, se asegura la precipitacin completa de
los FR y se mantiene en solucin cualquier aglutinina responsable de
una falsa reaccin positiva, como as tambin algn posible inhibidor.
III. FUNDAMENTO DEL METODO

La prueba rpida de latex esta basada en una reaccin inmunolgica
entre el Factor Reumatoideo (FR) presente en el suero problema y la
correspondiente IgG humana ligada a partculas de poliestireno.
Cuando se mezcla el suero problema conteniendo el Factor
reumatoideo con el reactivo RF latex, se puede visualizar una
aglutinacin.
IV. REACTIVOS Y MATERIALES
a)Reactivos
- LATEX RF : Suspensin de partculas de latex sensibilizadas con IgG
humano en buffer salino de glicina.
- BUFFER SALINO: Solucin salina fisiolgica (NaClO, 9%). Listo para
usar.
- CONTROL POSITIVO: Suero Humano prediluido y estabilizado
conteniendo RF que aglutina con el reactivo latex.
- CONTROL NEGATIVO: Suero Humano prediluido y estabilizado, no
reactivo en el test de aglutinacin.
- Solucion fisiolgica.
b)Materiales
-
Muestra de Sangre
Tubos Vacutainer Seco (Tapa roja)
Algodn
Etanol al 70%
Ligadura
Jeringas de 3 cc
Descartador de punzocortantes
Timer
Fuente de luz
Micropipetas Automticas de 20ul, 200ul a 1000ul.
Tips para micropipetas de 20ul, 200ul a 1000ul
01 placa de fondo oscuro con 3 o 6 reas de reaccin.
Varillas mezcladoras
V. METODOLOGIA
A. Recoleccin de la Muestra
- Extraer la muestra de sangre por Venopuncin del antebrazo,
tomndose todas las medidas de Bioseguridad en la obtencin de
la muestra.
- Recolectar 3ml de Sangre con la ayuda de una jeringa.

- Depositar la muestra dentro del tubo seco (tapa roja), centrifugar y
separar la sangre del suero.
VI.DESARROLLO
A.Mtodo Cualitativo en Placa
1. Dejar que los reactivos y muestras alcancen la temperatura
ambiente.
2. Poner 20ul del suero en las reas marcadas en la lmina.
3. Colocar 20ul del suero control positivo (+) y negativo (-) en las
reas marcadas de la lamina.
4. Mezclar el reactivo de latex FR hasta obtener una suspensin
homognea y aadir 20ul de reactivo de latex a cada uno de los
sueros controles y muestras.
5. Mezclar con aplicadores diferentes por cada rea.
6. Mover en un ngulo de 45 la laminilla por 3 minutos.
7. Observar inmediatamente la aglutinacin utilizando una fuente de
luz directa, comparar las reacciones del suero y de los controles.
Interpretacin:
La aglutinacin de las partculas de latex indica una reaccin
positiva (+). Si es asi, realizar la prueba Semicuantitativa.
La No aglutinacin o una ligera aparicin de granulosidad que
no exceda a la observada en el control negativo (-), indica un
resultado (-).
B.Mtodo Semicuantitativo o Titulacin
Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas,
en 6 tubos de ensayo.
1. Colocar 100ul de solucin Fisiologica en cada uno de los tubos.
2. Agregar 100ul de suero al tubo N 1 y homogenizar
cuidadosamente. Transferir 100ul de esta dilucin al tubo N 2 y
homogenizar, continuando de esta forma las diluciones hasta el
ultimo tubo.
Las diluciones asi obtenidas equivalen a : 1: 2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32,
1:64.
3. Transferir 20ul de cada tubo y proceder de acuerdo a la prueba
Cualitativa.
Interpretacin de los Resultados
Negativo: Suspensin homognea (sin aglutinacin)

Positivo: Aglutinacin que aparece dentro de los 2 minutos
Titulo: Es la inversa de la mxima dilucin a la que se produce
aglutinacin visble macroscpicamente.
La concentracin del Factor Reumatoideo en la muestra

puede ser calculada con la siguiente formula:
FR (IU/ml) = Titulo x Sensibilidad de la reaccin (8 IU/ml)

Nota: La sensibilidad del reactivo es de 8 IU/ml.
VII.
CUESTIONARIO
1. Define que es Factor Reumatoideo.
2. Por qu no es aconsejable trabajar con sueros con alto contenido
de lpidos, o que el plasma tenga fibrina?
3. Por qu la artritis reumatoide se considera una enfermedad
autoinmune?
4. Calcular la Titulacin de una muestra positiva para FR, teniendo
positividad en la dilucin 1:8
Informe 2
VIII. Introduccin
El Sistema inmune est conformado por una serie de rganos, tejidos y clulas
esparcidas de manera amplia por todo el cuerpo. Desde el punto de vista de sus
caractersticas estructurales podemos encontrar rganos macizos como el timo, el
bazo y los ganglios linfticos y estructuras tubulares como los vasos linfticos que se
encuentra intercomunicando algunos de los rganos mencionados anteriormente. Si se
toma en cuenta las funciones que realizan, entonces se pueden clasificar dichos
rganos en primarios y secundarios. En los primeros tienen lugar la generacin de las
clulas que conforman al sistema inmune (linfopoyesis) y adems existe un
microambiente idneo de modo que los linfocitos adquieren su repertorio de receptores
especficos para cada tipo de antgeno. Mientras que los segundos se encargan de
hospedar las clulas capacitadas funcionalmente para interactuar con microorganismo o
antgeno, atrapados por estos rganos, en un entorno adecuado para que las mismas
interacten con dichos agentes extraos al organismo y los eliminen.
Como ya habamos dicho anteriormente, estos rganos estn interconectados por vasos
sanguneos y vasos linfticos, de forma tal que se constituye un sistema unitario,
entrelazado y bien comunicado. Estos vasos transportan las clulas del sistema inmune,
de las cuales el actor principal es el linfocito.
IX.
Metodologa
fisiolgico (Anexo2)

suero. (Anexo3)


X. Resultados
Conteo celular
Medula sea
- Conteo celular
# de clulas: 40050= 20 000 cel/mm3
Bazo
- Conteo celular
# de clulas: 868100= 868 000 cel/mm3
Timo
Conteo celular
# de clulas: 1275100= 1275 000 cel/mm3
Viabilidad celular
V: 622
NoV: 91
Total: 713
Viabilidad: 87.2%

sea, timo y bazo
XI. Conclusiones

de la medula sea.

medula sea.
XII. Bibliografa
XIII. Cuestionario
rganos primarios
la hematopoyesis.
rganos secundarios
secundario.
7. Mencione cual es la funcin de los rganos linfoides en la respuesta inmunitaria
8. Cul es la estructura del timo y qu importancia tiene desde el punto de vista
Inmunolgico
regin
del
cuello.
La
importancia
inmunolgica
9. Comente la relacin estructura-funcin

linfticos,
estando
peritonizado,

10.Explique el fundamento del Mtodo de exclusin del Azul de Trypan

XIV. Anexos
9. Procedimiento: Extraccin de tejidos (Timo)
PRCTICA VI
INMUNOPRECIPITACION:
DETECCION SEROLOGICA DE SIFILIS
I. INTRODUCCION
Para detectar la presencia de algunas enfermedades infecciosas se
utilizan
pruebas
inmunolgicas
basadas
en
reacciones
de
inmunoprecipitacion, en las cuales el antgeno que se utiliza es soluble;
tal es el caso de la determinacin de anticuerpos frente a la cardiolipina
para realizar el diagnostico de sfilis (prueba no treponemica).
II.DETECCION DE SIFILIS
La sfilis es una enfermedad venrea causada por el Treponema
pallidum, que invade las mucosas intactas o la piel en areas de
abrasiones. El contacto sexual es la forma mas comn de transmisin.
La deteccin y tratamiento de la enfermedad en sus estadios tempranos
es fundamental a fin de evitar complicaciones graves como sfilis
cardiovascular, neurosifilis y sfilis congnita.
El diagnostico de esta enfermedad sufre la carencia de un mtodo para

cultivar el microorganismo en medios de laboratorio y la dificultad para
detectarlo en estadios de la enfermedad en los que no se observan
lesiones epidrmicas. Sin embargo, desde el comienzo de la infeccin
aparecen en el suero del individuo infectado ciertas sustancias
denominadas reaginas, que reaccionan con antgenos de cardiolipina,
lecitina y colesterol. Estas reaginas junto a los signos clnicos son por lo
tanto los procedimientos mas rpidos y tiles
disponibles para
diagnostico de sfilis.
En la prueba rpida para reaginas plasmticas (RPR), las reaginas
presentes en el suero de individuos infectados con Treponema pallidium,
se detectan por accin de las mismas con antgeno de cardiolipina,
lecitina y colesterol adsorbido sobre partculas de carbn. La reaccin
produce una aglutinacin visible macroscpicamente, favorecida por las
partculas de carbn. Las reacciones inespecficas se evitan con el
empleo de antgeno altamente purificado y el agregado de cloruro de
colina, por lo que no es necesario inactivar la muestra.
III. MATERIALES Y REACTIVOS

a. Materiales
- Muestra de Suero o Plasma.
- Dosificador de Plastico.
- Aguja Dosificadora.
- Cartulinas o Placas de Reaccion, desechable.
- Dispensadores-espatula (50ul) desechable.
a. Reactivos
-
Antigeno RPR Carbon, que contiene:

Cardiolipina
0.003%
Lecitina
0.022%
Colesterol
0.09%
Cloruro de Colina
Carbon
10.0%
0.02%
EDTA 0.0125M
Na2HPO4 0.01M
KH2PO4 0.01M
Control Positivo (Suero de origen humano, reactivo frente al

antigenoRPR Carbon)
Control Negativo (Mezcla de sueros de origen animal, no reactivos.
IV. DESARROLLO
1.
Tecnica Cualitativa:
1. Llevar los reactivos y muestras a temperatura ambienteantes
de practicar la determinacin.
2. Agitar la suspensin de ANtigeno RPR Carbon y abrir el vial. Con
el dosificador de plstico, provisto de la aguja, aspirar por
depresin el contenido y agitar la suspensin.
3. En uno de los crculos de reaccin aadir una gota de muestra
(50ul) con la ayuda del dispensador esptula. Seguidamente
adicionar una gota del antgeno (aprox. 20ul)
4. Mezclar y balancear la tarjeta con la ayuda de un agitador
rotativo durante 8 min.
B.Tecnica Semicuantitativa
Los sueros positivos pueden titularse efectuando diluciones seriadas,
en 6 tubos de ensayo.
1. Colocar 100ul de solucin Fisiolgica en cada uno de los tubos.
2. Agregar 100ul de suero al tubo N 1 y homogenizar

cuidadosamente. Transferir 100ul de esta dilucin al tubo N 2 y
homogenizar, continuando de esta forma las diluciones hasta el
ultimo tubo.
Las diluciones asi obtenidas equivalen a : 1: 2, 1:4, 1:8, 1:16,
1:32, 1:64.
3. Transferir 20ul de cada tubo y proceder de acuerdo a la prueba
Cualitativa.
Interpretacin de los Resultados

Negativo: Suspensin homognea (sin aglutinacin)
Positivo: Aglutinacin que aparece dentro de los 2 minutos
Titulo: Es la inversa de la mxima dilucin a la que se
produce aglutinacin visible macroscpicamente.
V. CUESTIONARIO
1. Qu diferencia existe entre las reacciones de RPR y VDRL?
2. Qu son las Reaginas?
3. Por qu en la prueba de RPR, el suero no debe de tratarse
trmicamente?
4. Cuntos tipos de pruebas existen para determinar la sfilis?
5. A que se refiere el fenmeno de prozona en la prueba de RPR?
Informe 2
XV. Introduccin
XVI.
Metodologa
fisiolgico (Anexo2)

suero. (Anexo3)


XVII. Resultados
Conteo celular
Medula sea
- Conteo celular
# de clulas: 40050= 20 000 cel/mm3
Bazo
- Conteo celular
# de clulas: 868100= 868 000 cel/mm3
Timo
Conteo celular
# de clulas: 1275100= 1275 000 cel/mm3
Viabilidad celular
V: 622
NoV: 91
Total: 713
Viabilidad: 87.2%

sea, timo y bazo
XVIII. Conclusiones

de la medula sea.

medula sea.
XIX. Bibliografa
XX. Cuestionario
rganos primarios
la hematopoyesis.
rganos secundarios
secundario.
12.Mencione cual es la funcin de los rganos linfoides en la respuesta inmunitaria
13.Cul es la estructura del timo y qu importancia tiene desde el punto de vista
Inmunolgico
regin
del
cuello.
La
importancia
inmunolgica
14.Comente la relacin estructura-funcin

linfticos,
estando
peritonizado,


XXI. Anexos
24. Procedimiento: Viabilidad celular al microscopi
PRACTICA VII
MODELO DE INFLAMACION IN VIVO: EDEMA
PLANTAR EN RATA INDUCIDO POR CARRAGENINA
I. INTRODUCCIN
El proceso inflamatorio es complejo e involucra una serie de
fenmenos que pueden ser desencadenados por varios estmulos,
entre los que se incluyen factores endgenos (necrosis tisular o rotura
sea) o factores exgenos como lesiones por agentes mecnicos
(corte), fsicos (quemaduras, radiaciones, fro, calor), qumicos
(corrosivos, venenos, toxinas), biolgicos (bacterias, virus, parsitos,
hongos) e inmunolgicos (reacciones de hipersensibilidad)
El mismo tiene lugar en el tejido conjuntivo vascularizado e implica
cambios vasculares, eventos celulares, y la produccin de mediadores
qumicos de la inflamacin. Todos estos componentes del sistema,
estn estrechamente vinculados. En el proceso inflamatorio despus
de una breve contraccin de las arteriolas se produce vasodilatacin
que es la causa del aumento de flujo sanguneo que a su vez es causa
de rubor y calor, y un incremento de la permeabilidad vascular. Como
consecuencia de estos eventos vasculares se torna lenta la circulacin
que hace que los leucocitos se dirijan hacia la periferia, proceso
conocido como marginacin.
Estos leucocitos se sitan sobre el endotelio vascular, lo que se
conoce como rodamiento, se produce la adhesin leucocitaria y
posteriormente, la trasmigracin que es el proceso mediante el cual
los leucocitos (fundamentalmente neutrfilos en la inflamacin aguda)
abandonan la circulacin mediante diapdesis.
Una vez fuera del sistema vascular se produce el fenmeno de
quimiotaxis, migrando los leucocitos hacia la zona de lesin. Los
factores quimiotcticos pueden ser exgenos o endgenos. Entre los
exgenos estn los productos bacterianos como los pptidos; entre los
endgenos estn los componentes del complemento, productos de
lipoxigenasa y las citoquinas.
En la zona de lesin, diversos factores favorecen la activacin
leucocitaria como las sustancias quimiotcticas en concentraciones
elevadas, la fagocitosis y complejos antgeno-anticuerpo. La
activacin leucocitaria se caracteriza por la produccin de metabolitos
del cido araquidnico (AA) debido al incremento de la actividad de

fosfolipasa A2 (FLA2) por diacilglicerol (DAG) y calcio, generacin de
especies reactivas del oxgeno (ERO) y liberacin del contenido
lisosomal a causa de la lisis celular, lo cual conduce al dao celular y
tisular.
EDEMA PLANTAR EN RATA INDUCIDO POR CARRAGENINA
Los modelos in vivo para la investigacin de la actividad

antiinflamatoria tienen como base para el ensayo los sntomas de
la inflamacin, siendo el ms frecuentemente utilizado el edema.
En estos modelos, la mayora de veces solamente nos permite
llegar a determinar la actividad ms no el mecanismo implicado
en el proceso antiinflamatorio que presenta el compuesto a
investigar, pero son de gran importancia ya que nos permiten
hacer un evaluacin de esta actividad y puede ser el punto de
partida para la investigacin de nuevos compuestos capaces de
interferir en el proceso inflamatorio.
El mtodo de edema plantar inducido por carragenina consiste en
la administracin subcutnea de una solucin de carragenina a
nivel de la aponeurosis plantar de la rata, provocando una
reaccin de carcter inflamatorio mediada por la liberacin de
diversos
autacoides
(histamina,
serotonina,
bradicinina,
prostaglandinas) adems diversos factores del complemento que
estn implicados en la amplificacin de la respuesta. El producto
a ensayar se puede administrar va intraperitoneal, oral, etc.
Una hora despus de la administracin de la sustancia problema,
la histamina y la serotonina tienen un papel principal como
mediadores. De una hora y media a dos y media horas despus
de la inyeccin de carragenina, intervienen las cininas como
mediadores. La ltima fase esta mediada por prostaglandinas
(PGE1 y PGE2, PGF2).
La respuesta vascular mxima ocurre aproximadamente a las 4
horas de la administracin de carragenina y coincide con la fase
mediada por las prostaglandinas. La extravasacin de protenas
ocurre durante toda la respuesta al agente edematgeno. La
migracin
celular,
fundamentalmente
leucocitos
polimorfonucleares, comienza a las 2 horas de haberse inyectado
el agente.
Se prefiere la carragenina ante otros irritantes porque el edema
producido esta menos modificado por factores ajenos a los
propiamente caractersticos de la inflamacin y adems, porque

la actividad antiinflamatoria de este ensayo guarda una buena
correlacin con la actividad anti-inflamatoria en clnica.
II. OBJETIVOS
-
Inducir inflamacin in vivo en ratas

Determinar el porcentaje de inflamacin inducida
III. REACTIVOS Y MATERIALES

a) Reactivos
-
Carragenina
Suero fisiologico
NaCl 0.1%
Triton X100
EDTA 5mM
b) Materiales
- Pletismometro
- Micropipetas
- Jeringas 1ml
- Tubos Eppendorf
- Bao maria
IV. PROCEDIMIENTO
A. Preparacin de la solucin de carragenina 2%
1. Pesar 20mg de carragenina y agregar 1ml de suero fisiolgico
2. Disolver la carragenina calentando la solucin a 80 oC
B. Induccin de inflamacin
1. Inyectar en la aponeurosis plantar de la pata trasera derecha
de la rata 100ul de la solucin de carragenina al 2%, dejar la
pata izquierda sin inyectar
2. Esperar 1 hora y realizar la medicin del volumen de ambas
patas utilizando el pletismometro.
C. Medicin de la Inflamacin
1. Calibrar el pletismometro con una solucin de NaCl 0.1% y

Triton X100, llevando a 0 ml (cero) el instrumento para luego
colocar una pesa de 3ml en el reservorio de medida y apretar
el botn de calibrado, la pantalla deber mostrar el valor de
3ml, lo cual indica que el instrumento ya esta calibrado Al
retirar la pesa la pantalla deber mostrar 0 ml
2. Introducir primero la pata no inyectada (izquierda) en el
reservorio de medida y anotar la lectura que aparece en la
pantalla
3. Luego introducir la pata inyectada (derecha) en el reservorio de
medida y anotar la lectura que aparece en la pantalla.
C. Calculo del porcentaje de Inflamacin
1. Con las lecturas del pletismometro correspondientes a cada
pata trasera aplicar la siguiente frmula para determinar el
porcentaje de inflamacin
%inflamacin= Vt (pata derecha) Vnt (pata izquierda) X 100
V. RESULTADOS
1. Esquematice los pasos para la induccin de inflamacin in vivo
2. Haga los clculos para determinar el porcentaje de inflamacin hasta las
dos horas
VI. CUESTIONARIO
1. Defina inflamacin aguda y crnica
2. Mencione los principales eventos que ocurren en un proceso
inflamatorio
3. Describa el modelo de edema plantar por carragenina en la pata
de la rata y que ventajas tiene frente a otros modelos
4. Mencione y comente otros modelos para evaluar actividad
inflamatoria in vivo
5. Esquematice el diseo experimental para evaluar la actividad
antiinflamatoria de un flavonoide obtenido a partir del llantn
Informe 2
XXII. Introduccin
XXIII.
Metodologa
fisiolgico (Anexo2)

suero. (Anexo3)


XXIV. Resultados
Conteo celular
Medula sea
- Conteo celular
# de clulas: 40050= 20 000 cel/mm3
Bazo
- Conteo celular
# de clulas: 868100= 868 000 cel/mm3
Timo
Conteo celular
# de clulas: 1275100= 1275 000 cel/mm3
Viabilidad celular
V: 622
NoV: 91
Total: 713
Viabilidad: 87.2%

sea, timo y bazo
XXV. Conclusiones


de la medula sea.

medula sea.
XXVI. Bibliografa
XXVII. Cuestionario
16.Indique cuales son los rganos linfoides primarios y secundarios
rganos primarios
la hematopoyesis.
rganos secundarios
secundario.
17.Mencione cual es la funcin de los rganos linfoides en la respuesta inmunitaria
18.Cul es la estructura del timo y qu importancia tiene desde el punto de vista
Inmunolgico
regin
del
cuello.
La
importancia
inmunolgica
19.Comente la relacin estructura-funcin del bazo en la respuesta inmunolgica

linfticos,
estando
peritonizado,
inmunolgicamente es un importante
rgano en la inmunidad humoral y
celular: Los antgenos son filtrados
desde la sangre circulante y se
transportan a los centros germinales
del rgano, donde se sintetiza
inmunoglobulina
M,
potente
opsonizador
que
provoca
lisis
bacteriana, envueltas vricas

XXVIII. Anexos

Inmuno Practicas

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centrfuga y por un periodo

suficiente para que alcance su densidad isopicnica en la gradiente, que

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(neutrfilos) tienen una densidad mayor que el

colectados en la parte inferior de la capa ficollhypaque las plaquetas

Tubos de centrifuga de 15ml (falcon)

medio de cultivo RPMI 1640

Sangre con anticoagulante ( EDTA )

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Colocar 5 ml de ficollhypaque en un tubo de falcon

Colocar lentamente 10 ml del sobrenadante obtenido en la

Separacin de las clulas

Centrifugar a 2000 rpm durante 20 min ( 200 C )

Retirar los tubos de la centrfuga lentamente evitando

Colectar la interfase de leucocitos mononucleares ubicada

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Luego colectar el pecipitado, conteniendo los neutrfilos,

Agregar 10ml de PBS

Centrifugar a 2000 rpm durante 4 min Si el pellet esta

Eliminar el sobrenadante y Resuspender el precipitado

Contar las clulas y determinar la viabilidad celular por el

E. Cultivo primario de linfocitos y neutrofilos

1. Colocar 3 x 106 clulas ( 1 x106 clulas 1 cm2 ) en placas de

Esquematice el procedimiento de aislamiento y cultivo

Determinar la viabilidad y el numero

neutrofilos humanos obtenidos por mililitro

Indique el fundamento del aislamiento de linfocitos y neutrofilos

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Qu caractersticas fsicas de las clulas de la sangre permiten

Qu es una gradiente de densidad?

indique los tipos de linfocitos que se encuentran en la sangre

Qu es una centrifugacion isopicnica?

Indique que otros medios de densidad se puede utilizar para la

Indique cual es la composicin del medio de Cultivo RPMI-1640

Porque se utiliza CO2 en el cultivo de Clulas animales o

Obtencin de clulas del sistema

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de la muestra sobre un gradiente de densidad discontinuo, cuyo medio original consista

5. Tras la centrifugacin obtuvimos dos fases: El pellet celular y el sobrenadante o

6. Decantamos el suero y conservamos las clulas (Anexo4)

8. Aadimos 20ul a la cmara de Nuebauer he hicimos el conteo celular (Anexo6)

10. Finalmente sacamos 2ul de la nueva muestra y he hicimos la determinacin de la

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Esquema de los rganos linfoides utilizados

Esquema del procedimiento de aislamiento de clulas a partir de medula

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De la misma manera con el timo, que ejerce una influencia en el

La medula sea es atentada por infecciones, que ocasionan un

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4. Comente la relacin estructura-funcin