INSTITUTO DE EDUCACION SUPERIOR NUEVO HORIZONTE

MZA AP 27 Lote 13 al 30 47 Hectreas B Alto Comedero S.S. de Jujuy

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INTRODUCCION AL LABORATORIO
MICROSCOPIA
Objetivos
Conocer las partes, funciones, cuidados, manejo y utilidad del
microscopio ptico compuesto.
Realizacin de preparaciones microscpicas sencillas en fresco.
Introduccin
La microscopa es la ciencia basada en el uso de microscopios para la
observacin de objetos que no pueden ser visualizados a simple vista. El
microscopio (de micro-, pequeo, y scopio, observar) es el instrumento
ms frecuentemente utilizado y el ms til en el Laboratorio de
Microbiologa para el estudio de la morfologa y estructura de los
microorganismos, as como su reaccin a diferentes colorantes, lo cual
junto con otros criterios, permitir su identificacin, por lo tanto, es
importante conocer su adecuado manejo.
Entre los instrumentos pticos conocidos con el nombre de microscopio
se incluyen los llamados microscopios simples o lupas, compuestos por
una sola lente, o un solo sistema de lentes convergentes; y los
microscopios compuestos, cuya parte ptica consta de dos lentes, o dos
sistemas de lentes convergentes: ocular y objetivo.
El microscopio simple da una imagen aumentada, derecha y virtual.
El microscopio compuesto da una imagen aumentada, invertida y
virtual.

Descripcin del Microscopio ptico Compuesto de Campo Claro

En el microscopio distinguimos un sistema ptico, destinado a la
iluminacin y obtencin de una imagen muy aumentada del objeto
examinado; y un sistema mecnico, cuya finalidad es la de sostener
convenientemente los elementos pticos y los preparados que se
examinan.

Microscopio ptico compuesto en el que se indican, mediante nmeros,

sus principales componentes. (1) Ocular; (2) Tubo; (3) Cabezal; (4)
Revolver; (5) Objetivo; (6) Platina; (7) Pinzas para sujetar el
portaobjetos; (8) Condensador; (9) Fuente luminosa con diafragma;
(10) Base o pie; (11) Interruptor; (12) Brazo; (13) Macromtrico; (14)
Micromtrico); (15 y 16) Mandos para de desplazamiento de la platina;
(17) Botn regulador de intensidad.

Sistema Mecnico:
Recibe tambin el nombre de estativo o montura del microscopio.
Base: Soporte sobre el cual se apoya el microscopio.
Brazo: Es un vstago articulado con el base y el brazo.
Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular
y binocular.
Mecanismo de movimiento:
Tornillo de Enfoque (Macromtrico): Acerca o aleja rpidamente el
objetivo a la preparacin para hacer un enfoque aproximado.
Tornillo Micromtrico: Permite enfocar con precisin, moviendo muy
lentamente el objetivo.
Revlver o Portaobjetivos: es una pieza giratoria provista de orificios
en los que se enroscan los objetivos. Al girar el revlver, los objetivos
pasan por el eje del tubo y se colocan en posicin de trabajo, lo que se
nota por el ruido de un pin que lo fija. Es una pieza giratoria provista
de orificios en los que se enroscan los objetivos. Al girar el revlver, los
objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posicin de trabajo,
lo que se nota por el ruido de un pin que lo fija.
Platina: Es la superficie sobre la cual se colocan las preparaciones.
Tiene un orificio en su centro para permitir el paso de la luz. En algunos
microscopios est dotada de un sistema con dos tornillos que permiten
el desplazamiento preciso de la preparacin.
Pinzas: son dos piezas metlicas que sirven para sujetar el objeto. Se
encuentran en la platina.
Tornillo del Condensador Permite subir o bajar el condensador
respecto a la platina para mejorar la iluminacin.

Parte ptica:

Lentes Objetivo: Llamado as porque se halla prximo al objeto a

examinar. Es un sistema de lentes ubicadas en la parte inferior del tubo.
Existen dos tipos de objetivos: los objetivos secos y los objetivos de
inmersin. Los objetivos secos son aquellos en los que entre la lente y el
objeto existe una pequea capa de aire. Los aumentos de los objetivos
secos ms frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X. Los
objetivos de inmersin son aquellos en los cuales se interpone entre Ia
lente y el objeto un liquido (aceite de cedro) el cual tiene un ndice de
refraccin que es semejante al del cristal de la lente. Generalmente,
estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos crculos o
anillos de color negro que rodea su extremo inferior.
Lentes Ocular: Es llamado de sta forma porque se halla prximo al
ojo del observador. Est formado por un sistema de lentes
convergentes. Los microscopios pueden tener dos modelos de oculares:
modelos de un solo ocular (monocular) o modelos con dos oculares
(binoculares). Su funcin es la de aumentar la imagen proyectada por el
objetivo.
Condensador: est formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es
concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparacin,
formando un cono de luz con el mismo ngulo que el del campo del
objetivo. El condensador se sita debajo de la platina y su lente superior
es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en
contacto con la preparacin cuando se usan objetivos de gran abertura
(los de mayor ampliacin). El condensador puede deslizarse
verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo,
bajndose para su uso con objetivos de poca potencia.
Diafragma: el condensador est provisto de un diafragma-iris, que
regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de
manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrndolo
de a poco si se quiere aprovechar la resolucin del sistema ptico.
Fuente luminosa: Es una lmpara que se encuentra al pie del
microscopio. Habitualmente los microscopios la tienen incorporada. En
otros casos, la luz es provista por un foco, que es captada por un espejo
que posee una cara plana y otra cncava, que proyectan el haz de rayos
que iluminan el objeto, dirigindolo hacia el eje ptico.

Formacin de la imagen en el Microscopio

La imagen en un microscopio se forma por Ia transmisin de los rayos
provenientes de una fuente luminosa a travs del objeto. Los rayos
luminosos atraviesan el diafragma, que a manera de iris, delimita el
dimetro del haz lumnico que penetra por el condensador. Este ltimo,
est formado por un sistema de lentes convergentes que concentra y
proyecta el haz lumnico sobre el objeto a examinar, a travs de la
abertura de la platina. El objetivo recoge la luz que atraves el objeto
examinado y proyecta una imagen real, invertida y aumentada que
se forma dentro del tubo y que es recogida por el ocular que es la
segunda lente, la cual forma una imagen virtual, invertida y
aumentada del objeto examinado.

I1

Se tienen dos lentes: Objetivo y ocular y un objeto. Este objeto lanza

un rayo paralelo sobre el lente objetivo que pasa por el foco y un rayo
que pasa por el foco y se refleja paralelo, formando con el choque de
estos 2 rayos la imagen 1, que entra a ser objeto para el lente ocular
(2do lente), esta imagen 1 que es "objeto" refracta un rayo por el centro
del lente y otro rayo paralelo que pasa por el foco formando as con las
prolongaciones de estos rayos la imagen 2, que es la imagen final
observada por nosotros.
Propiedades del microscopio:

Amplificacin:
Es la proporcin entre el tamao de la imagen observada al microscopio
y el tamao real del objeto. El aumento total puede calcularse como el
producto del aumento del ocular por el del objetivo.
Cada lente objetivo lleva inscripto su aumento: 5X, 10X, 40X o 100X.
(el signo X significa aumento).
La imagen aumentada producida por el objetivo, es tomada por el
ocular, y magnificada nuevamente. La imagen definitiva (que es
invertida, respecto a la original) resulta del producto entre el
aumento del objetivo por el aumento del ocular.
Por ejemplo:
Ocular: 10x
objetivo: 40x
Aumento Total: 10x40= 400x

Poder de resolucin (PR):

Es la capacidad de las lentes de distinguir o resolver (mostrar
separados) con nitidez dos puntos situados muy prximos entre s. Se
expresa como la distancia mnima que permite dar una imagen bien
definida de dos puntos, en vez de verlos como uno solo. Cuanto mayor
es el poder de resolucin (PR), menor es la distancia que separa los
puntos entre s sin que estos se confundan. En consecuencia, cuanto
mayor sea el poder resolutivo del objetivo, ms finos sern los detalles
de la preparacin que puedan distinguirse. El ojo humano no puede ver
separados dos puntos cuando su distancia es menor a una dcima de
milmetro; en el microscopio ptico, el poder separador mximo
conseguido es de 0,2 dcimas de micrmetro, y en el microscopio
electrnico, el poder separador llega hasta 10 A.
Poder de resolucin: dimetro de la estructura visible ms pequea:
Longitud de onda / (2 x apertura numrica)

Entonces, cuanto ms corta sea la longitud de onda de la luz empleada,

ms pequea ser la estructura visible; por ejemplo, la luz azul dar una
resolucin mayor que la luz roja.
Sin embargo, puesto que el espectro de la luz visible es relativamente
estrecho, el aumento de la resolucin, disminuyendo la longitud de
onda de la luz empleada, tiene un valor limitado. El mayor aumento en
la resolucin de un microscopio compuesto se consigue aumentando la
apertura numrica. Esta es funcin del dimetro real del objetivo en
relacin con su distancia focal y el poder de desviar el rayo luminoso o
ndice de refraccin del medio que hay entre la muestra y el objetivo.

Microscopios ms usados en los laboratorios microbiolgicos:

Microscopios pticos:
Microscopio de contraste de fase: Este microscopio permite observar
clulas sin colorear, por lo que es muy til para clulas vivas, ya que
como bien sabemos el fijarlas y teirlas implica la muerte de la misma,
lo que adems puede daar o cambiar la estructura. Su fundamento se
basa en el retraso que se produce en las ondas de luz al atravesar
objetos de diferentes ndices de refraccin, aprovechando y amplificando
dichos retrasos. Las diferencias se revelan en forma de distintos grados
de brillos o de oscuridad (un mejor contraste), pudiendo localizarse
estructura dentro de la clula sin teir, que no son visibles en la
microscopia de campo claro.
Microscopio de campo oscuro: Es similar al de campo claro, excepto
que va equipado con un condensador de campo oscuro y una abertura
numrica baja. Esta clase de condensador dirige los rayos de luz dentro
del campo de la muestra, formando un angulo tal, que solo los rayos que
chocan contra el objeto que hay en el campo de la muestra son
refractados (curvados) y penetran en el objetivo. As, el objeto queda
brillantemente iluminado y destaca sobre el fondo oscuro.
Microscopio de fluorescencia: La fluorescencia es la propiedad que
tienen algunas sustancias de emitir luz propia cuando inciden sobre ellas
radiaciones energticas, es decir que el objeto es iluminado con rayos de
una determinada longitud de onda, las molculas la absorben y remiten
luz con una longitud de onda mayor; para una correcta observacin es
necesario colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima de
los objetivos.
Ya que las molculas con la propiedad de fluorescencia son escasas, este
microscopio se utiliza tambin para revelar fluorescencia agregada
como en la deteccin de antgenos o anticuerpos, o cuando se inyectan
molculas fluorescentes en clulas para utilizarlas como marcadores.

Microscopio de barrido confocal: consiste en un microscopio

compuesto al que se le ha aadido un detector fluorescente y una fuente
lser que barre la muestra con un ngulo de incidencia muy pequeo.
Ello produce la excitacin de la muestra en un plano de espesor muy
pequeo por lo que se pueden obtener cortes pticos muy finos de la
muestra (1 m). La luz emitida por los fluorocromos se recoge con un
fotomultiplicador y se almacena y procesa digitalmente utilizando un
ordenador. Todas las imgenes obtenidas se pueden visualizar
individualmente o integrarse informticamente y permiten obtener
imgenes finales en tres dimensiones.
Microscopio de luz ultravioleta: se utiliza para analizar la absorcin
de luz UV por los componentes de la muestra. Permite registrar los
resultados como una fotografa. No permite por supuesto una visin
directa debido a la incapacidad del ojo humano de captar la luz
ultravioleta. Se utiliza para detectar ciertos componentes muy
especficos en las muestras, tales como cidos nucleicos o ciertos
aminocidos.
Microscopio de luz polarizada: Este microscopio se basa en el
diferente comportamiento que presentan ciertos tejidos y estructuras
celulares cuando se utiliza la luz polarizada. La luz se desplaza en
infinitos planos pero al pasar a travs de ciertos prismas polarizadores,
se selecciona un determinado plano de polarizacin. Por otro lado, otros
prismas, analizadores, realizan el proceso contrario convirtiendo la luz
polarizada en normal. El prisma polarizador se encuentra en la lente
condensadora, mientras que el analizador lo est en los oculares. En la
clula existen componentes istropos o monorrefringentes que no
modifican el plano de polarizacin de la luz, mientras que otros
componentes son anistropos o birrefringentes que pueden ser
observados al presentar un alto brillo. Las estructuras birrefringentes
son las que se identifican fcilmente y suelen estar formadas por
molculas alargadas y paralelas entre s. Se pueden observar sustancias
cristalinas y molculas fibrosas.

Microscopios Electrnicos:

El avance trascendental en la Biologa celular lo constituy el

desarrollo del microscopio electrnico. El microscopio electrnico
utiliza en lugar de un haz de luz, haces de electrones de una
longitud de onda (0.05 A).Esta longitud de onda resulta 100.000
veces inferior a la de la luz empleada habitualmente (5500A) y
logra un aumento y resolucin muy superior a la de los
microscopios comunes u pticos y permite estudiar la
ultraestructura o morfologa submicroscpica de la clula.
La microscopa electrnica de transmisin se basa en la dispersin de
electrones que inciden y pasan a travs del objeto de manera que la
imagen refleja la falta de electrones que fueron dispersados.
Es el instrumento indicado para el estudio de la ultraestructura de la
clula, es decir la morfologa detallada de los componentes de la misma.
Esta capacidad es consecuencia de su gran Poder de resolucin, que
resulta de su notable disminucin en la longitud de onda que utiliza.
La microscopa electrnica de barrido (scanning) utiliza los
electrones que se reflejan en la superficie del objeto y producen una
imagen tridimensional.
Una de sus mayores cualidades del ME de barrido es su capacidad de
enfocar simultneamente elementos ubicados en distintos planos, es
decir, tienen mucha profundidad de foco, con lo cual se logra la imagen
tridimensional

Recomendaciones para el cuidado del microscopio:

Al sacar el microscopio de su compartimiento para trasladarlo de
un lugar a otro, hgalo cuidadosamente transportndolo con
ambas manos; con la mano derecha tome firmemente el brazo y
ponga la mano izquierda debajo de la base. Debe mantener el
microscopio siempre en una posicin vertical, esto evita el
desplazamiento de algunas de las partes que no son fijas.
Coloque el microscopio suavemente sobre la mesa para evitar que
se desajuste la parte ptica. Nunca lo coloque en la orilla de la
mesa.

 Antes de usar el microscopio observe si todas sus partes se

encuentran limpias y en buen estado. Cualquier dao debe ser
informado al profesor a cargo.
Limpie suavemente la parte ptica con el papel de seda especial
(papel de lente). Nunca los limpie con el pauelo o con los dedos,
ya que podra rayar los lentes. Esto lo har antes y despus de sus
observaciones.
Mientras no est observando una preparacin mantenga apagada
la fuente luminosa.
Cuide que sus objetivos no se humedezcan cuando se observan
preparaciones liquidas.
Coloque el objetivo de menor aumento en su sitio cuando vaya a
guardar el microscopio.
Apague el microscopio y enrolle el cable.

Unidades de uso corriente en microscopia

mm (milmetro)= 0.001 m = 1 * 10-3 m
OBSERVACIONES
m (micrmetro, micrn
o micra) = 0.001 mm =MICROSCOPICAS
1 * 10-3 mm = 1 * 10-6 m
nm (nanmetro) = 0.001 m = 1 * 10-3 m = 1 * 10-6 mm = 1 * 10-9 m
(Angstrm) = 0.l nm = 1 * 10-1 nm = 1 * 10-4 m = 1 * 10-7 mm = 1 * 10-10 m.

Parte Prctica

1. Observacin de hongos
Es una observacin cotidiana el hecho que si se deja un trozo de pan,
frutas, hortalizas etc. en un lugar hmedo, con el paso del tiempo es
probable que crezca sobre ellos mohos. Los principales mtodos
aplicados para la observacin microscpica de los cultivos son: la
observacin en fresco con una solucin adecuada, y las preparaciones
en cinta adhesiva.

Materiales:
Pan, frutas, verduras con moho
aguja de diseccin y asa de gancho
portaobjetos y cubreobjetos
azul de metileno
Cinta adhesiva transparente
Microscopio

2. Observacin de levaduras
Materiales:
Levadura fresca de panadera
Tubo de ensayo
Porta y cubreobjetos
3. Observacin de epidermis de cebolla
Materiales:
Cebolla.
azul de metileno
Pinzas, tijera, portas y cubreobjetos, cuentagotas.
Mtodo:
Interesa como material, la epidermis interna de una escama de bulbo de
cebolla. Para obtenerla, se corta una cebolla en dos mitades. Se separa
manualmente en cascos, sacando entre cada dos cascos una capa fina y
translcida, que es, precisamente, la epidermis interna, y se lleva a una
caja de Petri para que se desenrolle. Cortar dos trozos de esta
epidermis. Un trozo se coloca entre porta y cubre con una gota de agua,
cuidando que quede bien extendido y sin burbujas de aire. El otro trozo
se sumerge en azul de metileno durante 5 minutos y luego se enjuaga
con agua destilada hasta que no desprenda mas colorante y
posteriormente se coloca entre porta y cubre para su observacin.
Observacin:
Las clulas de la epidermis de la cebolla, poligonal y grande, se hallan
ntimamente adheridas unas con otras. La pared se destaca muy clara

teida por el colorante. En las clulas vivas se ven los ncleos aplanados
(con 2 o ms nucleolos) adosados a la pared. A medida que las clulas
van degenerando, el ncleo se redondea y tiende a situarse en el centro.
El citoplasma tiene un aspecto bastante claro, en l se distinguen
algunas vacuolas grandes, dbilmente coloreadas. En algunas ocasiones
se observa que la preparacin tiene a manera de mosaico, otros estratos
de clulas; stas proceden de las capas ms internas de las hojas que
fcilmente han podido ser arrancadas al desprender la epidermis. Para la
observacin es ms adecuado utilizar las zonas constituidas por un nico
estrato epidrmico.
Resultados:
Dibujar un trozo de epidermis de cebolla a pocos aumentos.
Dibujar una clula a gran aumento, sealando pared celular,
vacuolas y ncleo.
4. Observaciones en fresco de microorganismos
Permite observar en los microorganismos la movilidad, el color, el
tamao, la forma y la agrupacin en su forma natural viva y sin
alteraciones. Sin embargo, la observacin es difcil y se perdern varios
detalles debido al escaso contraste, por la poca diferencia entre el ndice
de refraccin del medio y de los microorganismos. Este problema se
resuelve utilizando el microscopio de campo oscuro y el de contraste de
fases.
Una forma de preparacin en fresco es la preparacin en
portaobjetos normal con cubreobjetos.
Otra forma es la preparacin en gota suspendida. Se utiliza un
portaobjeto excavado y un cubreobjetos.
Materiales:
Muestra
portas y cubreobjetos
asa de ojal