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Capitulo 31g REPLICACION, REPARACION Y RECOMBINACION DEL DNA 1, Replicacion del DNA: Introduccion A. Horquillas de replicacion B. Funcién de la DNA girasa C. Replicacién semidiscontinua D. Cebadores de RNA ‘A. DNA polimerasa | B. DNA polimerasa Il C. Helicasas, proteinas de unién y DNA ligasas 3. Mecanismos de replicacién procariética A. Bacteriofago M13. B. Bacteriéfago 6X174 ©. E.coli D. Fidelidad de la repli 4.’Replicacion del DNA eucaridtico A. El ciclo celular B. DNA polimerasas eucariéticas ©. Transcriptasa inversa 5. Reparacién del DNA ‘A. Reparacién directa B. Reparacion por escision C. Reparacién por recombinacién D. La respuesta SOS E. Identificacion de carcinégenos Recombinacién y elementos genéticos méviles ‘A. Recombinacién general B. Transposicion 7. Metilacion de! DNA Los seres vivos somos los instrumentos del DNA para fabricar mas DNA. Anon En este capitulo, se tratara de la sintesis y el mantenimiento del DNA. La necesidad de la transmision de la informacién genética a las siguientes generaciones suficientemente fidedigna, pero con capacidad para admitir las mutaciones beneficiosas, ha llevado a la evolucin de complejos mecanismos para la replica- cién, reparacién y recombinacién del DNA. Los aspectos generales de estos procesos ya se conocen, si bien los detalles quedan atin por dilucidar. 1. REPLICACION DEL DNA: INTRODUCCION El hist6rico articulo de Watson y Crick sobre la estructura de la doble hélice de DNA acababa con la siguiente frase: “Es evidente que el apareamiento especifico que postulamos para las bases del DNA sugiere un posible mecanismo de reproduccién del1018 Secci6n 31-1. ReplicaciOn del DNA: Introduccién DNA molde s—> 5 ‘fey : coe — NA replcado Figura 31-1 By oH NY DNA polimerasa iM Las DNA polimerasas ensamblan los desoxinucledsido trifosfatos entrantes sobre moldes de DNA monohebra, con lo que la hebra creciente es extendida en direccién v3 material genético.” En un articulo posterior, estos au- tores se extendieron en sus suposiciones sefialando que una hebra de DNA puede actuar como molde para dirigir la sintesis de su hebra complementaria ‘Aunque en 1958, Meselson y Stahl demostraron que la replicacin del DNA era semiconservadora (Sec- cién 28-2A), no fue hasta 20 aftos después cuando se llegé a conocer con suficiente detalle el mecanismo de la replicacion del DNA en procariotas. Ello se debe, como veremos més adelante en este capitulo, a que el mecanismo de la replicacién del DNA rivaliza con el de la traduccion en complejidad, pero esta mediado por ensamblajes de proteinas débilmente asociadas, de las que solo estan presentes unas pocas copias por célula, La sorprendente complejidad de la replicacién del DNA, en comparacién con la transcripcién, que usa mecanismos quimicos parecidos (Seccién 29-3), proviene de ta necesidad de una fidelidad extrema en Ia replica- cién del DNA, con el fin de mantener la integridad del genoma generacién tras generacién, A. Horquillas de replicacion La replicacién det DNA se lleva a cabo mediante enzimas conocidos con el nombre de DNA polimerasas dirigidas por DNA o simplemente como DNA poli- ‘merasas, Estos enzimas utilizan DNA monohebra como molde sobre el que catalizan la sintesis de la hebra complementaria, a partir de los desoxinucleési- dos trifosfato adecuados (Fig. 31-1). Los nuevos nu- cletidos se seleccionan por su capacidad para aparearse, segiin la complementariedad demostrada por Watson y Crick, con las bases de la molécula molde, de modo que la hebra recién sintetizada forma una doble hélice con la hebra molde. Casi todas las DNA polimerasas conocidas pueden aftadir tinicamente el nucledtido aportado por un nucleésido trifosfato, al grupo 3-H libre de un polinucledtido, que tiene sus bases apareadas, de forma que la hebra de DNA se extiende s6lo en la direcci6n 5’ —» 3’. Las DNA polimerasas se describen en secciones posteriores: 31-2A, 2B y 4B. EI DNA daplex se replica semiconservadoramente en las horquillas de replicacion John Cairns obtuvo las primeras pruebas sobre el mecanismo de replicacién de los cromosomas mediante autorradiografias de DNA en replicacién. Estas autorradiografias de cromosomas circulares creciendo en un medio que contenia ['H]timidina mostraban Ojo de repicacién Figura 31-2 Autorradiogratia y dibujo actaratorio de un cromosoma de E. colireplicandose. Las bacterias se cultivaron durante algo mas de una generacion en un medio que contiene PHitimina, marcandose asi el DNA de nueva sintesis que aparece como una linea de granos oscuros en la emulsion fotografica (Ineas rojas en e! dibujo actaratoric). El tamatio dol ojo de replicacién indica que el cromosoma circular se hha duplicado una sexta parte en la vuelta de replicacién en curso. [Por cortesia de John Caims, Cold Spring Harbor Laboratory,Copa 31. Repco repay combina del DNA 1008 gue 31 Peano OMA, Ja existendia de “ojos” o “burbujs” de repiacin (fig 31-2), Estas estructura, denominadasestract 1280 (por su parecida a esta lea griega) indican que IDNA dip se veplica por una progreioaseparaiin elas doe bres paternay.scompena de ao se- Sis de sus heres complomentara, dando Laer deforma Semicnseondor, 2 as dbs bres hase. 91-3) EY mecanismo de replicacion del DNA basado en las estrutuas 6 es connddo como replleaion 8 El punto de separacion de las dos hebras ene ojo de roplicacion, donde la sntesis ene lugar, se de- omina horguila de replicaci, Una barbuja de e- plcaion puede contener una o dos horguls de Feplcacon(replicacion unllrecclonalo bidireclo- ‘al Los estudios mediante autoradiogafias han de- ostrado que lareplcacion de tipo Os cas siempre Didvecconal (Fig 51-4). Ademds,dchos expermen- ton, junto con algunas evidencosgenies an eet blecide que el DNA procantice jel de los barter {ages silo poseen un anico origen de replication (punto donde se inca In sntess del DNA}. B. Funci6n de la DNA girasa la necesidad de desenrollr Ia hebtapterna del DNA en a horglla de replcason (Fg 31-3) prods ce grandes problemas a nivel topologic, Por ejem: Plo el DNA de E coll se replica 2-una veloddad Eprosimada de ~ 1000 nuclesidos/s. isu cromouo ‘a de 1300 um de longi fuera lineal, debera gar dentro de los 3m de longitu de una ctl de Eel 42.100 revolucones/s recutdese que el B-DNA tiene unas 10 bp por yuo). Pero, incluso eto ne Sela posible, ya que de hecho el comoaoma de & {alles creat Pot el conta, Ia molécua de DNA ‘cumulara +100 supernvllamients/s (vee Seceon 25-54. para una revision del supeenvllamieno), Insta que legara a estar demasiado retorida sobre risa como para contnuar desensolandose. El su- petentllamiento negative que tiene lugar en el DNA aural promueve la desespualizacion de icamente '$'5 Bede sus elas duplex (recutrdese que los DNAs que se encuenzan en a natualeza no estn completamente superenolados, les alla una super” ie prada ~20 yt dpe Sect 285. Sin embargo, en organisms procaiouce, los super- cqllamientos nogatvos se pueden estableer en el [DNA por ls acon de una topossomeraa del Tipo Il (DNA grasa; Secion 28-50) a expensas dela hldl- Sis de ATP- Este proceso es esencal en Ia vepicacion cin \ Ve » ‘ferns, near aoresograa, ne replessen sndrecoenlyirecatea ge NA. (shun organ se nace recor rate aris erases aman meses ease con mara par gets sSNA so vole on na ‘szraaogri Uns poe eepunde ede sa ‘SRK erie de pus), s ode cue ira gre ster tees frases eri ‘apieaban undreedena sss ooaorstetonsente Imarace une ae os puts esis poe spr rose gua epeacisn Saeco provers dos do oe pros Go ramsacon ate me (i adormagrate co DNAse ol tae dee Ime fone: que cones su eaten bareecel {Gonuls de Davis Mc Prose, Ute of Coeace)1020 Seccién 31-1, Replicacion del DNA: Introduccién del DNA procaristico, como lo demuestra la deter cién de la replicacién del DNA en presencia de inhit dores de la DNA girasa, como la novobiocina o el Acido oxolinico, a excepcién de los mutantes en los que la DNA girasa no se une a estos antibisticos. C. Replicacién semidiscontinua Las imagenes de baja resoluci6n obtenidas mediante autorradiografias, como las de las Figs. 31-2 y 31-4b sugieren que las dos hebras antiparalelas del, DNA duplex se replican simultaneamente a medida que avanza la horquilla de replicacién. Pero, todas las DNA polimerasas conocidas tan solo pueden extender las hebras en la direccién 5’ — 3’. Como, entonces, la DNA polimerasa es capaz de copiar la hebra paterna que sigue la direccién 5’ > 3’, més alla de la horquilla de replicacién? Esta pregunta fue contestada en 1968 por Reiji Okazaki mediante los siguientes experimentos. Si durante el crecimiento de un cultivo de E. coli se realizan marcajes con pulsos de 30 s de ['H]timidina, la mayor parte de la radiactividad y, por ello el nuevo DNA sintetizado, tiene un coeficiente de sedimentacién en medio alcalino de 7S a 11S. Estos nuevos fragmentos sintetizados, llamados fragmentos de Okazaki, son tan s6lo fragmentos de 1000 a 2000 nucledtidos. Sin embargo, si después del pulso de 30 s con [°H] timidina, se transfiere el cultivo de E. coli a un medio no radiactivo (experimento de pulso y caza), el DNA tesultante, marcado radiactivamente, sedimenta a una velocidad que se incrementa con el tiempo que las células han crecido en el medio no radiactivo. De esta observacién, se deduce que los fragmentos de Okazaki deben haber sido incoporados covalentemente a moléculas de DNA de mayor ta- mato, ‘Okazaki interpret6 sus resultados experimentales en términos de un modelo de replicacién semidiscontinua (Fig. 31-5). Las dos hebras paternas se replican de modo diferente. La hebra de DNA sintetizada de nuevo, que crece en direccién 5’ —» 3’, al igual que el avance de la horquilla de replicacién, es la denominada hebra conductora y es esencialmente sintetizada de manera continua. La otra hebra de DNA sintetizada de ‘vance de i erate e repicacion Hebra conductors Hebra retrasada (Fragmentos de Okazak)) ST An as i A Figura 31-5 En la replicacién del DNA, ambas hebras hijas (rojo) se intetizan en la direccién &' -+ 3’. La hebra conductora se sintetiza de forma continua, mientras que la hebra retrasada lo hace de forma discontinua. Microgratfia electronica de un ojo de replicacion en el DNA de Drosophila melanogaster. Obsérvese que las regiones monohebra (fiechas), cerca de las horquillas de replicacion, tienen una configuraciOn trans, de acuerdo con el modelo ‘semidiscontinuo de replicacién del DNA. [Tomado de Kreigstein, H. J. y Hogness D. S., Proc. Natl. Acad. Sci. 71, 173 (1974) nuevo, la hebra retrasada, es también sintetizada en direccién 5’ + 3', pero de manera discontinua, formando los fragmentos de Okazaki, Estos fragmentos se unen covalentemente, después de su sintesis, en una reaccién catalizada por el enzima DNA ligasa (Seccién 31-20. Este modelo semidiscontinuo de replicacion del DNA se ve corroborado por micrografias de DNA replicandose, donde se muestran regiones de DNA monohebra en una de las ramas de la horquilla de repli- cacién (Fig. 31-6). En el DNA que se replica bidireccionalmente, aparecen ademas dos regiones de DNA monohebra dispuestas, como era de esperar, en sitios ‘opuestos diagonalmente respecto a la burbuja de replicacion. D. Cebadores de RNA Uno de los requerimientos casi universales para todas las DNA polimerasas es el extender la hebra de DNA a partir de un extremo 3’-OH libre. Como consecuencia de este hecho, resaltado por el estableci- miento del modelo semidiscontinuo, se plantea la siguiente pregunta: jcmo se inicia la sintesis de DNA? Analizando cuidadosamente los fragmentos de Okazaki, se observa que sus extremos 5” consisten en segmentos de RNA de 1 a 60 nucleétidos (esta longitud varia segin la especie), que son complementarios a la hebra de DNA molde (Fig. 31-7). E. coli posee dos enzimas que catalizan la formacién de estos cebadores de RNA: la RNA polimerasa, el enzima que media la transcripcién (Seccién 29-2), y otro de menor tamafio, la primasa (60 KD), que es el producto mo- nomérico del gen denominado dnaG. Esta primasa, contrariamente a la RNA polimerasa, es tesistente a la accién de la rifampicina (Seccién 29-2C). La observaci6n de que la rifampicina inhibeCapitulo 31. Replicacién, reparacién y recombinacién del DNA 1021 e LLU 5: RNA cebador| Figura 31-7 La sintesis de DNA se inicia en segmentos cortos de RNA. ‘inicamente la sintesis de la hebra conductora esta indicando que la primasa es la encargada de sintetizar los cebadores de los fragmentos de Okazaki. La inicia- cién de la sintesis de la hebra conductora en E. coli, tun suceso mucho menos frecuente que la de los fragmentos de Okazaki, puede ser realizada in vitro por cualquiera de las dos polimerasas solas, la RNA polimerasa o la primasa, pero el proceso es altamente estimulado cuando los dos enzimas estan presentes. Es por ello, que se piensa que estos dos enzimas actan sinérgicamente int vivo en el inicio la sintesis de la hebra conductora. EI DNA ya replicado, maduro, no contiene ningén fragmento de RNA. Los cebadores de RNA se eliminan durante el proceso de la replicacion y los huecos monohebra que dejan son llenados con DNA por el mecanismo descrito en la Seccién 31-24. 2. ENZIMAS DE REPLICACION La replicacién del DNA es un proceso complejo en el que intervienen gran variedad de enzimas. Los principales actores que participan en el proceso de replicacién, enumerados por su orden de aparicion son: (1) una DNA girasa, (2) proteinas que separan las hebras del DNA en la horquilla de replicacion, (3) proteinas que impiden la nueva union de las hebras antes de su replicacion, (4) enzimas que sintetizan los cebadores de RNA, (5) una DNA polimerasa, (6) un enzima que elimina los cebadores de RNA y (2) un enzima que une covalentemente los fragments de Okazaki contiguos. Ahora describiremos las. propiedades y funciones de muchas de estas proteinas. A. DNA polimerasa I En 1957, Arthur Kornberg publicaba el descubrimiento del enzima que cataliza la sintesis de DNA en extractos de E. coli, gracias a su capacidad de incorporar marcaje radiactivo en el DNA a partir de [C]timidina trifosfato. Este enzima, denominado desde entonces como DNA polimerasa I o Pol I, es un linico polipéptido de 928 restos. Pol I coloca desoxinucle6sido trifosfatos en los moldes de DNA (Fig. 31-1). La reaccién se produce por el ataque nucleofilico del grupo 3'-OH de Ia hebra de DNA que estd creciendo sobre el a-fosforilo del nucleésido trifosfa- to que se va a incorporar en la siguiente posiciOn. La reacci6n es impulsada por la consiguiente eliminacién de un grupo PP, y su posterior hidr6lisis por accién de la pirofosfatasa inorgénica. La reaccion global se parece a Ia catalizada por la RNA polimerasa (Seccion 29-2), pero difiere de ésta en el requerimiento estricto de que el nucléotido entrante debe unirse al extremo 3'-OH libre de un polinuclestido que tenga sus bases apareadas a la hebra molde (recuérdese que la RNA polimerasa inicia la transcripcién por la union de dos ribonuclestido trifosfatos sobre una hebra molde de DNA). La complementariedad entre el producto de DNA y el molde fue inferida por vez primera mediante estudios de la composicién de bases y de hibrida- cién, y, con el tiempo, fue establecida directamente mediante la determinacién de la secuencia de bases. EI nivel de error de la Pol I, cuando copia el DNA molde, es bastante bajo. Ello se demostré por la repli- cacién in vitro del DNA del bacteriéfago 6X174, la cual produjo DNA fagico con plena capacidad infec- ciosa. La especificidad de la Pol I por la base entrante, més que un mero reconocimiento, se cree debida a la necesidad de que la nueva base forme un par de bases de Watson-Crick con el molde (recuérdese que los cuatro pares de bases, A-T, T-A, G:C y C-G poseen todos formas casi idénticas; Seccién 28-24). Ello explica que la Pol I pueda intercambiar la timina solo con el 5-bromouracilo y la guanina sélo con la hipo- xantina. Se dice que la Pol I es procesiva porque cataliza una serie de pasos sucesivos de polimeriza- cin, normalmente unos 20 o més, sin liberar el molde. Por supuesto, la Pol I puede actuar también en Bases no apareadas Sito de hidouiss? x e la exonuceasa a5 Figura 31-8 La actividad exonucleasa 3° -+ 5’ de la DNA polimerasa | elimina nucleétidos no apareados desde el extremo 3' de la hebra de DNA naciente.1022, Seccién 31-2. Enzimas de replicacion Sto ela exonucleasa 5' -» 3 Corteen una sola hebra Figura 31-9 La actividad exonucleasa 5’ -+ 3'de la DNA polimerasa | elimina hasta 10 nuclestidos a partir del extremo 5° de un corte que se ha producido en una sola hebra. El nuclestido que se encuentra inmediatamente después del corte puede ‘estar apareado 0 no. sentido inverso, degrandando el DNA mediante pirofosforolisis. Esta reaccion inversa probablemente no tiene ningun significado biologico, ya que la concentracion in vivo de PP,, procedente de la accion de pirofosfatasa inorgénica, es muy baja Pol I puede corregir sus errores Ademas de su actividad polimerasa, la Vol I tiene dos actividades hidroliticas independientes: @ Figura 31-10 Estructura de rayos-X del fragmento Klenow de la Pol | (2) Dibujo de cintas, en el que la discontinuidad entre las helices H e | (izquierda) indica la posicion de un segmento desordenado de 50 restos. La divisién entre los dominios Pequerio (verde) y grande (purpura) de la proteina se encuentra en el lazo entre las hélices F y G. (Segun Ollis, LL, Brick, P., Hamlin, R., Xuong, N. G. y Steitz, T. A., Nature ‘313, 762 (1985).] (b) Dibujo de espacio leno, basado en, parte en la construccién de modelos, del fragmento Klenow de la Pol | con el B-DNA de doble hebra colocado en la hendidura propuesta de fijaci6n del ONA (el cristal de Pol | ‘no contiene DNA). La hebra cebadora (verde) acaba en la regién del probable sitio activo de la polimerasa, mientras que la hebra molde (amarillo) atraviesa el enzima. Una molécula de dTMP (purpura) se muestra unida, en la Posicién observada, al sitio activo de la exonucleasa 3' +5’. [Por cortesia de Thomas Steitz, Yale University.) 1. Puede actuar como exonucleasa 3’ -» 5’ 2. Puede actuar como exonucleasa 5’ -» 3’, La reacci6n exonucleasa 3’ — 5° difiere quimicamente de la reaccién de pirofosforolisis s6lo en que el acep- tor de nucleétidos es el H,O en lugar del PP,, Sin embargo, estudios cinéticos y cristalograficos (ver mas, adelante) indican que estas dos actividades cataliticas ‘ocurten en sitios activos diferentes. La funcion exonucleasa 3’ — 5’ es activada por un nucle6tido terminal en 3’, desapareado, con un grupo OH libre. Cuando la Pol I incorpora, por error, un nuclestido equivoca- do (desapareado) en el extremo de la hebra de DNA que esta creciendo, la actividad polimerasa se inhibe y la actividad exonucleasa 3’ 5’ elimina el nuclestido erréneo (Fig. 31-8). A continuacién, la actividad polimerasa reanuda la replicacion del DNA. La Pol I, de este modo, tiene la capacidad de releer Ia hebra de DNA que esté sintetizando y corregir sus propios errores. Ello permite explicar la gran fidelidad de la replicacion del DNA, a pesar de la relativamente poca ener- ©Capitulo 31. Replicacin, reparacin y recombinacién del DNA 1023 gia libre que posee una tnica interaccién por apareamiento de bases (los aspectos energéticos de la fidelidad en la unién se discuten en la Seccién 30- 2C). El coste de esta elevada fidelidad es que ~ 10 % de los nuclestidos incorporados corfectamente son también eliminados. Cuando actia como exonucleasa 5’ 3, la Pol Ise une a los puntos del DNA daplex que presentan muescas en una sola hebra, independientemente de las caracteristicas del nucledtido en 5’ (5'-OH 0 grupo fosfato, apareado 0 no). La Pol I corta el DNA en una region apareada proxima a la muesca, degradandolo a mononucledtidos u oligonuclestidos de hasta 10 restos (Fig. 31-9). En cambio, la actividad exonucleasa 3’ +» 5’ elimina tnicamente los mononuclestidos desapareados con grupos 3'-OH libres. La actividad polimerasa y las dos actividades exonucleasa de la Pol I tienen lugar en sitios, activos distintos La actividad exonucleasa 5’ -> 3’ de la Pol I es independiente de las otras dos, exonucleasa 3” — 5’ polimerasa. De hecho, como hemos visto en la Seccién 28-6C, algunas proteasas como la subtilisina © la tripsina digieren la Pol I en dos fragmentos: el fragmento grande o fragmento “Klenow” (posiciones 324-928), en el cual se encuentran las actividades polimerasa y exonucleasa 3’ —» 5’, y un pequefio fragmento (posiciones 1-323), que contiene la actividad exonucleasa 5’ 3’, Asi, la Pol I contiene tres sitios activos en una sola cadena polipeptidica. La estructura de rayos-X del complejo formado por el fragmento Klenow y el dTMP, determinada pot Tho- mas Steitz, indica que esta proteina esta formada por dos dominios (Fig. 31-102). El dominio pequefio fija 4TMP, cuyo fosfato 5’ interacciona con dos iones metélicos divalentes. El sitio de fijacin de dTMP forma parte de la exonucleasa 3’ — 5’. Ello se demos- tro por la ausencia de esta actividad, y no de la actividad polimerasa, en un fragmento Klenow mutante, modificado por ingenieria genética, que carecia de los sitios quelantes de iones pero que, por lo demas, posefa una estructura normal. El dominio grande (a partir de la hélice G, en la Fig. 31-10a) posee una hendidura prominente, el sitio activo de la polimerasa. La construccién de modelos indica que éste tiene el tamaito y la forma apropiados para unir una molécula de B-DNA, en una forma que recuerda a una mano derecha agarrandose a una barra (Fig. 31- 108). Un segmento de la proteina, constituido por 50 restos, que saldria del pulgar de la mano imaginaria (hélices H e I en la Fig. 31-102), no es visible en la estructura de rayos-X y, por ello, se cree que posee una conformacion desordenada. Steitz ha sugerido que este fragmento esta unido de una forma flexible a la proteina, cerrando el cuarto lado de la hendidura cuando ésta contiene DNA. Este mecanismo podria reducir enormemente la velocidad de disociacién del DNA de la polimerasa, explicando asi el caracter pro- cesivo observado en la Pol I. Los estudios de modela- do indican, ademés, que las hélices J y K se extienden hacia el interior del surco mayor del DNA. De esta forma, queda fijada la orientacin helicoidal del DNA. en el sitio activo de la Pol I, de una forma muy semejante a la rosca de una tuerca, Si estas dos caracteristicas estructurales son realmente ciertas, el DNA. deberia atornillarse, avanzando hacia un nuevo extremo 3’, entre las etapas de polimerizacion. Con la intencion de caracterizar mejor la funcién polimerasa de la Pol I, se cristalizé el fragmento Klenow unido a un fragmento de DNA, diseniado para imitar el complejo molde-cebador: un DNA de 8 bp, en el que la hebra molde presenta un segmento monohebra de 3 nuclestidos que sobresale en el extremo 5’. La estructura de rayos-X de este cristal revelé que el DNA, contrariamente a lo esperado, se une al sitio de la exonucleasa 3’ > 5’, dejando solamente un segmento visible de 4 nucledtidos (el resto est probablemente desordenado) que se extiende ha: cia el sitio de la polimerasa, que se encuentra a ~ 30 A, Ello sugiere que el sitio de la exonucleasa 3’ > 5” compite con el sitio de la polimerasa por el extremo 3’ del DNA recién sintetizado (Fig. 31-11). Como sea que el sitio de la exonucleasa puede fijar tnicamente DNA monohebra, cuando el extremo 3’ est desapareado y provoca por tanto la fusion del DNA, favore- ce claramente la unin de la hebra de nueva sintesis, al sitio de la exonucleasa. De esta forma, los errores de apareamiento son eliminados durante el proceso preferentemente. La funcién fisiolégica de 1a Pol I es la reparacién del DNA Durante los 13 afos que siguieron al descubrimien- to de la Pol I, fue comtinmente aceptado que este enzima era la DNA replicasa de E. coli, ya que no se habia detectado ninguna otra actividad polimerasa. En el afio 1969, esta presuncién fue cuestionada por Cairns y Paula DeLucia, al aislar un mutante de E. coli en el cual s6lo se detectaba < 1% de la actividad Pol I normal (aunque tenia niveles casi normales de actividad exonucleasa 5’ > 3’) y que, a pesar de ello, su velocidad de reproduccién éra normal. Sin embargo, esta cepa mutante era muy sensible a los efectos, dafinos de la radiacion UV y a los mutégenos quimicos. Era evidente que Ia polimerasa Pol I desempefiaba un papel fundamental en la reparacién del DNA dafiado (modificado quimicamente). EI DNA alterado, tal como se describe en la Seccién 31-5, es detectado por diferentes sistemas de repara- ion del DNA. La mayoria de ellos cortan, mediante endonucleasas, el DNA dafado en el lado 5’ de la lesion, activandose la exonucleasa 5’ -> 3’ de la Pol I Mientras por un lado se elimina el DNA dafiado, por el otro, la misma Pol I va rellenando el hueco que resulta en una de las hebras, mediante la actividad polimerasa. Asi, la actividad exonucleasa 5’ > 3° se incrementa diez veces cuando la funcién polimerasa esta activada. Es posible que la simultaneidad de las dos actividades de la Pol I, escision y polimeriza-1024 Secci6n 31-2, Enzimas de replicacién @ Sito activo de la polimerasa Sito acto ele excruclasa Figura 31-11 Modelo esquemitico del fragmento Klenow con el DNA Unido a (a) e! sito activo de la polimerasa: y (b) el sitio activo de la exonucleasa 3’ — 5’. Para desplazarse del sitio activo de la polimerasa al dé la exonucieasa, el extremo 3! de la hebra hia (rojo) debe recorrer la longtud de cuatro nucleétidos de DNA de doble hebra y cuatro de DNA monohebra. La hebra molde esta dibuiada en azul. (Seguin Freemont, P. S., Friedman, J. M., Bese, L. S., Sanderson, M . Ry Steitz, T. A. Proc Natl. Acad. Sci. 85, 8927 (1988),] cién, proteja al DNA de la accién de las nucleasas celulares, que podrian daar aun mas al DNA abierto. La Pol I cataliza la traslacién de muesca Las actividades exonucleasa 5’ -> 3’ y polimerasa de la Pol I pueden, conjuntamente, sacar y colocar nuevamente los nucleétidos en el lado 5’ de un corte, que se haya producido en una de las hebras de un DNA que, por lo demés, aparece intacto. Estas teac- ciones, de hecho, trasladan (mueven) la muesca hacia el extremo 3° de la hebra de DNA sin alterar, por lo dems, la molécula (Fig. 31-12). Este proceso de tras- lacién de muesca (“nick translation”), en presencia de desoxinucleésido trifosfatos marcados, es utilizado ena sintesis de DNA altamente radiactivo (las muescas pueden ser generadas por tratamiento del DNA con pequeftas cantidades de DNasa I pancreatica). La funcién fisiolégica de la exonucleasa 5’ —> 3’ de la Pol I es la eliminaci6n de los cebadores de RNA La exonucleasa 5'-» 3° también elimina los cebadores de RNA de los extremos 5 y rellena los huecos resultantes con DNA sintetizado de nuevo. La importancia de esta funcién fue demostrada por el aislamiento de mutantes de E. coli sensibles a la temperatura, los cuales no son viables ni muestran actividad exonucleasa 5’ + 3’ a la temperatura restrictiva de ~ 43 °C (el bajo nivel de actividad polimerasa de la cepa mutante en Pol I aislada por Cairns y DeLucia es, al parecer, suficiente para llevar a cabo este proceso fundamental de rellenar los huecos durante la replica- Tabla 31-1 Propiedades de las DNA polimerasas de E. coli Propiedad Poll Poll Pol lil Masa (kD) 109 = 120140 Moléculas/célula 400 2 10-20 Numero de recambio* 600 30 9000 Gen estructural polA pol poll Mutante letal condicional + - + Polimerizacién: 3° —> 5° + + + Exonucleasa: 3’ + 5° + + + Exonucleasa: 5 > 3° + - + -Nuclestidos polimerizados « min-! - molécula"! a 37 °C. Fuente: Kornberg A., DNA Replication, p. 169, Freeman (1980). cién cromosémica). Asi, la Pol I es indispensable en la replicacion del DNA de E. coli, aunque de una manera diferente a la que se suponia en un piincipio. B, DNA polimerasa III El descubrimiento de mutantes de E. coli, capaces de crecer normalmente, con una escasa actividad Pol 1, estimul6 la biisqueda de otras actividades polimeri- zantes del DNA. Este esfuerzo se vio recompensado cuando se encontraron dos enzimas mas, designados segiin el orden de su descubrimiento, DNA polimerasa II (Pol I) y DNA polimerasa III (Pol II). Las propiedades de estos enzimas se comparan con las de la Pol I en la Tabla 31-1. La Pol I y la Pol Ill no se habian detectado con anterioridad debido a que sus actividades conjuntas, en las condiciones utilizadas, son normalmente <5 % de la actividad Pol I Los mutantes que carecen de actividad Pol II no presentan ningiin defecto aparente. Se desconoce, por tanto, la funcion fisiologica de la Pol Ul, sila tiene. La Pol Ill es la DNA replicasa de E. coli La interrupcion de la replicacién del DNA en mutantes de polC, sensibles a la temperatura, por encima de la temperatura restrictiva (alta) demuestra que la Pol Ill es la DNA replicasa de E. coli. Este enzima tiene i Muesca dNTPs DNA polimerasa I : Sn : Mononuclestidos \”}~7 | Figura 31-12 Traslacién de muesca catalizada por la Po! |Capitulo 31. Replicacién, reparacién y recombinacién del DNA 1025 Tabla 31-2 Componentes del holoenzima de la DNA polimerasa III Subunidad Masa (kD) Gen estructural e 130 polC (dnat) e 275 inaQ & 10 Desconocido e 7 anaZx* Y 52 naz? é 32 Desconocido B 40,6 dnaN Componentes del la Po! IL ‘Las subunidades y y + son codificadas por la misma secuencia génica; la subunidad y comprende el extremo N-terminal de la subunidad Fuente: McHenry, C. S,, Annu. Rev. Biochem. 87, 538 (1988), una composicién de subunidades del tipo ae, donde 4, el producto del gen polC (Tabla 31-2), contiene la fancion polimerasa. Las propiedades cataliticas de la Pol Ill se asemejan a las de la Pol I (Tabla 31-1), excepto por la imposibilidad de la primera de replicar DNA monohebra unido a un cebador o DNA duplex cortado en una de sus hebras. De esta manera, la Pol Ill actia in vitro sobre huecos de < 100 nucledtidos en una sola hebra, situacién que recuerda el estado del DNA dentro de la horquilla de replicacion, La funcién exonucleasa 3° + 5’ de la Pol Ill, que reside en la subunidad & del enzima, es la principal correctora del DNA durante la replicacion; esta fun- cién aumenta hasta 200 veces la fidelidad del enzima en la replicacién. Sin embargo, la actividad exonucleasa 5’ > 3’ de la Pol Ill actiia anicamente sobre DNA monohebra, raz6n por la cual no puede catalizar la traslacion de muesca. La Pol III actiia in vivo como un complejo enzimatico abil, el holoenzima de la Pol III, formado como mini- $88 Holicasa a TTT Tt Hebrererasada <= Movimiento dela horquila B Hebra conductora & mo por siete tipos de subunidades (Tabla 31-2), Las liltimas cuatro subunidades de la Tabla 31-2 actian como moduladoras de la actividad de la Pol Ill. Por ejemplo, la fijacién del holoenzima de la Pol Ill a un DNA molde, con un cebador unido, requiere la hidr6- lisis de ATP en una reacci6n catalizada por la subunidad B. Mediante esta reaccién, el holoenzima queda sujeto al molde de DNA, formando un complejo que puede progresar por la doble hélice de una manera casi indefinida (> 5000 restos). En cambio, la Pol IIL por si sola, que no hidroliza ATP, tan s6lo es capaz de avanzar de 10 a 15 restos. Parece como si las subunidades del holoenzima, distintas de la Pol III, propor- cionaran algunos de los sitios de interaccion con otras proteinas participantes en la replicacién del DNA (Seccion 31-3). C. Helicasas, proteinas de union y DNA ligasas El holoenzima de la Pol Ill, a diferencia de la Pol I, no puede desenrollar el DNA diiplex. Asi pues, es necesario el trabajo coordinado de tres proteinas, la proteina Rep, la helicasa Il y la proteina de unién al DNA monohebra (SSB) (Tabla 31-3), para desenrollar el DNA antes del avance de la horquilla de replicacion (Fig. 31-13), en un proceso que es impulsado por la hidrélisis de ATP. La proteina Rep, producto del gen rep de E. coli, separa las hebras del DNA duplex, avanzando a lo largo de la hebra conductora del DNA. molde en direccién 3’ > 5’ y consumiendo, al mismo tiempo, dos ATPs por cada par de bases separado. De modo parecido, la helicasa II se desplaza a lo largo de la hebra retrasada del DNA molde en direccion 5’ 3’, La observaci6n de que, en los mutantes rep", nicamente se reduce la velocidad de la replicacion sugiere que la proteina Rep y la helicasa I trabajan juntas en la horquilla de replicacion desenrollando el DNA. La unién de la proteina SSB impide hibridar de nuevo a las hebras de DNA una vez separadas, detras del paso de la helicasa. Un gran nimero de copias de esta proteina tetramérica recubren cooperativamente el DNA monohebra, manteniéndolo asi desapareado. Obsérvese, sin embargo, que el DNA debe ser despo- jado de proteinas SSB antes de que pueda ser replicado por el holoenzima de la Pol Ill. Proteina Rep Figura 31-13 Desenrollamiento del DNA por la accién combinada de la proteina Rep, la helicasa Il y la proteina SSB, La proteina Rep se mueve a lo largo del molde de la hebra conductora fen direccién 3’ -+ 5', acompafiada por la helicasa Il en el molde de la hebra retrasada, moviéndose en direccion 5’ 3". La unién de la proteina SSB impide la nueva hibridacion de las hebras del DNA previamente separadas. Tabla 31-3 Proteinas desenrolladoras y de unién al DNA en E. coli Estructura Masaen —_ Moléculas Proteina __subunidades_subunidades (kD) célula Proteina Rep’ Monémero 65 50 Helicasa Il Monémero 75 6000 SSB Tetramero 19 800 Fuente: Kornberg, A., DNA Replication, 1982 Supplement, p. $83, Freeman (1982) y DNA Replication p. 283, Freeman (1980),1026 Seccién 31-3. Mecanismos de replicacién procariética La DNA ligasa cierra los cortes producidos en una de las hebras del DNA La Pol I, como se ha visto en la Seccién 31-1D, sustituye los cebadores de RNA de los fragmentos de ‘Okazaki por DNA, mediante la traslacién de muesca. Los cortes resultantes en una de las hebras, entre dos fragmentos de Okazaki adyacentes, asf como en el DNA circular después de la sintesis de la hebra conductora, son cerrados en una reaccién catalizada por la DNA ligasa. La energia libre requerida para esta reaccion es obtenida, dependiendo de la especie, a través de la hidrdlisis acoplada de o bien NAD* a NMN* + AMP, © bien ATP a PP, + AMP. El enzima de E. coli, un monémero de 77 kD que utiliza NAD*, cataliza la reaccién en tres etapas (Fig. 31-14): 1. El grupo adenilo del NAD* es transferido al grupo g-amino de un resto de Lys del enzima, formando E~Lys—NH,—P—O—R—A AMP Figura 31-14 Reacciones catalizadas por la ligasa de E. coll. En las DNA ligasas de eucariotas y del fago T4, el NAD* es sustituido Por ATP, con lo que, en el primer paso de la reacciOn, se ‘elimina PP, en lugar de NMN*. un aducto fosfoamida poco comin que es, sin embargo, facilmente aislado. 2. El grupo adenilo del enzima activado es transferido al extremo 5'-fosforilo de la muesca, formandose DNA adenilado. En este caso, el AMP se encuentra ligado al nucledtido en 5’ a través de un enlace pirofosfato, en lugar del habitual enlace fos- fodiéster, 3. La DNA ligasa cataliza la formacion de un enlace fosfodiéster, por ataque del grupo 3’-OH sobre el grupo 5’-fosforilo, cerrando asi la muesca y liberando AMP. Las DNA ligasas que requieren ATP, como las eu- cariéticas y la del fago T4, producen PP, en la primera etapa de la reaccién, en lugar de NMN*. La ligasa de T4 tiene, ademés, la peculiaridad de que, a elevadas concentraciones de DNA, es capaz de enlazar dos DNAs daplex (ligacién de extremos romos), reaccion sumamente importante en ingenieria genética (Sec- cin 28-88). 3. MECANISMOS DE REPLICACION PROCARIOTICA Los bacteri6fagos se encuentran entre las formas de vida més simples y los mecanismos de replicacion de su DNA reflejan claramente este hecho. Gran parte de los conocimientos sobre el mecanismo de repli- cacién del DNA procede del estudio de este proceso en diferentes fagos. En esta seccién, examinamos la replicacién del DNA en los colifagos M13 y #X174 y, después, consideramos la replicacién del DNA en la misma E. coli. La replicacién del DNA eucaristico se tratara en la Seccién 31-4. A. Bacteriéfago M13 El bacteriéfago M13 posee un DNA circular monohebra de 6408 nucledtidos, conocido como la hebra virica o (+). Tras la infeccién de una célula de E. coli, esta hebra dirige la sintesis de su hebra complementa- tia o (~), formandose el DNA diplex circular, Hamado forma replicativa (RF), pudiendo estar en la forma superenrollada (RFD o relajada (RFID). Este proceso de replicacion (Fig. 31-15) puede ser tomado como ejemplo de sintesis de la hebra conductora en el DNA duplex. Cuando la hebra (+) de M13 entra en las células de E, coli, es recubierta por la proteina SSB, a excepcion de un segmento palindrémico de 57 nucleétidos que forma una estructura de horquilla. La RNA polimerasa, en un proceso que requiere la subunidad ¢ para el reconocimiento del sitio de iniciacion (Seccién 29-2B), comienza la sintesis del cebador seis nuclestidos antes de la estructura de horquilla y extiende el RNA de 20 a 30 restos, formando un segmento de duplex hibrido RNA-DNA. El DNA, que resulta desplazadoCapitulo 31. ReplicaciOn, reparaciOn y recombinacién del DNA 1027 Hebre (4) del DNA de M13 | FA pliers Ey INGN 3 RNA cobador 1, Replicacion det ONA por la Pol II 2, Eliminacién del RNA y lenado del hueco resuitante por la Pol I 43, Sellado de la unién por la ONA ligasa 4, Superenrolamiento por la DNA grasa Figura 31-15 Sintesis de la hebra (~) del DNA de M13 sobre un molde de hebra (+), formandose el DNA de la RFI de M13. de la horquilla, es recubierto por la proteina SSB, de forma que cuando la RNA polimerasa llega a la posicion de SSB, termina la sintesis del cebador. A. conti- nuacién, el holoenzima de la Pol III extiende el cebador de RNA alrededor del circulo, formando la hebra (-). El cebador es eliminado por traslacion de miuesca, catalizada por la Pol I, formandose asi RFI, que es convertida a RFI por la accion secuencial de la DNA ligasa y de la DNA girasa. B. Bacteriéfago X174 El bacteri6fago #X174, al igual que M13, contiene ‘un pequefio DNA circular monohebra (5386 nuclestidos). Curiosamente, la conversién in vivo del DNA. virico de X174 a su forma replicativa es un proceso mucho més complejo que en el caso de M13. La replicacién de $X174 requiere la participacién de un Tabla 31-4 Proteinas del primosomat Estructura Masaen __ Moléculas Proteina _subunidades subunidades (kD) _célula n Dimero 4 80 n Monémero 76 70 n” Monémero v7 i Trimero 2 50 DnaB Hexamero 50 20 DnaC Monémero 29 100 Primasa Monémero 60 50 "El complejo de todas las proteins de primosom,excuyendo la primase; se conoce coco preprincsoma Fuente: Komberg, A. DNA Replication, 1982 Supplement p. $123, Freeman (1983), complejo proteico de casi 600 KD, conocido como primosoma (Tabla 31-4) La replicacién de la hebra (-) de #X174 es un ejemplo de sintesis de la hebra retrasada La sintesis de la hebra (-) de $X174 tiene lugar mediante un proceso de seis etapas (Fig. 31-16): 1. La secuencia de reacciones se inicia de la misma manera que en el caso de M13: la hebra (+) es recubierta con la proteina SSB, exceptuando una estructura de horquilla de 44 nuclestidos cerca de la posicién 2300. A continuacién, una secuencia de 55 nucledtidos que incluye la horquilla es recono- cida por las proteinas n, n’y n”, que se unen a ella. 2. Las proteinas i, DnaB y DnaC se afaden a este complejo, proceso que requiere ATP, formando el, preprimosoma. El preprimosoma, a su vez, une la primasa, convirtiéndose en primosoma. 3. El primosoma es empujado en la direccion 5’ -» 3’, a lo largo de la hebra (+), gracias a la hidrdlisis de ATP catalizada por n’. Este movimiento, que desplaza a la SSB de su camino, lleva una direccién ‘opuesta a la de lectura de la hebra molde durante la elongacion de la cadena de DNA. 4. En sitios seleccionados al azar, el primosoma invierte la direccién de su migraci6n, mientras que la, primasa sintetiza un cebador de RNA. La it ciacion de la sintesis del cebador requiere la parti- cipacién de la proteina DnaB que, mediante la hidrélisis concomitante de ATP, se ctee que modifica la conformacion del DNA molde, favoreciendo Ia accién de la primasa. El holoenzima de la Pol III extiende los cebadores, formando fragmentos de Okazaki 6. La Pol I elimina los cebadores y los reemplaza por DNA. A continuacién, la DNA ligasa conecta los1028 Seccién 31-3. Mecanismos de replicaciOn procaristica 1. Reconoeimiento i Proteins |, DnaB, Dnac, de unién & ATP rmenahebva a Primasa 3. Migracién ot ADP + Py Holeerzima de la ONA polimerasa Ill, dNTPs Pol igase, grasa 4QNTPs, NADY 6, Excision Uenado del hueco, ligacin, superenralamiento Figura 31-16 Sintesis de la hebra (-) del fago ¢X174 sobre un molde de hebra (+), formandose el DNA de la RFI de #X174. [Segin Arai, K., Low, R. Kobori, J. Schlomai, J. y Kornberg, A., J. Biol, Chem. 256, 5280 (1981),] fragmentos y la DNA girasa les confiere su estructura superenrollada, formando la RFI de ¢X174. El primosoma permanece formando un complejo con el DNA (Fig. 31-17), situacién en la que participa en la sintesis de la hebra (+) (ver més adelante). La replicacién de la hebra (+) de 4X174 sirve como modelo para la sintesis de la hebra retrasada Una de las hebras de un DNA diiplex circular se puede sintetizar siguiendo el modelo del circulo rodante o replicacién c (llamada asi por el parecido de la estructura replicativa con la letra griega sigma; Fig. 31-18). La hebra (+) del fago X174 se sintetiza sobre un molde de RFI, mediante una variacién de este proceso, el modelo del circulo rodante con lazo (Fig. 31-19): 1. La sintesis de la hebra (+) comienza con la uni6n, asistida por el primosoma, del enzima codificado por el fago, proteina del gen A (60 KD), a su sitio de reconocimiento de ~ 30 bp. Una vez. alli, la proteina del gen A corta especificamente el enlace fosfodiéster que precede el nucledtido 4306 de la hebra (+), formando un enlace covalente con su grupo 5'-fosforilo, lo que conserva la energia del enlace roto. 2, Seguidamente, la proteina Rep (Seccién 31-2C) se une ala hebra (-), a la altura de la proteina del gen Ay, con la ayuda del primosoma que continta asociado a la hebra (+), empieza a desenrollar el DNA daplex a partir del extremo 5’ de la hebra (+). La hebra (+) desplazada es recubierta con SSB, lo cual impide su reasociacion con la hebra (-). La proteina Rep resulta esencial en la replicacién del DNA de $X174, a diferencia de lo que ocurre en el cromosoma de E. coli, tal como se demuestra por la incapacidad de #X174 para replicarse en células de Figura 31-17 Micografia electrénica de un primosoma unido al DNA de la RFI del fago ¢X174. Estos complejos siempre Contienen un tnico primosoma asociado a uno 0 dos pequefios lazos de DNA. [Por cortesia de Jack Griffith, Lineberger Cancer Research Center, University of North Carolina.]Capitulo 31, Replicacién, reparacién y recombinaciém del DNA 1029 Origen I ga Figura 31-18 Modelo del circulo rodante de replicacion del DNA. La hebra (+), que esta siendo sintetizada, es extendida desde un corte especifico realizado en el origen de replicacién (1), desplazando la antigua hebra (+) (2 y 3). La sintesis continua de la hebra (+) sobre un molde de hebra (~) circular produce una serie de hebras (+) unidas fen tandem (4), las cuales pueden ser separadas mas tarde mediante una endonucleasa especifica, E, coli rep. El holoenzima de la Pol Ill extiende la hebra (+) a partir de su grupo 3’-OH libre. 3. El proceso de extensi6n genera un circulo rodante con lazo, en el cual el extremo 5’ de la antigua hebra (+) permanece unido a la proteina del gen A en la horquilla de replicacion. Se cree que, a medida que la antigua hebra (+) se separa de la RE, el primosoma sintetiza los cebadores que se necesita- rin para la generacion posterior de una nueva hebra (-). 4. Una vez que la protefna del gen A ha dado toda la vuelta al circulo siguiendo la hebra (-), realiza un nuevo corte especifico en el origen de replicacién, con el fin de unirse covalentemente al extremo 5’ de la nueva hebra (+). Simultaneamente, el grupo 3'-OH terminal recién formado de la antigua hebra (#), la cual forma parte del lazo, ataca nucleofilica- mente el enlace 5-fosforilo con la proteina del gen. A, liberando asi la hebra (+) cerrada covalentemente. Resulta evidente que la proteina del gen A debe tener dos sitios activos que se alternan en su union, a los extremos 5’ de las sucesivas hebras (+) sinteti- zadas. La horquilla de replicacién progresa alrededor del circulo duplex, produciendo nuevas hebras (+). En las etapas intermedias de una infeccion por el fago @X174, cada hebra (+) recién sintetizada dirige la sintesis de la hebra (-), formando la’RFI como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, en los tltimas etapas de la infeccién, las nuevas hebras (+) se empa- quetan dentro de las particulas viricas. C. E. coli El cromosoma de E. coli se replica desde un tinico origen de replicacion, siguiendo el modelo ® bidireccional (Seccién 31-14). El modelo mas plausible para los suicesos que tienen lugar en la horquilla de replicacion de E. coli (Fig. 31-20) proviene, en gran parte, de estudios sobre los mecanismos de replicacion del DNA de colifagos, tales como M13 y éX174, mucho més sencillos y mas abordables experimentalmente. EI DNA diplex es desenrollado por la proteina Rep, en la hebra conductora del molde, en colaboracién con la helicasa Il y el primosoma, en la hebra retrasada. Una vez separadas, las dos hebras sencillas son recubiertas inmediatamente por SSB. La sintesis de la hebra conductora esta catalizada por el holoenzima de la Pol III, asi como la sintesis de la hebra retrasada después del cebado por la primasa asociada al primosoma, Parece ser que tanto la sintesis de la hebra conductora como de la hebra retrasada tienen lugar en una tinica particula multiproteica, el replisoma. De esta forma, la hebra retrasada adquiere una estructura de lazo (Fig. 31-20). Después de completar la sintesis de un fragmento de Okazaki, el holoenzima situado en la hebra retrasada se traslada a un nuevo cebador cerca de la horquilla de replicacion, El ceba-1030 Seccién 31-3. Mecanismos de replicacion procariética RF con primosoma asoclad a Protena del gen A Proteina del gen & origen & Rep, SSB, IL ete 2 & oS Dap n Figura 31-19 Sintesis de la hebra (+) del fago ¢X174 mediante el modelo del circulo rodante con lazo. dor que encabezaba el fragmento de Okazaki previamente sintetizado es eliminado mediante traslacion de muesca, catalizada por la Pol I, y la muesca se cierra por accién de la DNA ligasa. La replicacién del DNA de E. coli se inicia en oriC por un proceso mediado por la proteina DnaA El origen de replicacion del cromosoma de E. coli consiste en un tinico segmento de 245 bp, conocido como el locus oriC. Esta secuencia, cuyos segmentos estén muy conservados entre las bacterias gram- negativas, sostiene la replicacién bidireccional en los diversos plésmidos en que ha sido insertado. Basan- dose en experimentos con estos plasmidos, Kornberg Propone que el inicio de replicacién en E, coli ocurre siguiendo el siguiente proceso que consta de varias etapas (Fig. 31-21): 1, La proteina DnaA (52 kD) reconoce y se une hasta a cuatro tepeticiones de 9 bp en oriC, formando, ‘como indican los experimentos de proteccién frente a DNasal y microscopia electronica, un complejo con el DNA de oriC superenrollado negativamen- te, que envuelve un nucleo central de 20 a 40 monémetros de la proteina DnaA. Este proceso viene facilitado por la proteina HU, semejante a las histonas. 2. A continuacién, las subunidades de la proteina Dna abren sucesivamente las hebras de tres seg- ‘mentos ricos en AT, repetidos en tandem, de 13 bp (la secuencia consenso es 5'-GATCTnTTaTTTT~ donde n indica posiciones no especificas) y localizados cerca del limite “izquierdo” de oriC. La existencia del complejo abierto resultante, de ~ 45 bp, se establecié a partir de la sensibilidad a la nucleasa Pl, una endonucleasa especifica para hebras, sencillas. La formacin de este complejo abierto requiere la presencia de la proteina DnaA y de ATP (el cual es fuertemente unido por la proteina DnaA, hidrolizandolo en una reaccién dependiente de DNA) y tiene lugar tnicamente por encima de 22 °C (al menos, in vitro ). No cabe duda que la riqueza en AT de las repeticiones de 13 bp facilita el proceso de separacién de las hebras del DNA. Después, la proteina Dna guia un complejo formado por las proteinas DnaB y DnaC hacia la region con el DNA abierto, formando el denominado complejo pre-iniciador. 4, En presencia de SSB y de girasa, la proteina DnaB, que posee actividad helicasa, desenrolla ain mas el DNA en el complejo pre-iniciador en ambas direcciones, permitiendo asi la entrada de la primasa y de la RNA polimerasa. La participacion de ambos enzimas en la sintesis de los cebadores de la hebra conductora (Seccién 31-1D), junto con la li- mitaci6n de este proceso al sitio oriC, sugiere que la RNA polimerasa debe activar a la primasa para que ésta sintetice al cebador. Ello podria explicar laCapitulo 31, Replicacién, reparacién y recombinacién del DNA 1031 Holoenzima de la DNA polimerase IIL @ Sse, Hebra conductora SWWWWWWY RNA cebador Fragrento de Okazaki reciente o WIWVUWWUWUWW Proteina Rep WWW WUWWUWUIUN. & Helicasa II TOODIOKYX 3 Hebra retraced WIMIWINIVIN Primasoma sintetizando tun nuevo RNA cebador o FS OWUIWUWUVWINIWVIVD Figura 31-20 Replicacién del DNA de E. col. (a) El replisoma del DNA. de E. coll, que se cree contiene dos holoenzimas de la Pol Il, sintetiza tanto la hebra conductora como la hebra retrasada. El molde de la hebra retrasada debe formar tun lazo para permitir que el holoenzima extienda la hebra retrasada, iniciada por el primosoma, (b) El holoenzima libera el mode de la hebra retrasada cuando similitud de los 13 nucledtidos ricos en AT del oriC con los promotores transcripcionales de la RNA. polimerasa (Seccién 29-28). Todo esta a punto para la replicacion bidireccional del DNA mediante el holoenzima de la Pol Il, tal como se ha descrito anteriormente. Helicasas de E. coli Se conocen diez enzimas de E. coli que poseen actividad helicasa. Cada uno de ellos parece tener en Ja célula una funcion especifica dirigida a facilitar procesos como la replicacién, reparacion y recombinacion del DNA, asi como también la transcrip- DIVING Fragmento de Okazaki completo NING RNA cebador a sustituir por DNA mediante la Po! I; rmuesca sellada or la DNA ligasa Fragmento e Okazaki cecién Antiguo fragmento 6 Okazaki encuentra con el fragmento de Okazaki previamente sintetizado. Ello probablemente sirve de sefial para que ‘el primosoma inicie la sintesis del RNA cebador de la hebra retrasada. (c) El holoenzima se une de nuevo al molde de la hebra retrasada y extiende el RNA cebador, formando un nuevo fragmento de Okazaki. Obsérvese que, en este modelo, la sintesis de la hebra conductora, esté siempre mas avanzada que la de la hebra retrasada. cion del RNA. Estos enzimas, los cuales son todos ATPasas dependientes de DNA monohebra, incluyen la proteina UvrABC, que participa en la reparacion por escisién del DNA (Seccién 31-5B), la proteina RecBCD, que interviene en la recombinacién general (Geccién 31-64), el factor rho, el cual finaliza la trans- cripcién desenrollando la hélice de DNA « RNA en la burbuja de transcripcién (Seccién 29-2E) y varias proteinas mas que seran discutidas con detalle mas adelante, Diversas pruebas circunstanciales han sugerido que la helicasa Il (producto del gen worD), junto con la proteina Rep (producto del gen rep) participan en la propagacién de la horquilla de replicacién en E. coli1032, Seccién 31-3. Mecanismos de replicacién procaridtica aaa woe 3 rn ‘it Sau. 1 oD Mr-onan core | 20 abe sma corse sow Sensis a PL l jee onec | ATP coreio Sensiies a P14 Iniciacion y replcacion Figura 31-21 Modelo del inicio de la replicacién del DNA en oriC. (1) Las proteinas DnaA se unen a los cuatro 9-meros, de manera que oriC, convenientemente superenrollado, envuelva un nicleo proteico de 20 a 40 subunidades. (2) continuacién, las tres repeticiones de 13 bp, ricas ‘en AT, se abren en una reaccién impulsada por ATP, formando un complejo abierto, al cual (3) se une el ‘complejo DnaB-DnaC. (4) El complejo abierto es desenrollado aun mas mediante la actividad helicasa de la proteina DnaB, preparando de esta manera el ‘complejo para el inicio y la replicacién bidireccional. {Seguin Bramhil, D. y Kornberg, A., Cell §2, 752 (1988) (Geccién 31-2C). Por ejemplo, la helicasa II estimula Ia replicacion del DNA in vitro, en un proceso que esta activado por la proteina Rep y en el que los mutantes dobles rep/uvrD parecen ser inviables. Sin embargo, muchos de los fenotipos correspondientes a los mutantes wvrD, como pueda ser el aumento de sensibilidad hacia la radiacion UV y otros agentes que danan el DNA, implican a la helicasa II en los proce- 0s de reparacién y/o recombinacién. Las células de E. coli portadoras de genes rep mutantes son viables, si bien sus horquillas de replicacién parecen propa- garse mas lentamente de lo que es habitual en las células de la estirpe salvaje. De ahi que el papel fisiolégico de la proteina Rep en E. coli siga siendo desconocido (aunque se sabe seguro que participa en la replicacion del tipo circulo rodante del DNA de la RFI del fago X174 [Fig. 31-19). Recientemente, se ha demostrado que las proteinas de E. coli responsables de la desenrollamiento del DNA en la horquilla de replicacion son la proteina n’ (también conocida como proteina PriA, ya que es el producto del gen priA), que es una helicasa 3’ > 5’, y la proteina DnaB, que es una helicasa 5’ > 3", ‘Ambas proteinas son componentes del primosoma, el cual se cree que se une al molde de la hebra retrasada en la horquilla de replicacion y, por ello, esta obliga- do a avanzar en la direccién 5’ — 3 (Fig. 31-20). Asi pues, el desenrollamiento del DNA, por delante del avance de la maquinaria de replicacion (el replisoma), requeriria la accién de una helicasa 5’ -» 3’, como la proteina DnaB. Por tanto, se ha sugerido que Ja proteina n’ funcionaria como una translocasa, haciendo pasar el lazo que forma el molde de la hebra retrasada a través del replisoma en la direccion 3’ + 5’, manteniendo asi el tamario del azo a medida que el replosoma avanza en la direccién 5’ —» 3’ La iniciacién de la replicacion del DNA de E. coli esta finamente regulada La replicacién del cromosoma en B. coli tiene lugar una sola vez en cada divisién celular, por lo que este proceso debe estar fuertemente controlado. El tiempo de division de E. coli a 37 °C varia segun las condiciones de crecimiento desde < 20 min hasta ~ 10 h. Sin embargo, la velocidad del movimiento de cada hor- guilla de replicacion es constante e igual a ~ 850 nucledtidos/s, 1o que fija el tiempo de replicacién cro-1034 Seccién 31-3. Mecanismos de replicacién procariética @ o Fou 3124 Si una DNA polimerasa pudiera sintetizar DNA en direccién 3° > 5': (a) El acoplamiento de cada ucle6sido trifosfato a la cadena creciente estaria, tales como el motivo hélice-giro-hélice (Seccién 29- 3C) 0 el dedo de zinc (Seccién 33-3B). La observacion de que cuando la proteina Tus se fusiona a una segunda proteina de unién al DNA, la replicacion es inhibida en el sitio de unién de la segunda proteina, sugiere que la proteina Tus no actia como una simple gtapa, sino que interacciona con la proteina DnaB inhibiendo su accién helicasa. Curiosamente, el gen tus empieza s6lo 10 bp corriente abajo del sitio TerB, lo cual sugiere que la transcripcion de tus esta auto- regulada D. Fidelidad de la replicacion Si un tnico polipéptido, tan pequeito como el fragmento Klenow de la Pol I puede replicar el DNA por si solo, gpor qué E. coli mantiene una serie de > 20 proteinas coordinadas entre si para replicar su cromosoma? Al parecer, la respuesta es para asegurar Ia casi perfecta fidelidad de Ia replicacién del DNA, requerida para conservar la integridad del mensaje genético de generaciin en generaci6n. Las velocidades de reversion de los mutantes de E, coli o del fago T4 a la estirpe salvaje indican que solo, ocurre un error de apareamiento por cada 10* a 10" pares de bases replicados. Ello corresponde a ~ 1 error por cada 1000 bacterias y por generacién. Esta gran precision en la replicacion es debida, en parte, a las funciones exonucleasa 3’ > 5’ de la Pol Ty de la Pol III, que detectan y eliminan los errores ocasiona- les producidos por su funcién polimerasa. De hecho, las mutaciones que aumentan la actividad exonucleasa correctora de las DNA polimerasas disminuyen las tasas de mutacién de otros genes. La incapacidad de una DNA polimerasa para iniciar la elongacién de una cadena sin un cebador parece ser un factor que aumenta Ia fidelidad de Ia replicacin del DNA. Los primeros nucledtidos de una cadena, que se et ony e Pep, pep, |p| oH, a poo, P| p |e. impulsado por la hidrélisis del nucledsido trifosfato unido previamente. (b) La eliminacién de un nucledsido trifosfato 5'-terminal incorrecto haria imposible continuar la elongacién de la cadena de DNA. esta formando, son los que més frecuentemente pueden estar desapareados, debido a la naturaleza coope- rativa de las interacciones en el apareamiento de las bases (Seccion 28-3). Igualmente, la correccin de un oligonucledtido daplex corto es un proceso sujeto a errores. E] uso de cebadores de RNA elimina esta fuente de error, ya que el RNA es sustituido al final por DNA, en unas condiciones que permiten un apa- teamiento de bases preciso. Nos podemos preguntar por qué las células en su evolucién han mantenido un sistema complejo de sintesis discontinua mediante hebras retrasadas, en lugar de una DNA polimerasa que pudiera simplemente extender las cadenas de DNA en la direccién 3’ — 5’. Si consideramos la quimica de la extension de la cadena de DNA, podemos observar que este Moss Preparacion_y division para la mitesis celular 26h Th Preparacién Repicacin para a GelONA- —repicacién 68h del DNA. Quiescencia variable) Figura 31-25 El ciclo de la célula eucaridtica. Las células en G, pueden entrar en la fase de quiescencia (Go), en lugar de seguir el ciclo.Capitulo 31. Replicacion, reparacién y recombinacion del DNA 1035 Proceso también conduce a una elevada fidelidad en la replicacion. La unién de 5'-desoxinucle6tido trifosfatos en direccion 3’ > 5’ requeriria la conservacion del grupo trifosfato 5’-terminal de la cadena creciente para facilitar el siguiente paso de acoplamiento (Fig. 31-242). Después de corregir un nucledtido 5’-terminal desapareado (Fig. 31-248), esta supuesta polimerasa podria, andlogamente a la Pol I, por ejemplo, climinar el nucledtido erréneo, dejando un grupo 5’-OH o bien un grupo 5’-fosfato. Ninguno de estos grupos terminales puede proporcionar la energia necesaria para continuar la extension de la cadena. Por la misma raz6n, una DNA polimerasa 3° -> 5” correctora tendria que ser capaz de reactivar su producto corregido. La complejidad inherente de este sistema, probablemente, ha sido un factor decisivo para que no fuera escogido durante la evolucién. Cualquier error que permanezca en un DNA daplex despues de su replicacion o que aparezca poste- tiormente, debido a ataques quimicos y/o fisicos, puede ser corregido mediante diversos procesos de reparacion del DNA (Seccién 31-5). Estos capacitan a Ja célula para mantener su herencia genética durante su ciclo vital 4, REPLICACION DEL DNA EUCARIOTICO Cada vez parece mas evidente Ia existencia de un elevado grado de similitud entre los mecanismos de re- plicacién del DNA en procariotas y eucariotas, Existen, sin embargo, diferencias significativas entre estos dos sistemas de replicacién, como consecuencia de la mucho mayor complejidad de los eucariotas en compara- cion con los procariotas. En esta seccién considerare- mos estas diferencias. A. El ciclo celular El ciclo celular, la secuencia general de sucesos que ocurren durante la vida de una célula eucaristica, se divide en cuatro fases distintas (Fig. 31-25): 1. La mitosis y la division celular ocurren durante la fase M (de mitosis), que es relativamente corta. 2. Esta fase es seguida por la fase G, (de ‘gap’, intervalo), la cual representa la parte més larga del ciclo celular. 3. La fase G, da paso a la fase S (de sintesis). Esta fase, a diferencia a lo que ocurre en procariotas, ¢s el iinico periodo durante el ciclo celular en que se sintetiza DNA. 4, Durante la fase G,, relativamente corta, la ahora célula tetraploide se prepara para la mitosis. A continuacién, se entra de nuevo en la fase M y asi empieza una nueva vuelta del ciclo celular. El ciclo de las células en cultivo ocupa normalmente un periodo de 16 a 24 h. En cambio, la duracién del Ciclo celular de los diferentes tipos celulares de un organismo pluricelular puede variar entre sélo 8 h y >" 100 dias. Esta variacién se debe, en su mayor Parte, a la fase G;. Ademés, la mayoria de células diferenciadas terminalmente, como las neuronas 0 las células musculares, nunca se dividen; adquieren un estado quiescente 0 de reposo, que se conoce como la fase Gy La “decision” irreversible de proliferar, por parte de la célula, se realiza durante G,. La quiescencia se mantiene si, por ejemplo, los nutrientes se agotan 0 si la célula entra en contacto con otras células (inhibi cin por contacto). Por el contrario, la sintesis de DNA puede inducirse por diversos agentes, tales como carcinégenos 0 virus tumorigenos, los cuales desencadenan la proliferacién celular incontrolada (cancer; Seccién 33-4C); la extirpacién quirargica de un tejido, que puede resultar en una répida regenera- ci6n; 0 por proteinas conocidas como mitégenos, que se unen a los receptores de superficie celulares € inducen de algin modo la division celular. Las células en crecimiento contienen factores citoplasmaticos que estimulan la replicacién del DNA. Por ejemplo, los, extractos de huevos de rana inducen la sintesis de DNA en células del bazo de rana. No obstante, el modo de accién de estos factores es hasta ahora desconocido (sin embargo, véase mas adelante). Tabla 31-5 Propiedades de las DNA polimerasas de animales a 8 Y 8 Localizacion Niicleo Naicleo Mitocondria Nacleo ‘Masa (kD) 120-220, 30-50 150-300 140-160 Inhibidores: Afidicolina Si No No Si Didesoxi NTPs Debi Fuerte Fuerte Debil Arabinosil NTPs Fuerte Debit Débil Fuerte Fuerte Debi Fuerte Fuerte N-Etilmaleimida (NEM)' + Reacciona con las dsteinas (Tabla 6-3). Fuente; Principalmente Kornberg, A., DA Replication, p. 208, Freeman (1980)1036 Seccién 31-4. Replicacién del DNA eucariético B. DNA polimerasas eucariéticas Las células animales contienen, como minimo, cinco tipos diferentes de DNA polimerasas, denomina- das segiin el orden en que fueron descubiertas, DNA. polimerasas 0, B, y, 8 y & (Tabla 31-5; la DNA polimerasa ¢ ha sido descubierta muy recientemente). Sus funciones se fueron elucidando, en gran parte, por sus diferentes respuestas a compuestos inhibidores (Tabla 31-5), ya que s6lo recientemente se han conseguido formas mutantes de estos enzimas. La DNA polimerasa a, que se encuentra tinicamente en el niicleo celular, interviene en la replicacién del DNA cromosémico. Esta funcién fue descrita con deta- le a partir de los trabajos con el inhibidor especifico afidicolina HOH HO OY HOH,C Ht Afidicolina y por la observacion de que la actividad de la DNA polimerasa a varia con la velocidad de proliferacion celular. Esta proteina compuesta de varias subunidades (cuatro tipos de subunidades en Drosophila; cinco en higado de rata), como todas las demas polimerasas, replica el DNA extendiendo un cebador en la direccion 5’ +» 3’ bajo la direccién de un molde de DNA monohebra. La DNA polimerasa a posee una actividad primasa fuertemente asociada. Sin embar- 80, carece de actividad exonucleasa y, por tanto, el DNA que ella replica debe ser corregido por otros me- dios La DNA polimerasa 8, un enzima nuclear sensible a los mismos inhibidores que la DNA polimerasa @ (Tabla 31-5), difiere de esta altima en que la DNA polimerasa 5 carece de la actividad primasa asociada, pero muestra una actividad exonucleasa correctora 3’ = 5’, Otra diferencia es que, al parecer, la DNA polimerasa 8 posee una procesividad ilimitada (es capaz de replicar un molde en toda: su longitud), mientras que la procesividad de la DNA polimerasa es s6lo moderada (~ 100 nucle6tidos). Por todo ello, se ha sugerido que la DNA polimerasa 6 es la replicasa de la hebra conductora (que requiere una elevada procesividad, pero que sélo necesita un cebador ocasionalmente), mientras que la DNA polimerasa es la replicasa de la hebra retrasada (que requiere un cebador frecuentemente, pero que solo precisa de una procesividad de 100-200 nuclestidos). Recientemente, se ha observado que la DNA polimerasa 5 sélo muestra una elevada procesividad cuando esta formando complejo con una proteina de 36 KD, llamada antigeno nuclear de células en proliferacion (PCNA; denominada asi porque sélo se encuentra en los niicleos de las células en prolifera- cin y reacciona con los sueros de un tipo de pacientes con la enfermedad autoinmune lupus erythremato- sus sistémico): Por ello, se cree que, en los eucariotas, la replicasa de la hebra conductora esta constituida por un complejo entre la DNA polimerasa 6 y el PCNA. Recientemente, se ha descubierto una quinta DNA polimerasa eucariética, 1a DNA polimerasa ¢. Aun- que laDNA polimerasa ¢ era anteriormente Hamada DNA polimerasa 8,, debido a su parecido superficial con la DNA polimerasa 8, los dos enzimas difieren en que la DNA polimerasa ¢ es altamente procesiva en ausencia de PCNA. Ademés, la DNA polimerasa & muestra una actividad exonucleasa 3’-» 5’ que solo degrada DNA monohebra a oligonuclestides de 6 a 7 restos, y no a mononuclestidos como hace la DNA polimerasa 6. El hecho de que la DNA polimerasa ¢ es necesaria para la reparacién de las lesiones inducidas por UV en las células HeLa (una linea de células cultivadas de cancer humano) prueba de forma con- vincente que este enzima participa en la reparacion del DNA. No obstante, dado que la DNA polimerasa & es necesaria para la viabilidad de la levadura, este enzima también podria ser necesario para la replicacin del DNA in vivo. La DNA polimerasa B destaca por su pequefio ta- mafo. Se desconoce la funcién biolégica de este enzima nuclear, aunque la observacién de que su nivel de actividad no varia con la velocidad de crecimiento celular sugiere que participa en los procesos de reparacin del DNA. La DNA polimerasa 7 se encuentra exclusivamente en la mitocondria, donde probablemente replica el DNA mitocondrial. Los cloroplastos contienen un enzima similar. Replicacién del DNA de SV40 El virus simico 40 (SV40) es un virus pequefto y relativamente simple (Fig. 32-1g) que contiene un DNA duplex circular de 5243 bp (Fig. 33-34). Se replica en células de primate y, por tanto, proporciona un modelo de replicacién del DNA eucaristico. La replicacion del DNA de SV40 es precedida por la union de miiltiples copias de la proteina de 708 restos, codificada por el virus, denominada antigeno tumoral mayor (antigeno T, SV40 es un virus tumo- rigeno) al origen de replicacién de SV40, de 64 bp (ori de SV40). El antigeno T, la Gnica proteina requerida para la replicacién del DNA de SV40 que no es suministrada por la célula huésped, posee una actividad helicasa, impulsada por ATP, que desenrolla localmente las dos hebras del ori de SV40, permitiendo la union de la SSB eucariética (también conocida como factor de replicacién A [RF-A]) y de una topoisomerasa que continéa desenrollando el daplex de SV40, de manera que la horquilla de replicacion puede ir avanzando, La SSB eucariética es un heterotri- mero que puede sustituir a la SSB de E. coli, aunque no al revés, sugiriendo por tanto que la SSB eucaristi-Capitulo 31. ReplicaciOn, reparacin y recombinacién del DNA 1037 Figura 31-26 Micrografia electronica que muestra multiples ojos de replicacion (flechas) en un fragmento del DNA de Drosophila que se esta replicando. [Tomado de Kreigstein, H. J. y Hogness, D. S., Proc. Natl. Acad. Sci 74, 196 (1974) ca tiene alguna otra funcion ademés de impedir la rehibridacién de las hebras del DNA. Llegado este punto, la replicacién del DNA es iniciada bidireccionalmente por el complejo DNA polimerasa d-primasa, el cual sintetiza un corto fragmen- to de DNA, cebado por RNA (fragmento de Okazaki), en cada hebra (recuérdese que la DNA polimerasa a tiene una actividad primasa estrechamente asociada y no tiene mas que una procesividad limitada). A conti- nuacién, el PCNA, formando complejo con una proteina de miltiples subunidades llamada RF-C (alternativamente, A1), se une al extremo 3’ de la hebra de DNA naciente, impidiendo la extension de la hebra por parte de la DNA polimerasa a. Sin embargo, la DNA polimerasa 8 sustituye a la DNA polimerasa a, uniéndose asi especificamente al complejo PCNA-RF-C en un proceso llamado cambio de polimerasas, y empieza la sintesis de la hebra conductora, extendiéndose progresivamente el fragmento de Oka- zaki (recuérdese que la DNA polimerasa 8 no tiene asociada la actividad primasa pero, formando complejo con PCNA, pose una procesividad ilimitada; RE-C es una proteina accesoria que activa la DNA polimerasa 8). La DNA polimerasa a que ha sido pues liberada se une al lado 5’ de la hebra conductora naciente, donde inicia la sintesis discontinua de la hebra retrasada. Los RNAs cebadores son finalmente eliminados por una RNasa H, los huecos son rellena- dos por una polimerasa, los cortes son sellados por una DNA ligasa y los dos DNAs duplex circulares hijos son desenredados y separados por la accién de tuna topoisomerasa II (Seccién 28-5C). Asi pues, el nico componente celular que todavia no ha sido identificado, como parte del aparato minimo de repli- cacién del DNA eucaridtico, es el equivalente al antigeno T, es decir, una proteina de union al origen de replicacion que reconozca los sitios de iniciacion y que tenga actividad helicasa para crear la horquilla de replicacién. Los cromosomas eucaridticos contienen numerosos replicones Los sistemas de replicacion eucaridticos y procari6 cos difieren obviamente en que el cromosoma eucari6tico posee miltiples origenes de replicacién, a diferencia del cromosoma procaridtico, que tiene un nico origen de replicacién. La DNA polimerasa a sintetiza DNA a una velocidad de ~ 50 nucledtidos/s (~ 20 veces més lenta que las polimerasas procatisticas). Dicha velocidad ha sido determinada autorradiograficamen- te, midiendo las diferentes longitudes de las secciones de cromosoma marcadas mediante un pulso. Consi- derando que un cromosoma eucariético tipico contie~ ne 60 veces mas DNA que los cromosomas procarié- ticos, si utilizara el sistema de replicacién bidireccional, con un solo origen de replicacién, se requeriria ~ 1 mes para finalizarla. Micrografias electronicas, tales como las mostradas en la Fig, 31-26, sin embargo, muestran que el cromosoma eucaridtico posee miltiples origenes de replicacién, uno cada 3 a 300 kb (Kilopares de bases), dependiendo de la especie y del tejido, con lo que la fase S dura normalmente unas pocas horas. Las observaciones citolégicas indican que no todas las diferentes regiones cromosémicas son replicadas simultaneamente, sino que son activados al mismo tiempo grupos de 20 a 80 replicones (unidades de replicacién; segmentos de DNA cada uno de los cuales esta servido por un origen de replicacién) adyacentes. Durante la fase S, son activados nuevos replicones, hasta que el cromosoma entero ha sido replicado, Durante este proceso, los replicones que ya han sido replicados, de algiin modo, son distinguidos de aquéllos que todavia no lo han sido. Experimentos sobre la sintesis del DNA en virus eucaridticos sugieren que la replicacién de los replicones puede ser desencadenada por la transcripcién de cebadores, bajo el control de elementos activadores asociados a los origenes de replicacién (los elementos activadores son aquellas secuencias de DNA que regulan el inicio de la transcripcion, mediante la unién de proteinas estimuladoras de la RNA polimerasa llamadas factores de transcripcién; Seccién 29-2F). En este caso, algunos factores de transcripcion especificos de tejido y de ciclo celular podrian activar determinados replicones. Telomeros y telomerasa Los extremos de los cromosomas lineales no pueden ser replicados por ninguno de los mecanismos vistos hasta ahora. Ello es debido a que el RNA cebador situado en el extremo 5’ de la hebra retrasada, cuando ya ha sido completada su sintesis, no puede ser reemplazado por DNA, ya que no existe el cebador necesario para ello, Entonces, como se replican las secuencias de DNA de los extremos de los cromosomas eucaristicos, es decir, los telémeros? El DNA telomérico posee una secuencia poco corriente, que consta de hasta mil o mas repeticiones en tandem de una sencilla secuencia rica en G, dependiente de especie, situada en la hebra del extremo 3’, al final del, cromosoma. Asi, por ejemplo, el protozoo ciliado Te- trahymena, tiene la secuencia telomérica repetida TIGGGG, mientras que en el hombre es TTAGGG.1038 Seccidn 31-4. Replicacién del DNA eucariético Origen deta etre conductors > A cs Poa af Origen de a hebra retrasada | { Hebra CL desplazada Orgende la 4 hebraretrasada Figura 31-27 Modelo del lazo D de replicacién del DNA. Ademés, en el extremo de esta hebra sobresale una secuencia de 12 a 16 bp. El DNA telomérico se sintetiza a través de un mecanismo tinico. El enzima que sintetiza la hebra rica en G del DNA telomérico se llama telomerasa. La telomerasa de Tetrahymena, por ejemplo, aftade repeticiones en tandem de la secuencia telomérica TIGGGG al extremo 3’ de cualquier oligonucledtido telomérico rico en G, independientemente de cual- quiet molde exogeno afadid. Elo se dedujo a partir lel descubrimiento de que las telomerasas son ribo- nucleoproteinas, cuyos RNAs componentes contienen ‘un segmento que es complementario de la secuencia telomérica repetida. Al parecer, esta secuencia actia ‘como molde en una reaccién del tipo transcriptasa inversa que sintetiza la secuencia telomérica, se trans- loca hacia el nuevo extremo 3’ del DNA y repite el proceso. Esta hipotesis se ha confirmado con la obser- vaci6n de que cuando se introducen mutaciones en el segmento del gen del RNA de la telomerasa, comple- ‘mentario del DNA telomérico, se produce un DNA telomérico que pose la secuencia mutada correspondiente. La hebra del DNA complementaria de la hebra telomérica rica en G, al parecer, es sintetizada.a través de los mecanismos celulares normales de sintesis de la hebra retrasada, explicdndose asi el 3’ saliente de la hebra rica en G. Sin la accion de la telomerasa, el cromosoma se veria acortado en sus extremos en una longitud correspondiente a la del RNA cebador, con cada ciclo de replicacion del DNA y de division celular. Los genes esenciales localizados cerca de los extremos de los ‘ 3’ a partir de un cebador unido a un molde. En el caso de la transcriptasa inversa, sin embargo, este molde es RNA en lugar de DNA. EI descubrimiento de la transcriptasa inversa tuvo, en un principio, una fria acogida en el seno de la comunidad bioquimica, ya que para algunos constituia una herejia contra uno de os dogmas centrales de la biologia molecular (Gecci6n 29-1). Pero la reaccién de la transcriptasa inversa no esta prohibida termodinamica- mente; de hecho, bajo ciertas condiciones, la Pol I también puede copiar moldes de RNA. Las transcriptasas inversas“procedentes del virus del mieloblastoma de ave y del virus del sarcoma de Rous son dimeros formados por las subunidades a y B de 65 y 95 KD, respectivamente. La transcriptasa inversa tiene dos actividades enzimaticas adicionales: 1. Es una exorribonucleasa que degrada especificamente el RNA de un hibrido RNA-DNA (actividad RNasa H; H, de hibrido). 2. Es una DNA polimerasa dependiente de DNA. Durante la infeccién por retrovirus, la transcriptasa inversa transcribe el RNA virico en una hebra de DNA complementario, formandose un hibrido RNA-DNA. A continuacién, el enzima degrada la hebra de RNA y replica el DNA monohebra, formando el DNA diplex que gobierna el resto de la infeccién virica. La transcriptasa inversa ha sido una herramienta especialmente titil en ingenieria genética debido a su capacidad para transcribir mRNAs en hebras complementarias de DNA (cDNA). En la transcripcién de mRNAS eucariéticos, que poseen colas de poli(A) (Geccién 29-4A), el cebador puede ser oligo(dT). Asi, los cDNAs se han utilizado, por ejemplo, como son- das en los anélisis mediante transferencia Southern (Seccién 28-4C) para identificar a los genes que codi- fican sus correspondientes mRNAs. La secuencia de bases de cualquier RNA puede ser determinada facil- rente mediante la secuenciacién de su cDNA (Sec- én 28-6D). 5. REPARACION DEL DNA EI DNA no se puede considerar en ningiin caso una sustancia inerte, como se podria suponer por la esta- bilidad del genoma. Por el contrario, la propia reacti- vidad del medio celular, la presencia de una gran variedad de sustancias toxicas y la exposicion a la radiacién UV 0 a las radiaciones ionizantes someten al DNA a numerosos ataques quimicos que eliminan © modifican bases y alteran los grupos de azticar- fosfato, De hecho, algunas de estas reacciones ocu- ren con una frecuencia sorprendentemente elevada Por ejemplo, todos los dias, en condiciones fisiol6gi- cas normales, el enlace glucosidico de unos 10000 nucle6tidos purinicos se hidroliza esponténeamente en el genoma de una célula humana, Cualquier daio en el DNA debe ser reparado si se quiere mantener la integridad del mensaje genético, La reparacién del DNA es posible gracias a la informacion redundante inherente al DNA diplex. La importancia biologica de la reparacién del DNA se manifiesta por la gran variedad de mecanismos de este tipo que poseen incluso organismos relativamente simples, tales como E. coli. De hecho, los principales procesos de reparacién del DNA en E. coli y en las células de mami- {feros son muy parecidos quimicamente, Dichos procesos se describen en esta seccién. A, Reparacion directa Los dimeros de pirimidina son destruidos por Ia fotoliasa La radiacién UV (200-300 nm) induce la formacion de un anillo de ciclobutilo entre restos de timina adyacentes en la misma hebra de DNA, formandose un dimero de timina intracatenario (Fig. 31-28). Igualmente, se forman dimeros de citosina y de timina-citosina, parecidos a los anteriores, aunque con una menor frecuencia. Dichos dimeros de pitimidi- na distorsionan localmente la estructura de bases apa-1040 Secciém 31-5. Reparacion del DNA Anillo de ciclobutilo Figura 31-28 Dimero de ciclobutitimina, que se forma tras la itradiacién con UV, entre dos restos de timina adyacentes en una misma hebra de DNA. Los enlaces centre los anillos de timina (rojo) son mucho mas cortos que la distancia normal de 3,4 A entre los anillos apilados de! B-DNA, con lo que se produce una distorsién local en el DNA. readas del DNA, con lo que éste no puede ser un buen molde para la transcripcién ni para la replica- ion. Los dimeros de pirimidina pueden volver a su forma monomérica, mediante la accién de un enzima que tiene capacidad para absorber luz y que se halla en todas las formas de vida, denominado enzima fotorreactivante 0 fotoliasa. El enzima de E. coli (64 KD) se une a los dimeros de pirimidina en un proceso que puede ocurrir en la oscuridad y, posteriormente, tras la absorcién de luz de 300 4 500 nm por medio de dos cofactores unidos mediante enlaces no covalentes, una pterina y un FADH,, la fotoliasa corta el dimero. Las alquiltransferasas desalquilan las bases alquiladas La exposicién del DNA a agentes alquilantes, como el N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), produce, entre otros productos, restos de O*-alquilguanina. La formacion de estos derivados resulta altamente mutagénica, ya que durante la replicacion inducen con frecuencia la incorporacion de timina en lugar de citosina. Las lesiones debidas a O*-metilguanina y O*-etil- guanina en el DNA de E. coli y de las células de mamiferos son reparadas por la O*-metilguanina- DNA metiltransferasa, la cual transfiere directamente el grupo alquilo a uno de sus propios restos de Cys. Dicha reaccién inactiva esta proteina, por lo cual no puede ser considerada estrictamente como un enzima. La reaccién de la alquiltransferasa es estudiada con considerable atencin debido a que la carcinogé- nesis inducida por agentes metilantes y etilantes se correlaciona con deficiencias en la reparacién de las lesiones por O*-alquilguanina. B. Reparaci6n por escision Los dimeros de pirimidinas también pueden ser reparados por un proceso denominado reparacién por escisiGn. En este mecanismo de reparacion, el oligo- nucleétido que contiene Ia lesin es escindido del DNA y el hueco que resulta en una de las hebras es rellenado, En E, coli, los dimeros de pirimidina son reconocidos por un enzima con miiltiples subunidades, producto de los genes word, uvrB y worC, Esta endonucleasa UvrABC, en una reaccién dependiente de ATP, corta el octavo enlace fosfodiéster en el lado 5’ del dimero y el cuarto en su lado 3’ (Fig. 31-29). El oligonucledtido escindido es sustituido por la accién de una DNA polimerasa, probablemente la Pol I, seguido por la accion de una DNA ligasa. La endonucleasa UvrABC escinde otros tipos de lesiones en el DNA, ademas de los dimeros de pirimidina. Estas lesiones se caracterizan por el desplaza- Endonucleasa UwABC Pol I, ONA ligase | | Figura 31-29 Mecanismo de reparacién por escisién de fotodimeros eo pirimidina. [Segun Haseltine, W. A. Cell 33, 15 (1983),]Capitulo 31. Replicacién, reparacién y recombinacién del DNA 1041 miento de las bases de su posicién normal, como cocurre en los dimeros de pirimidina, 0 por la adicion de un sustituyente voluminoso a una base. Por supuesto, la endonucleasa UvrABC es activada por la distorsién de la doble hélice y no por el reconocimiento de un determinado grupo. El xeroderma pigmentosum se debe a una deficiencia genética de la reparacién por escision En el hombre, la enfermedad hereditaria, poco comin, xeroderma pigmentosum (del griego: xeros, seca + derma, piel) es debida a la incapacidad de las células de la piel para reparar las lesiones en el DNA que han sido inducidas por rayos UV. Los individuos que padecen esta afeccién autosémica recesiva son extremadamente sensibles a la luz solar. Durante la infancia, padecen importantes cambios en su piel, tales como sequedad, abundantes pecas y queratosis (un tipo de tumor de la piel), ademas de enfermeda- des oculares, como opacidad progresiva y ulceracién de la cornea. Finalmente, desarrollan cancer de piel, a menudo fatal. Los cultivos de fibroblastos procedentes de la piel de individuos con xeroderma pigmentosum son deficientes en la reparacién por escisin de dimeros de pirimidina. Experimentos de fusion celular, con cultivos de célu- las de diferentes pacientes, han demostrado que esta enfermedad es debida a un defecto en uno de los nueve grupos de complementacion existentes. Asi pues, el hombre posee, al menos, nueve productos génicos implicados en la, sin duda importante, repa- tacién de los daiios causados por rayos UV. Las glucosilasas eliminan las bases alteradas Las bases del DNA son modificadas por reacciones que suceden en condiciones fisiol6gicas normales, asi como por la accién de agentes ambientales. Por ejemplo, la adenina y la citosina se desaminan de forma espontanea a velocidades finitas, formandose restos de hipo- xantina y uracilo, respectivamente. La S-adenosilmetionina, un agente metilante comin en el metabolis- ‘mo, a veces metila una base de forma no enzimatica, formandose derivados como los restos de 3-metiladenina y 7-metilguanina. Las radiaciones ionizantes pueden promover reacciones de apertura de anillo en las bases. Estos cambios modifican o eliminan propiedades del apareamiento de las bases. EL DNA que contenga una base daftada puede ser devuelto a su estado nativo mediante otra forma de reparacion por escisién. Las células poseen un con- junto de DNA glucosilasas, cada una de las cuales reconoce el enlace glucosidico correspondiente a un tipo especifico de nucledtido alterado (Fig. 31-30), dejando asi el resto de desoxirribosa en el esqueleto de la doble hélice. Estos sitios apurinicos o apirimi- dinicos (AP) son también creados, en condiciones fisiologicas normales, por la hidrolisis espontanea del enlace glucosidico. En ambos casos, el resto de desoxirribosa es cortado en uno de los lados por una endonucleasa AP, la desoxirribosa y varios restos DNA glucosasa oH Figura 31-30 Las DNA glucosilasas hidrolizan el enlace glucosidico de la base alterada correspondiente (rojo), generando un sitio AP. adyacentes son eliminados por la accion de la DNA polimerasa o alguna otra exonucleasa celular, y el hueco resultante es rellenado y cerrado por la DNA polimerasa y la DNA ligasa. El uracilo en el DNA seria altamente mutagénico Durante el tiempo que siguié a la elucidacion de las funciones basicas de los dcidos nucleicos, no se en- contro una raz6n aparente para explicar por qué la naturaleza hace un gasto metabolico considerable usando timina en el DNA y uracilo en el RNA, te- niendo en cuenta que estas sustancias poseen propiedades virtualmente idénticas en cuanto al apareamiento de bases. Este enigma se solucioné con el descubrimiento de la tendencia de la citosina a con- vertirse en uracilo por desaminacién, bien esponta- neamente o bien por reaccién con nitritos (Sec- cin 30-14). Si U fuera una base habitual en el DNA, la desaminacién de C seria altamente mutagénica, ya que no habria forma de distinguir si el desapareamiento resultante G - U habia sido inicialmente G - C 0 bien A- U. Sin embargo, dado que T es la base propia del DNA, cualquier U en el DNA es casi con toda certeza una C desaminada. Los uracilos que aparecen en el DNA son eliminados eficazmente por la DNA glucosilasa uracil N-glucosilasa y, posteriormente, sustituidos por C mediante reparacin por escision. La uracil N-glusosilasa también tiene una importante funcién en la replicacién del DNA. El dUTP, un intermedio en la sintesis del dTTP, est presente en pequefias cantidades en todas las células (Sec- ion 26-4B). La DNA polimerasa no discrimina bien entre dUTP y dTTP (recordar que las DNA polimera-1042. Secciém 31-5. Reparacién del DNA LTTE 5 Replicacién | 2 ra) Ton eee i TL — tes icon nce Reparacion por recombnacién DNA que contene un dimero de pirimidina DNA duplex normal — Hebra paterna danada — Hebra hia reparada Hebra hija normal Lt — Hebra petera con hueco Uenado y higacion Figura 31-31 DNA que contiene un dimero de pirimigina [DNA diplex normal En la reparacion por recombinacién, el huéco dejado en la hebra de DNA de nueva sintesis, frente a la hebra donde se encuentra el dafio, es llenado por el segmento correspondiente tomado de su duplex hermano. sas seleccionan una base para incorporarla al DNA segin su capacidad de aparearse con la base de la hebra molde), con lo que, a pesar del bajo nivel celular de dUTP (Seccién 26-48), el DNA de nueva sintesis contiene a veces alguna U. Estas son répida- mente sustituidas por T mediante la reparacién por escision. Sin embargo, dado que la escisién ocurre con mayor rapidez que la reparacién, el DNA de nueva sintesis aparece fragmentado, Cuando los fragmentos de Okazaki fueron descubiertos por primera vez, (Seccién 31-10), se crey6, por tanto, que todo el DNA era sintetizado de forma discontinua. Esta am- bigtedad fue resuelta con el descubrimiento de una cepa de E. coli deficiente en uracil N-glucosilasa. En estos mutantes, Ilamados ung", tnicamente la mitad del DNA de nueva sintesis aparece fragmentado, indicando que la hebra conductora del DNA se sintetiza de forma continua. C, Reparacion por recombinacién EI DNA danado puede ser replicado antes de que los sistemas de reparacion descritos anteriormente puedan actuar. La replicacién del DNA, que contiene un dimero de pirimidinas, es interrumpida por la dis- torsion de la hebra molde y s6lo es reanudada una vez soprepasado el sitio donde se encuentra el dimero. La hebra hija resultante tendré un hueco frente al dimero de pirimidina (Fig. 31-31). Esta lesion genética no puede ser eliminada mediante reparacin por escision, ya que en este caso se precisa una hebra comple- ‘mentaria intacta, Atn asi, queda una hebra intacta en la otra doble hélice hija que se esta formando en la misma horquilla de replicacion. Asi pues, la lesion puede ser corregida por un proceso conocido como Teparacién por recombinacién o, alternativamente, recombinacién posreplicativa (Fig. 31-31). Este mecanismo se basa en el intercambio de los segmentos homélogos de las hebras de DNA hermanas, colocindose asi el segmento de DNA, que tiene el hueco, sobre la hebra no daiiada, donde Ia discontinuidad puede ser reparada y cerrada. El dimero de pirimidina, que esta asimismo asociado con su hebra complementaria intacta, puede ser eliminado entonces mediante repara- cién por escision o fotorreactivacién. La reparacin por recombinacién fue detectada directamente graciasCapitulo 31. Replicacién, reparacién y recombinacién del DNA 1043 Estado no inducido “~“ DNA no dafado Estado Indueldo Operador Hacia otras genes controlados por Lew reprimiendo la sintess de proteinas implicadas en la respuesta SOS Figura 31-32 En una célula con el DNA no dafiado (parte superion, LexA reprime en gran parte la sintesis de LexA, RecA, RecBCD, UvrABC y otras proteinas implicadas en la respuesta SOS. Cuando se ha producido un dafio a la observacin de que habia segmentos de DNA paterno, marcado isotépicamente, que se transferian a las hebras hijas. La reparacién por recombinacién se asemeja mucho a la recombinacién genética. De hecho, en E. coli, ambos procesos son mediados por la proteina RecA, una nucleasa de 38 KD, que promueve el intercambio de hebras hermanas entre segmentos de DNA homdélo- gos. Asi pues, las E. coli que poseen mutaciones en el gen recA son deficientes tanto en la reparacion por recombinacién (siendo extremadamente sensibles a Jas radiaciones UV) como en la recombinacién genéti- ca. El mecanismo de la recombinacién genética lo consideramos en la Seccién 31-6A. B | | | «se A B ° J | a 4 — ! < as OWS _——— i ae . JS alinean y son cortadas. Estas hebras cortadas se entre- cruzan para aparéarse con las hebras casi complementarias del daplex homélogo, formando asi un segmento de DNA heterodaplex, después de lo cual se cierran los cortes (Fig. 31-34a-e). Los estudios de construccién de modelos indican, quizas inesperada- mente, que las bases de esta estructura de Holliday, formada por cuatro hebras de DNA, pueden aparearse por completo sin problemas estéricos, de tal manera que la estructura entrecruzada es probablemente estable (Fig. 31-35). El punto de entrecruzamiento puede desplazarse en una u otra direccién, en un proceso conocido como la migracién de las ramas (Fig. 31-34e y f). La estructura de Holliday puede resolverse de dos ‘maneras con igual probabilidad, produciendo dos DNAs diplex (Fig. 31-34g-I): 1. Si se cortan las hebras que no se entrecruzaron, se intercambian los extremos de los duplex originales, formandose, después de cerrarse nuevamente los cortes, la tradicional molécula de DNA recombinante (ramal derecho de la Fig. 31-34j-1). Si se cortan las hebras que sé entrecruzaron, se intercambia un par de segmentos homélogos de DNA monohebra (ramal izquierdo de la Figura 31-34j-1), La recombinacién de DNAs daplex circulares conduce a las estructuras cuyos diagramas se presentan en la Fig. 31-36. En la Fig. 31-372, se muestra la prueba, obtenida mediante microscopia electronica, de la existencia de la postulada “figura en 8°, Se demostré que estas estructuras de figura en 8 no son simples circulos retorcidos. Para ello se cortaron con un enzima de restriccién, generandose las estructuras chi (por su semejanza con la letra griega x), tal como se muestra en la Fig, 31-376. Xx; ‘ goes es ) ee neni ; es OE ores DNA homélogos.Capitulo 31, Replicacién, reparacion y recombinacién del DNA 1087 Figura 31-35 Modelo molecular que muestra cémo las conexiones entre dos DNAs duplex entrecruzados pueden llevarse @ cabo sin distorsiones moleculares importantes. [Tomado de Sigal, N. y Alberts, B., J. Mol. Biol. 71, 792 (1972) Copyright © 1972 de Academic Press, Inc.] La recombinacién general en E. coli es catalizada por RecA La observacién de que las células de E, coli rec presentan una frecuencia de recombinacion 10+ veces menor que la estirpe salvaje indica que la proteina RecA tiene una funcién importante en la recombinacion. ‘Aun mas, RecA aumenta enormemente la velocidad con que se renaturalizan las hebras complementarias in vitro, Esta proteina tan versatil (recuérdese que también estimula la autoproteolisis de LexA que des- encadena la respuesta SOS; Seccién 31-5D) recubre el DNA monohebra, formando una hélice arrollada a la derecha de 120 A de diametro, en la cual cada mono: mero de RecA se estima que se une a cuatro nucle6ti dos (Fig, 31-38). La formacién de este complejo estimula también la union de RecA a DNA duplex, el cual es examinado unidireccionalmente por RecA en busca de un segmento que sea complementario al DNA monohebra. En este proceso, RecA desenrolla el duplex desde 10,5 bp/vuelta, caracteristico del B-DNA, hasta 18,6 bp/vuelta. Tras encontrar un segmento complementario, RecA desenrolla atin mas el daplex y, en una reacci6n impulsada por la hidrolisis de ATP, catalizada por RecA, intercambia el DNA monohebra por la correspondiente hebra del diplex (Fig. 31-39). En la Fig. 31-40, se presenta un diagrama del modelo que explica cémo puede realizar este proceso RecA. EI proceso de intercambio de hebras mediado por RecA requiere que una de las hebras de DNA participantes tenga un extremo libre y s6lo tolera un cierto grado de desapareamiento. En la asimilacién de un circulo monohebra por parte de un duplex lineal, el extremo 3’ de la hebra duplex que se aparea con la monohebra invasora debe ser complementario a esta hebra invasora (Fig. 31-41), La invasin, ademas, no puede pro- Figura 31-36 Recombinacion general entre dos duplex de DNA circulares. Este proceso puede originar o bien dos irculos de igual tamano que los iniciales, o bien un solo circulo compuesto. seguir mas allé del extremo 3’ de un segmento muy desapareado en la hebra complementaria. La invasién de la monohebra debe, por tanto, empezar por su extremo 5’, Naturalmente, los dos procesos de intercambio de hebras deben ocurrir simultaneamente en la estructu- ta de Holliday (Figs. 31-34 y 31-36). Un modelo para el consiguiente proceso de migracién de las ramas aparece en el diagrama de la Fig. 31-42. RecBCD inicia la recombinacién produciendo cortes en una de las hebras Los cortes en una de las hebras, a los que se une RecA, son producidos por la proteina RecBCD, pro-1048 Seccién 31-6. Recombinaci6n y elementos genéticos maviles (@) @ Figura 31-37 Microgratias electrénicas de los intermedios en la ecombinacién general de dos plasmidos. (a) Estructura de figura en 8. Esta corresponde a la Fig. 31-364. (b) Estructura chi que resulta del tratamiento de una figura en 8 con una endonucleasa de restriccién. Obsérvense las conexiones monohebra en la regién de entrecruzamiento. [Por cortesia de David Dressler y Huntington Potter, Harvard Medical School.) Figura 31-38 Imagen al microscopio de barrido con efecto tinel de la proteina RecA formando un complejo con el DNA. Las fechas grandes sefialan uno de los complejos RecA-DNA; las flechas pequefias sefialan el DNA libre. Las barras indican una distancia de 20 nm en cada direcci6n. Las estrias en el complejo RecA-DNA se. eben al paso de rosca de 10 nm de esta estructura helicoidal. [Tomado de Amrein, R., Stasiak, A., Gross, H. Stoll, E. y Travagiini, G., Science 240, 515 (1988) Copyright © 1988 de American Society for the Advancement of Science] Hebe sencilla + + SoesodN Doble heora a esplazar Figura 31-39 Asimilacion de una hebra sencilla en un DNA duplex, Catalizada por RecA. Para que ocurra este proceso, es ecesario que una de las hebras tenga un extremo libre. (1) Hebra lineal + duplex circular cerrado covalentemente. (2) Hebra sencilla circular + duplex lineal.Capitulo 31. Replicacién, reparacién-y-recombinacién del DNA 1049 @ © Figura 31-40 ‘Modelo hipotetico del apareamiento ¢ intercambio de hebras entre DNAs monohebra y duplex, mediados por RecA. (a) El DNA monohebra se une a RecA, formando el complejo de iniciacién. (b) El DNA duplex se une al complejo de iniciacién, formandose transitoriamente una triple hélice que media el apareamiento correcto de las, hebras homélogas. (c) RecA hace girar las bases de las hebras homdlogas alineadas, para efectuar el intercambio de hebras. [Segun Howard-Flanders, P., West, S. C. y Stasiak, A., Nature 309, 217 (1984),] ducto de 330 kD de los genes del sistema SOS recB, recC y recD (Fig, 31-43). RecBCD actia desenrollando el DNA diiplex, en un proceso impulsado por ATP y, posteriormente, lo enrolla nuevamente. Sin embargo, RecBCD desenrolla el DNA a mayor velocidad que lo enrolla, de forma que la proteina se ve acompafiada por dos lazos monohebra crecientes, a medida que avanza unidireccionalmente a lo largo de la hélice. Cuando encuentra la secuencia GCTGGTGG, vinien- do del extremo 3'(la llamada secuencia Chi, que se encuentra aproximadamente cada 10 kb en el genoma de E. coli), RecBCD corta esa hebra en un punto situado de 4 a 6 nuclestidos mas alla ‘del lado 3° de Chi, produciendo asi el segmento monohebra al que se une RecA. Ello explica la observacién de que las secuencias Chi se encuentran en regiones que poseen frecuencias elevadas de recombinacion. RecBCD sélo puede comenzar el desenrollamiento del DNA en un extremo libre del duplex. Tales extre- ‘mos no estan presentes normalmente en E. coli, que pose un genoma circular, pero pueden aparecer du- ante procesos recombinatorios, como la conjugacién bacteriana (Seccién 27-1D), la transduccién virica (Geccién 27-18) y la transformacién bacteriana (Sec- ion 27-2A). ‘Aunque no se ha esclarecido totalmente el mecanismo detallado de la recombinacién genética, parece evidente que ademas de RecA y RecBCD existen otras, proteinas que participan en los procesos de recombi- nacién en E. coli. Al parecer, la topoisomerasa I (enzima de “cortar y sellar’; Seccién 28-5C) es necesaria para mitigar el superenrollamiento generado por el proceso de recombinacién. La proteina SSB también participa en la recombinaci6n: ayuda a mantener el DNA en su estado monohebra y probablemente regu- Ja también la funcién de RecA. La nucleasa que separa los dos duplex recombinantes (Figs. 31-34) y 31- 36f) atin no ha podido ser identificada, aunque se sospecha que pueda ser RecBCD. B. Transposicion A principios de los aftos cincuenta, basandose en analisis genéticos, Barbara McClintock estableci6 que el patron de pigmentacion abigarrado de los granos del maiz es el resultado de la accién de elementos genéticos que pueden trasladarse a lo largo del genoma del maiz. Esta propuesta fue ignorada estrepitosa- mente debido a que era contraria a la ortodoxia gené- tica establecida de que los cromosomas estin formados por genes ligados en un orden fijo. Tuvieron que pasar 20 aftos hasta que se obtuvieron pruebas de la existencia de elementos genéticos méviles en otro organismo, E. coli Los transposones transportan genes entre sitios no relacionados En la actualidad, se sabe que los elementos transpo- nibles 0 transposones son comunes tanto en procariotas como en eucariotas, en los que intervienen en la varia- cién de la expresin fenotipica a corto plazo y en el desarrollo evolutivo a largo plazo. Cada transposon codifica los enzimas que catalizan especificamente su inser- cién en el DNA receptor. Este proceso se ha descrito como recombinacion ilegitima, ya que no requiere homologia entre el DNA receptor y el dador. A diferencia de la recombinaci6n general, la transposicién es un proceso muy poco eficiente: ocurre con una frecuencia de solamente 10°? a 10~* sucesos en cada generacion. Se han caracterizado transposones con tres niveles de complejidad:1050. Seccidn 31-6. Recombinacién y elementos genéticos moviles Te = an, af ~~ DNA ‘Asimilacién imposible de un DNA no complementario eel Vnoeognproooow—™ POC) No hay asimitacén ° roo app gH 5 La strc so deere on Figura 31-41 segmento heterdlogo La asimilacion, catalizada por RecA, de un circulo monohebra por un DNA diplex ee puede courrir Unicamente si el diplox poses un extremo 3" que puede aparear sus Arroyo? bases con el cirulo. La asimlacion de la hebra no puede avanzar a lo largo de un segmento no complementari. Proena Race treme tie de cpex ReeBcD RONG NINANG aya so eee ATP. \ ears Chi - ADP + P; __- taro monobebra recur Modelo de la migracién de ramas mediada RecA, que forma un filamento de nucleoproteina en un | Roture DNA diplex, promueve la migracién de ramas por rotacién de! segundo duplex, el cual esta unido al primero por entrecruzamiento, alrededor del filamento. La reaccién es unidireccional e impulsada por la 3" hidrbisis de ATP, catalizada por RecA. [Seguin Cox, M. VID GNOX M.y Lehman, |. R., Annu. Rev. Biochem. 56, 252 (1987).] ° @ Reca 3 , Figura 31-43 Oe \Sopoe Modelo de la generacién de DNA monohebra por OPO RecBCD al inicarse la recombinacién. RecBCD se une a un extremo libre del DNA diplex y, en un proceso 3 - impulsado por la hidrdlsis de ATP, avanza a lolargode 7 la hélice, desenrollando el DNA y enroliéndolo después 5 ‘nuevamente algo mas despacio, forméndose dos lazos, monohebra. RecBCD corta uno de estos laz0s en un punto situado de 4 a 6 nucledtidos en el lado 3° de una ‘secuencia Chi orientada adecuadamente, produciendo % asi el DNA monohebra con capacidad invasora, al que xs se une RecA inicialmente.Capitulo 31. Replicacién, reparacién-y:recombinaeién del DNA 1051 Secuencia eer Secuencia diana | diane Figura 31-44 Los elementos IS, asi como los demas transposones, oseen repeticiones terminales invertidas (numeros) y estan flanqueados por repeticiones directas de las, secuencias diana del DNA huésped (letras). Tabla 31-6 Propiedades de algunos elementos de insercion Repeticion _Repeticion terminal directa en la Elemento de Longitud —_invertida__—_secuencia insercién op) op) diana (bp) Ist 768 23 9 Is2 1327 a 5 184 1428 18 Mow 185 1195 16 4 Fuente: Lewin, B., Genes (3. ed), p. 591, Wiley (1987). 1, Los transposones mas sencillos, y los primeros que fueron caracterizados, se denominan. secuencias de insercién o elementos IS. Se designan con las siglas “IS’, seguidas de un nimero de identifica- cin. Los elementos IS son constituyentes habitua- les de los plasmidos y cromosomas bacterianos. Por ejemplo, una cepa corriente de E. coli pose ocho copias de IS1 y cinco copias de IS2, Los elementos IS poseen normalmente < 2000 bp. Entre ellos se encuentra el denominado gen de la transposasa y, en algunos casos, un gen regulador, flanqueado por cortas repeticiones terminales invertidas (que presentan orientaciones opuestas) (Fig. 31-44 y Tabla 31-6). Las repeticiones invertidas son esenciales para la transposicion; su altera- cin genética impide invariablemente este proceso. Un elemento IS insertado esta flanqueado por un segmento del DNA huésped repetido directamente (con la misma orientaci6n) (Fig, 31-44). Ello sugiere que un elemento IS se inserta en el DNA hués- ped haciendo un corte en bisel, que posteriormente es rellenado (Fig. 31-45). La longitud de esta secuencia diana, generalmente de 5 a 9 bp, aunque no la secuencia, es caracteristica del elemento IS. 2. Los transposones mas complejos poseen genes que no participan en el proceso de transposicién como, por ejemplo, genes de resistencia a antibidticos, Dichos transposones se designan con “Tn”, seguido por un. niimero de identificacion. Por ejemplo, Tn3 (Figura 31-46) consta de 4957 bp y posee repeticiones terminales invertidas de 38 bp. La region central de Tn3 codifica tres proteinas: (1) una transposasa de 1015 restos denominada TnpA; (2) una proteina de Corte en bse enel DNA huésped | Transposén, Repeticin inverts enact y lgacién i Figura 31-45 Modelo de la generacién de repeticiones directas de la ‘secuencia diana debido a la insercién de un transposon. 185 restos conocida como TnpR, con funcién re- presora sobre la expresion de inpA y tmpR, asi como de mediadora en la reaccién de recombina- cién especifica de sitio necesaria para la transpo- sicién (ver mas adelante), y (3) una B-lactamasa que inactiva la ampicilina (Seccién 10-3B). La recombi- naci6n especifica de sitio tiene lugar en una region rica en AT, conocida como sitio de resolucién interna, que esta ubicada entre tnpA y tnpR. 3. Los denominados transposones compuestos (Fig. 31-47) consisten en una region central, que contiene genes, flanqueada por dos médulos idén- ticos 0 casi idénticos, similares a las IS, que tienen © bien la misma orientacién relativa o bien invertida, Parece, por tanto, que los transposones compuestos surgieron de la asociacion de dos elemen- Repeticién inverse Repeticion invertida Sito de resolve interno Transpasasa PrLactamasa Represor y resolvasa Figura 31-46 Mapa del transposén Tn3.1052 Seccidn 31-6. Recombinacién y elementos genéticos méviles @ Méuios Médiios semejantes a 1S semejantes 2 18 — — o — <— 4 See 7 is ze Repeticiones Repetciones invertidas invertidas Figura 31-47 Un transposén compuesto consiste en dos médulos idénticos 0 casi idénticos, parecidos a un IS (verde), que flanquean una regién central portadora de varios genes. Los médulos semejantes a IS pueden tener rientaciones relativas (a) directas o (b) invertidas. tos IS independientes. Debido a que los médulos similares a las IS estan flanqueados por repeticiones invertidas, los extremos de cada tipo de trans- posén compuesto deben ser tambien repeticiones invertidas. Los experimentos demuestran que los transposones compuestos pueden transponer cualquier secuencia de DNA contenida en su region central. Si se introduce un plasmido que contiene un transposon en una célula bacteriana portadora de un plasmido que carece del transposén, en algunas de las células de la progenie ambos tipos de plasmidos con- tendran el transposén (Fig. 31-48). Parece claro que la transposicién implica la replicacién del transposén en el plasmido receptor, a diferencia de lo que sugerian los primeros experimentos realizados, que hacian suponer la transferencia de dador a receptor. En este caso, la pala- bra “transposicin” esta mal empleada. Mecanismo propuesto para la transposicion Dos plasmidos, uno de ellos conteniendo un tras- posén, pueden fusionarse ocasionalmente para for- Muchas ‘generaciones| Bacteria Figura 31-48 La transposicion inserta una copia del transposén en el sitio diana, mientras que otra copia permanece en el sitio de origen. Cy C) nd Ve Figura 31-49 Un cointegrado se forma por la fusién de dos plésmidos, uno de ellos con un transposén, de manera que las dos. Uuniones del plasmico original contienen transposones con la misma orientacién (flechas) mar un cointegrado, que contiene copias del transpo- s6n en la misma orientacién en las dos uniones del plasmido original (Fig. 31-49). Mas atin, algunas célu- las de la progenie de una célula, que lleva un cointegrado, carecen del cointegrado pero, en su lugar, contienen los dos plasmidos originales, cada uno de ellos con una copia del transposon (Fig, 31-48). El cointegrado, por tanto, debe ser un intermedio en el proceso de transposicion, EI mecanismo de la transposicién es desconocido, Sin embargo, un modelo plausible para este proceso (entre otros), que recoge todas las observaciones anteriores, consta de los siguientes pasos (Fig. 31-50): 1. Tal como muestra el diagrama de la Fig, 31-45, se genera un par de cortes monohebra en bisel, en la secuencia diana del plasmido receptor. De igual manera, se producen cortes monohebra en las hebras opuestas a cada lado del transposén. Cada uno de los extremos libres del transposon se une a una monohebra saliente en el lugar de inser- ci6n. Ello produce una horquilla de replicacion en cada extremo del transposon, El transposon se replica, produciendo asi un cointegrado, A través de un entrecruzamiento especifico de sitio entre los sitios de resolucin internos de ambos transposones, el cointegrado se resuelve con la formacién de los dos plasmidos originales, conteniendo cada uno un transposon. Este proceso de recombinacién est catalizado por una resolvasa, codificada en el transposén (TnpR en T3), y no por RecA; la transposicién funciona normalmente en células recA~ (aunque RecA puede resolver, a una velocidad mas reducida, un cointegrado que contenga un transposén con una resolvasa mutante 0 con un sitio de resolucién interno defectuoso). La transposicién es responsable de buena parte de la reorganizaci6n genética Ademas de mediar su propia insercién en el DNA, los transposones promueven inversiones, deleciones y reordenaciones del DNA huésped. Las inversiones pueden ocurrir cuando el DNA huésped contiene dos copias de un mismo transposon en orientaciones invertidas. La recombinacién de dichos transposonesCapitulo 31. Replicacién, reparacién y recombinaci6n del DNA 1053 Plismido dador ste Ge cote — t Secuencia diana Plésmido receptor Rotura espectica e sito y gacion CCointegrad Sitios de recombinacién { Resolucion Plasmido ador } Pidsmido receptor que contiene transposén y secuencia diana dupicada Figura 31-50 ‘Modelo de la transposicién con los intermedios implicados en la resolucién del cointegrado. Los segmentos de color mas claro representan DNA de nueva sintesis. (Segun Shapiro, J. A., Proc. Natl. Acad, Sci. 76, 1934 (1979).] invierte la orientacion de la region comprendida entre ellos (Fig. 31-514). Si, por el contrario, los dos transposones tienen la misma orientacién, la resolucion de esta estructura, parecida a un cointegrado, produce la delecién del segmento comprendido entre los dos transposones (Fig. 31-51b; si el segmento delecionado carece de origen de replicacién, no podra ser propaga- do). La delecién de un fragmento cromosomico mediante este sistema, seguida por su integracién en otro punto del cromosoma a través de otro proceso independiente de recombinacién, causa una reordenacion cromosémica. La transposicién parece ser importante en la evolu- cién de los cromosomas y de los plasmidos. De hecho, se ha sugerido que los transposones son las “herramientas” de la ingenieria genética natural. Por ejemplo, la rapida evolucion, desde que los antibidticos son de uso corriente, de los plasmidos que confie- ten resistencia a varios antibidticos (Seccion 28-8A), es el resultado de la acumulacion de los correspondientes transposones con resistencia a antibioticos en esos plasmidos. Las reordenaciones mediadas por transposones pueden ser responsables de la organiza- cion de genes distantes originalmente en operones regulados coordinadamente, asi como de la formacién de nuevas proteinas por unién de segmentos de genes independientes. Mas atin, Ia presencia de transposones idénticos en bacterias no relacionadas indica que la transferencia de informacion genética entre organismos mediada por transposones no est limitada a especies cercanas, contrariamente a lo que ocurre en la transferencia genética mediada por la recombinacién general. in de fase esta mediada por la transposicion La expresion fenotipica en bacterias puede ser regu- Jada por mecanismos de transposicion. Por ejemplo, ciertas cepas de Salmonella typhimurium fabrican dos versiones antigénicamente distintas de la proteina flagelina (el componente principal del flagelo en forma de latigo con el cual se propulsa la bacteri Seccién 34-3G) que se designan H1 y H2, Solo una de estas proteinas se expresa en una célula determinada pero, una vez cada 1000 divisiones celulares, en un proceso conocido como variacién de fase, la célula cambia el tipo de flagelina sintetizada. Se cree que la variacion de fase capacita a Salmonella para eludir las defensas inmunologicas del huésped. Qué es el mecanismo de variacién de fase? Los dos genes de la flagelina residen en diferentes partes del ‘cromosoma bacteriano. H2 esté ligado al gen rh1, que codifica el represor de la expresion de Hi (Fig. 31-52). De ahi que, cuando se expresa la unidad transcripeio- nal H2-rh1, es reprimida la sintesis de H1; si no, se sintetiza H1. Melvin Simon ha demostrado que la expresin de la unidad H2-rh1 esta controlada por la orientacién de un segmento de 995 bp colocado en direccion 5’ de H2 (Fig. 31-52). Este segmento, que esta flanqueado por repeticiones invertidas de 14 bp, contiene un promotor para la expresién de H2-rh1.1054 Seccién 31-6, Recombinacion y elementos genéticos méviles @ Transposones con ofientaciones inverts Apareamiento de repeticiones invrtidas Recombinacin LL segmento invertido ——I Figura 31-51 Modelos de recombinacién para: (a) Inversién de un ‘segmento de DNA entre dos transposones idénticos con rientaciones invertidas. (b) Delecion de un segmento de También contiene el gen hin, que codifica una resolvasa que dirige la inversion de este segmento de DNA mediante un mecanismo similar al mostrado en el diagrama de la Fig. 31-51a (de hecho, la proteina Hin es homéloga en un 33 % a TnpR, lo cual indica que estas proteinas tienen un antepasado comin). En bacterias en Fase 2 (Fig. 31-522), el promotor orientado correctamente esta justamente corriente arriba de H2, con lo que este gen y rh son expresados coordinadamente, reprimiendo asf la sintesis de H1. En bacterias en Fase 1 (Fig. 31-525), sin embargo, este segmento esta en la orientacién contraria. Por consiguiente, al carecer ahora de promotor, no se expresan ni H2 ni rhl, con lo que se sintetiza H1, En eucariotas, la transposicion ocurre a través de intermedios de RNA Los transposones aparecen en eucariotas tan distantes desde el punto de vista evolutivo como la Figura 31-82 Mecanismo de la variacion de fase en Salmonella, (a) En las bacterias en Fase 2, el promotor de H2-rh1 esta orientado de forma que se sinteticen la flagelina H2 y el represor. El represor se une al gen H1, bloqueando asi su expresion. (b) En las bacterias en Fase 1, el segmento que precede la unidad transcripcional H2-rh1 ha sido invertido respecto a la orientacion que posee en las bacterias en Fase 2. Asi, esta unidad transcripcional no puede expresarse porque carece de promotor. Esto libera al gen H1 de su represor y se produce la sintesis, de la flagelina H1. La inversién del segmento que precede la unidad transcripcional H2-rhi esté mediada por la proteina Hin, la cual se puede expresar en ambas rientaciones del gen hin, “ransposones con la misma orientacién ry | Awa depts drecas o i ecm bincdn zs Cromesona Segmento «ue contene un dtieconado sie warsposen conten un wanesesén DNA entre dos transposones idénticos con la misma orientacion. Este proceso reparte un transposén entre cada uno de los segmentos de DNA resultantes. Promoter H2-rh1 (a) Fase 2 Repeticén invertida (IR) @e 0° Represor a Flagelina HICapitulo 31. Replicacién, reparacién y recombinacién del DNA 1085 levadura, el maiz y la mosca del vinagre. De hecho, ~ 3 % del genoma de Drosophila esta constituido por transposones colocados en lugares dispersos. EL parecido entre la secuencia de bases de la mayorfa de transposones eucaristicos y los genomas de retrovirus (y su gran diferencia con los transposones bacterianos) sugiere que los transposones eucaristicos son retrovirus degenerados. Por esta raz6n, se llaman retrotransposones. Existen pruebas que demuestran que los retrotransposones realizan la transposicién en tres pasos: (1) su transcripcién a RNA, (2) la copia de este RNA. a DNA mediante la transcriptasa inversa (Seccién 31- 4C) y (3) la insercién al azar de este DNA en el genoma del organismo huésped (el ciclo vital de un retrovirus incluye la integracion {insercién] del DNA virico en el genoma del huésped, de forma parecida a la que se describe para el bacteriéfago 4 en la Seccion 32-3C). Asi, Gerald Fink modificé la estructura de Ty, el elemento movil mas comin en levadura (en el genoma de la levadura, existen ~ 35 copias de este elemento de 5,9 kb; las siglas Ty son las iniciales de Transposon yeast), introduciendo un intron de levadura precedido por un promotor de levadura sensible a la galactosa. Cuando este transposén modificado se inserté en el genoma de levadura, su nivel de trans- posicién variaba con la concentracion de galactosa presente en el medio y todos los elementos transpues- tos habian perdido el intron, indicando que la transposicion ocurre a través de un intermedio de RNA. ‘Ademés, de las dos proteinas codificadas por Ty, una se parece a la proteina que forma parte de las particulas de los retrovirus y la otra es homéloga a la transcriptasa inversa de los retrovirus. De hecho, estas dos proteinas, junto con el RNA y el DNA de Ty, forman unas particulas parecidas a virus en el citoplasma de las levaduras. El elemento Ty, y probablemente otros retrotransposones, pueden por tanto ser considerados como “virus internos” que iinicamente pueden mi verse dentro del genoma, aunque con una frecuencia muy baja comparada con la de las infecciones viricas auténticas. METILACION DEL DNA Los restos de A y C del DNA pueden ser metilados, segiin patrones especificos de cada especie, formando restos de N*-metiladenina y 5-metilcitosina, respectivamente. Resto de Nmetiladenina ‘Resto de 6-metileitosina, Estas modificaciones son las tinicas de que es objeto el DNA en organismos celulares (aunque todos los restos de C de los DNAs de los fagos T de numero par son convertidos en restos de 5-hidroximetilcitosina, NH, Nae cH,On Resto de 5-hidroximetileitosina los cuales pueden, a su vez, ser glucosilados). Estos grupos metilo se colocan en el surco mayor del B-DNA, donde pueden interaccionar con proteinas de unién al DNA. En la mayoria de las células, s6lo esta metilado un porcentaje pequerio de las bases suscep- tibles de metilacién, aunque este valor se eleva hasta > 30 % de los restos de C en algunas plantas. EI DNA bacteriano es metilado en sus propios sitios de restriccién, evitando asi que las correspondientes endonucleasas de restriccién degraden el DNA (Sec cin 28-6A). Sin embargo, este fenémeno sélo explica una parte de las metilaciones del DNA bacteriano. En E, coli, la mayorfa de las metilaciones del DNA son catalizadas por los productos de los genes dam y dem. La metilasa Dam metila el resto de A de todas las secuencias GATC, mientras que la metilasa Dem metila los dos restos de C en CC#GG. Obsérvese que ambas secuencias son palindrémicas. Los enzimas anteriores, como todas las DNA metilasas, utilizan S-adenosilmetionina como dador de grupos metilo. Reparaci6n de un error de apareamiento La funcién mas importante de la metilacién en procariotas es la reparaci6n de las bases mal apareadas. Cual- quier error de aparemiento producido durante la re- plicacién, que haya eludido las funciones correctoras de la Pol I y la Pol III, todavia puede ser corregido por ‘un proceso conocido como reparaci6n de errores de apareamiento (la Pol I y la Pol Ill presentan una frecuencia de error de 1010-7 por par de bases teplicado, pero la frecuencia de mutacién en E. coli es de 10-10" por par de bases replicado). Si este sistema multienzimatico esta disertado para corregir errores, y no para perpetuarlos, debe distinguir el DNA paierno, que posee la base correcta, de la hebra hija, que posee la base incorrecta, aunque normal. La observacin de que las células de E. coli dam presentan una mayor frecuencia de mutacién que las bacterias de la estitpe salvaje sugiere cOmo se realiza esta distincién, Las hebras hijas recién replicadas estén poco metiladas en comparacién con las hebras paternas, ya que la metilacién del DNA es posterior a la sintesis del DNA. Experimentos con modelos de DNA han demostrado que el sistema de reparacién de errores de apareamiento sustituye la hebra no metilada entre el punto donde se produce el error de aparea-1056 Seccién 31-7. Metilacién del DNA miento y el sitio hemimetilado mas proximo (situado hasta una distancia de ~ 1000 bp). En los eucariotas, la metilacion del DNA puede intervenir en la regulacién génica La 5-metilcitosina ("C) es la tinica base metilada en la mayoria de los DNAS eucaridticos, incluyendo los de los vertebrados. Esta modificacién tiene lugar, en su mayor parte, en el dinucledtido CG de diversas secuencias palindrémicas (en el genoma de los vertebrados, CG se encuentra con una frecuencia igual a la quinta parte de la que se esperaria en una distribucién al azar). El grado de metilacion del DNA eucariético y su patron se pueden evaluar comodamente compa- rando las transferencias Southern de DNA digerido con las endonucleasas de restriccion Hpall (que corta CCGG pero no C*CGG) y Mspl (que corta en ambos sitios). Estos estudios indican que la metilacion del DNA eucaristico varia con la especie, el tejido y la osicion a lo largo del cromosoma. Existen numerosas pruebas circunstanciales de que la metilacién del DNA inactiva la expresion de genes eucariéticos, especialmente cuando ocurre en las regiones de control, situadas corriente arriba de las secuencias transcritas de los genes. Por ejemplo, los genes de la globina estan menos metilados en los eritrocitos que en las demés células y, de hecho, la metilacion especifica de la regién de control en un gen recombinante de la globina inhibe su transcripci6n en células trans- fectadas. Otra prueba a favor del efecto inhibitorio de Ja metilacion del DNA es la observacion de que la S-azacitosina (5-azaC), NH, y7 wy AY U S-Azacitosina (G-aza0) un andlogo de la base citosina que no puede ser ‘metilado en su posicién N(S) y que inhibe las DNA metilasas, estimula la sintesis de varias proteinas y cambia los patrones de diferenciacin celular de célu- las eucaridticas en cultivo. Sin embargo, estos efectos pueden no ser debidos a la desmetilacion de los genes: la 5-azaC también induce genes que normalmente no estén metilados. Se desconoce la manera en que la metilacién del DNA bloquea la expresion génica. Sin embargo, se ha suscitado una interesante posibilidad, basada en la observacién de que la metilacién de un poli(GC) sin- tético estabiliza su conformacin de Z-DNA. Es posible que la formacién de Z-DNA, que ha sido detectada in vivo (Seccién 28-2B), actte como un interruptor conformacional que inhiba localmente la expresin génica. A pesar de todo, dado que en el DNA de muchos invertebrados altamente diferenciados, incluyendo Drosophila, no se ha podido detectar metila- cién, no puede considerarse este mecanismo como ‘tinico regulador de la expresion génica. De hecho, no se demostrado de modo inequivoco que la expresién génica esté controlada por metilacion del DNA. En eucariotas, la metilacién del DNA se autoperpetiia La naturaleza palindrémica de los sitios de metila- cién en el DNA ha conducido a la hipétesis de que, en los eucariotas, el patron de metilacion de las hebras del DNA paterno dirige la generacion del mismo patron en las hebras hijas (Fig. 31-53). Esta metila- cién de mantenimiento permitiria la “herencia” estable de un patron de metilacion en una linea celular y, asi, todas estas células tendrian el mismo fenotipo de diferenciacién. Existen numerosas pruebas experimentales a favor de esta hipotesis, incluyendo la ob- servacién de que el DNA virico metilado artificial- mente, tras su transfeccién en células eucaristicas, mantiene su patron de metilacion durante al menos 30 generaciones. Poco se sabe, sin embargo, acerca de como se establece o se modifica durante la diferencia- cién el patrén de metilacién del DNA en células ger- minales, Metilacion de mantenimiento | Hs—C G G C—cHy CH, Figura 31-53 En la metilacién de mantenimiento, el patron de ‘metilacion de una hebra paterna induce el ‘correspondiente patrén de metilacion en la hebra ‘complementaria. De esta manera, puede mantenerse un Patron de metilacién estable en una linea celular.Capitulo 31. Replicacién, reparacién y recombinacién del DNA 1057 Resumen del capitulo EL DNA se replica en la direccion 5’ -» 3’, mediante la incorporacion de desoxinucleésido trifosfatos sobre moldes de DNA complementario, La replicacin se inicia con la generacién de pequeiios cebadores de RNA, proceso mediado en E, coli por la primasa y la RNA polimerasa. A continua- cion, el DNA es extendido desde los extremos 3’ de los cebadores por la accion de la DNA polimerasa (Pol Ill en E. coli), La hebra conductora en la horquilla de replicacion es sintetizada de forma continua, mientras que la hebra retrasada es sintetizada de manera discontinua mediante la for- macién de fragmentos de Okazaki. Los cebadores de RNA en el DNA de nueva sintesis son eliminados y sustituidos por DNA a través de la traslacién de muesca, catalizada por la Pol I (en E. coli). Estas muescas en una sola hebra son después cerradas por la DNA ligasa. Los errores de aparea~ miento producidos durante la sintesis de DNA son corregi- dos mediante la actividad exonucleasa 3’ —» 5’ de ambas polimerasas, Pol I y Pol Ill. La sintesis de DNA en E, coli requiere la participacion de muchas proteinas auxiliares, incluyendo Rep, helicasa Il, SSB y DNA girasa. La sintesis de DNA se inicia en sitios especificos denominados origenes de replicacién. En la sintesis de la hebra (-) sobre el molde de la hebra (+) en el bacteridfago M13, el origen de replicaci6n es reconocido y el cebador es sintetizado por la RNA polimerasa. El proceso andlogo en el bacteri6fago #X174, asi como en E. coli, esta mediado por tuna particula compleja que contiene la primasa, conocida como primosoma. La hebra (+) del fago &X174 es sintetizada, segiin el modelo de replicacion del DNA del circulo rodante con lazo, sobre moldes de hebras (-) de la forma replicativa, en un proceso que es dirigido por la proteina virica del gen A. El cromosoma de E. coli es replicado bidireccionalmente siguiendo el modelo @, desde un tinico otigen de replicacién, oriC. La sintesis de la hebra conductora es iniciada, probablemente, por la RNA polimerasa y la primasa actuando conjuntamente, mientras que los fragmentos de Okazaki son iniciados por la primasa en el primosoma. Al parecer, la gran complejidad del proceso de la replicacion del DNA permite asegurar la extremada fidelidad necesaria para mantener la integridad del genoma, En los eucariotas, el DNA es sintetizado durante la fase S del ciclo celular. En las células animales, el DNA cromos6- mico es replicado bidireccionalmente, a partir de origenes mailtiples, por accién de las DNA polimerasas a y 8, las Bibliografia General ‘Adams, R. L. P., Knowler, J. T., y Leader, D. P., The Bioche- mistry of the Nucleic Acids (10.* ed.), Capitulos 6 y 7, Chap- man & Hall (1986) Boyer, P. D. (Ed), The Enzymes, Vols. 14 y 15, Academic Press, (1981 y 1982). [Contiene una serie de revisiones autorizadas sobre muchos de los enzimas que median la replicacion, la reparacion y la recombinacién del DNA.] Freifelder, D., Molecular Biology, Capitulos 8, 9, 18 y 19, Science Books International (1983). cuales se cree que sintetizan las hebras retrasada y conductora. El DNA mitocondrial se replica, siguiendo el mode- Jo del lazo D, por la DNA polimerasa 7. Los retrovirus sintetizan DNA sobre moldes de RNA, en una secuencia de reacciones catalizadas por la transcriptasa inversa Las células poseen una gran variedad de mecanismos de reparacién. El datio en el DNA puede ser revertido directamente, como en la fotorreactivacion de los dimeros de pirimidina, inducidos por radiacién UV, o en la reparacién de las lesiones de O%-metilguanina, Los dimeros de pirimidina, asi como otros muchos tipos de lesiones, pueden ser eliminados mediante la reparacion por escision. Las DNA slucosilasas eliminan especificamente las correspondientes bases, que han resultado alteradas quimicamente, incluyendo el uracilo, formandose sitios AP que son eliminados ‘mediante reparacién por escision. Una lesion producida en una hebra del DNA, debido a la sintesis sobre un molde dafiado, puede corregirse a través de la reparacién por recombinacién, Cuando se acumula una gran cantidad de lesiones en el DNA, se induce la respuesta SOS, que incorpora un sistema de reparacién propenso a los errores. La elevada correlacién entre mutagénesis y carcinogenesis per~ mite la identificacion de carcinégenos mediante el test de Ames, La informacion genética puede ser intercambiada entre secuencias de DNA homélogas mediante la recombinacién, general, Este proceso, que ocurre seguin el modelo de Holli- day, esté mediado en E, coli por RecA. El DNA puede también sufrir reordenaciones por la accién de los transposones. Estos segmentos de DNA contienen genes que codi- fican las proteinas que median su propio proceso de tran: posicion, asi como otros genes. La transposicién puede ser importante en la evolucién de Ios cromosomas y de los plasmidos y ha sido relacionado con el control de ia expresin fenotipica, como la variacion de fase en Salmonella. En los eucariotas, los transposones parecen ser retrovirus degenerados, EI DNA procaristico puede ser metilado en sus bases Ao C. Ello protege al DNA de la accién de las endonucleasas de restriccién y permite la correction de los errores de apareamiento en el DNA de nueva sintesis. En los eucariotas, la metilacién del DNA, que se produce a través de la formacion de ®C, ha sido implicada en el control de la expresion génica. Kornberg, A., For Love of Enzymes: The Odyssey of a Bioche- mist, Harvard University Press (1989). [Autobiografia cienti- fica] Komberg, A., DNA Replication y 1982 Supplement to DNA Replication, Freeman (1980 y 1982). (Libros de referencia muy informativos sobre la mayoria de los aspectos de la replicacion del DNA, escritos por el fundador de este cam- Po y uno de sus principales contribuyentes.) Lewin, B,, Genes (3.* ed.), Capitulos 13-15 y 28-30, Wiley (1987).1058 Bibliografia Watson, J. D., Hopkins; N. H., Roberts, J. W., Steitz,J. A. y Weiner, A. M., Molecular Biology of the Gene (8.* ed.), Capi- tulos 10-12, Benjamin /Cummings (1987) Replicacién del DNA Bambara, R. A. y Jessee, C. B., Properties of DNA polymerases 8 and ¢, and their roles in eukaryotic DNA replication, Biochim. Biophys. Acta 1088, 11-24 (1991), Blackbur, E. H., Telomeres: Structure and synthesis, J. Biol Chem. 265, 5919-5921 (1990). Boeke, J. D., Reverse transcriptase, the end of the chromo- some, and the end of life, Cell 61, 193-195 (1990). Bramhill, D. y Kornberg, A., A model for initiation at ori- gins of DNA replication, Cell 54, 915-918 (1988), Burgers, P. M. 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Con- cretar las respuestas. (a) dnaB, (b) dnaE, (c) dnaG, €€) lig, (&) polA, (0 rep, (g) s8b y (h) recA. 3. Cuantos fragmentos de Okazaki son sintetizados aproximadamente durante la replicacién del cromosoma de E. coli? {Cul es el niimero minino y maximo de horquillas de replicacién que aparecen en un cromosoma contiguo de una célula de E. coli que se esta dividiendo cada 25 min; cada 80 min? {Por qué los DNAs diiplex lineales, tal como ocurre en, el bacteri6fago 17, no pueden ser replicados totalmente por ninguno de los mecanismos de replicacién considerados en este capitulo? 2Cual es la vida media de una determinada base puri- nica en el genoma humano suponiendo que esta sujeta iinicamente a despurinacion espontinea? {Qué frac- ion de las bases purinicas del genoma humano serén despurinadas en el transcurso de una generacién (suponer que dura 25 aitos)? @Por qué es mutagénica la metilacion del DNA, for- ‘mando O*-metilguanina? Existen ciertos sitios en el cromosoma de E. coli, cono- idos como puntos calientes, que presentan una fre- Figura 31-54 Micrografia electrénica de un DNA circular monohebra {que contiene un transposén. (Por cortesia de Stanley Cohen, Stanford University School of Medicine] cuencia de mutacién puntual anormalmente alta. La mayoria de estos sitios eontienen un resto de 5-metilcitosina. Explicar la existencia de estos puntos calientes. 12, Explicar por qué una breve exposicién de un cultivo de células eucaridticas a la 5-azacitosina produce cambios fenotipicos permanentes en estas células. 13, Explicar por qué las estructuras chi, como la que se muestra en la Fig. 31-376, tienen dos pares de brazos. de igual longitud, "14. Los DNAs circulares monohebra, que contienen un transposén, presentan una estructura caracteristica de vastago y doble lazo, como la que se muestra en la Fig. 31-54. ;Cual es la base fisica de esta estructura? 15. En algunas ocasiones, un transposon compuesto inte- grado en un plésmido circular transpone el DNA correspondiente al plasmido original, en lugar de la re~ gion central del transposon. Explicar cOmo puede ser posible esto.

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