2.

Mtodos de investigacin de polisacridos

Los polisacridos han sido ampliamente aceptados como productos sanitarios para
mejorar las funciones inmunes del cuerpo. Sin embargo, muchos polisacridos slo
permanecen en la etapa de productos de salud y no se convierten en drogas. La
razn principal es que es difcil aislar y purificar polisacridos y el nivel tecnolgico
relacionado no cumple con el requisito. En general, los polisacridos son
macromolculas hidrfilas. Las metodologas de aislamiento y purificacin de los
polisacridos son diferentes de las molculas pequeas. Adems, muchos
polisacridos tienen propiedades diferentes, por lo que se necesitarn diferentes
mtodos de aislamiento y purificacin ellos. Este trabajo requiere no slo
conocimientos tericos sobre polisacridos, sino tambin experiencias de trabajo
para aislar y purificar polisacridos.
2.1. Mtodos de aislamiento y extraccin de polisacridos.
Hay muchos mtodos para aislar y purificar polisacridos. El principio para
seleccionar el mtodo de aislamiento del polisacrido es mantener las propiedades
intrnsecas de los polisacridos sin cambios durante el proceso de aislamiento y
purificacin. Aunque algunos polisacridos existen fuera de la pared celular animal /
vegetal (llamado polisacrido extracelular o exopolisacrido), la mayora de los
polisacridos estn todava presentes en la pared celular (llamado polisacrido
intracelular). As que el primer paso de la extraccin de polisacridos es aplastar los
materiales de los animales / plantas para hacer que los polisacridos intracelulares
se liberen fcilmente. Adems de los mtodos tradicionales de trituracin, la
tecnologa ultrasnica de trituracin de flujo de gas se utiliza para romper la pared
celular de animales / plantas o esporas de hongos en los ltimos aos, aumentando
as enormemente la eficiencia de la extraccin de polisacridos. Debido a las
paredes celulares de animales / plantas estn en gran parte rodeadas de lpidos, la
eliminacin de los lpidos tiene que hacerse despus de la trituracin mecnica. El
mtodo comn para la eliminacin de lpidos es el etanol de reflujo 6-8 h utilizando
Soxhlet extractor. La materia prima despus de la eliminacin de los lpidos se
puede utilizar para extraer los polisacridos. Existen muchos mtodos de extraccin
de polisacridos, entre los cuales se utilizan con frecuencia cuatro mtodos.
2.1.1. Mtodo de extraccin de agua caliente.
Este es el mtodo ms utilizado actualmente en la extraccin de polisacridos, cuyo
principio es que la mayora de los polisacridos tienen mayor solubilidad en agua
caliente. El polisacrido es estable en agua caliente, por lo que puede recibir el
dao mnimo mediante este mtodo de extraccin. La prctica habitual es extraer
de 2-6 h usando agua. Si el extracto es bajo en viscosidad, el residuo en el extracto
puede ser fcilmente filtrado. Si el extracto es viscoso, el residuo puede eliminarse
mediante centrifugacin.
2.1.2. Mtodo de extraccin de una solucin diluida de lcali-agua.
Algunos polisacridos cidos o polisacridos de alto PM no se disuelven fcilmente
en agua caliente. Su solubilidad es generalmente ms grande en solucin alcalina
diluida que en agua caliente. Por lo tanto, a menudo se usa solucin de NaOH o
solucin de NaCO3 de 5% -15% (p / p) para extraer en lugar de agua caliente.
Cuando se usa solucin alcalina diluida para extraer, la temperatura debe

mantenerse por debajo de 10 C por lo contrario, los polisacridos son propensos a

la degradacin. En la prctica, usualmente se usa en primer lugar agua caliente
para extraer polisacridos, y luego se usa solucin alcalina diluida para extraer los
polisacridos restantes en el residuo obtenido. As, la mayora de los polisacridos
en el material animal / vegetal sern extrados de esta manera.

2.1.3. Mtodo de Enzimlisis.

La materia prima triturada de las plantas se suspende en agua. De acuerdo con la
condicin ptima de reaccin de las enzimas compuestas que se van a utilizar, se
fijan en primer lugar la temperatura y el pH ptimos, y despus se aadir una
cierta cantidad de enzimas compuestas en la suspensin y se reaccionar durante
un perodo de tiempo. El filtrado es la solucin de extracto de polisacrido despus
de filtrar el residuo. Este mtodo se ha aplicado en la preparacin de algunos
productos de salud de polisacridos. Sin embargo, en la prctica, el mtodo
ampliamente utilizado es el mtodo combinado de extraccin con agua caliente y
enzimlisis, es decir, primero usa agua caliente para extraer, y despus usa
enzimas para extraer. As, el rendimiento de polisacrido puede aumentar mucho.
2.1.4. Otros mtodos.
Los tres mtodos anteriores se usan comnmente en la extraccin de polisacridos.
Adems de estos, todava hay algunos mtodos que no se utilizan a menudo debido
a alto costo y bajo rendimiento. Por ejemplo, una vez se utilizaron DMSO (sulfxido
de dimetilo), o algunos disolventes orgnicos de sales de metales alcalinos como 2metoxietanol-LiCl o solucin acuosa cida para extraer los polisacridos Etc.

2.2. Eliminacin de impurezas en extractos de polisacridos.

Las soluciones de extracto de polisacrido obtenidas utilizando los mtodos
anteriores contienen muchas impurezas, tales como sales inorgnicas,
monosacridos, oligosacridos, sustancias de bajo PM no polares e impurezas
orgnicas de alto PM (por ejemplo protenas, lignina). Las sales inorgnicas, los
monosacridos, los oligosacridos y las sustancias no polares de bajo PM se pueden
eliminar utilizando el mtodo de dilisis. La duracin de la dilisis no es mayor de
36 h normalmente, de lo contrario la bolsa de dilisis se moja fcilmente sin
conservantes. Dado que las bolsas de dilisis tienen diferentes especificaciones de
corte de PM, el primer paso es seleccionar una adecuada bolsa de dilisis de corte
de PM. Las bolsas de dilisis deben ser pre-tratadas antes de su uso. Por lo general
se ponen en agua hirviendo y se hierve durante alrededor de 0,5 h para eliminar las
impurezas antes de su uso. Las bolsas de dilisis pueden utilizarse repetidamente,
pero deben lavarse despus, empapadas en el agua con un poco de conservante
(como el cido benzoico) y almacenadas en el refrigerador (tenga en cuenta para
evitar sequedad y moldeo). En general, las bolsas de dilisis son estables en el pH
de 5-9, por lo tanto la solucin de extracto de polisacrido debe ajustarse a pH 5-9
primero antes de la dilisis. Debe observarse que aunque las bolsas de dilisis
tienen cierto margen de exclusin de PM, algunas molculas de polisacrido son
lineales, por lo tanto, a veces las molculas de polisacrido que exceden el margen
de exclusin tambin pueden pasar a travs de la bolsa de dilisis. Adems, las
resinas de intercambio inico tambin se usan para eliminar sales inorgnicas

(aniones y cationes cargados). Para la eliminacin de sales a gran escala industrial,

se pueden aplicar camas mixtas de resina de intercambio inico. Hay cuatro
mtodos bsicos para la eliminacin de protenas en el extracto:
2.2.1. Mtodo enzimtico.
Utilizar la proteasa relacionada para hidrolizar o digerir las protenas en la solucin
del extracto. Uno de los mtodos usados con frecuencia es el tratamiento de
digestin de pronasa, es decir, ajustar la solucin del extracto a pH 7-8, aadir
pronasa y digerir 2-4 h a 37C. Despus de la digestin, la solucin mixta se
calienta en agua hirviendo durante 5 minutos para bloquear la reaccin.
2.2.2. Mtodo de Sevag.
Segn la caracterstica de que las protenas pueden desnaturalizar en cloroformo,
se le aade a la solucin acuosa de polisacrido (pH 4-5) en la proporcin de 1: 5
(v / v), y despus se aade n-butanol a la solucin mixta. La relacin de n-butanol a
cloroformo es de 1: 5 (v / v). La mezcla de solucin de polisacrido-cloroformo-nbutanol se agita violentamente durante 20 min. La gelatina de protenas
desnaturalizadas aparecer en la interface entre la fase acuosa y la fase disolvente.
De este modo, las protenas desnaturalizadas pueden eliminarse mediante
centrifugacin. Este mtodo es suave en trminos de condiciones de reaccin, pero
la eficiencia no es alta. Por lo general, este mtodo se utiliza repetidamente 5 veces
o ms para deshacerse de las protenas.
2.2.3. Triclorotrifluoroetano (CCl2FCClF2).
El triclorotrifluoroetano se aade a la solucin de extracto de polisacrido (1/1) en
una condicin de enfriamiento (usualmente 4 C). La mezcla de solucin se agita
lentamente durante 10 minutos y las protenas en la solucin aparecern y se
convertirn en gelatina. Las protenas pueden ser eliminadas por centrifugacin.
La fase acuosa superior se trata repetidamente 2 veces usando
triclorotrifluoroetano de nuevo y se puede obtener la solucin de polisacrido sin
protenas. Este mtodo es muy eficiente. Sin embargo, debe aplicarse a baja
temperatura ya que el triclorotrifluoroetano tiene un bajo punto de ebullicin (47,7
C) y es voltil, lo que limita la utilizacin de este mtodo.
2.2.4. Mtodo del cido tricloroactico (TCA).
La solucin de extracto de polisacrido necesita ser previamente enfriada en bao
de hielo primero. Se aade lentamente TCA (concentracin es de 15% -30%, p / p) a
la solucin de extracto enfriada mientras se agita hasta que no se forma
precipitacin. Como el TCA tiene una acidez relativamente fuerte y puede causar la
degradacin de algunos polisacridos, la mezcla se coloca durante 4 h a una
temperatura baja (usualmente 4 C) y luego se centrifuga para eliminar la
precipitacin y obtener una solucin de polisacrido extrada sin protena. Este
mtodo es eficiente y a menudo se utiliza para eliminar las protenas de los
polisacridos de las plantas.
Las soluciones de extracto de polisacrido, especialmente la solucin de extracto
alcalino, contienen a menudo impurezas de compuestos fenlicos que tienen un
color ms oscuro. Aunque este color puede eliminarse en el proceso de purificacin,
el coste suele ser muy elevado usando tratamientos de purificacin complejos. Se

han desarrollado algunos mtodos sencillos y rentables. El carbn activado se

utiliza para decolorar la solucin de extracto de polisacrido en la prctica. Sin
embargo, el carbn activado tiene una fuerte adsorcin para pigmentos y
polisacridos. As que este punto puede conducir a una gran prdida de rendimiento
de polisacridos. La resina de intercambio inico dbilmente bsica tambin se usa
para decolorar. La resina puede eliminar pigmentos libres en polisacridos crudos,
pero la resina tiene tambin una fuerte adsorcin a polisacridos cidos. El mtodo
del perxido de hidrgeno (H2O2) se utiliza ms frecuentemente para decolorar los
polisacridos crudos. El pH de la solucin acuosa de polisacrido bruto (0,3% -0,8%,
p / p) se ajust a 8,0 usando amonaco (NH3 H2O), y luego se aadi
gradualmente H2O2 (concentracin final de 10% -30% v / v) A 45C bajo agitacin
manteniendo durante 2 h. La mezcla resultante se ajust a pH 7,0 utilizando cido
actico, se concentr y se precipit con etanol para obtener los polisacridos
decolorados. Es esencial controlar estrictamente las condiciones de decoloracin
cuando se utiliza el mtodo H2O2 (concentracin de solucin de polisacrido bruto,
temperatura, tiempo, pH, etc.). Aun as, este mtodo todava puede dar lugar a
cierta prdida de degradacin de polisacridos. J.N Fang Invent un nuevo mtodo
de decoloracin de polisacridos, que utiliz una clase de solucin micelar inversa
compuesta de n-hexanol-CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) -isooctano para
decolorar el polisacrido. Este mtodo que se ha concedido una patente es
conveniente y rpido. Mientras tanto, la recuperacin del polisacrido es alta.