UNIVERSIDAD NACIONAL

TORIBIO RODRGUEZ DE MENDOZA DE AMAZONAS

FACULTAD DE INGENIERA ZOOTECNISTA, AGRONEGOCIOS Y
BIOTECNOLOGA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA ZOOTECNISTA

PRACTICA DE OPU, FERTILIZACION y MADURACION INVITRO DE

OVOCITOS
ALUMNO : HUANCA SILVA LEISY.

CURSO

: BIOTECNOLOGA ANIMAL

PROFESOR: PhD. ILSE S. CAYO COLCA

CHACHAPOYAS PER
2016

INTRODUCCION

A pesar de que es abundante el conocimiento de los factores que afectan la recoleccin pos
mortem de ovocitos, existe escasa literatura de los efectos de los procedimientos de aspiracin en

el nmero, morfologa y la capacidad de desarrollo subsecuente de los complejos cumulusovocito recuperados. Sin embargo existen pocas deferencias bsicas entre la recuperacin de
ovocitos post mortem e in vivo, que hacen una comparacin entre ambas, al menos parcialmente
hipottica.
Primero la manipulacin transrectal del ovario es ms complicado en la donante viva siendo an
ms trabajoso por la visualizacin indirecta del mismo a travs de imgenes ecogrficas. Cuando
ovarios de mataderos son puncionados el operador puede examinar el ovario completamente.
Segundo, se puede esperar que diferentes fuerzas mecnicas jueguen un rol mientras se
puncionan

un ovario de matadero mediante una jeringa y una aguja, comparado con la

aspiracin folicular in vivo con una presin de vaco de aspiracin ajustable, como fue
demostrado en la prctica por el Dc. Luis Murga.

OBJETIVOS
Que el alumno desarrolle sus capacidades y obtenga conocimientos bsicos sobre reas de Biotecnologa
reproductiva animal.
Obtener ovocitos mediante aspiracin folicular in vivo.
Aprender a seleccionar y Categorizar los ovocitos obtenidos de la aspiracin folicular
Obtencin de ovocitos en animales vivos con el mtodo de OPU.

II. MARCO TEORICO

A. EN QU CONSISTE LA ASPIRACIN FOLICULAR TRANSVAGINAL?
Mejor conocida por sus siglas en ingls, OPU (Ovum Pick-up), la aspiracin folicular transvaginal es una
tcnica mediante la cual los ovocitos inmaduros son recolectados de los folculos en los ovarios de una vaca
viva por aspiracin guiada mediante ultrasonografa a travs de la pared vaginal. Esta tcnica fue aplicada
por primera vez en bovinos en 1988 al adaptar para tal fin los procedimientos de bsqueda ultrasonogrfica
transvaginal utilizados en humanos y aparece como una solucin luego de intentos previos de aspiracin de
folculos en vacas vivas mediante tcnicas como la laparotoma y la laparoscopia.
B. LA TCNICA DE OPU
Para llevar a cabo esta tcnica de aspiracin folicular in vivo se requiere contar con un equipo de
ultrasonografa, un transductor sectorial, una bomba de aspiracin y un sistema de gua de la aguja. La sonda
ultrasonogrfica para OPU ha sido construida con la finalidad de que permita la manipulacin de la aguja
desde el exterior del animal y que el transductor est en contacto con los ovarios; de ese modo, el extremo de
la aguja pueda ser visualizado cuando penetra dentro de los folculos que sern aspirados. La aguja est
conectada a la bomba de vaco por medio de una tubera plstica o de silicona, lo que permite que el
contenido folicular sea vaciado directamente al filtro, que es similar al utilizado para la recoleccin de
embriones.
En primer lugar, al iniciar el trabajo, las hembras a utilizar deben ser sedadas con y adems deben recibir
anestesia epidural con lidocana al 2% (3-5 ml/vaca), luego de esto se debe proceder a limpiar y desinfectar
la vulva y el perineo. Una vez realizada la higiene, se procede a introducir el transductor que tiene acoplado
el sistema de gua de la aguja. No es necesario introducir la mano por la vagina para tal fin. La cabeza del
transductor debe ubicarse en cualquiera de los lados del crvix, segn sea el ovario a puncionar. Luego se
introduce la mano izquierda por el recto y se fija el ovario contra la cabeza del transductor, lo que permite
visualizarlo en la pantalla del equipo del ultrasonografa, al igual que a los folculos y la aguja. A su vez en la
pantalla del ultrasonografo podemos apreciar la trayectoria de la aguja lo que nos permite ubicar los folculos
para lograr una aspiracin exitosa. Una vez ubicado el folculo a aspirar, se impulsa la aguja suavemente para
que penetre la pared vaginal y luego la folicular; una vez logrado esto la bomba de vaco aspira el contenido
y lo deposita en el filtro de embriones o en el recipiente destinado para tal fin. En cualquiera de los casos
estos debe contener medio de aspiracin heparinizado (PBS + 10% de suero fetal bovino). Posterior a esto
los ovocitos son procesados igual que para fertilizacin in vitro.
C. EL USO DE LA OPU

La OPU permite incrementar de forma significativa, el nmero de embriones transferibles y de preeces por
vaca al ao, dada la posibilidad de reutilizar las vacas donantes de ovocitos a intervalos mucho ms cortos en
comparacin con la tcnica de superovulacin y en comparacin con la utilizacin de ovarios de matadero.
La tcnica permite realizar hasta dos sesiones de aspiracin por donante a la semana, obtenindose en
promedio unos 4,1 ovocitos/vaca/sesin. Adems, este nmero puede llegar a 10,4 ovocitos/vaca/sesin, si
las donantes son tratadas previamente con hormona folculo estimulante (FSH) y somatotropina (bST), por lo
que se pueden llegar a obtener entre 50 (sin estimulacin hormonal) y 100 (con estimulacin hormonal,
FSH+bST) becerros por vaca donante al ao. Esto representa entre3 a 4 veces el valor logrado con la
transferencia de embriones clsica. Los resultados pueden estar afectados por factores como el dimetro de la
aguja de aspiracin, la presin de aspiracin, el momento del ciclo estral en que se realice la aspiracin,
edad, raza y condicin corporal de la donante, as como el uso de estimulacin hormonal.
Adems, la OPU permite incorporar hembras donantes que se rechazaran en los procedimientos de
superovulacin por razones de dificultades anatmicas en el crvix como a una falta de respuesta o a una
disminucin progresiva de la respuesta al tratamiento superovulatorio. Tambin pudiera ser que se trate de
hembras que sean infrtiles y que continen vacas luego de cuatro o ms servicios. No debe pasarse por alto
la posibilidad de incorporar como donantes de ovocitos a hembras jvenes e inclusive pre-pberes, lo que
nos permitira no solo acortar el intervalo generacional sino tambin acelerar las pruebas de progenie para la
evaluacin gentica de sementales. Por supuesto que para esto es necesaria an mucha investigacin.
Es importante resaltar que el uso de esta tcnica no est restringida a bovinos y ha sido aplicada en diversas
especies
como
son
equinos,
rumiantes
silvestres
y
bfalos,
ademsderepresentarunaherramientaimportanteenlarecuperacindeespeciesenpeligro de extincin. Otro uso
potencial
de
la
OPU
es
la
posibilidad
de
aplicar
tratamientos
hormonalesdirectamenteenelovario.Taleselcasodelainyeccinintraovricadelfactorde
crecimiento
insulnicotipoI (IGF-I), que permite incrementar la capacidad de desarrollo de ovocitos aspirados de ovarios
de hembras pre-pberes.
D. FACTORES:

E. MADURACIN DE OVOCITOS.
La maduracin ovocitaria es un fenmeno complejo, durante el cual el ovocito progresa desde el estadio de
profase de MI hasta el de MII (maduracin nuclear). El ovocito completa la meiosis en respuesta al pico
ovulatorio de LH, o bien, cuando es retirado del folculo para llevar a cabo la maduracin in vitro. Un periodo
de 24h es necesario para que el ovocito bovino complete la maduracin nuclear, es decir, alcance el estadio de
MII, en el que permanece hasta el momento en que es fertilizado, que es cuando completa la meiosis y se
forma los proncleos.
Adems de la maduracin nuclear, tambin es importante que exista una maduracin citoplasmtica ya que
prepara al ovocito para soportar la fertilizacin y aportar los nutrientes requeridos para el desarrollo
embrionario temprano. De manera natural, la meiosis inicia en el ovario fetal, pero se detiene antes del
nacimiento, en la profase (PI) de la primera divisin meiotica; los ovocitos pasan entonces a la etapa
reticulada, que es un estado de reposo nuclear y que suele durar hasta que se ovula el primer ovocito en la
pubertad. Los ovocitos en reposo o inmaduros tienen un gran ncleo denominado vescula germinal. La
meiosis avanza desde la etapa de vescula germinal o PI hasta la metafase de la segunda divisin meiotica en
la que se detiene una vez ms, dando como resultado un primer cuerpo polar que es expulsado al espacio
perivitelino. De la misma manera en la que madura el nucleo se debe llevar a cabo la maduracin del
citoplasma.
En los ltimos tiempos se ha podido demostrar que la adquisicin de capacidad para desarrollar es un proceso
que comienza mucho antes del periodo periovulatorio, antes de la ruptura de la vescula germinal. En este
sentido se ha demostrado que ovocitos contenidos en folculos antrales de ms de 5-6 mm presentan una
mayor capacidad para desarrollar respecto a aquellos contenidos en folculos de menor dimetro.
Recientemente se han desarrollado protocolos de estimulacin ovrica en bovinos tendientes a aumentar la
presencia de folculos de mayor dimetro al momento de la puncin folicular con los que se han obtenido
tasas de produccin de embriones hasta un 80%.
Cuando los ovocitos son aspirados desde los folculos terciarios reanudan espontneamente la meiosis y al ser
cultivados in vitro continan con los procesos de maduracin. De este modo la composicin de los medios y
el ambiente controlado por estufas de cultivo, deben brindar un ambiente adecuado para que la maduracin
ocurra en 24hs de un modo similar a lo que sucede in vivo durante ms de dos ciclos estrales en el bovino.
Las condiciones utilizadas en la mayora de los laboratorios para lograr este ambiente, involucra el uso de
medios de cultivo tales como el TCM-199 suplementado con hormonas (LH, FSH, estradiol, etc.),
antioxidantes (glutatin, cisteamina, cistina), factores de crecimiento y macromoleculas (suero, albumina), en
una atmsfera de 5% CO2 a 38,5C y humedad a saturacin.

F. FECUNDACIN DE LOS OVOCITOS.

Consiste en incubar los vulos madurados (producto de la fase anterior) con espermatozoides vivos y
mviles durante un periodo de 6 a 24 horas, luego de un proceso de seleccin y capacitacin espermtica
que nos permitir a su vez deshacernos de componentes del plasma seminal, crioprotectores y
espermatozoides muertos o con escasa vitalidad. La capacitacin espermtica generalmente se logra
exponiendo los espermatozoides vivos a concentraciones de heparina y cafena, entre otras. Estas
sustancias logran estimular el proceso de capacitacin del espermatozoide que lo prepara para
interaccionar y fecundar el vulo.
Una vez que disponemos de ovocitos maduros, el siguiente objetivo es lograr la fecundacin de los
mismos, para ello se incuban junto con espermatozoides capacitados en un medio suplementado con
fuentes energticas (piruvato, lactato) y albmina srica. En la especie bovina, la capacitacin
espermtica se ve favorecida por la incorporacin de heparina al medio. No obstante, para lograr unos

V.

resultados ptimos es necesario ajustar la concentracin de heparina y el nmero de espermatozoides

para cada eyaculado concreto.
En el caso de la fecundacin in vitro, los ovocitos madurados son cocultivados con espermatozoides en
medios especiales y en un ambiente controlado por estufas de cultivo por un tiempo comprendido entre
524 hs dependiendo del protocolo, la concentracin de espermatozoides y la calidad del semen utilizado.
Con el fin de lograr los procesos de capacitacin, reaccin del acrosoma y pasaje a travs de las barreras
ovocitarias, el semen debe ser tratado rpidamente antes de cocultivar los espermatozoides con los
ovocitos. Este tratamiento incluye la eliminacin de todos los elementos presentes (plasma seminal,
componentes del diluyente en caso de semen congelado-descongelado, contaminantes, etc.) excepto los
espermatozoides y una seleccin de los espermatozoides vivos y con motilidad progresiva.

MATERIALES
A. EQUIPOS

transductor
lidocana
Placa trmica de calentamiento
Estereomicropscopio
Micropipetas
Bao mara

B. MATERIALES
LABORATORIO:
Termo
Vaso de precipitado x 200 cc ( 01 unidad)
Solucin Fisiolgica (NaCl 0.9%) 1 litro
Jeringa de 5 ml y agujas de 18 x 1 (1 unidad por alumno).
Placas Petri de 100 mm y placa Petri de 35 mm ( 5 o 6 unidades)
Guantes quirrgicos (1 par / alumno)
Papel Toalla (01 rollo/grupo)
BIOLOGICOS:
Ovarios de la vaca 064, Mara y Ilse

V.

PROCEDIMEINTO Y RESULTADOS
La
OPU
precisa
de
la
tranquilizacion previa del animal,
esta se llevara a cabo con el animal
en un chantador, mediante
lidocana. 2%.
Posteriormente,
se
debe
administrar anestesia va epidural,
para
reducir
los
esfuerzos
expulsivos
y
facilitar
la
manipulacin del ovario.

Vaciamiento del recto, limpieza y

desinfeccin de la vulva y rea
perineal.

Se introducir el transductor en la
vagina convenientemente
lubricado y protegido por una
cubierta sanitaria de ltex.

Introduccin del transductor.

Sujecin del ovario (mano
izquierda) y manejo del mango de
OPU (mano derecha).

Para la visualizacin de los folculos ovricos empleamos un ecgrafo equipado con una sonda transvaginal de
5-75 MHz y un handgrip o mango de OPU de 60 cm de longitud donde se colocara la gua de puncin. Por la
gua se introducir una aguja de puncin desechable (20 G, 09 x 70mm) conectada a un tubo estril de 50 ml

mediante una conduccin de Tefln. El equipo de OPU se completa con una bomba de vaco accionada por
pedal con la que se aplicara una aspiracin constante de 50-53 mm Hg (20 ml/min).
El tubo de recogida debe mantenerse atemperado a 37oC en bao termosttico (grafico 1).

Grafico 1. SISTEMA DE OPU. Pieterse e col. 1988.

Los ovarios se posicionaran va rectal delante de la sonda para ovricos visibles de

ms de 3 mm de dimetro. Antes de iniciar la sesin de puncin se drenara el
sistema aspirando una pequea cantidad de medio de recogida. Tras la aspiracin
de cada 3-4 folculos se realizara un lavado exhaustivo del fluido folicular en la
aguja de aspiracin y en el sistema de recoleccin con medio de lavado y recogida
[PBS suplementado con heparina sdica (22 UI/ml) y suero fetal bovino (1%)].

El fluido obtenido de cada animal

contenido en un tubo de recogida de
50 ml ser inmediatamente filtrado
(fotografa 6), los restos de sangre
sern eliminados por continuos
lavados en PBS fresco y se pasara a
una placa de Petri para localizar y
evaluar
morfolgicamente
bajo
estereomicroscopio los complejos
cumulus ovocito aspirados.

. Bsqueda y clasificacin de
los vulos.

BUSQUEDA Y CLASIFICACION DE OVOCITOS

ANIMAL
BUSQUEDA
CLASIFICACION
064
6 ovocitos
Ninguno todo degenerado
MARIA
3 ovocitos
2 EXELENTES
ILSE
3 ovocitos
2 excelentes y 1 regulares

VI.

Clasificaremos los COCs obtenidos en cuatro categoras, segn homogeneidad, morfologa del citoplasma y
compactibilidad de las clulas del cumulo:
Categora I: Ovocitos con ms de
tres capas de clulas de cumulo
compactas y con citoplasma
homogneo
uniformemente
granulado.

Categora II: Ovocitos mayor o

igual a tres capas de clulas del
cumulo y citoplasma generalmente
homogneo
Categora III: Ovocitos con una
sola capa de clulas del cmulo y
citoplasma de aspecto irregular con
reas oscuras
Categora IV: Ovocitos denudados

- Categora V: Ovocitos madurados

in vivo, con cumulo expandido.

CONCLUCIONES
En conclusin, la aspiracin folicular transvaginal es un procedimiento que permite la recuperacin
repetida de ovocitos de donantes vivas, siendo una tcnica de alta eficiencia y repetibilidad, lo que
permite al combinarla con la fertilizacin in vitro superar con creces el nmero de becerros obtenidos
por donante en un periodo fijo de tiempo en comparacin con la superovulacin.
La aplicacin de esta tcnica puede, adems, incrementar el nmero de donantes de ovocitos entre las
cuales se podr contar con hembras pre-puberales, lo que permitira reducir el intervalo generacional y
as incrementar el progreso gentico.
Con el desarrollo de todos los procesos de produccin de embriones in vitro, se conoci la tcnica de
una manera clara y precisa y como estudiantes nos comprometemos en seguir desarrollando la tcnica
y realizar investigaciones en la tcnica.
Se trabaj con los principales medios de cultivo para la produccin in vitro de embriones y se conoci
de una manera correcta cada una de ellas.
El mtodo descrito de produccin in vitro de embriones permite disponer de un gran nmero de
embriones bovinos en diferentes estadios de desarrollo.

VII.

BIBLIOGRAFIA
STRINGFELLOW. DA., SIEDEL. SM., Manual de la sociedad internacional de transferencia de
embriones (I.E.T.S), 3ed, Alabama USA. 2000.
FELMER R, Produccin in vitro de embriones bovinos: Suplementacin de los medios de cultivo con
suero. Arch. Med. Vet, 2006; 38(2): pp.97-104.
VERNICA A. PELEZ, Produccin In Vitro De Embriones Bovinos.
PALASZ, AT., Y DE LA FUENTE, J. Produccin de embriones bovinos: Efecto de los medios de
cultivo y de los requerimientos fisiolgicos sobre la calidad de los embriones producidos in vitro.
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PARRISH, J.J., SUSKO-PARRISH, J.L., LEIBFRIED-RUTLEDGE, M.L., CRITSER, E.S.,
EYESTONE, W.H., FIRST, N.L. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen.
Theriogenology; 25: 591-600. 1986.

VIII. ANEXOS

Entrada de la vaca para la

aspiracin

Preparacin de materiales
Muestra de la vaca 064
Muestra de la vaca 064, Mara
y ILSE
Resultados de la aspiracin
en un bao mara Resultado de la vaca 064,
Muestra de la vaca 064, Mara
Mara y ILSE
y ILSE

Observacin de ovarios y
ovocitos
Resultado de la 064, Mara y Clulas espermticas
ILSE